Summary
O objetivo deste relato é descrever o protocolo para a deteção de imuno-histoquímica robusto de marcadores epigenéticas, 5-metilcitosina (5mC) e 5-Hidroximetilcitosina (5hmC) no desenvolvimento e postmitotic mouse retina.
Abstract
A epigenética do desenvolvimento da retina é um campo de pesquisa bem estudado, que promete trazer um novo nível de compreensão sobre os mecanismos de uma variedade de doenças degenerativas da retina humanas e identificar novas abordagens de tratamento. A arquitetura nuclear da retina do rato está organizada em dois padrões diferentes: convencional e invertido. Convencional padrão é universal onde heterocromatina é localizada para a periferia do núcleo, enquanto ativa eucromatina reside no interior nuclear. Em contraste, padrão nuclear invertido é exclusivo para o núcleo de células de fotorreceptoras haste adulto onde heterocromatina localiza-se ao centro nuclear, e eucromatina reside na periferia nuclear. Metilação do DNA é predominantemente observada em chromocenters. Metilação do DNA é uma modificação covalente dinâmica sobre os resíduos de citosina (5-metilcitosina, 5mC) de dinucleotídeos CpG que são enriquecidos nas regiões promotor de muitos genes. Três DNA metiltransferases (DNMT1, DNMT3A e DNMT3B) participarem de metilação de DNA durante o desenvolvimento. Detecção 5mC com técnicas de imuno-histoquímica é muito desafiador, contribuindo para a variabilidade nos resultados, como todas as bases do DNA, incluindo bases 5mC modificado estão escondidas dentro da hélice de DNA dupla-hélice. No entanto, a delimitação detalhada da distribuição de 5mC durante o desenvolvimento é muito informativa. Aqui, descrevemos uma técnica reprodutível para detecção de imuno-histoquímica robusto de 5mC e outro epigenéticas DNA marcador 5-Hidroximetilcitosina (5hmC), que colocalizes com a cromatina "aberta", transcricionalmente ativa no desenvolvimento e retina do rato postmitotic.
Introduction
Regulação epigenética do desenvolvimento e homeostase postmitotic da retina do rato são uma excitante área de pesquisa, que promete trazer uma novela compreensão dos mecanismos biológicos, controlando a determinação de retinogenesis e a célula de destino, tipo específico de célula função metabólica, bem como patologias celular, morte celular e regeneração1,2,3,4,5,6,7,8 , 9 , 10 , 11 , 12 , 13. cromatina sofre alterações dinâmicas no desenvolvimento, bem como em resposta a sinais externos variáveis seja estresse, metabólica ou célula morte estímulos6,14,15, 16 , 17 , 18. em núcleos de rato, a cromatina é dividida em ativa eucromatina e heterocromatina inativo6,19,20. No núcleo interfásico, eucromatina reside na região interna do núcleo enquanto heterocromatina linhas a periferia nuclear e o nucléolo. Este padrão é chamado convencional e é altamente conservado em eucariontes. Em contraste, núcleos de haste em animais noturnos como rato e rato tem invertido o padrão onde o núcleo é ocupado pela heterocromatina no centro rodeado por eucromatina, formando a casca mais externa6,18, 20. No nascimento, haste núcleos têm arquitetura nuclear convencional. Inversão de núcleos de haste ocorre durante o desenvolvimento, pela remodelação da arquitetura nuclear convencional. Durante esse processo, heterocromatina periférica separa a periferia nuclear e chromocenters se fundem para formar um único chromocenter no centro do núcleo6,18.
Metilação de DNA genômica participa no controlo de conformação de cromatina local21. Metilação do DNA ocorre na 5' posição de resíduos de citosina de dinucleotídeos CpG que são enriquecidos na região promotora de muitos genes no rato genomas22,23,24,25,26 bem como em intergênicas e regiões intrão, que carregam elementos reguladores27. Metilação das Ilhas CpG em promotores proximal21,24 e sequências CpG no gene potenciadores27,28 é importante na regulação do estado dinâmico da cromatina bivalente, que contém muitos fatores de genes/transcrição do desenvolvimento desempenha um papel importante no desenvolvimento, câncer e envelhecimento29,30,31,32,33,34 . Três DNA metiltransferases (DNMTs) participarem de metilação de DNA durante rato desenvolvimento35. Todos os três DNMTs são expressos durante o desenvolvimento da retina de rato36 e alterações específicas do retina em Dnmt genes impacto desenvolvimento retinal2,7. Hidroximetilcitosina (5hmC) é o produto oxidativo de desmetilação (5mC) 5-metilcitosina. As três enzimas de translocação (TET) dez-onze participarem 5mC desmetilação37,38,39. Hidroximetil-C modificação é enriquecida em promotores, corpos de gene e sequências genomic intergênicas dentro gene rico e regiões activamente transcrito27,40.
Há uma variedade de abordagens descritas para a determinação de mudança dos padrões de metilação do DNA em células41,42,,43,44,45,46, permitindo que alguns deles mudanças globais de metilação do DNA, enquanto outros focando precisas mudanças nas regiões de CpG-ricos dentro de promotores e potenciadores de quantificar. Métodos para a detecção e quantificação de 5hmC também foram relatados47, incluindo por imuno-histoquímica13. Técnicas de imuno-histoquímica, que permitem monitoramento robusto de 5mC e 5hmC alterações nos núcleos de desenvolvimento e células postmitotic, são muito informativo para delinear cromatina dinâmica em situ em resposta às mudanças externas ou internas impactando as células4,13,,48,49. No entanto, esta abordagem é propensa a subestimar a metilação do DNA e alterações hydroxymethylation devido a problemas técnicos, associados com a detecção de modificações de citosina em preparações histológicas. Isso ocorre porque o DNA apolar bases, incluindo 5mC e citosina 5hmC modificados, estão escondidos dentro do centro da hélice DNA dupla-hélice50e exigem o desmascaramento. Isto é especialmente desafiador em preparações histológicas congeladas, que podem rapidamente perdem a organização informativa do tecido original, quando é aplicado o tratamento áspero.
A retina do rato é um excelente modelo para dissecar a contribuição de metilação do DNA para o desenvolvimento neural e homeostase postmitotic. Só existem 6 tipos de neurônios (haste e cone fotorreceptores, amacrine, bipolares, células horizontais e gânglio), tipo uma célula glial (glia Muller) e uma neuroepithelial célula tipo (epithelium retinal do pigment)51. Tipos de células da retina foram relatados para ter padrões distintos de DNA metilação18,,19, que recentemente tem sido estudada em base única resolução1,5,9,12. Nós recentemente relatou aplicação imuno-histoquímica para delinear 5mC padrão de distribuição dentro de núcleos de células da retina e alterações nos núcleos da retina do rato adulto, onde todos os três DNA metiltransferases foram removidos pelo direcionamento condicional 7. em comparação com uma série de relatórios, onde a presença de metilação de DNA nas células da retina pode ser vista apenas como um positivo ou negativo sinal em hypermethylated submetidos à apoptose de células, nossa abordagem permitiu detecção específica cromatina arranjo dentro os núcleos de células da retina, que nós e vários grupos relataram e discutiram anteriormente5,6,7,18,19,36 , 52. aqui, descrevemos a técnica de imuno-histoquímica (IHC) de detecção de 5mC e 5hmC em congelados paraformaldeído-corrigido cortes histológicos em detalhes assim como demonstram os dados, que fomos capazes de se reproduzir do nosso relatório original7 .
Protocol
Todos os procedimentos com ratos foram realizados em conformidade com os protocolos aprovados pela Hospital Oakland Research Institute animal cuidados e uso Comitê das crianças e aderiu à associação para pesquisa em visão e oftalmologia (ARVO) instrução para o uso de animais em oftalmologia e visão de pesquisa.
1. tecido preparação para imunocoloração
- Eutanásia em camundongos C57 BL/6J em dia embrionário (E) 16, dia pós-natal (P) 0, P15 e P90 por dióxido de carbono (CO2) seguido por decapitação (ratos E16 e P0).
- Olhos de rato imediatamente enucleate perfurado com agulha de 29 1/2 no lado dorsal do olho. Incube durante 5 minutos (min) em 1 mL de paraformaldeído 4% (PFA) em pH tampão fosfato salino (1X PBS) 8.0 à temperatura ambiente.
- Para fazer olho copos de P0, P15 e P90, dissecar para fora da córnea e da lente com uma tesoura de Oftalmologia bem enquanto estão de olhos nos 4% PFA.
Nota: Ignorar este passo para E16 olhos como os olhos são muito pequenos. - Corrigir os copos de olho (P0, P15 e P90) e os olhos todo (E16) em 4% PFA por 20 min em temperatura ambiente. Então lave os copos de olho e olhos todo duas vezes em 1 mL de 1X PBS durante 10 minutos à temperatura ambiente.
- Crioproteção o olho xícaras e todo os olhos no 1xPBS, pH 8.0 contendo 10% de sacarose por 1 hora. Manter-se em 20% de sacarose em 1X PBS durante 1 hora e então saturar em 30% de sacarose em 1X PBS durante a noite a 4 ° C.
- No dia seguinte, incorporar os copos de olho e os olhos todo corte ideal temperatura composto (OCT), (500 µ l) em cryomolds, snap-congelamento em banho de gelo seco/etanol e armazenar a-80 ° C.
- Remover os moldes com copos de olho incorporado e olhos todo de-80 ° C e permitem equilibrar a-20 ° C durante 1 hora antes de cryosectioning.
- Cortar as seções transversais da retina (12 µm de espessura) paralelo ao eixo temporonasal na cabeça do nervo óptico usando um criostato a-20 ° C.
- Monte seções da retina em lâminas de microscópio53 e loja a-80 ° C.
2. imunocoloração com anticorpos 5-mC e 5-hmC
- Cercam as seções da retina montadas em slides com uma caneta de barreira hidrofóbica. A caneta de barreira hidrofóbica reduz o volume de anticorpo necessário para manchar o tecido.
- Lave as seções da retina uma vez com 200 µ l de PBS 1x por 10 min.
- Permeabilize as seções da retina com 200 µ l de 0,1% Triton X-100 em 1X PBS (PBS-T) por 10 min à temperatura ambiente.
- Desnature seções da retina por 30 min com 200 µ l de acabadas 2 N de ácido clorídrico (HCl) em PBS 1x numa incubadora 37 ° C.
Nota: Cuidadosa titulação do HCl tratamento é necessário para otimizar o sinal de 5mC. - Sempre inclua biológicas repetições (3-4), otimizando a 5mC sinal54.
Nota: Nós fizemos a recuperação do antígeno em 4 pontos de tempo (15 min, 30 min, 1 h e 2 h) e incubação encontrado 30 min é o ideal para sinal de 5mC. Mais incubação com HCl degrada a estrutura dos núcleos, levando a incapacidade de localizar 5mC sinal para o núcleo. - Após desnaturação, neutralizar seções da retina, adicionando-se 100 µ l de 0.1 M Tris-HCl (pH 8,3) em seções da retina por 10 min.
- Incubar as seções em 500 µ l de solução de bloqueio (5% de soro de cabra normal preimmune em 0,1% Triton X-100 em 1X PBS) por 1h à temperatura ambiente em uma câmara de umidade.
- Após o bloqueio, adicionar anti-5mC; anticorpos anti-5hmC diluem a 1: 500 no bloqueio de solução para as seções da retina.
- Incube retinal seções durante a noite a 4 ° C, em câmara de umidade.
- A próxima lavagem de dia, seções da retina 3 vezes (10-15 min cada tempo) com 0,1% PBS-T e então incubar em solução com os correspondentes anticorpos secundários de bloqueio (cabra anticoelho e cabra anti-Mouse IgG, diluído; 1: 1000), contendo DAPI (4', 6 - solução de diamidino-2-phenylindole) (1 µ g/mL) à temperatura ambiente durante 1 h em solução de bloqueio.
Nota: Evite a secagem das seções durante todas as fases de immunodetection. - Lavar as lâminas três vezes com 1 mL de 0.1% PBS-T.
- Após a última lavagem, montar as seções com meio de montagem aquoso sob uma lamela e selar com esmalte incolor.
3. confocal imuno-histoquímica
- Oriente as seções para que o lado de epitélio retinal do pigmento da Taça óptica sempre enfrentando uma maneira (por exemplo, acima), para a consistência.
- Realizar captura de imagem de immunostained da retina seções em 63 X (ampliação de uma lente objetiva) com 2 X ou 3x zoom.
- Gerar várias seções óticas de cada imagem selecionada (z-pilhas) em todos os 3 canais (vermelho, verde e azul, RGB) usando 0,35 µm de passo.
Nota: A ampliação final de um espécime visualizado no X de 10-20 (ampliação de uma lente objetiva) serão 63 X, respectivamente, quando combinado com um 10 (geralmente usado) X lente ocular.
Visualizar a pilha compactada de óptica para localizar o sinal de 5mC e 5hmC
Representative Results
Para determinar a distribuição da 5-metilcitosina (5mC) e 5-Hidroximetilcitosina (5hmC) durante o desenvolvimento da retina e na retina postmitotic, nós immunostained C57BL/6J rato da retina seção de E16, P0, P15 e P90 com anticorpos específicos para 5mC e 5hmC.
No E16 manchando o 5mC era forte em chromocenters dos núcleos celulares enquanto fraca coloração observou-se no núcleo celular (Figura 1a). A coloração de 5hmC limitou-se a núcleos de célula e estava ausente da chromocenters (Figura 1b).
Na retina de P0, o sinal de 5mC era localizado, o chromocenters do núcleo de células e periferia nuclear (Figura 2a, seta e seta). Também observamos fraca coloração de 5mC entre os chromocenters dos núcleos celulares. O sinal de 5hmC foi fortemente presente no núcleo celular exceto para o chromocenters (Figura 2b). Encontramos que mais núcleos estão manchados com 5mC e 5hmC na camada interna neuroblasto (INBL) (Figura 2C, linha pontilhada)
Na retina P15, encontramos forte coloração de 5mC e 5hmC na camada nuclear externa (ONL), a camada nuclear interna (INL) e a camada de células ganglionares (GCL) (Figura 3). Em ONL (fotorreceptores de haste), o sinal de 5mC estava presente na chromocenters do núcleo de células e periferia nuclear (figuras 3a-3C, 3G). O sinal de 5hmC foi encontrado no núcleo celular exceto para o chromocenters (figuras 3d-3f). A microscopia eletrônica de transmissão feita na retina P15 mostra a distribuição de domínios heterocromático em núcleos de células de haste semelhante ao encontrado com sinal de anticorpo 5mC (figuras 3 h e 3i).
A coloração de 5mC no INL e GCL era forte na chromocenters dos núcleos celulares e coloração fraca foi também observada em núcleos de células inteiras (figuras 3j-3L e 3r-3t). Em contraste com o 5mC, o sinal de 5hmC era localizado para os núcleos de célula inteira, exceto para o chromocenters no INL e GCL (figuras 3M-3o e 3u-3w). Observamos um fortes sinal de 5hmC, na periferia do núcleo de células GCL.
Em fotorreceptores de haste adultas, o sinal de 5mC era restrito à periferia nuclear dos núcleos celulares (figuras 4a-4C) e chromocenter, enquanto 5hmc sinal foi confinado à periferia nuclear (figuras 4 d-4f).
Figura 1. Localização da 5-metilcitosina e 5-Hidroximetilcitosina na retina do rato em embrionária dia 16.
Immunostaining de retina C57BL/6J com anticorpos para 5mC (vermelho, um) e 5hmC (verde, b). No E16, 5mC sinal é muito forte no chromocenters dos núcleos celulares e também presente no núcleo celular em nível muito inferior. 5hmC coloração foi confinado exclusivamente para o núcleo de células. C painel representa 5mC mesclado e 5hmC imagem. Núcleos são counterstained com DAPI (azul, c). As inserções representam a ampliação da área mostrada com asterisco nas imagens. Barra de escala: 5 µm. clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2. Coloração imuno-histoquímica da 5-metilcitosina e 5-Hidroximetilcitosina na retina do rato no pós-Natal dia 0.
Immunolabeling de retina C57BL/6J com anticorpos para 5mC (vermelho, um) e 5hmC (verde, b). Na retina de P0, 5mC e 5hmC estão presentes na camada exterior neuroblasto (ONBL) e camada interna neuroblasto (INBL). ) um 5mC sinal está fortemente presente na periferia nuclear dos núcleos celulares (seta) e chromocenters (seta). Coloração fraca de 5mC também é observada entre o chromocenters do núcleo de células. b) 5hmC coloração está confinado ao núcleo da célula e sinal forte é observada em INBL (linha pontilhada no painel c). C painel representa 5mC mesclado e 5hmC imagem. Núcleos são counterstained com DAPI (azul, c). As inserções representam a ampliação da área mostrada com asterisco nas imagens. Barra de escala: 5 µm. clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3. 5-metilcitosina e 5-Hidroximetilcitosina distribuição na retina do rato, no 15º dia pós-parto.
Immunostaining de retina C57BL/6J com anticorpos anti-5mC e 5hmC (g, j-y). Na camada nuclear externa (ONL) (fotorreceptores haste), sinal de 5mC (vermelho, um) geralmente coincide com a chromocenters dos núcleos celulares (ponta de seta, b) e também se localiza à periferia nuclear (seta, b). Painel b (vermelho) e c (cinza) representam a ampliação da área mostrada com asterisco na imagem de um. O sinal de 5hmC (verde, d) limita-se aos núcleos do celular, exceto para o chromocenters. Painel e (verde) e f (cinza) representam a ampliação da área mostrada com asterisco na imagem d. painel g representa 5mC mesclado e 5hmC imagem. Núcleos são counterstained com DAPI. Painel h e eu somos imagem de microscópio eletrônico de transmissão de núcleos fotorreceptoras em distribuição de apresentando pós-Natal dia 15 de domínios heterocromático. Seta preta no painel h aponta para haste único fotoreceptor núcleo ampliado no painel i. setas vermelhas no painel que para domínios heterocromático dentro núcleo de fotorreceptoras haste ponto enquanto setas vermelhas apontam a heterocromatina na periferia nuclear. No INL (j-q) e núcleo de células GCL (r-y), o sinal de 5mC (vermelho) está localizado o chromocenters presente na periferia e coloração fraca também é detectado no resto dos núcleos celulares. Painel k (vermelho) e eu (cinza) representam a ampliação da área mostrada com asterisco em j a imagem. O 5hmC de coloração (verde) no núcleo de células INL e GCL está confinado ao núcleo da célula inteira. Note 5hmC forte coloração na periferia nuclear das células GCL. X e p painel representam 5mC mesclado e 5hmC imagem enquanto y e painel q representam a ampliação da área mostrada com asterisco na imagem p e x, respectivamente. Núcleos são counterstained com DAPI. Barra de escala: 5 µm. clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 4. 5-metilcitosina 5-Hidroximetilcitosina distribuição e em núcleos de haste fotorreceptoras da retina do rato C57BL/6J em dia pós-natal 90.
A coloração de 5mC (vermelho, um) está fortemente presente no chromocenter do núcleo de células e também fracamente presente na periferia nuclear. Painel b (vermelho) e c (cinza) representam a ampliação da área mostrada com asterisco na imagem de um. A coloração de 5hmC (verde, d) é exclusivamente confinada para o painel de periferia nuclear e (verde) e ampliação de representar f (cinza) da área mostrada com asterisco na imagem d. painel g representa 5mC mesclado e 5hmC imagem ao painel h é a ampliação da área mostrada com asterisco na imagem que g. núcleos são counterstained com DAPI (azul). Barra de escala: 5 µm. clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Discussion
Hydroxymethylation e metilação de DNA são modificações de DNA dinâmicas e reversíveis, que modulatethe a variada gama de mecanismos biológicos no desenvolvimento, bem como em células postmitotic. Aqui, descrevemos uma técnica reprodutível para detectar 5mC e 5hmC DNA modificações em situ técnica de imuno-histoquímica (utilizando anticorpos anti-5mC e anti-5hmC) nas seções congeladas paraformaldeído-fixo da retina do rato e fornecer Diretrizes para melhorar e padronizar os resultados, especialmente ao comparar vários espécimes diferentes. Nós anteriormente usou este método para delinear 5mC alterações na retina do rato com retina específicos como alvo de Dnmt1, Dnmt3a e Dnmt3b genes de metiltransferase de DNA e relatou o esgotamento (esperado) de 5mC marcas em suas retinas7 .
O passo crítico na deteção de immunohistochemical 5mC é a otimização do tratamento de cortes histológicos com HCl: menos do que 15 min pré-tratamento não é esperado para produzir resultados reprodutíveis, Considerando que o tratamento excessivo com HCl destrói o nuclear arquitetura. Achamos melhor resultado após incubação 30 min com HCl. Recomendamos sempre usar HCl fresco diluído e solução PFA 4% feita recentemente para fixação de tecido de desnaturação e da retina de DNA.
Para solucionar os resultados, recomendamos incluir três ou quatro repetições biológicas, otimizando o sinal 5mC. Enquanto cada indivíduo definido de coloração imuno-histoquímica pode gerar resultados ligeiramente diferentes (mais ou menos brilhantes heterocromático regiões), que é esperado em imuno-histoquímica método, o 5mC e 5hmC distribuição nuclear dentro do conjunto de individual das secções são esperadas para ser muito reprodutíveis, para contanto que o protocolo é seguido.
Esta técnica também tem limitação como consistentemente observamos variabilidade na distribuição de 5mC nos núcleos de células fotorreceptoras dentro da mesma seção. Encontramos alguns núcleos mostrou sinal de 5mC forte enquanto núcleo de células adjacentes não mostrou nenhum sinal de 5mC. Isto é devido a limitação em desmascarar 5mC antígeno por tratamento de HCl nas seções congeladas.
A importância desta técnica permite 5mC localização sem tratamento de DNase e proteinase K, levando a melhor preservação do chromocenters. Esta técnica é esperada para trabalhar robustamente em todas as seções de todos os tecidos de animais vertebrados, 5mC escriturada, marcas de 5hmC e processada com uma abordagem semelhante, não só o retina do rato, por enquanto o protocolo é seguido.
Disclosures
Os autores não têm nada para divulgar.
Acknowledgments
Este trabalho foi financiado por um subsídio SBIR (1R44EY027654-01A1).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Supplies | |||
| 29G1/2 ULTRA-FINE | BD Biosciences | 329461 | |
| Ophthalmic scissor | Fine Science tools, Inc. | 15000-03 | |
| PAP pen | RPICORP.com | 195505 | |
| Microslide Superfrost plus | VWR | 48311-703 | |
| Reagent | |||
| Paraformaldehyde | Electron Microscope Science | 15710 | |
| 1x PBS | Corning | 21-031-CV | |
| Sucrose | Sigma | S9378 | |
| Tissue-Tek Optical cutting compound (OCT) | VWR | 4583 | |
| Triton X 100 | Sigma | T9284 | |
| 6 N HCl | VWR analytical | BDH7204-1 | |
| Tris-HCl pH 8.3 | Teknova | T1083 | |
| Goat serum | Jackson Immunoresearch | 005-000-121 | |
| 5mC | Genway Biotech | GWB-BD5190 | |
| 5hmC | Active Motif | 39791 | |
| LaminB1 | Abcam | Ab16048 | |
| Cy2 AffiniPure Goat Ant-Rabbit IgG | Jackson Immunoresearch | 111-225-1444 | |
| Cy3 AffiniPure Goat Ant-Mouse IgG | Jackson Immunoresearch | 115-585-166 | |
| DAPI | Thermo Fisher Scientific | D1306 | |
| Prolong Gold Antifade medium | Thermo Fisher Scientific | P36930 | |
| Equipment | |||
| MICRM HM 550 | Thermo Fisher Scientific | 388114 | |
| Confocal microscope | Zeiss |
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