Summary
इस रिपोर्ट का उद्देश्य epigenetic मार्करों, 5-methylcytosine (5mC) और 5-hydroxymethylcytosine (5hmC) के विकास और postmitotic माउस रेटिना के मजबूत immunohistochemical डिटेक्शन के लिए प्रोटोकॉल का वर्णन करना है ।
Abstract
रेटिना विकास के epigenetics एक अच्छी तरह से अध्ययन किया अनुसंधान क्षेत्र है, जो मानव रेटिना अपक्षयी रोगों की एक किस्म के तंत्र के बारे में समझने का एक नया स्तर लाने का वादा किया है और नए उपचार दृष्टिकोण तुच्छ है । माउस रेटिना के परमाणु वास्तुकला दो अलग पैटर्न में आयोजित किया जाता है: पारंपरिक और औंधा । पारंपरिक पैटर्न जहां heterochromatin नाभिक की परिधि के लिए स्थानीय है सार्वभौमिक है, जबकि सक्रिय euchromatin परमाणु इंटीरियर में रहता है । इसके विपरीत, उल्टे परमाणु पैटर्न वयस्क रॉड photoreceptor सेल नाभिक के लिए अद्वितीय है जहां heterochromatin परमाणु केंद्र को स्थानीयकरण, और euchromatin परमाणु परिधि में रहता है । डीएनए मिथाइल chromocenters में मुख्य रूप से मनाया जाता है । डीएनए मिथाइल cytosine अवशेषों पर एक गतिशील आबंध संशोधन है (5-methylcytosine, 5mC) CpG dinucleotides है कि कई जीन के प्रवर्तक क्षेत्रों में समृद्ध कर रहे हैं । तीन डीएनए methyltransferases (DNMT1, DNMT3A और DNMT3B) विकास के दौरान डीएनए के मिथाइल में भाग लेते हैं । immunohistochemical तकनीकों के साथ 5mC का पता लगाना बहुत चुनौतीपूर्ण है, परिणामों में परिवर्तनशीलता के लिए योगदान दे, के रूप में 5mC संशोधित कुर्सियां सहित सभी डीएनए कुर्सियां डबल फंसे डीएनए कुंडल के भीतर छिपा रहे हैं । हालांकि, विकास के दौरान 5mC वितरण के विस्तृत विरेखांकन बहुत जानकारीपूर्ण है । यहां, हम 5mC के मजबूत immunohistochemical पता लगाने के लिए एक reproducible तकनीक का वर्णन और एक और epigenetic डीएनए मार्कर 5-hydroxymethylcytosine (5hmC), जो "खुले" के साथ colocalizes, transcriptionally सक्रिय क्रोमेटिन के विकास में और postmitotic माउस रेटिना ।
Introduction
विकास के Epigenetic विनियमन और माउस रेटिना के postmitotic homeostasis अनुसंधान के एक रोमांचक क्षेत्र है, जो जैविक retinogenesis और सेल भाग्य दृढ़ संकल्प, सेल प्रकार के विशेष नियंत्रण तंत्र की एक उपंयास समझ लाने का वादा किया है चयापचय समारोह के रूप में अच्छी तरह से कोशिका विकृतियों, कोशिका मृत्यु और पुनर्जनन1,2,3,4,5,6,7,8 , 9 , 10 , 11 , 12 , 13. क्रोमेटिन विकास में गतिशील परिवर्तन, के रूप में अच्छी तरह के रूप में चर बाहरी संकेतों के जवाब में है कि क्या यह तनाव, चयापचय या कोशिका मृत्यु उत्तेजनाओं6,14,15, 16 , 17 , 18. माउस नाभिक में, क्रोमेटिन सक्रिय euchromatin और निष्क्रिय heterochromatin6,19,20में विभाजित है । चरण नाभिक में, euchromatin नाभिक के भीतरी क्षेत्र में रहता है जबकि heterochromatin लाइनों परमाणु परिधि और nucleolus । इस पद्धति को पारंपरिक कहा जाता है और eukaryotes में अत्यधिक संरक्षण किया जाता है । इसके विपरीत, रॉड नाभिक जैसे माउस और चूहे के रूप में रात जानवरों में उल्टे पैटर्न जहां नाभिक heterochromatin के सबसे बाहरी शैल6,18के गठन euchromatin से घिरा केंद्र में द्वारा कब्जा कर लिया है, 20। जंम के समय, रॉड नाभिक पारंपरिक परमाणु वास्तुकला है । रॉड नाभिक का उलटा पारंपरिक नाभिकीय वास्तुकला के पुनर्मॉडलिंग द्वारा विकास के दौरान होता है । इस प्रक्रिया के दौरान, परिधीय heterochromatin परमाणु परिधि से अलग है और chromocenters फ्यूज एक साथ नाभिक6,18के केंद्र में एक एकल chromocenter बनाने के लिए ।
जीनोमिक डीएनए मिथाइल स्थानीय क्रोमेटिन अनुरूपता को नियंत्रित करने में भाग लेता है21. डीएनए मिथाइल CpG dinucleotides के cytosine अवशेषों की 5 ' स्थिति में होता है कि माउस जीनोम में कई जीन के प्रवर्तक क्षेत्र में समृद्ध कर रहे है22,23,24,25,26 साथ ही intergenic और intron क्षेत्रों में, जो विनियामक तत्व27ले । समीपस्थ प्रवर्तकों में CpG द्वीपों का मिथाइल21,जीन बढ़ाने में24 और CpG अनुक्रम27,28 bivalent क्रोमेटिन की गतिशील स्थिति को विनियमित करने में महत्वपूर्ण है, जिसमें कई विकास जीन/प्रतिलेखन कारकों विकास, कैंसर और उंर बढ़ने में महत्वपूर्ण भूमिका निभा29,30,31,३२,३३,३४ . तीन डीएनए methyltransferases (DNMTs) माउस विकास३५के दौरान डीएनए मिथाइल में भाग लेते हैं । सभी तीन DNMTs माउस रेटिना विकास३६ और रेटिना के दौरान व्यक्त कर रहे है Dnmt जीन प्रभाव रेटिना विकास2,7में विशिष्ट परिवर्तन । Hydroxymethylcytosine (5hmC) 5-methylcytosine (5mC) का ऑक्सीडेटिव उत्पाद है । ३ १०-ग्यारह Translocation (TET) एंजाइमों में भाग लेने के 5mC३७,३८,३९। Hydroxymethyl-सी संशोधन प्रवर्तकों, जीन निकायों और जीन रिच और सक्रिय रूप से लिखित क्षेत्रों27,४०के भीतर intergenic जीनोमिक दृश्यों में समृद्ध है ।
वहां कोशिकाओं४१,४२,४३,४४,४५,४६में डीएनए मिथाइल पैटर्न बदलने का निर्धारण करने के लिए वर्णित दृष्टिकोण की एक किस्म है, उनमें से कुछ को सक्षम करने जबकि दूसरों के प्रवर्तकों और बढ़ाने के भीतर CpG-अमीर क्षेत्रों में सटीक परिवर्तन पर ध्यान केंद्रित कर डीएनए मिथाइल के वैश्विक परिवर्तन को बढ़ाता है । 5hmC का पता लगाने और ठहराव के लिए विधियां भी४७बताया गया था, सहित immunohistochemistry13। Immunohistochemical तकनीक है, जो विकासशील और postmitotic कोशिकाओं के नाभिक में 5mC और 5hmC परिवर्तन की मजबूत निगरानी सक्षम, बहुत बाह्य या आंतरिक परिवर्तन के जवाब में सीटू में delineating क्रोमेटिन गतिशीलता के लिए जानकारीपूर्ण रहे हैं कोशिकाओं को प्रभावित4,13,४८,४९. हालांकि, इस दृष्टिकोण के लिए डीएनए मिथाइल और hydroxymethylation तकनीकी कठिनाइयों के कारण परिवर्तन का आकलन करने के लिए प्रवण है, ऊतकवैज्ञानिक तैयारियों में cytosine संशोधनों का पता लगाने के साथ जुड़े । इसका कारण यह है कि 5mC और 5hmC सहित गैर-ध्रुवीय डीएनए कुर्सियां, संशोधित cytosine, डबल फंसे डीएनए कुंडलित५०के केंद्र के भीतर छिपा रहे हैं, और बेपर्दा की आवश्यकता है । यह विशेष रूप से जमे हुए ऊतकवैज्ञानिक की तैयारी में चुनौतीपूर्ण है, जो तेजी से मूल ऊतक के जानकारीपूर्ण संगठन खो जब कठोर उपचार लागू किया जाता है हो सकता है ।
माउस रेटिना के तंत्रिका विकास और postmitotic homeostasis करने के लिए डीएनए मिथाइल के योगदान को काटना करने के लिए एक उत्कृष्ट मॉडल है । न्यूरॉन्स के केवल 6 प्रकार के होते हैं (रॉड और शंकु photoreceptors, amacrine, द्विध्रुवी, क्षैतिज और नाड़ीग्रंथि कोशिकाओं), एक glial सेल प्रकार (मुलर glia) और एक neuroepithelial कोशिका प्रकार (रेटिना वर्णक उपकला)५१. रेटिना सेल प्रकार डीएनए मिथाइल18,19, जो हाल ही में एकल आधार संकल्प1,5,9,12पर अध्ययन किया गया है के विशिष्ट पैटर्न है करने के लिए सूचित किया गया । हमने हाल ही में रेटिना कोशिकाओं के नाभिक के भीतर वितरण का 5mC पैटर्न delineating करने के लिए immunohistochemistry आवेदन की सूचना दी और वयस्क माउस रेटिना की नाभिक में परिवर्तन, जहां सभी तीन डीएनए methyltransferases सशर्त लक्ष्यीकरण द्वारा हटा दिया गया है 7. रिपोर्ट की एक संख्या की तुलना में, जहां रेटिना कोशिकाओं में डीएनए मिथाइल की उपस्थिति apoptosis के दौर से गुजर hypermethylated कोशिकाओं में केवल एक सकारात्मक या नकारात्मक संकेत के रूप में देखा जा सकता है, हमारे दृष्टिकोण विशिष्ट क्रोमेटिन का पता लगाने सक्षम रेटिना सेल नाभिक के भीतर व्यवस्था, जो हम और कई समूहों की सूचना दी और पहले चर्चा की5,6,7,18,19,३६ , ५२. यहां, हम immunohistochemical (आइएचसी) का पता लगाने की तकनीक का वर्णन 5mC और जमे हुए paraformaldehyde में 5hmC-फिक्स्ड ऊतकवैज्ञानिक वर्गों के रूप में के रूप में अच्छी तरह से डेटा है, जो हम अपने मूल 7 रिपोर्ट से पुन: पेश करने में सक्षम थे प्रदर्शन .
Protocol
चूहों के साथ सभी प्रक्रियाओं बच्चों के अस्पताल ऑकलैंड अनुसंधान संस्थान पशु देखभाल और उपयोग समिति द्वारा अनुमोदित प्रोटोकॉल के अनुसार प्रदर्शन किया और दृष्टि और नेत्र विज्ञान (ARVO) में अनुसंधान के लिए संघ का पालन करने के लिए उपयोग के लिए विवरण नेत्र और विजन रिसर्च में जानवरों की.
1. Immunostaining के लिए ऊतक तैयार करना
- Euthanize C57 बीएल/6J चूहों पर भ्रूण दिवस (ई) 16, जन्मोत्तर दिवस (पी) 0, P15 और P90 द्वारा कार्बन डाइऑक्साइड (CO2) द्वारा पीछा किया decapitation (E16 और P0 चूहों) ।
- तुरंत enucleate माउस आंखें आंख के पृष्ठीय पक्ष पर 29G1/2 सुई के साथ पंचर । 5 मिनट के लिए मशीन (ंयूनतम) 1 मिलीलीटर में 4% paraformaldehyde (पीएफए) फॉस्फेट में बफर खारा (1x पंजाब) पीएच ८.० कमरे के तापमान पर ।
- P0, P15 और P90 से आंख कप बनाने के लिए, बाहर काटना कॉर्निया और ठीक नेत्र कैंची के साथ लेंस जबकि आंखें 4% पीएफए में हैं ।
नोट: E16 आंखों के लिए इस कदम को छोड़ के रूप में आंखें बहुत छोटी हैं । - आंख के कप (P0, P15 और P90) और पूरी आंखें (E16) 4% पीएफए में कमरे के तापमान पर 20 मिनट के लिए ठीक करें । फिर कमरे के तापमान पर 10 मिनट के लिए 1x पंजाब के 1 मिलीलीटर में आंख कप और पूरी आंखों को दो बार धो लें ।
- 1xPBS में आई कप और पूरी आंखों को Cryoprotect, पीएच ८.० 1 घंटे के लिए 10% सुक्रोज युक्त । 1 घंटे के लिए 1x पंजाब में 20% सुक्रोज में रखें और फिर 4 डिग्री सेल्सियस पर रात में 1x पंजाब में 30% सुक्रोज में संतृप्त ।
- अगले दिन, आंख कप और इष्टतम काटने तापमान यौगिक (OCT), (५०० µ l) cryomolds में, स्नैप-फ़्री में एक सूखी बर्फ/इथेनॉल स्नान, और स्टोर-८० डिग्री सेल्सियस में पूरी आंखें एंबेड ।
- -८० डिग्री सेल्सियस से एंबेडेड आंख कप और पूरी आंखों के साथ मोल्ड निकालें और cryosectioning से पहले 1 घंटे के लिए equilibrate-20 डिग्री सेल्सियस के लिए अनुमति देते हैं ।
- कट रेटिना पार वर्गों (12 µm मोटी) ऑप्टिक तंत्रिका सिर के माध्यम से temporonasal अक्ष के समानांतर-20 डिग्री सेल्सियस पर एक cryostat का उपयोग कर ।
- -८० डिग्री सेल्सियस पर खुर्दबीन स्लाइड५३ और स्टोर पर रेटिना वर्गों माउंट ।
2.5-mC और 5-hmC एंटीबॉडी के साथ Immunostaining
- एक hydrophobic बाधा कलम के साथ स्लाइड पर घुड़सवार रेटिना वर्गों घेरना । hydrophobic बैरियर पेन ऊतक दाग करने के लिए आवश्यक एंटीबॉडी की मात्रा कम कर देता है ।
- 10 मिनट के लिए 1x पंजाब के २०० µ एल के साथ एक बार रेटिना वर्गों धो लें ।
- Permeabilize के साथ रेटिना वर्गों २०० µ एल के ०.१% ट्राइटन एक्स-१०० के लिए 1x पंजाबियों में (पंजाब-टी) कमरे के तापमान पर 10 मिनट के लिए ।
- एक ३७ डिग्री सेल्सियस मशीन में 1x पंजाब में हौसले से बना 2 N हाइड्रोक्लोरिक (एचसीएल) एसिड की २०० µ एल के साथ 30 मिनट के लिए स्वभाव रेटिना वर्गों ।
नोट: 5mC सिग्नल को ऑप्टिमाइज़ करने के लिए एचसीएल ट्रीटमेंट की गर्लफ्रैंड अनुमापन की जरूरत होती है । - हमेशा शामिल जैविक प्रतिकृतियां (3-4) जबकि 5mC संकेत५४का अनुकूलन ।
नोट: हम 4 समय अंक (15 मिनट, 30 मिनट, 1 एच और 2 एच) में प्रतिजन पुनर्प्राप्ति किया और पाया 30 मिनट की मशीन 5mC संकेत के लिए इष्टतम है । एचसीएल के साथ लंबे समय तक की मशीन नाभिक नाभिक को 5mC संकेत स्थानीयकरण अक्षमता के लिए अग्रणी की संरचना नीचा । - विकार के बाद, 10 मिनट के लिए रेटिना वर्गों पर ०.१ एम Tris-एचसीएल (पीएच ८.३) के १०० µ एल जोड़कर रेटिना वर्गों को बेअसर.
- समाधान अवरुद्ध के ५०० µ एल में वर्गों की मशीन (5% ट्राइटन X में ०.१% प्रतिरक्षित सामांय बकरी सीरम-१०० 1x पंजाब में) 1 घंटे के लिए एक आर्द्रता कक्ष में कमरे के तापमान पर ।
- ब्लॉक करने के बाद, एंटी-5mC जोड़ें; विरोधी 5hmC एंटीबॉडी रेटिना वर्गों के लिए समाधान अवरुद्ध में 1:500 पतला ।
- नमी चैंबर में 4 डिग्री सेल्सियस पर रातोंरात रेटिना वर्गों की मशीन ।
- अगले दिन धोने, रेटिना वर्गों 3 बार (10-15 मिनट हर बार) ०.१% पंजाबियों के साथ टी और फिर इसी माध्यमिक एंटीबॉडी (बकरी विरोधी खरगोश और बकरी विरोधी माउस आईजीजी, पतला; 1:1000), युक्त DAPI (4 ', 6 के साथ समाधान अवरुद्ध करने में मशीन । diamidino-2-phenylindole) समाधान (1 µ g/एमएल) के लिए कमरे के तापमान पर 1 h समाधान अवरुद्ध में ।
नोट: immunodetection के सभी चरणों के दौरान अनुभागों के सूखने से बचें । - ०.१% पंजाबियों की 1 मिलीलीटर के साथ स्लाइड तीन बार धो लें-टी ।
- अंतिम धोने के बाद, एक coverslip के तहत जलीय बढ़ते मध्यम और बेरंग नेल पॉलिश के साथ मुहर के साथ वर्गों माउंट ।
3. फोकल Immunohistochemistry
- ओरिएंट वर्गों ऑप्टिक हमेशा एक ही रास्ता (जैसे, ऊपर), निरंतरता के लिए सामना करना पड़ के रेटिना वर्णक उपकला की ओर है ।
- 2x या 3x ज़ूम के साथ 63X (एक उद्देश्य लेंस का इज़ाफ़ा) पर immunostained रेटिना वर्गों की छवि पर कब्जा करते हैं ।
- ०.३५ µm कदम का उपयोग कर सभी 3 चैनलों (लाल, हरे और नीले, आरजीबी) में प्रत्येक चयनित छवि (जेड-ढेर) के कई ऑप्टिकल वर्गों उत्पन्न करते हैं ।
नोट: एक 10 में visualized नमूना के अंतिम इज़ाफ़ा-20X (एक उद्देश्य लेंस का इज़ाफ़ा) 63X होगा, क्रमशः, जब एक के साथ संयुक्त (आमतौर पर इस्तेमाल किया) 10x नेत्र लेंस ।
5mC और 5hmC संकेत का पता लगाने के लिए संपीड़ित ऑप्टिकल स्टैक विज़ुअलाइज़ करें
Representative Results
रेटिना के विकास और postmitotic रेटिना के दौरान 5-methylcytosine (5mC) और 5-hydroxymethylcytosine (5hmC) के वितरण का निर्धारण करने के लिए, हम immunostained, C57BL, 6J और E16 और P0 के लिए विशिष्ट एंटीबॉडी के साथ P15 P90/5mC माउस रेटिना खंड ।
E16 में 5mC धुंधला सेल नाभिक के chromocenters में मजबूत था, जबकि कमजोर धुंधला पूरे सेल नाभिक (आंकड़ा 1a) में मनाया गया । 5hmC धुंधला सेल नाभिक तक ही सीमित था और chromocenters (आंकड़ा 1b) से नदारद था ।
P0 रेटिना में, 5mC संकेत सेल नाभिक और परमाणु परिधि (चित्रा 2a, तीर और arrowhead) के chromocenters के लिए स्थानीयकृत किया गया था । हम भी सेल नाभिक के chromocenters के बीच 5mC के कमजोर दाग मनाया । 5hmC संकेत chromocenters (चित्रा बी) के अलावा सेल नाभिक में दृढ़ता से उपस्थित थे । हमने पाया है नाभिक 5mC और भीतरी neuroblast परत (INBL) (चित्रा 2c, बिंदीदार रेखा) में 5hmC के साथ दाग रहे है
P15 रेटिना में हमें बाहरी नाभिकीय परत (केव), इनर न्यूक्लियर लेयर (आईएनएल) और नाड़ीग्रंथि सेल लेयर (GCL) (figure 3) में 5mC और 5hmC का मजबूत दाग मिला । केव (रॉड photoreceptors) में, 5mC संकेत सेल नाभिक और परमाणु परिधि के chromocenters में मौजूद था (आंकड़े 3 ए-3 सी, 3 जी) । chromocenters (आंकड़े 3डी-3f) को छोड़कर पूरे सेल नाभिक में 5hmC सिग्नल पाया गया । P15 रेटिना पर किया गया संचरण इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी रॉड सेल नाभिक में heterochromatic डोमेन के वितरण से पता चलता है कि इसी तरह 5mC एंटीबॉडी संकेत के साथ पाया (आंकड़े 3h और 3i).
आईएनएल और GCL में 5mC दाग सेल नाभिक के chromocenters में मजबूत था और कमजोर दाग भी पूरे सेल नाभिक (आंकड़े 3j-3l और 3r -3t) में मनाया गया । 5mC के विपरीत, 5hmC संकेत आईएनएल और GCL (आंकड़े 3m-3o और 3u-3w) में chromocenters के अलावा पूरे सेल नाभिक को स्थानीयकृत किया गया । हम GCL सेल नाभिक की परिधि पर मजबूत 5hmC संकेत मनाया ।
वयस्क रॉड photoreceptors में, 5mC संकेत सेल नाभिक (आंकड़े 4a-4c) के chromocenter और परमाणु परिधि के लिए प्रतिबंधित किया गया था, जबकि 5hmc संकेत परमाणु परिधि (आंकड़े 4d-4f) तक ही सीमित था ।
चित्र 1. 5-methylcytosine और 5-hydroxymethylcytosine के स्थानीयकरण पर माउस रेटिना में भ्रूण के दिन 16.
Immunostaining C57BL/6J रेटिना के 5mC (लाल, ए) और 5hmC (ग्रीन, बी) के लिए एंटीबॉडी के साथ । E16 में 5mC सिगनल सेल नाभिक के chromocenters में बहुत मजबूत है और काफी निचले स्तर पर भी पूरे सेल नाभिक में मौजूद है । 5hmC दाग विशेष रूप से सेल नाभिक तक ही सीमित था । पैनल सी विलय 5mC और 5hmC छवि का प्रतिनिधित्व करता है । नाभिक DAPI (नीला, सी) के साथ counterstained हैं । प्रीसेट छवियों में तारांकन चिह्न के साथ दिखाए गए क्षेत्र की आवर्धन का प्रतिनिधित्व करते हैं । स्केल बार: 5 µm. कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए ।
चित्र 2. Immunohistochemical 5-methylcytosine और 5-hydroxymethylcytosine के धुंधला जन्मोत्तर दिन 0 पर माउस रेटिना में ।
Immunolabeling C57BL/6J रेटिना के 5mC (लाल, ए) और 5hmC (ग्रीन, बी) के लिए एंटीबॉडी के साथ । P0 रेटिना में 5mC और 5hmC दोनों ही बाहरी neuroblast लेयर (ONBL) और इनर neuroblast लेयर (INBL) में मौजूद हैं । a) 5mC सिगनल chromocenters (arrow) और कोशिका नाभिक (arrowhead) के नाभिकीय परिधि में दृढ़ता से उपस्थित होता है । 5mC के कमजोर दाग भी सेल नाभिक के chromocenters के बीच में मनाया जाता है । ख) 5hmC धुंधला सेल नाभिक तक ही सीमित है और मजबूत संकेत INBL (पैनल सी में बिंदीदार रेखा) में मनाया जाता है । पैनल सी विलय 5mC और 5hmC छवि का प्रतिनिधित्व करता है । नाभिक DAPI (नीला, सी) के साथ counterstained हैं । प्रीसेट छवियों में तारांकन चिह्न के साथ दिखाए गए क्षेत्र की आवर्धन का प्रतिनिधित्व करते हैं । स्केल बार: 5 µm. कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए ।
चित्र 3. 5-methylcytosine और 5-hydroxymethylcytosine में जन्मोत्तर दिवस 15 पर माउस रेटिना में वितरण ।
एंटी-5mC और 5hmC एंटीबॉडी (ए जी, जे-वाई) के साथ C57BL/6J रेटिना का Immunostaining । बाहरी परमाणु परत (केव) में (रॉड photoreceptors), 5mC संकेत (लाल, एक) आमतौर पर सेल नाभिक के chromocenters के साथ मेल खाता है (arrowhead, बी) और भी परमाणु परिधि (तीर, ख) को स्थानीयकृत । पैनल बी (लाल) और सी (ग्रे) छवि a में तारांकन चिह्न के साथ दिखाए गए क्षेत्र के आवर्धन का प्रतिनिधित्व करते हैं । 5hmC संकेत (green, d) chromocenters को छोड़कर पूरे सेल नाभिक तक ही सीमित है. कक्ष e (हरा) और f (धूसर) छवि में तारांकन चिह्न के साथ दिखाए गए क्षेत्र की आवर्धन का प्रतिनिधित्व करें d. कक्ष g मर्ज किए गए 5mC और 5hmC छवि का प्रतिनिधित्व करता है । नाभिक DAPI के साथ counterstained हैं । पैनल एच और मैं जन्मोत्तर दिन 15 heterochromatic डोमेन के वितरण दिखा रहा है पर photoreceptor नाभिक के संचरण इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोप छवि रहे हैं । काले पैनल में arrowhead एकल रॉड photoreceptor नाभिक पैनल में बढ़े मैं पैनल में लाल ऐरोहेड मैं रॉड photoreceptor नाभिक के भीतर heterochromatic डोमेन को इंगित करते हुए लाल तीर परमाणु परिधि में heterochromatin को इंगित करते हैं । आईएनएल (जे-क्यू) और GCL सेल नाभिक (आर-वाय) में 5mC सिग्नल (red) की परिधि में मौजूद chromocenters को स्थानीयकृत किया जाता है और कमजोर दाग को भी सेल के बाकी नाभिक में पाया जाता है । कक्ष k (लाल) और i (धूसर) छवि j में तारांकन चिह्न के साथ दिखाए गए क्षेत्र की आवर्धन का प्रतिनिधित्व करते हैं । आईएनएल और GCL सेल नाभिक में 5hmC धुंधला (हरा) पूरे सेल नाभिक तक ही सीमित है । नोट मजबूत 5hmC GCL कोशिकाओं के परमाणु परिधि में दाग । पेनल p और x मर्ज किए गए 5mC और 5hmC छवि का प्रतिनिधित्व करते है जबकि पैनल q और y क्रमशः छवि p और x में तारांकन चिह्न के साथ दिखाए गए क्षेत्र की आवर्धन का प्रतिनिधित्व करते हैं । नाभिक DAPI के साथ counterstained हैं । स्केल बार: 5 µm. कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए ।
चित्र 4. 5-methylcytosine और 5-रॉड में hydroxymethylcytosine वितरण C57BL दिन ९० पर 6J माउस रेटिना की photoreceptor नाभिक/
5mC धुंधला (लाल, अ) कोशिका नाभिक के chromocenter में दृढ़ता से विद्यमान है और परमाणु परिधि में भी कमजोर उपस्थित है. पैनल बी (लाल) और सी (ग्रे) छवि a में तारांकन चिह्न के साथ दिखाए गए क्षेत्र के आवर्धन का प्रतिनिधित्व करते हैं । 5hmC धुंधला (हरा, घ) विशेष रूप से परमाणु परिधि पैनल ई (ग्रीन) और एफ (ग्रे) तक ही सीमित है छवि में तारांकन चिह्न के साथ दिखाया क्षेत्र की वृद्धि का प्रतिनिधित्व डी. पैनल जी का प्रतिनिधित्व करता है विलय 5mC और 5hmC छवि जबकि पैनल एच के साथ दिखाया क्षेत्र का इज़ाफ़ा है छवि में तारांकन जी नाभिक DAPI (नीला) के साथ counterstained हैं. स्केल बार: 5 µm. कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए ।
Discussion
डीएनए मिथाइल और hydroxymethylation गतिशील और प्रतिवर्ती डीएनए संशोधनों, जो एक विकासशील में जैविक तंत्र के modulatethe विविध रेंज के रूप में के रूप में अच्छी तरह से postmitotic कोशिकाओं में हैं । यहां, हम immunohistochemical तकनीक द्वारा सीटू में 5mC और 5hmC डीएनए संशोधनों का पता लगाने के लिए एक reproducible तकनीक का वर्णन (विरोधी 5mC और विरोधी 5hmC एंटीबॉडी का उपयोग कर) paraformaldehyde में-फिक्स्ड माउस रेटिना के जमे हुए वर्गों, और प्रदान सुधार और परिणाम मानकीकरण के लिए दिशानिर्देश, विशेष रूप से जब कई विभिंन नमूनों की तुलना । हम पहले चित्रित रेटिना के साथ माउस रेटिना में 5mC परिवर्तन Dnmt1, Dnmt3a और Dnmt3b डीएनए methyltransferase जीन की विशिष्ट लक्ष्यीकरण के लिए इस विधि का इस्तेमाल किया, और उनके रेटिना 7 में 5mC मार्क्स की (उंमीद) कमी की सूचना .
5mC immunohistochemical का पता लगाने में महत्वपूर्ण कदम एचसीएल के साथ ऊतकवैज्ञानिक वर्गों के उपचार का अनुकूलन है: 15 से कम न्यूनतम उपचार reproducible परिणामों का उत्पादन करने की उम्मीद नहीं है, जबकि एचसीएल के साथ अत्यधिक उपचार परमाणु नष्ट कर देता है वास्तुकला. हम एचसीएल के साथ 30 मिनट की मशीन के बाद सबसे अच्छा परिणाम पाया । हम हमेशा ताजा पतला एचसीएल और डीएनए विकार और रेटिना ऊतक निर्धारण के लिए ताजा बनाया 4% पीएफए समाधान का उपयोग करने की सलाह देते हैं ।
परिणामों के निवारण के लिए, हम तीन से चार जैविक प्रतिकृति 5mC संकेत के अनुकूलन के दौरान शामिल करने के लिए अनुशंसा करते हैं । जबकि immunohistochemical धुंधला के प्रत्येक व्यक्ति सेट थोड़ा अलग परिणाम उत्पंन (अधिक या कम उज्ज्वल heterochromatic क्षेत्रों), जो immunohistochemical विधि में उंमीद है, 5mC और 5hmC परमाणु वितरण व्यक्तिगत सेट के भीतर हो सकता है वर्गों के बहुत reproducible होने की उंमीद है, के लिए के रूप में लंबे समय के रूप में प्रोटोकॉल का पालन किया है ।
इस तकनीक की भी सीमा के रूप में हम लगातार एक ही खंड के भीतर photoreceptor सेल नाभिक में 5mC वितरण में परिवर्तनशीलता मनाया । हमने पाया कुछ नाभिक मजबूत 5mC संकेत दिखाया जबकि आसंन सेल नाभिक कोई 5mC संकेत दिखाया । यह जमे हुए वर्गों में एचसीएल उपचार द्वारा बेपर्दा 5mC प्रतिजन में सीमा के कारण है ।
इस तकनीक का महत्व DNase और proteinase K chromocenters के बेहतर संरक्षण के लिए अग्रणी उपचार के बिना 5mC स्थानीयकरण सक्षम बनाता है । इस तकनीक को सभी हड्डीवाला पशु ऊतकों से किसी भी वर्गों पर मजबूती से काम करने की उंमीद है, ले 5mC, 5hmC के निशान, और एक समान दृष्टिकोण के साथ कार्रवाई की, न केवल माउस रेटिना, के लिए के रूप में लंबे समय के रूप में प्रोटोकॉल का पालन किया जाता है ।
Disclosures
लेखकों का खुलासा करने के लिए कुछ नहीं है ।
Acknowledgments
इस काम को एक SBIR ग्रांट (1R44EY027654-01A1) ने सपोर्ट किया था ।
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Supplies | |||
| 29G1/2 ULTRA-FINE | BD Biosciences | 329461 | |
| Ophthalmic scissor | Fine Science tools, Inc. | 15000-03 | |
| PAP pen | RPICORP.com | 195505 | |
| Microslide Superfrost plus | VWR | 48311-703 | |
| Reagent | |||
| Paraformaldehyde | Electron Microscope Science | 15710 | |
| 1x PBS | Corning | 21-031-CV | |
| Sucrose | Sigma | S9378 | |
| Tissue-Tek Optical cutting compound (OCT) | VWR | 4583 | |
| Triton X 100 | Sigma | T9284 | |
| 6 N HCl | VWR analytical | BDH7204-1 | |
| Tris-HCl pH 8.3 | Teknova | T1083 | |
| Goat serum | Jackson Immunoresearch | 005-000-121 | |
| 5mC | Genway Biotech | GWB-BD5190 | |
| 5hmC | Active Motif | 39791 | |
| LaminB1 | Abcam | Ab16048 | |
| Cy2 AffiniPure Goat Ant-Rabbit IgG | Jackson Immunoresearch | 111-225-1444 | |
| Cy3 AffiniPure Goat Ant-Mouse IgG | Jackson Immunoresearch | 115-585-166 | |
| DAPI | Thermo Fisher Scientific | D1306 | |
| Prolong Gold Antifade medium | Thermo Fisher Scientific | P36930 | |
| Equipment | |||
| MICRM HM 550 | Thermo Fisher Scientific | 388114 | |
| Confocal microscope | Zeiss |
References
- Merbs, S. L., et al. Cell-specific DNA methylation patterns of retina-specific genes. PLoS One. 7 (3), e32602 (2012).
- Nasonkin, I. O., et al. Conditional knockdown of DNA methyltransferase 1 reveals a key role of retinal pigment epithelium integrity in photoreceptor outer segment morphogenesis. Development. 140 (6), 1330-1341 (2013).
- Rhee, K. D., Yu, J., Zhao, C. Y., Fan, G., Yang, X. J. Dnmt1-dependent DNA methylation is essential for photoreceptor terminal differentiation and retinal neuron survival. Cell Death & Disease. 3, e427 (2012).
- Wahlin, K. J., et al. Epigenetics and cell death: DNA hypermethylation in programmed retinal cell death. PLoS One. 8 (11), e79140 (2013).
- Aldiri, I., et al. The Dynamic Epigenetic Landscape of the Retina During Development, Reprogramming, and Tumorigenesis. Neuron. 94 (3), 550-568 (2017).
- Eberhart, A., et al. Epigenetics of eu- and heterochromatin in inverted and conventional nuclei from mouse retina. Chromosome Research. 21 (5), 535-554 (2013).
- Singh, R. K., et al. Dnmt3a and Dnmt3b cooperate in photoreceptor and outer plexiform layer development in the mammalian retina. Experimental Eye Research. 159, 132-146 (2017).
- Farinelli, P., et al. DNA methylation and differential gene regulation in photoreceptor cell death. Cell Death & Disease. 5, e1558 (2014).
- Mo, A., et al. Epigenomic landscapes of retinal rods and cones. Elife. 5, e11613 (2016).
- Popova, E. Y., Barnstable, C. J., Zhang, S. S. Cell type-specific epigenetic signatures accompany late stages of mouse retina development. Advances in Experimental Medicine and Biology. 801, 3-8 (2014).
- Kim, J. W., et al. NRL-Regulated Transcriptome Dynamics of Developing Rod Photoreceptors. Cell Reports. 17 (9), 2460-2473 (2016).
- Wang, L., et al. Retinal Cell Type DNA Methylation and Histone Modifications Predict Reprogramming Efficiency and Retinogenesis in 3D Organoid Cultures. Cell Reports. 22 (10), 2601-2614 (2018).
- Perera, A., et al. TET3 is recruited by REST for context-specific hydroxymethylation and induction of gene expression. Cell Reports. 11 (2), 283-294 (2015).
- Mimura, I., et al. Dynamic change of chromatin conformation in response to hypoxia enhances the expression of GLUT3 (SLC2A3) by cooperative interaction of hypoxia-inducible factor 1 and KDM3A. Molecular and Cellular Biology. 32 (15), 3018-3032 (2012).
- Nair, N., Shoaib, M., Sorensen, C. S. Chromatin Dynamics in Genome Stability: Roles in Suppressing Endogenous DNA Damage and Facilitating DNA Repair. Int J Mol Sci. 18 (7), (2017).
- Mekhail, K., Moazed, D. The nuclear envelope in genome organization, expression and stability. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 11 (5), 317-328 (2010).
- Misteli, T., Soutoglou, E. The emerging role of nuclear architecture in DNA repair and genome maintenance. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 10 (4), 243-254 (2009).
- Solovei, I., et al. Nuclear architecture of rod photoreceptor cells adapts to vision in mammalian evolution. Cell. 137 (2), 356-368 (2009).
- Solovei, I., et al. LBR and lamin A/C sequentially tether peripheral heterochromatin and inversely regulate differentiation. Cell. 152 (3), 584-598 (2013).
- Solovei, I., Thanisch, K., Feodorova, Y. How to rule the nucleus: divide et impera. Current Opinion in Cell Biology. 40, 47-59 (2016).
- Jaenisch, R., Bird, A. Epigenetic regulation of gene expression: how the genome integrates intrinsic and environmental signals. Nature Genetics. 33, Suppl . 245-254 (2003).
- Cross, S. H., Charlton, J. A., Nan, X., Bird, A. P. Purification of CpG islands using a methylated DNA binding column. Nature Genetics. 6 (3), 236-244 (1994).
- Antequera, F., Bird, A. Number of CpG islands and genes in human and mouse. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 90 (24), 11995-11999 (1993).
- Antequera, F., Boyes, J., Bird, A. High levels of de novo methylation and altered chromatin structure at CpG islands in cell lines. Cell. 62 (3), 503-514 (1990).
- Fouse, S. D., et al. Promoter CpG methylation contributes to ES cell gene regulation in parallel with. Oct4/Nanog, PcG complex, and histone H3 K4/K27 trimethylation. Cell Stem Cell. 2 (2), 160-169 (2008).
- Elango, N., Yi, S. V. DNA methylation and structural and functional bimodality of vertebrate promoters. Molecular Biology and Evolution. 25 (8), 1602-1608 (2008).
- Lister, R., et al. Global epigenomic reconfiguration during mammalian brain development. Science. 341 (6146), 1237905 (2013).
- Colwell, M., et al. Evolutionary conservation of DNA methylation in CpG sites within ultraconserved noncoding elements. Epigenetics. 13 (1), 49-60 (2018).
- Lee, S. M., et al. Intragenic CpG islands play important roles in bivalent chromatin assembly of developmental genes. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 114 (10), E1885-E1894 (2017).
- Charlet, J., et al. Bivalent Regions of Cytosine Methylation and H3K27 Acetylation Suggest an Active Role for DNA Methylation at Enhancers. Molecular Cell. 62 (3), 422-431 (2016).
- Bernhart, S. H., et al. Changes of bivalent chromatin coincide with increased expression of developmental genes in cancer. Scientific Reports. 6, 37393 (2016).
- Curry, E., et al. Genes Predisposed to DNA Hypermethylation during Acquired Resistance to Chemotherapy Are Identified in Ovarian Tumors by Bivalent Chromatin Domains at Initial Diagnosis. Cancer Research. 78 (6), 1383-1391 (2018).
- Rakyan, V. K., et al. Human aging-associated DNA hypermethylation occurs preferentially at bivalent chromatin domains. Genome Research. 20 (4), 434-439 (2010).
- Smith, Z. D., Meissner, A. DNA methylation: roles in mammalian development. Nature Reviews Genetics. 14 (3), 204-220 (2013).
- Chen, T., Li, E. Structure and function of eukaryotic DNA methyltransferases. Current Topics in Developmental Biology. 60, 55-89 (2004).
- Nasonkin, I. O., et al. Distinct nuclear localization patterns of DNA methyltransferases in developing and mature mammalian retina. The Journal of Comparative Neurology. 519 (10), 1914-1930 (2011).
- Scourzic, L., Mouly, E., Bernard, O. A. TET proteins and the control of cytosine demethylation in cancer. Genome Medicine. 7 (1), 9 (2015).
- Gong, Z., Zhu, J. K. Active DNA demethylation by oxidation and repair. Cell Research. 21 (12), 1649-1651 (2011).
- Ito, S., et al. Tet proteins can convert 5-methylcytosine to 5-formylcytosine and 5-carboxylcytosine. Science. 333 (6047), 1300-1303 (2011).
- Pastor, W. A., et al. Genome-wide mapping of 5-hydroxymethylcytosine in embryonic stem cells. Nature. 473 (7347), 394-397 (2011).
- Suzuki, M. M., Bird, A. DNA methylation landscapes: provocative insights from epigenomics. Nature Reviews Genetics. 9 (6), 465-476 (2008).
- Kurdyukov, S., Bullock, M. DNA Methylation Analysis: Choosing the Right Method. Biology (Basel). 5 (1), (2016).
- Lisanti, S., et al. Comparison of methods for quantification of global DNA methylation in human cells and tissues). PLoS One. 8 (11), e79044 (2013).
- Armstrong, K. M., et al. Global DNA methylation measurement by HPLC using low amounts of DNA. Biotechnology Journal. 6 (1), 113-117 (2011).
- consortium, B. Quantitative comparison of DNA methylation assays for biomarker development and clinical applications. Nature Biotechnology. 34 (7), 726-737 (2016).
- Bock, C., et al. Quantitative comparison of genome-wide DNA methylation mapping technologies. Nature Biotechnology. 28 (10), 1106-1114 (2010).
- Song, C. X., He, C. The hunt for 5-hydroxymethylcytosine: the sixth base. Epigenomics. 3 (5), 521-523 (2011).
- Abakir, A., Wheldon, L., Johnson, A. D., Laurent, P., Ruzov, A. Detection of Modified Forms of Cytosine Using Sensitive Immunohistochemistry. Journal of Visualized Experiments. (114), (2016).
- Santos, F., Dean, W. Using immunofluorescence to observe methylation changes in mammalian preimplantation embryos. Methods in Molecular Biology. 325, 129-137 (2006).
- Watson, J. D., Crick, F. H. The structure of DNA. Cold Spring Harbor Symposia on Quantitative Biology. 18, 123-131 (1953).
- Swaroop, A., Kim, D., Forrest, D. Transcriptional regulation of photoreceptor development and homeostasis in the mammalian retina. Nature Reviews Neuroscience. 11 (8), 563-576 (2010).
- Kizilyaprak, C., Spehner, D., Devys, D., Schultz, P. In vivo chromatin organization of mouse rod photoreceptors correlates with histone modifications. PLoS One. 5 (6), e11039 (2010).
- Singh, R. K., Kolandaivelu, S., Ramamurthy, V. Early alteration of retinal neurons in Aipl1-/- animals. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 55 (5), 3081-3092 (2014).
- Eberhart, A., Kimura, H., Leonhardt, H., Joffe, B., Solovei, I. Reliable detection of epigenetic histone marks and nuclear proteins in tissue cryosections. Chromosome Research. 20 (7), 849-858 (2012).
