Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Developmental Biology
Click here for the English version

Developmental Biology

5-metilsitozin ve gelişmekte olan 5-arasında bakterilerde görülen immunohistokimyasal tespiti ve Postmitotic fare Retina

Published: August 29, 2018 doi: 10.3791/58274
Automatic Translation
1, 1, 1, 1
1BioTime, Inc

Summary

Bu rapor amacı sağlam immunohistokimyasal algılama epigenetik işaretleri için iletişim kuralı tanımlamak için fare retina 5-metilsitozin (5mC) ve 5 arasında bakterilerde görülen (5hmC) gelişmekte olan ve postmitotic.

Abstract

Epigenetik Retina gelişimi getirmek a yeni yüzey insan Retina Dejeneratif hastalıkları çeşitli mekanizmaları hakkında anlayış ve yeni tedavi yaklaşımları kesin olarak belirlemek için söz bir iyi okudu araştırma alanıdır. Fare retina nükleer mimarisi iki farklı desen düzenlenmiştir: geleneksel ve ters. Geleneksel desen active euchromatin nükleer iç bulunduğu varken heterochromatin çekirdeği, çevre için nerede lokalize evrenseldir. Buna ek olarak, ters nükleer desen nerede heterochromatin nükleer merkezine yerelleştirir ve euchromatin nükleer çevre içinde bulunduğu yetişkin çubuk photoreceptor hücre çekirdeği için benzersizdir. DNA metilasyonu ağırlıklı olarak chromocenters görülmektedir. DNA metilasyonu sitozin artıkları (5-metilsitozin, 5mC) üzerinde dinamik bir kovalent modifikasyon birçok genler organizatörü bölgelerde zenginleştirilmiş KSY dinucleotides biridir. DNA metilasyonu geliştirme sırasında üç DNA methyltransferases (DNMT1, DNMT3A ve DNMT3B) katılmaktadır. İmmunohistokimyasal tekniklerle algılama 5mC sonuçları, değişkenlik 5mC modifiye bazlar da dahil olmak üzere tüm DNA üsleri çift iplikçikli DNA sarmalının içinde gizli olarak katkıda çok zordur. Ancak, 5mC dağıtım geliştirme sırasında detaylı tarif çok bilgilendirici. Burada, 5mC ve başka bir epigenetik DNA işaretleyicisi 5-hangi gelişmekte olan "açık", transcriptionally aktif kromatin ile colocalizes arasında bakterilerde görülen (5hmC), sağlam immunohistokimyasal algılanması için tekrarlanabilir bir tekniğini tanımlamak ve postmitotic fare retina.

Introduction

Epigenetik düzenleme geliştirme ve fare retinanın postmitotic homeostazı araştırma, biyolojik mekanizmaları kader tayini, retinogenesis ve hücre kontrol yeni bir anlayış getirmek için hangi sözler hücre türüne özgü heyecan verici alanıdır metabolik fonksiyon aynı zamanda hücre patolojiler, hücre ölümü ve yeniden oluşturma işlemi1,2,3,4,5,6,7,8 , 9 , 10 , 11 , 12 , 13. kromatin uğrar dinamik değişiklikler geliştirme, hem de değişken dış sinyallere yanıt stres, metabolik veya Ölüm uyaranlara6,14,15, hücre olup 16 , 17 , 18. fare çekirdeği, kromatin active euchromatin ve etkin olmayan heterochromatin6,19,20ayrılmıştır. Heterochromatin hatları nükleer çevre ve çekirdekçik ise Interphase çekirdeğinde euchromatin çekirdeği iç bölgesinde yer alır. Bu desen geleneksel denir ve ökaryotlarda son derece korunmuş. Buna ek olarak, fare ve sıçan gibi gece hayvanlarda çubuk çekirdeği nerede çekirdeği oluşturan en dıştaki Kabuk6,18euchromatin tarafından çevrili merkezi heterochromatin tarafından işgal desen ters, 20. Doğumda, konvansiyonel nükleer mimari çubuk çekirdeği var. Çubuk çekirdeği inversiyon konvansiyonel nükleer mimarisini modelleme geliştirme sırasında oluşur. Bu işlem sırasında periferik heterochromatin nükleer çevre--dan ayıran ve chromocenters birlikte çekirdeği6,18merkezi tek bir chromocenter forma sigorta.

Genomik DNA metilasyonu yerel kromatin uyum21kontrolünde katılır. Birçok fare genleri22,23,24,25,26 genlerinde organizatörü bölgesinde zenginleştirilmiş KSY dinucleotides, sitozin kalıntılarının 5' konumundaki DNA metilasyonu oluşur içinde intergenic gibi iyi ve düzenleyici elemanlarının27taşımak intron bölgeleri. Metilasyon proksimal Rehberleri21,24 CpG adaları ve gen arttırıcılar27,28 CpG dizileri bivalent kromatin, birçok içeren dinamik durumunu düzenlenmesinde önemlidir geliştirme, kanser ve yaşlanma29,30,31,32,33,34 önemli rol oynayan gelişimsel genler/transkripsiyon faktörleri . DNA metilasyonu fare geliştirme35sırasında üç DNA methyltransferases (DNMTs) katılmaktadır. Tüm üç DNMTs fare Retina geliştirme36 ve retina özgü değişikliklerin Dnmt genler etkisi Retina gelişimi2,7sırasında ifade edilir. Arasında bakterilerde görülen (5hmC) 5-metilsitozin (5mC) demethylation oksidatif ürünüdür. Üç 5mC demethylation37,38,39yılında on-Eleven Translocation (TET) enzimler katılmak. Hydroxymethyl-C değişiklik rehberleri, gen organları ve gen zengin ve aktif kopya etmek bölgeleri27,40içinde intergenic genom dizileri zenginleştirilmiştir.

Çeşitli açıklanan yaklaşımlar hücreleri41,42,43,44,45,46değişen DNA metilasyonu desenleri belirlemek için bir kýsmýný etkinleştirme KSY zengini bölgeleri rehberleri ve arttırıcılar içinde kesin değişiklikler üzerinde odaklanan diğerleri DNA metilasyon genel değişiklikleri miktarının. Yöntemleri için hafiye ve 5hmC miktar da bildirilen47immünhistokimya13tarafından da dahil olmak üzere, vardı. Güçlü çekirdek geliştirme 5mC ve 5hmC değişiklikleri izlemeyi etkinleştir immunohistokimyasal teknikler ve onun postmitotic hücreler, kromatin dynamics in situ harici veya dahili değişiklikler operasyona için çok bilgilendirici etkileyen hücreleri4,13,48,49. Ancak, bu yaklaşım DNA metilasyonu ve sitozin değişiklikler histolojik hazırlıkları algılama ile ilgili teknik sorunlar nedeniyle hydroxymethylation değişiklikleri küçümseyen için eğilimli olur. Nonpolar DNA bazlarına, bunun nedeni, 5mC ve 5hmC-modified sitozin dahil, Çift iplikçikli DNA sarmalı50merkezi içinde gizlidir ve maskesini gerektirir. Bu özellikle sert tedavi uygulandığında hangi hızla bilgilendirici özgün doku organizasyonu kaybedebilirsiniz donmuş histolojik hazırlıkları, meydan okuyor.

Fare retina sinir kalkınma ve postmitotic homeostazı DNA metilasyonu katkısını incelemek için mükemmel bir modeldir. Orada sadece 6 tip nöronların (çubuk ve koni photoreceptors, amacrine, bipolar, yatay ve ganglion hücreleri), bir gliyal hücre tipi (Muller glia) ve bir neuroepithelial hücre türü (retina pigment epiteli)51. Retina hücre tipleri son zamanlarda tek-base çözünürlük1,5,9,12okudu DNA metilasyonu18,19, farklı desenler için rapor edilmiştir. Biz son zamanlarda 5mC desen Retina hücreleri ve yetişkin fare retina, nerede tüm üç DNA methyltransferases koşullu hedefleyerek kaldırılmıştır çekirdekleri değişimler çekirdeklerin içindeki dağılımı operasyona immünhistokimya uygulama rapor 7. nerede Retina hücrelerindeki DNA metilasyonu varlığı sadece olumlu olarak görülebilir veya negatif sinyal hypermethylated hücreleri geçiren apoptosis, raporlar, bir sayısıyla karşılaştırıldığında yaklaşımımız algılama belirli kromatin etkin Biz ve çeşitli gruplar bildirdi ve yukarıda açıklanan Retina hücre hücre çekirdeği içinde düzenleme5,6,7,18,19,36 , 52. burada, 5mC ve 5hmC de bizim özgün rapordan7 çoğaltmak mümkün veri göstermek paraformaldehyde-sabit donmuş histolojik bölümlerinde detaylı olarak algılama immunohistokimyasal (IHC) tekniğini tanımlamak .

Protocol

Fareler ile tüm yordamları Çocuk Hastanesi Oakland Araştırma Enstitüsü hayvan bakım ve kullanım Komitesi tarafından onaylanmış ve vizyon ve Oftalmoloji (ARVO) deyim kullanmak için Araştırma Derneği yapıştırılır iletişim kuralları uyarınca gerçekleştirilen hayvan oftalmik ve vizyon araştırma.

1. doku hazırlık Immunostaining için

  1. C57 BL/6J farelerin embriyonik gün (E) 16, postnatal gün (P) ötenazi 0, P15 ve işten çıkarma (E16 ve P0 fareler) tarafından takip karbondioksit (CO2) tarafından P90.
  2. 29G 1/2 iğne göz dorsal tarafta ile hemen anlatabilirsin fare gözleri delmiş. 5 dakika (min) % 4 paraformaldehyde (PFA) 1 ml fosfat tamponlu tuz (1 x PBS) pH 8.0 oda sıcaklığında kuluçkaya.
  3. P0, P15 ve P90 göz bardak yapmak için kornea teşrih ve lens iyi oftalmik makasla gözleri % 4 iken İngiltere'de yılın.
    Not: Atla E16 gözleri gözleri için bu adım çok küçük.
  4. Göz bardak (P0, P15 ve P90) ve tüm gözler (E16) %4 oranında tamir PFA oda sıcaklığında 20 dakika. O zaman göz bardak ve tüm gözler iki kez 1 mL 1 x PBS için oda sıcaklığında 10 dakika yıkayın.
  5. Cryoprotect göz su bardağı ve bütün 1xPBS, pH 8.0 içeren % 10 sükroz 1 saat içinde gözleri. 1 saat için % 20 sükroz 1 x PBS içinde tutun ve sonra 1 x PBS gecede 4 ° C'de % 30 sükroz emdirmek
  6. Ertesi gün, en iyi kesim ısı bileşik (OCT), (500 µL) cryomolds göz bardak ve tüm gözler gömmek, ek-bir kuru buz/etanol banyosunda donma ve-80 ° C'de depolayın
  7. Bütün gözleri ve katıştırılmış göz bardak kalıpları-80 ° C'den kaldırmak ve -20 ° C-1 saat önce cryosectioning için equilibrate sağlar.
  8. Retina kesitleri (12 µm kalınlığında) paralel bir cryostat-20 ° C'de kullanarak optik sinir başı ile temporonasal eksen için kesmek
  9. Mikroskop slayt53 ve mağaza-80 ° C'de Retina bölümleri bağlama

2. 5-mC ve 5-hmC antikorlar ile Immunostaining

  1. Slaytlarda hidrofobik bariyer kalemle monte Retina bölümleri çevreler. Hidrofobik bariyer kalem doku leke için gerekli antikor seviyesini azaltır.
  2. 1 x PBS 10 min için Retina bölümlerini 200 µL hemen ile yıkayın.
  3. % 0.1 ile 200 µL bölümleri Retina permeabilize Triton X-100 1 x PBS (PBS-T) Oda sıcaklığında 10 dakika içinde.
  4. Retina bölümleri ile 200 µL 30 dk için taze 1 x PBS 37 ° C kuluçka 2 N hidroklorik (HCl) asit yapılan denatüre.
    Not: Dikkatli titrasyon HCl tedavi 5mC sinyal en iyi duruma getirmek için gereklidir.
  5. Her zaman 5mC sinyal54en iyi duruma getirme sırasında biyolojik çoğaltır (3-4) içerir.
    Not: Biz 4 saat puan (15 dk, 30 dk, 1 saat ve 2 h) antijen alımı yaptı ve bulunan 30 dk kuluçka 5mC sinyal için en iyi yöntemdir. HCl ile uzun kuluçka yetersizlik çekirdeği 5mC sinyal yerelleştirmek için lider çekirdeklerin yapısını alçaltır.
  6. Denatürasyon sonra 0.1 100 µL ekleyerek Retina bölümleri nötralize M Tris-HCl (pH 8.3) Retina bölümlerinde 10 dk için.
  7. Çözüm engelleme 500 µL bölümlerde kuluçkaya (%5 preimmune normal keçi serum %0,1 1 x PBS Triton X-100) nem Odası Oda sıcaklığında 1 h için.
  8. Engelleme sonra anti-5mC ekleyin; Anti-5hmC antikorlar 1:500 çözüm Retina bölümlerine kapatmaktır seyreltilmiş.
  9. Nem odasında 4 ° C'de bölümleri gecede Retina kuluçkaya.
  10. Sonraki gün yıkama, Retina bölümleri 3 kere (10-15 dk her zaman) ile % 0,1 PBS-T ve çözüm ile ilgili ikincil antikorlar engelleme kuluçkaya (keçi Anti-tavşan ve keçi Anti-fare seyreltilmiş; IgG, 1: 1000), DAPI (4', 6 - içeren diamidino-2-phenylindole) çözüm çözüm kapatmaktır 1 h için oda sıcaklığında (1 µg/mL).
    Not: immunodetection tüm aşamalarında bölümleri kurutma önlemek.
  11. Slaytları üç saat 1 mL % 0.1 ile yıkayın PBS-T.
  12. Son yıkama sonra sulu montaj orta bir coverslip altında bölümlerle dağ ve renksiz oje ile kapatın.

3. confocal immünhistokimya

  1. Retina pigment epiteli optik bir yolu (Örneğin, kadar), tutarlılık sağlamak için her zaman karşı karşıya Kupası yok için bölümleri gelecek şekilde yönlendirin.
  2. Görüntü yakalama bölümlerinin immunostained Retina, 63 X (bir objektif lens büyütme) 2 X ile gerçekleştirmek veya 3 X zoom.
  3. Her seçili resmin birden çok optik bölüm oluşturmak (z-yığınlar) tüm 3 Kanalları (kırmızı, yeşil ve mavi, RGB) 0,35 µm adım kullanma.
    Not: Bir örnek 10-20 X görselleştirildiği son büyütme (bir objektif lens büyütme) 63 X, sırasıyla, (genellikle kullanılan) 10 X oküler lens ile birlikte zaman olacaktır.
    5mC ve 5hmC sinyal bulmak için sıkıştırılmış optik yığın görselleştirmek

Representative Results

5-metilsitozin (5mC) ve 5 arasında bakterilerde görülen (5hmC) ve postmitotic retina Retina geliştirme sırasında dağılımı belirlemek için biz immunostained C57BL/6J fare Retina bölümünden E16, P0, P15 ve P90 antikorlar belirli ile 5mC ve 5hmC.

Zayıf boyama bütün hücre çekirdeği (Şekil 1a) gözlenmiştir E16 5mC boyama hücre çekirdeği chromocenters içinde güçlü oldu. Hücre çekirdeği için sınırlı olduğunu ve yok oldu 5hmC boyama chromocenters (Şekil 1b) üzerinden.

P0 retinada 5mC sinyal hücre çekirdeği ve nükleer çevre (Şekil 2a, ok ve ok başı) chromocenters lokalize. Biz de 5mC hücre çekirdeği chromocenters arasında zayıf boyama gözlenen. 5hmC sinyal güçlü hücre çekirdeği chromocenters (Şekil 2b) dışında bulunması. Daha fazla çekirdeği 5mC ve 5hmC iç neuroblast katmanı (INBL) (Şekil 2 c, noktalı çizgi) ile lekeli bulduk

P15 retinada bulduk güçlü boyama 5mC ve 5hmC dış nükleer tabaka (yalnız), iç nükleer tabaka (INL) ve ganglion hücre katmanı (un) (Şekil 3). LNIZCA (rod photoreceptors), 5mC sinyal hücre çekirdeği ve nükleer çevre (Şekil 3a-3 c, 3 g) chromocenters mevcuttu. 5hmC sinyal chromocenters (rakamlar 3d-3f) dışında bütün hücre çekirdeği bulundu. Transmisyon Elektron mikroskobu P15 retina üzerinde yapılan dağıtım heterochromatic etki alanlarının çubuk hücre çekirdeği içinde 5mC antikor sinyal (rakamlar 3 h ve 3i) ile bulundu benzer gösterir.

INL ve un 5mC boyama hücre çekirdeği chromocenters içinde güçlü ve zayıf boyama da bütün hücre çekirdeği (rakamlar 3j-3 l ve 3r-3t) gözlenmiştir. 5mC aksine, 5hmC sinyal chromocenters INL ve un (rakamlar 3 m-3o ve 3u-3w) dışında bütün hücre çekirdeği için yerelleştirilmiş. Biz güçlü gözlenen GCL hücre çekirdeği periferal 5hmC sinyal.

Yetişkin çubuk photoreceptors 5hmc sinyal nükleer çevre (rakamlar 4 d-4f) sınırlı olduğunu 5mC sinyal chromocenter ve hücre çekirdeği (rakamlar 4a-4 c) nükleer çevre sınırlı oldu.

Figure 1
Şekil 1. 5-metilsitozin ve 5-arasında bakterilerde görülen fare retina yerelleştirme embriyonik gün 16.
Immunostaining C57BL/6J retinanın 5mC antikorlar ile (kırmızı bir) ve 5hmC (yeşil, b). E16 5mC sinyal çok güçlü hücre çekirdeği chromocenters ve aynı zamanda bütün hücre çekirdeği çok daha alt düzeyde bulunması. 5hmC boyama sadece hücre çekirdeği sınırlı oldu. Paneli c birleştirilmiş 5mC ve 5hmC görüntü temsil eder. Çekirdeklerin DAPI (mavi, c) ile counterstained. İnsets görüntüleri yıldız işareti ile gösterilen alanı büyütme oranlarını temsil eder. Ölçek çubuğu: 5 µm. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Figure 2
Şekil 2. İmmunohistokimyasal 5-metilsitozin ve 5-arasında bakterilerde görülen fare retina postnatal gün 0 saat boyama.
Immunolabeling C57BL/6J retinanın 5mC antikorlar ile (kırmızı bir) ve 5hmC (yeşil, b). P0 retinada 5mC ve 5hmC hem dış neuroblast katman (şey) hem de iç neuroblast katman (INBL). a) 5mC sinyal güçlü chromocenters (ok) ve hücre çekirdeği (ok ucu) nükleer çevre mevcuttur. Zayıf 5mC boyama hücre çekirdeği chromocenters arasında da görülmektedir. b) 5hmC boyama hücre çekirdeği için sınırlı olduğunu ve güçlü sinyal INBL (noktalı çizgi panel c) görülmektedir. Paneli c birleştirilmiş 5mC ve 5hmC görüntü temsil eder. Çekirdeklerin DAPI (mavi, c) ile counterstained. İnsets görüntüleri yıldız işareti ile gösterilen alanı büyütme oranlarını temsil eder. Ölçek çubuğu: 5 µm. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Figure 3
Şekil 3. Doğum sonrası gün 15, 5-metilsitozin ve 5 arasında bakterilerde görülen dağılım fare retina içinde.
Immunostaining C57BL/6J retinanın anti-5mC ve 5hmC antikorları (a-g, j-y) ile. Dış nükleer katmanda (yalnız) (rod photoreceptors), 5mC sinyal (kırmızı, a) genellikle hücre çekirdeği (ok ucu, b) chromocenters ile çakışacak ve ayrıca nükleer çevre (ok, b) yerelleştirir. Masası b (kırmızı) ve c (gri) temsil eden görüntü yıldız işareti ile gösterilen alanı büyütme bir. 5hmC sinyal (yeşil, d) chromocenters dışında bütün hücre çekirdeği sınırlı. Masası'e (yeşil) ve f (gri) g birleştirilmiş 5mC ve 5hmC resmi temsil eden resim d Panel içinde yıldız işareti ile gösterilen alanı büyütme oranlarını temsil eder. Çekirdeklerin DAPI ile counterstained. Panel s ve photoreceptor çekirdeği postnatal gün 15 gösteren dağıtım heterochromatic etki alanlarının, iletim elektron mikroskobu görüntüsü vardır. Panel h siyah ok ucu heterochromatin nükleer çevre için kırmızı oklar işaret ederken çubuk photoreceptor çekirdeği heterochromatic etki alanları gelin Masası'ndaki kırmızı ok uçları tek çubuk photoreceptor çekirdeği paneli ı. genişlemiş işaret eder. INL (j-q) ve un hücre çekirdeği (r-y), 5mC sinyal (kırmızı) çevre içinde mevcut chromocenters için yerelleştirilmiştir ve zayıf boyama da hücre çekirdeği geri kalanı algılanır. Paneli k (kırmızı) ve ben (gri) görüntü j yıldız işareti ile gösterilen alanı büyütme oranlarını temsil eder. 5hmC (yeşil) INL ve un hücre çekirdeği içinde boyama bütün Hücre çekirdeğine sınırlı olduğunu. Güçlü 5hmC un hücreleri nükleer çevre boyama unutmayın. Panel q ve y sırasıyla yıldız görüntü p ve x işareti ile gösterilen alanı büyütme oranlarını temsil ederken paneli p ve x birleştirilmiş 5mC ve 5hmC görüntü temsil eder. Çekirdeklerin DAPI ile counterstained. Ölçek çubuğu: 5 µm. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Figure 4
Şekil 4. 5-metilsitozin ve 5 arasında bakterilerde görülen çubuk photoreceptor çekirdeği içinde C57BL/6J fare retinanın, dağılım postnatal gün 90.
5mC boyama (kırmızı, bir) güçlü olan hücre çekirdeği ve aynı zamanda zayıf hediye chromocenter nükleer çevre vardır. Masası b (kırmızı) ve c (gri) temsil eden görüntü yıldız işareti ile gösterilen alanı büyütme bir. 5hmC (yeşil, d) boyama sadece nükleer çevre paneli e (yeşil) sınırlı olduğunu ve birleştirilmiş 5mC ve 5hmC görüntü paneli h ise g temsil eden görüntü d Panel içinde yıldız işareti ile gösterilen alanı f (gri) temsil büyütme ile gösterilen alanı büyütme olduğunu Resimdeki g. çekirdeği DAPI (mavi) ile counterstained yıldız. Ölçek çubuğu: 5 µm. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Discussion

DNA metilasyonu ve hydroxymethylation dinamik ve tersinir DNA değişiklikleri, hangi modulatethe çeşitli bir de olduğu gibi postmitotic hücreleri gelişmekte olan biyolojik mekanizmaları vardır. Burada, 5mC ve 5hmC DNA değişiklikler in situ (anti-5mC ve anti-5hmC antikorları kullanarak) immunohistokimyasal tekniği ile paraformaldehyde sabit donmuş bölümlerinde fare retina, algılamak için tekrarlanabilir bir tekniğini tanımlamak ve sağlamak iyileştirilmesi ve sonuçları, özellikle birkaç farklı örnekler karşılaştırırken standartlaştırılması için yönergeler. Biz daha önce Dnmt1, Dnmt3a ve Dnmt3b DNA metiltransferaz genler retina özel hedefleme ile fare retina 5mC değişimler betimlemek için kullanılan bu yöntem ve 5mC işaretleri içine onların Retina7 (beklenen) tükenmesi bildirdi .

HCl ile histolojik bölümlerin tedavisinin optimizasyonu 5mC immunohistokimyasal bulunması önemli adımdır: aşırı tedavi HCl ile nükleer yok eder ise 15 dk Önarıtma tekrarlanabilir sonuçlar üretmek için değil beklenenden daha az mimarisi. 30 dk kuluçka HCl ile sonra en iyi sonuç bulundu. Biz her zaman taze seyreltik HCl ve taze yapılmış % 4 İngiltere'de yılın çözüm DNA denatürasyon ve Retina doku fiksasyon için kullanmanızı öneririz.

Sonuçları gidermek için 3-4 biyolojik çoğaltır 5mC sinyal en iyi duruma getirme sırasında eklemek öneririz. Her birey, ayarlı iken immunohistokimyasal boyama biraz farklı sonuçlar (daha fazla veya daha az parlak heterochromatic bölgeler), hangi bireysel kümesi içinde immunohistokimyasal yöntemi, 5mC ve 5hmC nükleer dağıtım bekleniyor verebilir: bölümlerini protokolü takip sürece için yeniden üretilebilir olması bekleniyor.

Biz sürekli değişkenlik 5mC dağıtım photoreceptor hücre çekirdeği içinde aynı bölüm içinde gözlemlediği gibi bu teknik aynı zamanda sınırlaması vardır. Biz güçlü 5mC sinyal bitişik hücre çekirdeği 5mC sinyal gösterdi gösterdi bazı çekirdekleri bulundu. Bu sınırlama nedeniyle maskesinin 5mC antijen tarafından HCl tedavi donmuş bölümlerinde bulunmaktadır.

Bu teknik önemini 5mC yerelleştirme chromocenters daha iyi korunması için önde gelen DNaz ve İndinavir K tedavi olmadan sağlar. Bu teknik sağlam herhangi bir bölümü tüm omurgalı hayvan dokuları, taşıma 5mC, 5hmC işaretleri üzerinde çalışmak için beklenen ve protokolü takip sürece için benzer bir yaklaşım ile sadece fare retina, işlenmiş.

Disclosures

Yazarlar ifşa gerek yok.

Acknowledgments

Bu eser desteklenen bir SBIR hibe (1R44EY027654-01A1).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Supplies
29G1/2 ULTRA-FINE BD Biosciences 329461
Ophthalmic scissor Fine Science tools, Inc.  15000-03
PAP pen RPICORP.com 195505
Microslide Superfrost plus VWR 48311-703
Reagent
Paraformaldehyde Electron Microscope Science 15710
1x PBS Corning 21-031-CV
Sucrose Sigma S9378
Tissue-Tek Optical cutting compound (OCT) VWR 4583
Triton X 100 Sigma T9284
6 N HCl VWR analytical  BDH7204-1
Tris-HCl pH 8.3 Teknova T1083
Goat serum Jackson Immunoresearch 005-000-121
5mC Genway Biotech  GWB-BD5190
5hmC Active Motif 39791
LaminB1 Abcam Ab16048
Cy2 AffiniPure Goat Ant-Rabbit IgG Jackson Immunoresearch 111-225-1444
Cy3 AffiniPure Goat Ant-Mouse IgG Jackson Immunoresearch 115-585-166
DAPI Thermo Fisher Scientific D1306
Prolong Gold Antifade medium Thermo Fisher Scientific P36930
Equipment
MICRM HM 550 Thermo Fisher Scientific 388114
Confocal microscope Zeiss

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Merbs, S. L., et al. Cell-specific DNA methylation patterns of retina-specific genes. PLoS One. 7 (3), e32602 (2012).
  2. Nasonkin, I. O., et al. Conditional knockdown of DNA methyltransferase 1 reveals a key role of retinal pigment epithelium integrity in photoreceptor outer segment morphogenesis. Development. 140 (6), 1330-1341 (2013).
  3. Rhee, K. D., Yu, J., Zhao, C. Y., Fan, G., Yang, X. J. Dnmt1-dependent DNA methylation is essential for photoreceptor terminal differentiation and retinal neuron survival. Cell Death & Disease. 3, e427 (2012).
  4. Wahlin, K. J., et al. Epigenetics and cell death: DNA hypermethylation in programmed retinal cell death. PLoS One. 8 (11), e79140 (2013).
  5. Aldiri, I., et al. The Dynamic Epigenetic Landscape of the Retina During Development, Reprogramming, and Tumorigenesis. Neuron. 94 (3), 550-568 (2017).
  6. Eberhart, A., et al. Epigenetics of eu- and heterochromatin in inverted and conventional nuclei from mouse retina. Chromosome Research. 21 (5), 535-554 (2013).
  7. Singh, R. K., et al. Dnmt3a and Dnmt3b cooperate in photoreceptor and outer plexiform layer development in the mammalian retina. Experimental Eye Research. 159, 132-146 (2017).
  8. Farinelli, P., et al. DNA methylation and differential gene regulation in photoreceptor cell death. Cell Death & Disease. 5, e1558 (2014).
  9. Mo, A., et al. Epigenomic landscapes of retinal rods and cones. Elife. 5, e11613 (2016).
  10. Popova, E. Y., Barnstable, C. J., Zhang, S. S. Cell type-specific epigenetic signatures accompany late stages of mouse retina development. Advances in Experimental Medicine and Biology. 801, 3-8 (2014).
  11. Kim, J. W., et al. NRL-Regulated Transcriptome Dynamics of Developing Rod Photoreceptors. Cell Reports. 17 (9), 2460-2473 (2016).
  12. Wang, L., et al. Retinal Cell Type DNA Methylation and Histone Modifications Predict Reprogramming Efficiency and Retinogenesis in 3D Organoid Cultures. Cell Reports. 22 (10), 2601-2614 (2018).
  13. Perera, A., et al. TET3 is recruited by REST for context-specific hydroxymethylation and induction of gene expression. Cell Reports. 11 (2), 283-294 (2015).
  14. Mimura, I., et al. Dynamic change of chromatin conformation in response to hypoxia enhances the expression of GLUT3 (SLC2A3) by cooperative interaction of hypoxia-inducible factor 1 and KDM3A. Molecular and Cellular Biology. 32 (15), 3018-3032 (2012).
  15. Nair, N., Shoaib, M., Sorensen, C. S. Chromatin Dynamics in Genome Stability: Roles in Suppressing Endogenous DNA Damage and Facilitating DNA Repair. Int J Mol Sci. 18 (7), (2017).
  16. Mekhail, K., Moazed, D. The nuclear envelope in genome organization, expression and stability. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 11 (5), 317-328 (2010).
  17. Misteli, T., Soutoglou, E. The emerging role of nuclear architecture in DNA repair and genome maintenance. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 10 (4), 243-254 (2009).
  18. Solovei, I., et al. Nuclear architecture of rod photoreceptor cells adapts to vision in mammalian evolution. Cell. 137 (2), 356-368 (2009).
  19. Solovei, I., et al. LBR and lamin A/C sequentially tether peripheral heterochromatin and inversely regulate differentiation. Cell. 152 (3), 584-598 (2013).
  20. Solovei, I., Thanisch, K., Feodorova, Y. How to rule the nucleus: divide et impera. Current Opinion in Cell Biology. 40, 47-59 (2016).
  21. Jaenisch, R., Bird, A. Epigenetic regulation of gene expression: how the genome integrates intrinsic and environmental signals. Nature Genetics. 33, Suppl . 245-254 (2003).
  22. Cross, S. H., Charlton, J. A., Nan, X., Bird, A. P. Purification of CpG islands using a methylated DNA binding column. Nature Genetics. 6 (3), 236-244 (1994).
  23. Antequera, F., Bird, A. Number of CpG islands and genes in human and mouse. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 90 (24), 11995-11999 (1993).
  24. Antequera, F., Boyes, J., Bird, A. High levels of de novo methylation and altered chromatin structure at CpG islands in cell lines. Cell. 62 (3), 503-514 (1990).
  25. Fouse, S. D., et al. Promoter CpG methylation contributes to ES cell gene regulation in parallel with. Oct4/Nanog, PcG complex, and histone H3 K4/K27 trimethylation. Cell Stem Cell. 2 (2), 160-169 (2008).
  26. Elango, N., Yi, S. V. DNA methylation and structural and functional bimodality of vertebrate promoters. Molecular Biology and Evolution. 25 (8), 1602-1608 (2008).
  27. Lister, R., et al. Global epigenomic reconfiguration during mammalian brain development. Science. 341 (6146), 1237905 (2013).
  28. Colwell, M., et al. Evolutionary conservation of DNA methylation in CpG sites within ultraconserved noncoding elements. Epigenetics. 13 (1), 49-60 (2018).
  29. Lee, S. M., et al. Intragenic CpG islands play important roles in bivalent chromatin assembly of developmental genes. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 114 (10), E1885-E1894 (2017).
  30. Charlet, J., et al. Bivalent Regions of Cytosine Methylation and H3K27 Acetylation Suggest an Active Role for DNA Methylation at Enhancers. Molecular Cell. 62 (3), 422-431 (2016).
  31. Bernhart, S. H., et al. Changes of bivalent chromatin coincide with increased expression of developmental genes in cancer. Scientific Reports. 6, 37393 (2016).
  32. Curry, E., et al. Genes Predisposed to DNA Hypermethylation during Acquired Resistance to Chemotherapy Are Identified in Ovarian Tumors by Bivalent Chromatin Domains at Initial Diagnosis. Cancer Research. 78 (6), 1383-1391 (2018).
  33. Rakyan, V. K., et al. Human aging-associated DNA hypermethylation occurs preferentially at bivalent chromatin domains. Genome Research. 20 (4), 434-439 (2010).
  34. Smith, Z. D., Meissner, A. DNA methylation: roles in mammalian development. Nature Reviews Genetics. 14 (3), 204-220 (2013).
  35. Chen, T., Li, E. Structure and function of eukaryotic DNA methyltransferases. Current Topics in Developmental Biology. 60, 55-89 (2004).
  36. Nasonkin, I. O., et al. Distinct nuclear localization patterns of DNA methyltransferases in developing and mature mammalian retina. The Journal of Comparative Neurology. 519 (10), 1914-1930 (2011).
  37. Scourzic, L., Mouly, E., Bernard, O. A. TET proteins and the control of cytosine demethylation in cancer. Genome Medicine. 7 (1), 9 (2015).
  38. Gong, Z., Zhu, J. K. Active DNA demethylation by oxidation and repair. Cell Research. 21 (12), 1649-1651 (2011).
  39. Ito, S., et al. Tet proteins can convert 5-methylcytosine to 5-formylcytosine and 5-carboxylcytosine. Science. 333 (6047), 1300-1303 (2011).
  40. Pastor, W. A., et al. Genome-wide mapping of 5-hydroxymethylcytosine in embryonic stem cells. Nature. 473 (7347), 394-397 (2011).
  41. Suzuki, M. M., Bird, A. DNA methylation landscapes: provocative insights from epigenomics. Nature Reviews Genetics. 9 (6), 465-476 (2008).
  42. Kurdyukov, S., Bullock, M. DNA Methylation Analysis: Choosing the Right Method. Biology (Basel). 5 (1), (2016).
  43. Lisanti, S., et al. Comparison of methods for quantification of global DNA methylation in human cells and tissues). PLoS One. 8 (11), e79044 (2013).
  44. Armstrong, K. M., et al. Global DNA methylation measurement by HPLC using low amounts of DNA. Biotechnology Journal. 6 (1), 113-117 (2011).
  45. consortium, B. Quantitative comparison of DNA methylation assays for biomarker development and clinical applications. Nature Biotechnology. 34 (7), 726-737 (2016).
  46. Bock, C., et al. Quantitative comparison of genome-wide DNA methylation mapping technologies. Nature Biotechnology. 28 (10), 1106-1114 (2010).
  47. Song, C. X., He, C. The hunt for 5-hydroxymethylcytosine: the sixth base. Epigenomics. 3 (5), 521-523 (2011).
  48. Abakir, A., Wheldon, L., Johnson, A. D., Laurent, P., Ruzov, A. Detection of Modified Forms of Cytosine Using Sensitive Immunohistochemistry. Journal of Visualized Experiments. (114), (2016).
  49. Santos, F., Dean, W. Using immunofluorescence to observe methylation changes in mammalian preimplantation embryos. Methods in Molecular Biology. 325, 129-137 (2006).
  50. Watson, J. D., Crick, F. H. The structure of DNA. Cold Spring Harbor Symposia on Quantitative Biology. 18, 123-131 (1953).
  51. Swaroop, A., Kim, D., Forrest, D. Transcriptional regulation of photoreceptor development and homeostasis in the mammalian retina. Nature Reviews Neuroscience. 11 (8), 563-576 (2010).
  52. Kizilyaprak, C., Spehner, D., Devys, D., Schultz, P. In vivo chromatin organization of mouse rod photoreceptors correlates with histone modifications. PLoS One. 5 (6), e11039 (2010).
  53. Singh, R. K., Kolandaivelu, S., Ramamurthy, V. Early alteration of retinal neurons in Aipl1-/- animals. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 55 (5), 3081-3092 (2014).
  54. Eberhart, A., Kimura, H., Leonhardt, H., Joffe, B., Solovei, I. Reliable detection of epigenetic histone marks and nuclear proteins in tissue cryosections. Chromosome Research. 20 (7), 849-858 (2012).

Tags

Gelişim biyolojisi sayı 138 göz göz Pigment epitel Retina kimyasal biyokimyasal süreçler DNA metilasyonu anatomi duyu organları olayları ve işlemleri kimyasal olaylar 5-metilsitozin 5 arasında bakterilerde görülen retina geliştirme epigenetik DNA metilasyonu fare immünhistokimya kromatin çekirdek hidroklorik asit denatürasyon Photoreceptor
5-metilsitozin ve gelişmekte olan 5-arasında bakterilerde görülen immunohistokimyasal tespiti ve Postmitotic fare Retina
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Singh, R. K., Diaz, P. E., Binette,… More

Singh, R. K., Diaz, P. E., Binette, F., Nasonkin, I. O. Immunohistochemical Detection of 5-Methylcytosine and 5-Hydroxymethylcytosine in Developing and Postmitotic Mouse Retina. J. Vis. Exp. (138), e58274, doi:10.3791/58274 (2018).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter