Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Developmental Biology
Click here for the English version

Developmental Biology

الكشف المناعي 5-ميثيلسيتوسيني وهيدروكسيميثيلسيتوسيني 5 في تطوير والشبكية الماوس بوستميتوتيك

Published: August 29, 2018 doi: 10.3791/58274
Automatic Translation
1, 1, 1, 1
1BioTime, Inc

Summary

والهدف من هذا التقرير وصف البروتوكول للكشف المناعي قوية من علامات جينية، 5-ميثيلسيتوسيني (5mC) و 5-هيدروكسيميثيلسيتوسيني (5hmC) في تطوير وبوستميتوتيك الماوس الشبكية.

Abstract

التخلق للتنمية الشبكية هو حقل بحث مدروسة، التي تبشر بتحقيق مستوى جديد من التفاهم حول الآليات لمجموعة متنوعة من الأمراض التنكسية الشبكية البشرية وتحديد نهج معاملة جديدة. يتم تنظيم بنية الشبكية الماوس النووية في نمطين من أنماط مختلفة: التقليدية ومقلوب. النمط التقليدي عالمي حيث heterochromatin مترجمة على هامش النواة، بينما يقيم euchromatin النشطة في الداخلية النووية. على النقيض من ذلك، النمط النووي المقلوب فريدة من نوعها لنواة خلية مستقبله قضيب البالغين heterochromatin يموضع للمركز النووي، حيث يوتشروماتين يتواجد في محيط النووية. ويلاحظ مثلايشن الحمض النووي أساسا في تشروموسينتيرس. مثلايشن الحمض النووي تعديل التساهمية دينامية على بقايا السيتوزين (5-ميثيلسيتوسيني، 5mC) من دينوكليوتيديس البد أن تكون أثرت في مناطق المروج العديد من الجينات. ثلاثة ميثيلترانسفيراسيس الحمض النووي (DNMT1 و DNMT3A و DNMT3B) المشاركة في مثلايشن الحمض النووي من خلال التنمية. الكشف عن 5mC مع تقنيات المناعي صعبة للغاية، الإسهام في التفاوت في النتائج، كما يتم إخفاء جميع قواعد الحمض النووي بما في ذلك قواعد 5mC تعديل داخل الحلزون الدنا مزدوج-الذين تقطعت بهم السبل. ترسيم تفصيلية لتوزيع 5mC أثناء التطوير غير مفيدة للغاية. هنا، يمكننا وصف أسلوب استنساخه للكشف المناعي قوي 5mC وأخرى جينية الحمض النووي علامة 5-هيدروكسيميثيلسيتوسيني (5hmC)، الذي كولوكاليزيس مع الكروماتين "فتح"، ترانسكريبتيونالي النشطة في تطوير و الماوس بوستميتوتيك الشبكية.

Introduction

التنظيم جينية للتنمية والتوازن بوستميتوتيك الشبكية الماوس هو منطقة مثيرة للبحوث، التي وعود لتحقيق فهم رواية البيولوجية آليات التحكم في تحديد مصير ريتينوجينيسيس والخلية، الخلية نوع معين وظيفة التمثيل الغذائي، فضلا عن الأمراض المحمولة، موت الخلايا وتجديد1،2،3،4،،من56،،من78 , 9 , 10 , 11 , 12 , 13-يخضع الكروماتين التغيرات الدينامية في التنمية، وكذلك استجابة لإشارات متغير خارجي سواء كان ذلك التأكيد، الأيض أو خلية الموت المحفزات6،،من1415، 16 , 17 , 18-في نويات الماوس، تنقسم الكروماتين euchromatin نشطة وغير نشطة heterochromatin6،،من1920. نواة الطور البيني، يتواجد يوتشروماتين في المنطقة الداخلية من النواة بينما heterochromatin خطوط على هامش النووي ونويه. هذا النمط يسمى التقليدية، وهو الغاية المصانة في حقيقيات النوى. على النقيض من ذلك، قد نوى رود في الحيوانات الليلية مثل الماوس وفار مقلوب نمط حيث تحتل النواة هيتيروتشروماتين في وسط محاط بتشكيل6،شل الأبعد18، يوتشروماتين 20. عند الولادة، وقد نوى رود الهندسة النووية التقليدية. انعكاس نويات رود يحدث أثناء التطوير قبل إعادة عرض للهندسة النووية التقليدية. أثناء هذه العملية، يفصل heterochromatin الطرفية من هامش النووي وتشروموسينتيرس تلتحم معا لنموذج تشروموسينتير واحد في المركز نواة6،18.

المجينية الحمض النووي مثلايشن تشارك في مراقبة المطابقة الكروماتين المحلية21. مثلايشن الحمض النووي يحدث في 5 ' موقف من بقايا السيتوزين دينوكليوتيديس البد أن يتم إثراء في منطقة المروج العديد من الجينات في الماوس جينومات22،،من2324،25،26 كذلك في إينتيرجينيك ومناطق إنترون، التي تحمل العناصر التنظيمية27. مثلايشن جزر البد في المروجين الدانية21،24 وتسلسل البد في الجينات القدرة على27،28 المهم في تنظيم الدولة الحيوية من الكروماتين الثنائي التكافؤ، التي تحتوي على العديد العوامل الإنمائية الجينات/النسخ تلعب دوراً هاما في التنمية والسرطان والشيخوخة29،30،،من3132،،من3334 . المشاركة ثلاثة الحمض ميثيلترانسفيراسيس (دنمتس) في مثلايشن الحمض النووي خلال الماوس التنمية35. يتم التعبير عن جميع دنمتس الثلاثة خلال الماوس التنمية الشبكية36 والتغييرات الخاصة بالشبكية في دنمت الجينات أثر التنمية الشبكية2،7. هيدروكسيميثيلسيتوسيني (5hmC) هو نتاج الأكسدة ديميثيلاتيون 5-ميثيلسيتوسيني (5mC). الثلاثة الإنزيمات إزفاء (TET) أحد عشر العشر المشاركة في 5mC ديميثيليشن37،،من3839. تعديل هيدروكسيميثيل-C هو المخصب المروجين والهيئات الجينات وتسلسل الجينوم إينتيرجينيك داخل الجينات الغنية والمناطق بنشاط يدون27،40.

وهناك مجموعة متنوعة من وصف النهج لتحديد الأنماط المتغيرة مثلايشن الحمض النووي في الخلايا41،42،،من4344،،من4546، البعض منهم تمكن التحديد الكمي للتغيرات العالمية من مثلايشن الحمض النووي بينما تركز على التغييرات الدقيقة في المناطق الغنية البد داخل المروجين ومحسنات. وكانت أساليب الكشف والتحديد الكمي ل 5hmC أيضا المبلغ عنها47، بما في ذلك إيمونوهيستوتشيميستري13. تقنيات المناعي، التي تمكن من رصد التغيرات 5mC و 5hmC في نواة لتطوير قوي والخلايا بوستميتوتيك، ومفيدة للغاية لتحديد الكروماتين الديناميات في الموقع استجابة للتغيرات الخارجية أو الداخلية تؤثر على خلايا4،13،،من4849. بيد أن هذا النهج عرضه للتقليل من شأن مثلايشن الحمض النووي والتغيرات هيدروكسيميثيليشن بسبب الصعوبات التقنية، المرتبطة بالكشف عن التعديلات السيتوزين في التحضير النسيجي. وهذا يرجع إلى أن قواعد الحمض النووي نونبولار، بما في ذلك 5mC وتعديل 5hmC السيتوزين، مخفية داخل مركز الحلزون50الحمض النووي المزدوج-الذين تقطعت بهم السبل، وتتطلب فضحه. هذا تنطوي على تحديات خاصة في التحضير النسيجي المجمدة، التي قد تفقد بسرعة منظمة إعلامية من الأنسجة الأصلية عندما يتم تطبيق معاملة قاسية.

الشبكية الماوس نموذج ممتاز تشريح مساهمة مثلايشن الحمض النووي للتنمية العصبية والتوازن بوستميتوتيك. لا يوجد سوى 6 أنواع من الخلايا العصبية (فوتوريسيبتورس رود والمخروط، أماكريني، القطبين، خلايا العقدة وأفقي)، نوع واحد من الخلايا الدبقية (إطلاق مولر) وواحد نيوروبيثيليال الخلية النوع (ظهارة صباغ الشبكية)51. وأبلغ أنواع الخلايا الشبكية أنماط متميزة من الحمض النووي مثلايشن18،19، التي درست مؤخرا في قرار واحد-قاعدة1،5،9،12. ونحن مؤخرا ذكرت التطبيق إيمونوهيستوتشيميستري لتحديد نمط التوزيع داخل نواة خلايا الشبكية وتغيرات في نواة الشبكية الماوس الكبار، حيث تم إزالة جميع ميثيلترانسفيراسيس الحمض النووي الثلاثة باستهداف الشرطي 5mC 7-مقارنة بعدد من التقارير، حيث وجود مثلايشن الحمض النووي في خلايا الشبكية ويمكن اعتبار فقط إيجابية أو إشارة سلبية في هايبرميثيلاتيد الخلايا المبرمج تمر، تمكين النهج الذي نتبعه كشف الكروماتين محددة الترتيب داخل نواة الخلية الشبكية، التي نحن والعديد من المجموعات ذكرت ونوقش في وقت سابق5،،من67،18،،من1936 , 52-وهنا، يمكننا وصف تقنية المناعي (المدينة) للكشف عن 5mC و 5hmC في المجمدة مقاطع نسيجية بارافورمالدهيد--الثابتة في التفاصيل، فضلا عن إثبات البيانات التي كنا قادرين على إنتاج من تقريرنا الأصلي7 .

Protocol

وأجريت جميع الإجراءات مع الفئران وفقا لبروتوكولات وافق عليها مستشفى أوكلاند معهد بحوث الحيوان الرعاية واستخدام اللجنة الأطفال والتقيد برابطة البحوث في بيان الرؤية و "طب العيون" (آرفو) لاستخدام للحيوانات في العيون والرؤية للبحث.

1-الأنسجة التحضير إيمونوستاينينج

  1. Euthanize فئران C57 BL/6J في يوم الجنينية (ه) 16، يوم بعد الولادة (ف) 0, P15 و P90 بثاني أكسيد الكربون (CO2) متبوعاً بقطع الرأس (الفئران E16 و P0).
  2. عيون الفأر فورا انوكليتي ثقب بإبرة 29 1/2 في الجهة الظهرية من العين. احتضان لمدة 5 دقائق (دقيقة) في 1 مل من 4% بارافورمالدهيد (PFA) في المحلول الملحي مخزنة الفوسفات (1 x PBS) pH 8.0 في درجة حرارة الغرفة.
  3. جعل الكؤوس العين من P0, P15 و P90، تشريح خارج القرنية والعدسة مع مقص العيون الجميلة في حين العيون في 4% منهاج عمل بيجين.
    ملاحظة: تخطي هذه الخطوة لعيون E16 كالعيون صغيرة جداً.
  4. إصلاح العين الكؤوس (P0 و P15 و P90) وعيون كله (E16) في 4% منهاج العمل لمدة 20 دقيقة في درجة حرارة الغرفة. ثم يغسل الكؤوس العين والعيون كلها مرتين في 1 مل من س 1 برنامج تلفزيوني لمدة 10 دقائق في درجة حرارة الغرفة.
  5. كريوبروتيكت العين كوب وعيون كله في 1xPBS، pH 8.0 تحتوي على السكروز 10% لمدة ساعة واحدة. الاحتفاظ في السكروز 20% في 1 x برنامج تلفزيوني لمدة ساعة واحدة وتشبع ثم في السكروز 30% في برنامج تلفزيوني س 1 بين عشية وضحاها في 4 درجات مئوية.
  6. في اليوم التالي، تضمين الكؤوس العين والعيون كلها الأمثل خفض درجة الحرارة مجمع (OCT)، (500 ميليلتر) في كريومولدس وتجميد المفاجئة في حمام الثلج الجاف/إيثانول، وتخزينها في-80 درجة مئوية.
  7. إزالة القوالب مع الكؤوس العين جزءا لا يتجزأ وعيون كل من-80 درجة مئوية، والسماح لحجته إلى-20 درجة مئوية لمدة ساعة واحدة قبل كريوسيكتيونينج.
  8. قطع المقاطع العرضية الشبكية (12 ميكرومتر سميكة) موازية للمحور تيمبوروناسال عن طريق رأس العصب البصري باستخدام كريوستات في-20 درجة مئوية.
  9. تحميل المقاطع الشبكية على شرائح المجهر53 ومخزن في-80 درجة مئوية.

2-إيمونوستاينينج مع الأجسام المضادة 5 mC و 5-مؤسسة حمد الطبية

  1. تطويق المقاطع الشبكية التي شنت على الشرائح بقلم حاجز مسعور. القلم حاجز الماء يقلل حجم الأجسام المضادة المطلوبة لوصمة عار في الأنسجة.
  2. تغسل أجزاء الشبكية مرة واحدة مع 200 ميليلتر 1 x برنامج تلفزيوني لمدة 10 دقائق.
  3. بيرميبيليزي المقاطع الشبكية مع 200 ميليلتر من 0.1% X-100 تريتون في 1 x برنامج تلفزيوني (برنامج تلفزيوني-تي) لمدة 10 دقائق في درجة حرارة الغرفة.
  4. تؤذي المقاطع الشبكية لمدة 30 دقيقة مع 200 ميليلتر من طازجة 2 حمض الهيدروكلوريك (HCl) ن في س 1 برنامج تلفزيوني في حاضنة 37 درجة مئوية.
    ملاحظة: مطلوب معايرة دقيق المعاملة HCl لتحسين إشارة 5mC.
  5. وتشمل دائماً replicates البيولوجية (3-4) حين الأمثل 5mC إشارة54.
    ملاحظة: قمنا باسترجاع مستضد في 4 نقاط زمنية (15 دقيقة، 30 دقيقة، ح 1 وح 2) والحضانة وجدت 30 دقيقة الأمثل لإشارة 5mC. حضانة أطول مع HCl يحط هيكل النوى مما يؤدي إلى عدم القدرة على ترجمة 5mC إشارة إلى النواة.
  6. بعد تمسخ، تحييد المقاطع الشبكية بإضافة 100 ميليلتر من 0.1 متر تريس-HCl (pH 8.3) في أقسام الشبكية لمدة 10 دقائق.
  7. احتضان الفروع في 500 ميليلتر من عرقلة الحل (مصل الماعز العادية بريمن 5% في 0.1% X-100 تريتون في برنامج تلفزيوني 1 x) عن ح 1 في درجة حرارة الغرفة في غرفة رطوبة.
  8. وبعد تجميد، إضافة مكافحة--5mC؛ الأجسام المضادة 5hmC المخفف 1: 500 في عرقلة حل للمقاطع الشبكية.
  9. احتضان الشبكية المقاطع بين عشية وضحاها في 4 درجات مئوية في دائرة الرطوبة.
  10. الغسيل اليوم التالي، المقاطع الشبكية 3 مرات (10-15 دقيقة في كل مرة) مع 0.1% PBS-T واحتضان ثم في عرقلة الحل مع الأجسام المضادة الثانوية المقابلة (الماعز المضادة الأرانب والماعز الماوس المضادة مفتش، تضعف؛ 1: 1000)، التي تحتوي على DAPI (4 ', 6- دياميدينو-2-فينيليندولي) الحل (1 ميكروغرام/مل) في درجة حرارة الغرفة ح 1 في عرقلة الحل.
    ملاحظة: تجنب تجفيف الأقسام خلال جميع مراحل إيمونوديتيكشن.
  11. يغسل الشرائح الوقت الثلاثة مع 1 مل من 0.1% برنامج تلفزيوني-ت.
  12. بعد الغسيل الأخير، جبل المقاطع مع المتوسطة تصاعد مائي تحت ساترة وختم مع طلاء الأظافر عديم اللون.

3-[كنفوكل] إيمونوهيستوتشيميستري

  1. توجيه الفروع أن يكون الجانب ظهارة صباغ الشبكية كأس البصرية دائماً تواجه طريقة واحدة (مثلاً أعلى) للاتساق.
  2. تنفيذ التقاط الصورة إيمونوستينيد الشبكية أقسام في 63 X (التكبير عدسة الهدف) مع 2 X أو 3 X التكبير.
  3. إنشاء عدة مقاطع بصرية لكل صورة مختارة (z-مكدسات) في جميع القنوات 3 (الأحمر والأخضر والأزرق RGB) استخدام 0.35 ميكرومتر خطوة.
    ملاحظة: التكبير النهائي من عينة تصور في العاشر 10-20 (التكبير عدسة الهدف) سيكون 63 X، على التوالي، عندما جنبا إلى جنب مع 10x (تستخدم عادة) في عدسة العين.
    تصور مضغوطة مكدس البصرية لتحديد موقع إشارة 5mC و 5hmC

Representative Results

لتحديد توزيع 5-ميثيلسيتوسيني (5mC) و 5-هيدروكسيميثيلسيتوسيني (5hmC) أثناء التنمية الشبكية وفي شبكية العين بوستميتوتيك، ونحن إيمونوستاينيد C57BL/6J الماوس الشبكية قسم من E16 و P15 و P0 P90 مع الأجسام المضادة المحددة إلى 5mC و 5hmC.

في E16 تلطيخ 5mC كان قويا في تشروموسينتيرس نواة الخلية بينما تلطيخ ضعيفا ولوحظ في نواة خلية كاملة (الشكل 1a). 5hmC تلطيخ مقتصرة على نواة الخلية وكان غائبا من تشروموسينتيرس (الشكل 1b).

في P0 الشبكية، وكان المترجمة إشارة 5mC إلى تشروموسينتيرس من نواة الخلية وهامش النووي (الشكل 2aوالسهم ورأس السهم). كما لاحظنا تلطيخ ضعيفة من 5mC بين تشروموسينتيرس نواة الخلية. إشارة 5hmC كان حاضرا بقوة في نواة الخلية باستثناء تشروموسينتيرس (الشكل 2). وجدنا أنوية أكثر ملطخة ب 5mC و 5hmC في طبقة نيوروبلاست الداخلية (إينبل) (الشكل 2 ج، الخط المنقط)

في P15 الشبكية، وجدنا تلطيخ قوية 5mC و 5hmC في الطبقة الخارجية النووية (ONL) والطبقة النووية الداخلية (المكتب) وطبقة خلايا العقدة (جكل) (الشكل 3). في ONL (فوتوريسيبتورس رود)، كانت إشارة 5mC موجودة في تشروموسينتيرس لنواة الخلية وهامش النووي (الأرقام 3a-3 ج، والجيل الثالث 3g). تم العثور على إشارة 5hmC في نواة خلية كاملة باستثناء تشروموسينتيرس (الأرقام 3d-3f). مجهر إلكتروني على الشبكية P15 يبين التوزيع للمجالات هيتيروتشروماتيك في نواة الخلية رود مشابهة لتلك الموجودة مع إشارة جسم 5mC (ح 3 أرقام و 3i).

تلطيخ 5mC في المكتب وجكل قوية في تشروموسينتيرس نواة الخلية وتلطيخ ضعيفة وقد لوحظ أيضا في نواة خلية كاملة (الأرقام 3j-3 لتر و 3r-3t). خلافا 5mC، وكان المترجمة إشارة 5hmC إلى نواة الخلية كلها باستثناء تشروموسينتيرس في المكتب وجكل (الأرقام م 3-3o و 3 وات 3u). لاحظنا قوية إشارة 5hmC على هامش جكل نواة الخلية.

في فوتوريسيبتورس رود الكبار، اقتصر إشارة 5mC تشروموسينتير وهامش النووي لنواة الخلية (الأرقام 4a-4 ج) بينما يقتصر إشارة 5hmc على هامش النووي (د 4 أرقام-4f).

Figure 1
الشكل 1. ترجمة 5-ميثيلسيتوسيني و 5-هيدروكسيميثيلسيتوسيني في الشبكية الماوس في الجنينية يوم 16.
إيمونوستينينج C57BL/6J الشبكية مع الأجسام المضادة إلى 5mC (الأحمر، أ) و 5hmC (الخضراء، ب). في E16، 5mC إشارة قوية جداً في تشروموسينتيرس نواة الخلية وأيضا موجودة في نواة خلية كاملة في مستوى أدنى بكثير. تلطيخ 5hmC يقتصر حصرا على نواة الخلية. ويمثل الفريق ج 5mC المدمجة والصورة 5hmC. هي نواة كونتيرستينيد مع DAPI (الأزرق، ج). وتمثل insets تكبير منطقة سيظهر مع العلامة النجمية في الصور. شريط الحجم: 5 ميكرومتر. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

Figure 2
الرقم 2. المناعي تلطيخ 5-ميثيلسيتوسيني وهيدروكسيميثيلسيتوسيني 5 في الشبكية الماوس في يوم الولادة 0.
إيمونولابيلينج C57BL/6J الشبكية مع الأجسام المضادة إلى 5mC (الأحمر، أ) و 5hmC (الخضراء، ب). في P0 الشبكية، 5mC و 5hmC موجودة في طبقة نيوروبلاست الخارجي (أونبل) وطبقة نيوروبلاست الداخلية (إينبل). أ) إشارة 5mC موجود بقوة في تشروموسينتيرس (سهم) وهامش النووي لنواة الخلية (رأس السهم). ويلاحظ أيضا تلطيخ ضعيفة من 5mC ما بين تشروموسينتيرس نواة الخلية. ب) تلطيخ 5hmC يقتصر على نواة الخلية، ويلاحظ إشارة قوية في إينبل (الخط المنقط في لوحة ج). ويمثل الفريق ج 5mC المدمجة والصورة 5hmC. هي نواة كونتيرستينيد مع DAPI (الأزرق، ج). وتمثل insets تكبير منطقة سيظهر مع العلامة النجمية في الصور. شريط الحجم: 5 ميكرومتر. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

Figure 3
الشكل 3. 5-ميثيلسيتوسيني 5-هيدروكسيميثيلسيتوسيني التوزيع وفي الشبكية الماوس عند الولادة يوم 15.
إيمونوستينينج C57BL/6J الشبكية مع الأجسام المضادة--5mC و 5hmC (-ز، ي ص). في الطبقة الخارجية النووية (ONL) (فوتوريسيبتورس رود)، إشارة 5mC (أ) عادة ما يتزامن مع تشروموسينتيرس نواة الخلية (رأس السهم، ب) الأحمر، وأيضا يموضع على هامش النووي (سهم، ب). لوحة ب (أحمر) وجيم (رمادي) تمثل تكبير منطقة سيظهر مع العلامة النجمية في الصورة. إشارة 5hmC (الخضراء، د) تقتصر على نواة خلية كاملة باستثناء تشروموسينتيرس. ه الفريق (الأخضر) و (الرمادي) و تمثل تكبير منطقة سيظهر مع العلامة النجمية في دال صورة لوحة تمثل ز 5mC المدمجة والصورة 5hmC. هي نواة كونتيرستاينيد مع DAPI. لوحة ح، وانتقال المجهر الإلكتروني صورة نويات مستقبله في يوم الولادة 15 تبين توزيع المجالات هيتيروتشروماتيك. السهم الأسود في ح الفريق يشير إلى قضيب واحد مستقبله نواة توسيعه في الفريق الأول-رؤوس الأسهم الحمراء في لوحة وأشير إلى مجالات heterochromatic داخل نواة مستقبله رود بينما الأسهم الحمراء تشير إلى هيتيروتشروماتين في محيط النووية. في المكتب (ي-س) ونواة الخلية جكل (ص ص)، إشارة 5mC (أحمر) هو مترجم إلى تشروموسينتيرس الموجودة في المحيط وتلطيخ ضعف الكشف عن كما في بقية نواة الخلية. لوحة ك (أحمر) وأنا (رمادي) تمثل تكبير منطقة سيظهر مع العلامة النجمية في ي الصورة. (الأخضر) تلطيخ 5hmC في نواة الخلية المكتب وجكل تقتصر على نواة الخلية كلها. ملاحظة تلطيخ 5hmC قوية في محيط الخلايا جكل النووية. ف الفريق و x تمثل 5mC المدمجة والصورة 5hmC بينما تمثل لوحة س وص تكبير منطقة سيظهر مع العلامة النجمية في الصورة ف والعاشر على التوالي. هي نواة كونتيرستينيد مع DAPI. شريط الحجم: 5 ميكرومتر. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

Figure 4
الشكل 4. 5-ميثيلسيتوسيني 5-هيدروكسيميثيلسيتوسيني التوزيع وفي نويات مستقبله رود C57BL/6J الماوس الشبكية في يوم الولادة 90.
تلطيخ 5mC (أحمر،) موجود بقوة في تشروموسينتير في نواة الخلية وأيضا الحاضر ضعيفة في محيط النووية. لوحة ب (أحمر) وجيم (رمادي) تمثل تكبير منطقة سيظهر مع العلامة النجمية في الصورة. تلطيخ 5hmC (الخضراء، د) يقتصر حصرا على هامش النووي ه الفريق (الأخضر)، والتكبير و (رمادي) تمثل منطقة سيظهر مع العلامة النجمية في دال صورة الفريق يمثل ز 5mC المدمجة والصورة 5hmC مع الفريق ح التكبير للمنطقة التي تظهر مع النجمة في الصورة هي كونتيرستاينيد نوى زاي مع DAPI (أزرق). شريط الحجم: 5 ميكرومتر. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

Discussion

مثلايشن الحمض النووي وهيدروكسيميثيليشن هي دينامية وعكسها الحمض النووي التعديلات، التي مودولاتيثي مجموعة متنوعة من الآليات البيولوجية في دولة نامية، وكذلك كما هو الحال في الخلايا بوستميتوتيك. هنا، يمكننا وصف أسلوب استنساخه للكشف عن 5mC و 5hmC الحمض النووي إجراء تعديلات في الموقع بتقنية المناعي (باستخدام الأجسام المضادة 5mC ومكافحة--5hmC) في الأجزاء المجمدة ثابتة بارافورمالدهيد الشبكية الماوس، وتوفير المبادئ التوجيهية لتحسين وتوحيد النتائج، خاصة عند مقارنة عينات مختلفة عدة. أننا في وقت سابق تستخدم هذا الأسلوب لتحديد التغييرات 5mC في الشبكية الماوس مع استهداف الشبكية الخاصة Dnmt1و Dnmt3a و Dnmt3b الحمض النووي ميثيلترانسفيراسي الجينات، وأبلغ الاستنفاد (المتوقع) لعلامات 5mC في شبكية العين على7 .

أن الخطوة الحاسمة في الكشف المناعي 5mC هو الأمثل لعلاج أقسام نسيجية مع HCl: أقل من 15 دقيقة المعالجة المسبقة لا يتوقع أن تسفر عن نتائج استنساخه، بينما يدمر العلاج المفرط مع قائمة توافق الأجهزة النووية الهندسة المعمارية. وجدنا أفضل نتيجة بعد الاحتضان 30 دقيقة مع HCl. نوصي باستخدام دائماً HCl المخفف الطازج وحل منهاج العمل 4% تقدم طازجة للحمض النووي تمسخ والشبكية تثبيت الأنسجة.

لاستكشاف الأخطاء وإصلاحها النتائج، نوصي لتشمل ثلاثة أو أربعة replicates البيولوجية حين الأمثل لإشارة 5mC. في حين تعيين كل فرد من المناعي تلطيخ قد تولد نتائج مختلفة قليلاً (مناطق heterochromatic مشرقة أكثر أو أقل)، الذي من المتوقع في توزيع المناعي النووية الأسلوب، و 5mC و 5hmC ضمن مجموعة فردية المقاطع من المتوقع أن تكون الغاية استنساخه، لطالما يتم اتباع البروتوكول.

هذا الأسلوب أيضا لديه الحد كما لاحظنا استمرار التفاوت في توزيع 5mC في نواة خلية مستقبله داخل نفس القسم. وجدنا بعض الأنوية أظهر إشارة قوية 5mC في حين أظهرت نواة الخلية المجاورة لا توجد إشارة 5mC. هذا سبب القيد في تعرية مستضد 5mC بمعاملة HCl في الأجزاء المجمدة.

أهمية هذا الأسلوب يتيح التعريب 5mC دون علاج ك الدناز وبروتيناز مما يؤدي إلى المحافظة على أفضل من تشروموسينتيرس. يعد هذا الأسلوب المتوقع للعمل بقوة على أي مقاطع من جميع الأنسجة الحيوانية الفقارية، 5mC تحمل علامات 5hmC، والمجهزة بنهج مماثل، ليس فقط الماوس الشبكية، لطالما يتم اتباع البروتوكول.

Disclosures

الكتاب ليس لها علاقة بالكشف عن.

Acknowledgments

وأيد هذا العمل بمنحه SBIR (1R44EY027654-01A1).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Supplies
29G1/2 ULTRA-FINE BD Biosciences 329461
Ophthalmic scissor Fine Science tools, Inc.  15000-03
PAP pen RPICORP.com 195505
Microslide Superfrost plus VWR 48311-703
Reagent
Paraformaldehyde Electron Microscope Science 15710
1x PBS Corning 21-031-CV
Sucrose Sigma S9378
Tissue-Tek Optical cutting compound (OCT) VWR 4583
Triton X 100 Sigma T9284
6 N HCl VWR analytical  BDH7204-1
Tris-HCl pH 8.3 Teknova T1083
Goat serum Jackson Immunoresearch 005-000-121
5mC Genway Biotech  GWB-BD5190
5hmC Active Motif 39791
LaminB1 Abcam Ab16048
Cy2 AffiniPure Goat Ant-Rabbit IgG Jackson Immunoresearch 111-225-1444
Cy3 AffiniPure Goat Ant-Mouse IgG Jackson Immunoresearch 115-585-166
DAPI Thermo Fisher Scientific D1306
Prolong Gold Antifade medium Thermo Fisher Scientific P36930
Equipment
MICRM HM 550 Thermo Fisher Scientific 388114
Confocal microscope Zeiss

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Merbs, S. L., et al. Cell-specific DNA methylation patterns of retina-specific genes. PLoS One. 7 (3), e32602 (2012).
  2. Nasonkin, I. O., et al. Conditional knockdown of DNA methyltransferase 1 reveals a key role of retinal pigment epithelium integrity in photoreceptor outer segment morphogenesis. Development. 140 (6), 1330-1341 (2013).
  3. Rhee, K. D., Yu, J., Zhao, C. Y., Fan, G., Yang, X. J. Dnmt1-dependent DNA methylation is essential for photoreceptor terminal differentiation and retinal neuron survival. Cell Death & Disease. 3, e427 (2012).
  4. Wahlin, K. J., et al. Epigenetics and cell death: DNA hypermethylation in programmed retinal cell death. PLoS One. 8 (11), e79140 (2013).
  5. Aldiri, I., et al. The Dynamic Epigenetic Landscape of the Retina During Development, Reprogramming, and Tumorigenesis. Neuron. 94 (3), 550-568 (2017).
  6. Eberhart, A., et al. Epigenetics of eu- and heterochromatin in inverted and conventional nuclei from mouse retina. Chromosome Research. 21 (5), 535-554 (2013).
  7. Singh, R. K., et al. Dnmt3a and Dnmt3b cooperate in photoreceptor and outer plexiform layer development in the mammalian retina. Experimental Eye Research. 159, 132-146 (2017).
  8. Farinelli, P., et al. DNA methylation and differential gene regulation in photoreceptor cell death. Cell Death & Disease. 5, e1558 (2014).
  9. Mo, A., et al. Epigenomic landscapes of retinal rods and cones. Elife. 5, e11613 (2016).
  10. Popova, E. Y., Barnstable, C. J., Zhang, S. S. Cell type-specific epigenetic signatures accompany late stages of mouse retina development. Advances in Experimental Medicine and Biology. 801, 3-8 (2014).
  11. Kim, J. W., et al. NRL-Regulated Transcriptome Dynamics of Developing Rod Photoreceptors. Cell Reports. 17 (9), 2460-2473 (2016).
  12. Wang, L., et al. Retinal Cell Type DNA Methylation and Histone Modifications Predict Reprogramming Efficiency and Retinogenesis in 3D Organoid Cultures. Cell Reports. 22 (10), 2601-2614 (2018).
  13. Perera, A., et al. TET3 is recruited by REST for context-specific hydroxymethylation and induction of gene expression. Cell Reports. 11 (2), 283-294 (2015).
  14. Mimura, I., et al. Dynamic change of chromatin conformation in response to hypoxia enhances the expression of GLUT3 (SLC2A3) by cooperative interaction of hypoxia-inducible factor 1 and KDM3A. Molecular and Cellular Biology. 32 (15), 3018-3032 (2012).
  15. Nair, N., Shoaib, M., Sorensen, C. S. Chromatin Dynamics in Genome Stability: Roles in Suppressing Endogenous DNA Damage and Facilitating DNA Repair. Int J Mol Sci. 18 (7), (2017).
  16. Mekhail, K., Moazed, D. The nuclear envelope in genome organization, expression and stability. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 11 (5), 317-328 (2010).
  17. Misteli, T., Soutoglou, E. The emerging role of nuclear architecture in DNA repair and genome maintenance. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 10 (4), 243-254 (2009).
  18. Solovei, I., et al. Nuclear architecture of rod photoreceptor cells adapts to vision in mammalian evolution. Cell. 137 (2), 356-368 (2009).
  19. Solovei, I., et al. LBR and lamin A/C sequentially tether peripheral heterochromatin and inversely regulate differentiation. Cell. 152 (3), 584-598 (2013).
  20. Solovei, I., Thanisch, K., Feodorova, Y. How to rule the nucleus: divide et impera. Current Opinion in Cell Biology. 40, 47-59 (2016).
  21. Jaenisch, R., Bird, A. Epigenetic regulation of gene expression: how the genome integrates intrinsic and environmental signals. Nature Genetics. 33, Suppl . 245-254 (2003).
  22. Cross, S. H., Charlton, J. A., Nan, X., Bird, A. P. Purification of CpG islands using a methylated DNA binding column. Nature Genetics. 6 (3), 236-244 (1994).
  23. Antequera, F., Bird, A. Number of CpG islands and genes in human and mouse. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 90 (24), 11995-11999 (1993).
  24. Antequera, F., Boyes, J., Bird, A. High levels of de novo methylation and altered chromatin structure at CpG islands in cell lines. Cell. 62 (3), 503-514 (1990).
  25. Fouse, S. D., et al. Promoter CpG methylation contributes to ES cell gene regulation in parallel with. Oct4/Nanog, PcG complex, and histone H3 K4/K27 trimethylation. Cell Stem Cell. 2 (2), 160-169 (2008).
  26. Elango, N., Yi, S. V. DNA methylation and structural and functional bimodality of vertebrate promoters. Molecular Biology and Evolution. 25 (8), 1602-1608 (2008).
  27. Lister, R., et al. Global epigenomic reconfiguration during mammalian brain development. Science. 341 (6146), 1237905 (2013).
  28. Colwell, M., et al. Evolutionary conservation of DNA methylation in CpG sites within ultraconserved noncoding elements. Epigenetics. 13 (1), 49-60 (2018).
  29. Lee, S. M., et al. Intragenic CpG islands play important roles in bivalent chromatin assembly of developmental genes. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 114 (10), E1885-E1894 (2017).
  30. Charlet, J., et al. Bivalent Regions of Cytosine Methylation and H3K27 Acetylation Suggest an Active Role for DNA Methylation at Enhancers. Molecular Cell. 62 (3), 422-431 (2016).
  31. Bernhart, S. H., et al. Changes of bivalent chromatin coincide with increased expression of developmental genes in cancer. Scientific Reports. 6, 37393 (2016).
  32. Curry, E., et al. Genes Predisposed to DNA Hypermethylation during Acquired Resistance to Chemotherapy Are Identified in Ovarian Tumors by Bivalent Chromatin Domains at Initial Diagnosis. Cancer Research. 78 (6), 1383-1391 (2018).
  33. Rakyan, V. K., et al. Human aging-associated DNA hypermethylation occurs preferentially at bivalent chromatin domains. Genome Research. 20 (4), 434-439 (2010).
  34. Smith, Z. D., Meissner, A. DNA methylation: roles in mammalian development. Nature Reviews Genetics. 14 (3), 204-220 (2013).
  35. Chen, T., Li, E. Structure and function of eukaryotic DNA methyltransferases. Current Topics in Developmental Biology. 60, 55-89 (2004).
  36. Nasonkin, I. O., et al. Distinct nuclear localization patterns of DNA methyltransferases in developing and mature mammalian retina. The Journal of Comparative Neurology. 519 (10), 1914-1930 (2011).
  37. Scourzic, L., Mouly, E., Bernard, O. A. TET proteins and the control of cytosine demethylation in cancer. Genome Medicine. 7 (1), 9 (2015).
  38. Gong, Z., Zhu, J. K. Active DNA demethylation by oxidation and repair. Cell Research. 21 (12), 1649-1651 (2011).
  39. Ito, S., et al. Tet proteins can convert 5-methylcytosine to 5-formylcytosine and 5-carboxylcytosine. Science. 333 (6047), 1300-1303 (2011).
  40. Pastor, W. A., et al. Genome-wide mapping of 5-hydroxymethylcytosine in embryonic stem cells. Nature. 473 (7347), 394-397 (2011).
  41. Suzuki, M. M., Bird, A. DNA methylation landscapes: provocative insights from epigenomics. Nature Reviews Genetics. 9 (6), 465-476 (2008).
  42. Kurdyukov, S., Bullock, M. DNA Methylation Analysis: Choosing the Right Method. Biology (Basel). 5 (1), (2016).
  43. Lisanti, S., et al. Comparison of methods for quantification of global DNA methylation in human cells and tissues). PLoS One. 8 (11), e79044 (2013).
  44. Armstrong, K. M., et al. Global DNA methylation measurement by HPLC using low amounts of DNA. Biotechnology Journal. 6 (1), 113-117 (2011).
  45. consortium, B. Quantitative comparison of DNA methylation assays for biomarker development and clinical applications. Nature Biotechnology. 34 (7), 726-737 (2016).
  46. Bock, C., et al. Quantitative comparison of genome-wide DNA methylation mapping technologies. Nature Biotechnology. 28 (10), 1106-1114 (2010).
  47. Song, C. X., He, C. The hunt for 5-hydroxymethylcytosine: the sixth base. Epigenomics. 3 (5), 521-523 (2011).
  48. Abakir, A., Wheldon, L., Johnson, A. D., Laurent, P., Ruzov, A. Detection of Modified Forms of Cytosine Using Sensitive Immunohistochemistry. Journal of Visualized Experiments. (114), (2016).
  49. Santos, F., Dean, W. Using immunofluorescence to observe methylation changes in mammalian preimplantation embryos. Methods in Molecular Biology. 325, 129-137 (2006).
  50. Watson, J. D., Crick, F. H. The structure of DNA. Cold Spring Harbor Symposia on Quantitative Biology. 18, 123-131 (1953).
  51. Swaroop, A., Kim, D., Forrest, D. Transcriptional regulation of photoreceptor development and homeostasis in the mammalian retina. Nature Reviews Neuroscience. 11 (8), 563-576 (2010).
  52. Kizilyaprak, C., Spehner, D., Devys, D., Schultz, P. In vivo chromatin organization of mouse rod photoreceptors correlates with histone modifications. PLoS One. 5 (6), e11039 (2010).
  53. Singh, R. K., Kolandaivelu, S., Ramamurthy, V. Early alteration of retinal neurons in Aipl1-/- animals. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 55 (5), 3081-3092 (2014).
  54. Eberhart, A., Kimura, H., Leonhardt, H., Joffe, B., Solovei, I. Reliable detection of epigenetic histone marks and nuclear proteins in tissue cryosections. Chromosome Research. 20 (7), 849-858 (2012).

Tags

علم الأحياء التنموي، العدد 138، العين والصباغ ظهارة من العين، الشبكية، العمليات الكيميائية، والعمليات الكيميائية الحيوية، مثلايشن الحمض النووي، التشريح، أجهزة الإحساس، الظواهر والعمليات والظواهر الكيميائية، 5-ميثيلسيتوسيني، 5-هيدروكسيميثيلسيتوسيني، والشبكية ، التنمية، التخلق، مثلايشن الحمض النووي، الماوس، إيمونوهيستوتشيميستري، الكروماتين، نواة، وحمض الهيدروكلوريك، وتمسخ، مستقبله
الكشف المناعي 5-ميثيلسيتوسيني وهيدروكسيميثيلسيتوسيني 5 في تطوير والشبكية الماوس بوستميتوتيك
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Singh, R. K., Diaz, P. E., Binette,… More

Singh, R. K., Diaz, P. E., Binette, F., Nasonkin, I. O. Immunohistochemical Detection of 5-Methylcytosine and 5-Hydroxymethylcytosine in Developing and Postmitotic Mouse Retina. J. Vis. Exp. (138), e58274, doi:10.3791/58274 (2018).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter