Summary
Her præsenterer vi en protokol af elastisk farvning for at identificere elastiske fibre i pT3N0M0 gastrisk Cancer væv på formalin-faste, paraffin-indlejrede sektioner. Efterfølgende beskriver vi en metode til at afgøre, om tumorceller invaderer ud over den elastiske lamina.
Abstract
Den elastiske lamina, som normalt er placeret i sub-meta lag, støder op til bughinden mesotheliale celler, er amfifile på hematoxylinlegemer og eosin (H & E) farvning, men kan visualiseres gennem elastisk farvning. En af de vigtige fordele ved elastisk farvning er, at det gør det nemt at afgøre, om tumorceller har invaderet ud over den elastiske lamina. Dette hjælper med at undersøge omfanget af peritonealdialyse overflade invasion, og derved skelne pT3 og pT4 stadier i gastrointestinal cancer. I denne undersøgelse præsenterer vi en protokol til at identificere elastiske fibre i formalin-fast, paraffin-indlejret pT3N0M0 gastrisk Cancer vævs sektioner. Vi forbereder 5-μm paraffin sektioner fastsat på slides, og derefter alle slides er afparaffineret og rehydreret under farvnings proceduren. Efterfølgende er alle sektioner oxideret af kaliumpermanganat, bleget af oxalsyre, farvet af elastisk farvning og modfarves af van Giesons. Endelig undersøger vi virkningen af farvning; elastisk lamina er farves blå-sort og kollagen fibre er farvet rødt, mens kræftcellerne er farves i varierende nuancer af gul. Vi beskriver også i detaljer de metoder, der anvendes til bestemmelse af positionelle forhold mellem kræftceller og elastisk lamina. Denne metode er enkel, billig, og bredt anvendelig i identifikationen af peritonealdialyse overflade invasion i gastrointestinal Cancer på grund af sin enestående selektivitet for elastiske fibre og autentiske resultater.
Introduction
Som pr tumor, knude, og metastase (TNM) Cancer staging-system, prognosen for gastrisk Cancer på patologisk Stadium pT4 er betydeligt værre end på pT3 (8th UICC/AJCC)1. Med gastrisk cancer, klassificering af den primære tumor (pT) normalt afhænger af dybden af tumor invasion2. Patologisk Stadium pT3 gastrisk cancer er defineret som kræft invaderer gennem muscularis propria i subserosal væv, mens pT4 gastrisk kræft er defineret som kræft penetrateret til overfladen af visceral peritoneum. Tilstedeværelsen af peritonealdialyse overflade invasivitet er nøglen til at skelne de to faser2. Men fordi peritonealdialyse meta cellelag er meget tynd, det kunne blive beskadiget under operationen, postoperative behandling, og fiksering3. Desuden kan tumor-relaterede inflammatoriske ændringer og fibrose beskadige den normale Anatomi af bughinde, hvilket gør det meget vanskeligt præcist at bedømme den peritoneale overflade invasion ved hjælp af kun H & E farvning4. Nuværende hjælpe diagnosemetoder såsom cytologi og immun histokemi er af begrænset diagnostisk værdi5,6 fordi de er falsk positive eller har en lav omkostningseffektivitet.
Serøse membranen omfatter peritoneum, pleura og periicardium, og er sammensat af mesothelium, en kælder membran og et sub-mesothelial lag7. Et fælles histologisk træk ved serøse membranen er tilstedeværelsen af en elastisk lamina i det sub-mesotheliale lag, der støder op til de mesotheliale celler8,9. Elastisk lamina har en stærk anti-skade evne og kan tjene som en alternativ prognose markør, hvis de mesotheliale celler ødelægges af svær tumor-relaterede inflammation eller fibrose3. Elastisk lamina består hovedsageligt af elastin og microfibril10, som kan visualiseres ved elastisk farvning. Den vigtigste årsag til brugen af den elastiske farvning er, at elastin danner en hydrogen binding med phenolgruppen resorcinol i elastin opløsningen, hvilket forårsager elastiske fibre, der skal farves blå-sort. Efter van gieson (VG) kontrasterende farvning, kollagen fibre kan farves rød og muskelfibre og røde blodlegemer kan farves gul8,11,12,13.
Den ottende udgave af TNM iscenesættelse af lungekræft definerer visceral pleural invasion (T2) som en tumor invasion ud over den elastiske lamina eller en invasion på overfladen af den visceral brysthinden2. Undersøgelser af kolorektal cancer har vist, at den elastiske lamina invasion i pT3 kolorektal cancer kan være årsagen til dårlige prognoser. Den 5-årige sygdomsfrie og samlede overlevelsesrate af kolorektal cancer har også vist sig at være som pT4a13,14,15. Baseret på vores tidligere undersøgelser om elastisk farvning, elastisk lamina invasion har været fundet for at have en betydelig negativ indflydelse på prognosen for pT3 gastrisk cancer og bør behandles på samme måde som pT4a gastrisk Cancer12. Denne enkle og omkostningseffektive metode kan derfor medvirke til at eliminere usikkerheden i de resultater, der opnås gennem H & E-farvning, og andre fælles begrænsninger i forbindelse med andre hjælpe diagnosemetoder, herunder cytologi og immun histokemi, blandt Andre. Denne metode kan bruges effektivt til at diagnosticere peritonealdialyse overflade invasioner af gastrointestinal cancer, især i nogle tvetydige tilfælde. Det er bekvemt, da H & E bejdser og andre pletter normalt gør det vanskeligt at identificere sådanne invasioner. Denne metode sikrer også en pålidelighed af resultaterne, da det er meget selektiv, især til elastiske fibre. Her udfører vi elastisk farvning for at afgøre, om tumorceller har invaderet den elastiske lamina i pT3N0M0 gastrisk Cancer12.
Denne metode bruges til at identificere elastiske fibre i væv på formalin-faste, paraffin-indlejrede sektioner, og kan anvendes til frosne sektioner samt. Her vælger vi paraffin-indlejrede sektioner for den bedste vedligeholdelse af cellulære og vævs morfologi. Alle trinene i denne protokol finder sted ved stuetemperatur. Et kommercielt farvnings udstyr, som omfatter en kaliumpermanganatopløsning, en oxalsyreopløsning, en elastin opløsning og en van Giesons opløsning, anvendes i den præsenterede undersøgelse.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Mellem 1994 og 2005 blev patientprøverne udvalgt af to erfarne gastrointestinale patologer på det tilknyttede Cancer Hospital i Xiangya School of Medicine, central South University, fra patienter, der led garectomi af mave neoplasmer, med en postoperative patologiske diagnose af gastrisk cancer i pT3N0M0 fase (i henhold til den syvende TNM staging). Denne undersøgelse blev godkendt af Udvalget for etisk vurdering.
1. skæring
- Placer paraffin blokken i en fastholder af slæde mikrotomen, som kan bevæge sig bagud og fremad over klingen. Juster den optimale vinkel mellem blokken og mikrotom kniven.
Bemærk: den optimale vinkel afhænger ikke kun af bladets geometri, men også af skærehastigheden og teknikken. - Trim paraffin blokken som nødvendigt, og skær den i 5 μm tykke tværsnit.
- Placer paraffin 5-μm-sektionerne i et vandbad på ca. 40-45 °C og Monter den derefter fra vandet på glaspladen, en sektion pr. slide.
- Tryk forsigtigt på den monterede sektion mod et papirhåndklæde for at fjerne eventuelt overskydende vand og potentielle luftbobler.
- Lad sektioner lufttørre i 30 min og derefter bage dem i en ovn ved 45-50 °C i 2 timer.
2. deparaffinization og rehydrering af alle slides
- Nedsænk gliderne i xylen i en Coplin-krukke i 10 minutter.
- Tag gliderne ud fra den første xylen krukke og sænk dem i xylen i en anden krukke i 10 min.
- Nu nedsænkes diasene i 100% ethanol i en Coplin jar i 5 min.
- Sænk slidene i 100% ethanol i en anden Coplin jar, også i 5 min.
- Nedsænk gliderne i 95% ethanol i en Coplin jar i 2 min.
- Nedsænk gliderne i 70% ethanol i en Coplin jar i 2 min.
Bemærk: Sørg for, at diasene er helt nedsænket i løsningerne, mens du udfører ovenstående trin. - Skyl gliderne kortvarigt med destilleret vand i en ny krukke.
3. farvning
- Før du fortsætter til farvning, tørre eventuelle overskydende opløsninger rundt om vævet på diaset med et silkepapir.
- Placer gliderne IRUM temperatur og rumfugtigheds forhold for at undgå tørring af vævet på diaset gennem hele farvningsprocessen.
- Oxider diasene med et par dråber kaliumpermanganat i 5 min. Sørg for, at mængden af kaliumpermanganat er nok til at dække vævs afsnittet på hvert dias.
- Skyl de oxiderede slides med destilleret vand i en Coplin krukke med 2-3 ændringer. Overhold den blå farve af vævet.
- Nu blege disse slides ved at tilføje et par dråber oxalsyre i 5 min. Sørg for, at mængden af oxalsyre er nok til helt at dække vævs afsnittet på hvert dias.
- Skyl gliderne ved at fordybe dem i Coplin krukken fyldt med destilleret vand. Udfør skylningen 2x-3x.
- Nu, vask disse slides kort i 95% alkohol, og derefter fordybe dias i en elastin opløsning (5 g/L) for 8-24 h.
Bemærk: elastin-opløsningen er ustabil, og dens farvnings tid er relativt lang, så det er bedst at fordybe gliderne med elastisk farvning i en forseglet beholder, såsom en transparent glas flaske med en tætnings hætte. Beholderens kapacitet og elastin-løsningens volumen afhænger af antallet af nedsænkede slides, så længe det giver mulighed for fuldstændig nedsænkning af alle slides. - Nedsænk disse slides direkte i 95% ethanol for 1-2 min at differentiere hver vævs sektion godt.
Bemærk: differentiering refererer til ændringen i ladning af vævs sektionen, som fjerner den overskydende farvning absorberes af vævet og gør farverne klarere. Efter at elastin opløsningen er faret, bør prøverne ikke vaskes med destilleret vand for at undgå problemer med differentieringen. Kontroller mikroskopisk, efter behov, for blå-sorte elastiske fibre farvning og grå baggrund. Det er bedre at lidt under differentiere vævet, da den efterfølgende van gieson's counterstain kan også noget udtrække den elastiske plet. - Skyl disse slides helt med destilleret vand efter differentiering.
- Modplette diasene i en van Giesons løsning i 1 min.
Bemærk: volumenet af van Giesons opløsning skal være nok til at være i stand til at fordybe vævs afsnittet på hvert dias helt. - Hurtigt droppe 95% ethanol på disse skiver i et par sekunder for at differentiere hver vævs sektion godt.
Bemærk: Skyl ikke slides med vand efter van giesons modfarvning, som kan svække eller endda elueres farven på Van giesons modfarvning.
4. dehydrering og montering
- Sænk gliderne i 95% alkohol i 5 minutter for at lade dem dehydrere hurtigt.
- Fortsæt med at dehydrere disse skiver ved 2 ændringer af 100% alkohol, hver gang nedsænkes dias i 5 min.
- Nedsænk gliderne i 2 ændringer af xylen, hver gang i 3 min.
- Tilføj en dråbe af det harpiksholdige monterings medium til diaset, og Placer coversedlen på toppen.
5. mikroskopisk observation af lysbilleder
- Find den serøse retning og observere resultaterne af elastisk farvning: elastiske fibre (lamina) er farvede blå-sort, kollagen fibre er farvet rødt, og muskelfibre er farvede gule.
- Se efter kræftcellerne i hele diaset: kræftceller er farvede gule12.
- Bestem positionelle forhold mellem kræftcellerne og elastisk lamina.
Bemærk: der vil være to situationer her. Så længe der er en tumor celle, der har invaderet ud over den elastiske lamina i hele diaset, så denne sag kunne betragtes som elastisk lamina invasion. På den anden side, kun når der ikke er nogen tumor celle, der har invaderet ud over den elastiske lamina i hele diaset, kan denne sag betragtes som elastisk lamina ikke-invasion.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
En vellykket elastisk farvning tydeligt afslører elastiske lamina og kræftceller i pT3 gastrisk cancer. Figur 1 -lavenergi felt, mikroskopisk kontrolleret efter elastin opløsning farvning, forud for van gieson's counterstain som pr den nævnte protokol-viser den elastiske lamina er tæt på serøse mesotheliale celler og er farvet blå-sort i form af filamenter, og der er stadig en vis afstand mellem tumorcellerne og den elastiske lamina. Figur 2 er en typisk elastisk farvning med Van gieson's counterstain, hvor elastisk lamina er plettet blå-sort, kollagen fibre er farvet rødt, og muskelfibre og kræftceller er farvede gule. Elastisk lamina invasion kan betragtes som kræftceller trænge ind i den elastiske lamina (figur 2B), hvorimod elastisk lamina ikke-invasion kan betragtes som kræftceller, der er tæt på den elastiske lamina, men ikke invaderer (figur 2 A). Hvis den elastiske farvning afslører en gentagen struktur, som antyder, at der er mere end et lag af elastisk lamina, hvis tumor invasionen ikke invaderer ud over den yderste elastiske lamina (indikeret med pile), bør prøven diagnosticeres som elastisk lamina ikke-invasion (figur 2C).
Figur 1 : Det mikroskopiske billede af elastisk farvning før van giesons modfarvning. Den elastiske lamina er markeret med pile, "T" repræsenterer tumorceller, "S" repræsenterer retningen af serøse membranen. Den elastiske lamina kan tydeligt visualiseres ved elastisk farvning. Pilene indikerer elastisk lamina. Skala bjælken er 200 μm. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2 : Det repræsentative resultat af elastisk farvning med Van giesons modplet. Den elastiske lamina er markeret med pile, "T" repræsenterer tumorceller, "S" repræsenterer retningen af serøse membranen. (A) tumor celler vokser nær den elastiske lamina uden at invadere ud over det. (B) tumor celler invaderer ud over den elastiske lamina. (C) tumor celler udviser invasion i nærheden af elastisk lamina, men trænger ikke ud over den yderste elastiske lamina. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Denne metode, som foreslås her, giver en præcis metode til at identificere den subserosale elastiske lamina. Metoden kan bruges til at vurdere, om tumorceller har invaderet den elastiske lamina i pT3N0M0 gastrisk Cancer12. Elastisk lamina er rødlig i H & E-farvede sektioner, som ikke let kunne skelnes fra kollagen fibre, og andre eksisterende hjælpe diagnosemetoder, såsom cytologi og immunhistochemistry, udøvede også begrænset diagnostisk værdi. Konstateringen af tumorceller i peritonealdialyse kunstvandings væsken indikerer ikke nødvendigvis tilstedeværelsen af en serøse invasion af den primære tumor, som kan skyldes lymfe knudepunktet metastase eller anden Fjern metastaser5. Da de mesotheliale celler sandsynligvis vil blive ødelagt af fibrøs inflammation, en Immunohistokemi diagnose kan ikke muligt, og arbejdsbyrden er relativt store6. Men elastisk farvning som en klassisk, speciel farvnings metode kan gøre den elastiske lamina klart synlig11,12,13. Efter standarddrift, ifølge denne protokol, kan den elastiske lamina farves blå-sort, kollagen fibre kan farves rødt, og muskelfibre og røde blodlegemer kan farves gul, hvilket gør det lettere for patologer at vurdere fordelingen af tumorceller og elastisk lamina. Elastisk farvning kan også have nogle begrænsninger i de diagnostiske kriterier. For eksempel, i nogle tilfælde, strukturen af elastisk lamina er ikke klar på grund af indlysende tumor-relaterede fibrøs inflammation. Forskellige observatører kan have forskelle i forståelsen og den praktiske anvendelse af de diagnostiske kriterier i ét tilfælde, selv om nogle patologer stadig mener, at hvis tumorvævet invaderer ud over den ene side af den resterende elastiske lamina, kan det være diagnosticeret som en elastisk lamina invasion17. Ikke desto mindre, med den fortsatte popularisering af anvendelsen af elastisk farvning og standardisering af diagnose konsensus af patologer, denne begrænsning vil blive svækket i fremtiden.
Kritiske trin i denne protokol omfatter korrekt kontrol af differentieringen proces og standard vævsprøven udvælgelse. Efter elastin opløsning farvning, bør slides ikke vaskes med destilleret vand, men differentierede dias skal placeres direkte i 95% ethanol for 1-2 minutter for at undgå vanskeligheder med differentiering. Efter van Giesons modfarvning bør kontakt med vandrutsjebanerne undgås; i stedet skal de differentierede skiver hurtigt vaskes i 95% ethanol i et par sekunder. Ellers vil farven på Van Gieson's counterstain blive svækket eller endda eluted. Som for vævsprøven udvælgelse, den vigtigste del er det område, hvor bughinden skifter retning, især den akutte vinkelområde, snarere end det område, der er dækket af fladt meta væv4. Alle tilfælde i denne undersøgelse blev trukket i henhold til denne metode, og dybden af vævsprøven udvælgelse var så dyb som muligt for at vurdere forholdet mellem tumoren og serosa. Desuden finder alle trinene i denne protokol sted ved stuetemperatur. Da elastin opløsning er let at flygtige og farvnings tiden er relativt lang, er det bedst at fordybe gliderne i elastisk farvningsopløsning i en forseglet beholder. Med hensyn til den mikroskopiske observation, resultatet af elastisk farvning er nøjagtige og pålidelige. I nogle særlige tilfælde skal der dog tages hensyn til nogle fornuftige diagnostiske kriterier som foreslået af grin et al. 16. i tilfælde, hvor tumor-relateret fibrøs inflammation resulterer i en indlysende ustabilitet i den elastiske lamina struktur, når tumorvæv invaderer ud over den resterende elastiske lamina på den ene side, det kan diagnosticeres som elastisk lamina invasion. I tilfælde af mucinøs adenokarcinom, kun hvis cellulær slimhinderne invaderer ud over den elastiske lamina kan det diagnosticeres som elastisk lamina invasion. Hvis elastisk farvning viser en gentagen elastisk lamina struktur, kan prøven diagnosticeres som elastisk lamina invasion, når tumor invasionen er uden for den yderste elastiske lamina. Hvis ovenstående tilstand opstår i en eller flere sektioner, kan sagen diagnosticeres som elastisk lamina invasion16.
Denne protokol viser en enkel teknik til visuelt at identificere den elastiske lamina i gastrisk cancer. Denne teknik er meget tilpasningsdygtig og kan udvides til at bedømme serøse invasion for andre prognostiske forudsigelser, såsom esophageal eller æggestokkene kræft17. Det kan også udnyttes til at identificere blod og lymfe fartøj invasion i kolorektal cancer samt i andre kræftformer, især i nogle vanskelige tilfælde, af den grund, at elastisk lamina også findes i beholderen og lymfe endotelet. Også, elastisk farvning er billig og kan nemt vedtages af patologer på forskellige steder18. Desuden er denne teknik ikke begrænset til tumor væv, men kan også bruges til diagnoser af dermatologiske og vaskulære sygdomme, såsom diskoid lupus erythematosus, alopeci, og carotis arterie læsion19,20. Med udviklingen af den elastiske farvning teknologi og akkumulere undersøgelser af tumorer med store prøvestørrelser, vi forventer, at elastisk farvning kan accepteres af ajcc staging system i bedømmelsen af serøse invasion af gastrisk cancer og kolorektal cancer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har intet at afsløre.
Acknowledgments
Forfatterne takker delvist støtten fra National Natural Science Foundation (NO. 81401902 og NO. 81501992) og Hunan Natural Science Foundation (NO. 2017SK2134, NO. 2018JJ2238). Manuskriptet er skrevet af Guang Lei. Hele eksperimentet udføres af Guang Lei og Haiyan Yang. Forfatterne takker hjælpen fra patologer og stipendiater, der følger op på patienternes data.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Elastin-Van Gieson staining kit | Baso | BA4083B | Used for staining of elastic fibers, collagen fibers and myofibers |
| Permount TM Mounting Medium | MXB Biotechnologies | DAB-0033 | Used for mounting |
| Ethanol | LMAI Bio | LM64-17-5 | 100% |
| Xylene | LMAI Bio | LX820585 |
References
- Jiang, C. G., et al. Clinicopathologic characteristics and prognosis of gastric cancer invading the subserosa. Journal of Surgical Oncology. 102 (7), 737-741 (2010).
- Amin, M. B., et al. AJCC Cancer Staging Manual. 8th ed. , Springer. New York, NY. (2017).
- Kojima, M., et al. Elastic laminal invasion in colon cancer: diagnostic utility and histological features. Frontiers in Oncology. 2, 179 (2012).
- Ludeman, L., Shepherd, N. A. Serosal involvement7 in gastrointestinal cancer: its assessment and significance. Histopathology. 47 (2), 123-131 (2005).
- Shepherd, N. A., Baxter, K. J., Love, S. B. The prognostic importance of peritoneal involvement in colonic cancer: a prospective evaluation. Gastroenterology. 112 (4), 1096-1102 (1997).
- Liang, W. Y. Retrospective evaluation of elastic stain in the assessment of serosal invasion of pT3N0 colorectal cancers. American Journal of Surgical Pathology. 37 (10), 1565-1570 (2013).
- Carter, D., True, L., Otis, C. N. Serosal membranes. Histology for Pathologists. 3rd ed. Mills, S. E. , Lippincott Williams and Wilkins. Philadelphia, PA. 547-562 (2007).
- Knudsen, P. J. The peritoneal elastic lamina. Journal of Anatomy. 177, 41-46 (1991).
- Shepherd, N. A., Baxter, K. J., Love, S. B. Influence of local peritoneal involvement on pelvic recurrence and prognosis in rectal cancer. Journal of Clinical Pathology. 48 (9), 849-855 (1995).
- Uitto, J., Li, Q., Urban, Z. The complexity of elastic fibre biogenesis in the skin--a perspective to the clinical heterogeneity of cutis laxa. Experimental Dermatology. 22 (2), 88-92 (2013).
- Kazlouskaya, V., et al. The utility of elastic Verhoeff-Van Gieson staining in dermatopathology. Journal of Cutaneous Pathology. 40 (2), 211-225 (2013).
- Lei, G., et al. Elastic staining-a rejuvenated method to reassess prognosis and serosal invasion in patients with pT3N0M0 gastric cancer. Human Pathology. 65, 79-84 (2017).
- Hernández-Morera, P., Travieso-González, C. M., Castaño-González, I., Mompeó-Corredera, B., Ortega-Santana, F. Segmentation of elastic fibres in images of vessel wall sections stained with Weigert's resorcin-fuchsin. Computer Methods and Programs in Biomedicine. 142, 43-54 (2017).
- Kojima, M., Nakajima, K., Ishii, G., Saito, N., Ochiai, A. Peritoneal elastic laminal invasion of colorectal cancer: the diagnostic utility and clinicopathologic relationship. American Journal of Surgical Pathology. 34 (9), 1351-1360 (2010).
- Nakanishi, Y., et al. Reappraisal of Serosal Invasion in Patients With T3 Colorectal Cancer by Elastic Stain. ARCHIVES OF PATHOLOGY & LABORATORY MEDICINE. 140 (1), 81-85 (2016).
- Grin, A., et al. Peritoneal elastic lamina invasion: limitations in its use as a prognostic marker in stage II colorectal cancer. Human Pathology. 44 (12), 2696-2705 (2013).
- Stewart, C. J., Brennan, B. A., Crook, M. L., Russell, P. Value of elastin staining in the assessment of peritoneal implants associated with ovarian serous borderline tumours. Histopathology. 51 (3), 313-321 (2007).
- Kojima, M., et al. Pathological diagnostic criterion of blood and lymphatic vessel invasion in colorectal cancer: a framework for developing an objective pathological diagnostic system using the Delphi method, from the Pathology Working Group of the Japanese Society for Cancer of the Colon and Rectum. Journal of Clinical Pathology. 66 (7), 551-558 (2013).
- Elston, C. A., Kazlouskaya, V., Elston, D. M. Elastic staining versus. fluorescent and polarized microscopy in the diagnosis of alopecia. Journal of the American Academy of Dermatology. 69 (2), 288-293 (2013).
- Vos, A., et al. Predominance of Nonatherosclerotic Internal Elastic Lamina Calcification in the Intracranial Internal Carotid Artery. Stroke. 47 (1), 221-223 (2016).
