pT3N0M0胃癌組織のパラフィン埋め込みスライド上の弾性染色

Summary

ここでは、ホルマリン固定、パラフィン埋め込みセクション上のpT3N0M0胃癌組織における弾性繊維を同定するための弾性染色のプロトコルを提示する。続いて、腫瘍細胞が弾性ラミナを越えて侵入するかどうかを決定する方法について説明する。

Abstract

通常、下中皮層に位置する弾性層は、中皮細胞に隣接し、ヘマトキシリンおよびエオシン(H&E)染色に対して両生性であるが、弾性染色を通じて可視化することができる。弾性染色の重要な利点の1つは、腫瘍細胞が弾性ラミナを越えて侵入したかどうかを容易に判断できることです。これは、腸内炎上の侵襲の程度を調べるのに役立ち、それによって消化管癌におけるpT3およびpT4段階を区別する。本研究では、ホルマリン固定パラフィン埋め込みpT3N0M0胃癌組織部における弾性繊維を同定するプロトコルを提示する。スライドに固定された5μmパラフィンセクションを準備し、すべてのスライドが染色手順中に脱パラフィン化および水分補給されます。その後、すべてのセクションは過マンガン酸カリウムによって酸化され、シュウ酸によって漂白され、弾性染色によって染色され、ヴァン・ギーソンによって逆染色される。最後に、染色の効果を調べます。弾性ラミナは青黒色に染まり、コラーゲン繊維は赤色に染まり、癌細胞は黄色の様々な色合いで染色されます。また、癌細胞と弾性ラミナとの位置関係を決定するために用いられる方法についても詳しく述べる。この方法は、弾性繊維と本物の結果のための優れた選択性のために、消化管癌における腹膜表面の侵入の同定に、シンプルで低コストで広く適用可能です。

Introduction

腫瘍、ノード、および転移(TNM)癌ステージングシステムに起因して、病理学期pT4における胃癌の予後はpT3(第8UICC/AJCC)1よりも有意に悪化している。胃癌では、原発性腫瘍(pT)の分類は、通常、腫瘍侵来2の深さに依存する。病理学的段階pT3胃癌は、筋肉のプロプリアを介して皮下組織に侵入する癌として定義され、一方、pT4胃癌は、内臓頭膜の表面に浸透する癌として定義される。両座面侵襲性の存在は、2つの^段階2を区別するための鍵である。しかし、間膜中皮細胞層は非常に薄いため、手術、術後治療、および^固定3の間に損傷を受ける可能性がある。さらに、腫瘍関連の炎症性変化および線維症は、両腸骨の正常な解剖学を損傷する可能性があり、H&E染色4のみを用いて腸膜表面の侵来を正確に判断することは非常に困難である。細胞学や免疫組織化学などの現在の補助診断方法は、偽陽性であるか、または低い費用対効果を有するため、限られた診断値5、6である。

血清膜は、胸膜、胸膜、および心膜を含み、中皮、基板膜、および中皮下^層7から構成される。血清膜の一般的な組織学的特徴の1つは、中皮細胞8,9に隣接する中皮層中皮中層における弾性層の存在である。弾性ラミナは強い抗損傷能力を有し、中皮細胞が重度の腫瘍関連炎症または線維^症3によって破壊された場合、代替予後マーカーとして役立つことができる。弾性ラミナは、主にエラスチンおよびマイクロフィブリ^ル10からなり、弾性染色によって可視化することができる。弾性染色の使用の主な理由は、エラスチンがエラスチン溶液中のレソルシノールのフェノール群と水素結合を形成し、弾性繊維が青黒色に染色されることである。ヴァン・ギーソン(VG)対比染色後、コラーゲン繊維は赤色および筋線維および赤血球を染色することができ、黄色8、11、12、13を染色することができる。

肺癌のTNMステージングの第8版は、内膜胸膜侵開(T2)を弾性ラミナを越えた腫瘍の侵入または内臓胸^膜2の表面への侵入として定義する。大腸癌に関する研究は、pT3大腸癌における弾性ラミナ侵食が予後不良の原因である可能性があることを示している。大腸癌の5年間の無病および全体的な生存率はまたpT4a13、14、15のようなものであることが証明されている。弾性染色に関する我々の以前の研究に基づいて、弾性ラミナ侵食はpT3胃癌の予後に有意な悪影響を及ぼすことが判明しており、pT4a胃^癌12と同様に治療されるべきである。したがって、このシンプルで費用対効果の高い方法は、H&E染色によって得られた結果の不確実性を排除し、細胞学や免疫組織化学を含む他の補助的な診断方法に関連する他の一般的な制限を排除するのに役立ちます。他。この方法は、特にいくつかのあいまいな場合に、消化管癌の根膜表面の侵入を診断するために効率的に使用することができる。H&Eの汚れやその他の汚れが、通常、このような侵入を識別することが困難にするので便利です。この方法はまた、特に弾性繊維に対して非常に選択的であるため、結果の信頼性を保証する。ここでは、pT3N0M0胃^癌12において腫瘍細胞が弾性ラミナに侵入したかどうかを判定するために弾性染色を行う。

この方法は、ホルマリン固定、パラフィン埋め込みセクション上の組織内の弾性繊維を識別するために使用され、同様に凍結セクションに使用することができます。ここでは、細胞および組織形態の最高の維持のためのパラフィン埋め込みセクションを選択します。このプロトコルのすべてのステップは室温で行われます。過マンガン酸カリウム溶液、シュウ酸溶液、エラスチン溶液、およびヴァンギーソンの溶液を含む市販の染色キットを提示された研究で使用する。

Protocol

1994年から2005年の間に、中央南大学西谷医学部付属癌病院の2人の経験豊富な消化管病理学者によって、胃新生物の胃切除術を受けた患者から、患者サンプルが選ばれた。pT3N0M0段階における胃癌の術後病理学的診断(第7TNMステージングによると)。この研究は倫理審査委員会によって承認された。

1. 断面

1. パラフィンブロックをそりマイクロトームの固定ホルダーに入れ、ブレードを前後に移動します。ブロックとマイクロトームナイフの間の最適な角度を調整します。
   注:最適な角度は、ブレードの形状だけでなく、切断速度とテクニックにも依存します。
2. 必要に応じてパラフィンブロックをトリミングし、5μm厚の断面に切断します。
3. パラフィン5μmのセクションを約40~45°Cの水浴に入れ、水からガラススライドに取り付けます。
4. 取り付けられた部分をペーパータオルに対して注意深く押して、残留水と気泡を取り除きます。
5. セクションを30分間空気乾燥させ、45~50°Cのオーブンで2時間焼きます。

2. すべてのスライドの脱パラフィン化と水分補給

1. コプリンの瓶に10分間キシレンのスライドを浸します。
2. 最初のキシレン瓶からスライドを取り出し、10分間別の瓶にキシレンに浸します。
3. さて、100%エタノールでスライドをコプリン瓶に5分間浸します。
4. 別のコプリン瓶に100%エタノールでスライドを浸し、また5分間。
5. 95%エタノールのスライドをコプリン瓶に2分間浸します。
6. 70%エタノールのスライドをコプリン瓶に2分間浸します。
   注: 上記の手順を実行しながら、スライドがソリューションに完全に浸されていることを確認します。
7. 新しい瓶に蒸留水でスライドを短時間すすいでください。

3. 染色

1. 染色を進める前に、スライド上の組織の周りの余分な溶液をティッシュペーパーで拭き取ります。
2. スライダーを室内温度と室湿量条件に置き、染色プロセス全体を通してスライド上の組織の乾燥を避けます。
3. 過マンガン酸カリウムを数滴で5分間酸化し、過マンガン酸カリウムの体積が各スライドの組織部を覆うのに十分であることを確認します。
4. 酸化したスライドをコプリン瓶に蒸留水ですすいで、2~3の変化を加えます。組織の青色を観察します。
5. さて、これらのスライドを5分間シュウ酸を数滴加えて漂白し、シュウ酸の体積が各スライドの組織セクションを完全に覆うのに十分であることを確認します。
6. 蒸留水で満たされたコプリンの瓶に浸してスライドをすすいでください。すす2x -3xを実行します。
7. 次に、これらのスライドを95%のアルコールで短時間洗い、8~24時間のエラスチン溶液(5g/L)にスライドを浸します。
   注:エラスチン溶液は揮発性であり、その染色時間は比較的長いので、シールキャップ付きの透明なガラスボトルなどの密閉容器に弾性染色でスライドを浸すことをお勧めします。容器の容量およびエラスチン溶液の容積は、すべてのスライドの完全な浸漬を可能にする限り、浸漬されたスライドの数に依存する。
8. これらのスライドを95%エタノールに直接浸し、各組織セクションを十分に区別するために1~2分間浸します。
   注:分化とは、組織部の電荷の変化を指し、組織によって吸収される余分な染色を除去し、色を明確にします。エラスチン溶液染色後、分化の困難を避けるために蒸留水でサンプルを洗浄しないでください。必要に応じて、青黒色の弾性繊維の染色と灰色の背景を顕微鏡で確認してください。その後のヴァン・ギーソンのカウンターステインも弾性染色をいくらか抽出できるので、組織をわずかに分化しない方が良い。
9. 分化後は蒸留水でスライドを完全にすすいでください。
10. ヴァン・ギーソンの溶液のスライドを1分間カウンターステインします。
    注:ヴァン・ギーソンの溶液の体積は、各スライドのティッシュセクションを完全に浸すことができるのに十分である必要があります。
11. 95%のエタノールを数秒間、これらのスライスに素早く落とし、各組織セクションをうまく区別します。
    注:ヴァン・ギーソンのカウンターステインの後にスライドを水ですすいでください。

4. 脱水と取り付け

1. スライドを95%のアルコールで5分間浸し、素早く脱水させます。
2. 100%アルコールの2つの変化によってこれらのスライスを脱水し続け、毎回5分間スライドを浸します。
3. 3分間、毎回キシレンの2つの変更にスライドを浸します。
4. スライドに樹脂用取り付け媒体を1滴追加し、カバースリップを上部に置きます。

5. スライドの顕微鏡観察

1. 血清方向を見つけて弾性染色の結果を観察する:弾性繊維(ラミナ)は青黒色染色され、コラーゲン繊維は赤色に染まり、筋線維は黄色に染色される。
2. スライド全体で癌細胞を探す:癌細胞は^黄色12に染色されています。
3. 癌細胞と弾性ラミナとの位置関係を決定する。
   注: ここでは 2 つの状況があります。スライド全体の弾性ラミナを越えて侵入した腫瘍細胞が1つある限り、この症例は弾性ラミナ侵襲と考えることができる。一方、スライド全体において弾性ラミナを越えて侵入した腫瘍細胞がない場合にのみ、この場合は弾性ラミナ非侵入と考えることができる。

Representative Results

弾性染色に成功すると、pT3胃癌の弾性ラミナおよび癌細胞が明らかに明らかになっています。図1 -低電力場、エラスチン溶液染色後に顕微鏡的にチェック、前述のプロトコルに従ってヴァン・ギーソンのカウンターステインの前に-弾性層がセロサル中皮細胞に近く、青色黒色に染色されているフィラメントの形態であり、腫瘍細胞と弾性ラミナとの間に一定の距離が残っている。図2は、弾性ラミナが青黒色に染色され、コラーゲン繊維が赤色に染色され、筋線維および癌細胞が黄色に染色されるヴァン・ギーソンのカウンターステインを用いた典型的な弾性染色である。弾性ラミナ侵像は弾性ラミナを貫通する癌細胞(図2B)と考えることができるが、弾性ラミナ非侵入は弾性ラミナに近いが侵入しない癌細胞と考えることができる(図2)。 A)。弾性染色が繰り返し構造を明らかにする場合、弾性ラミナの複数の層があることを示唆し、腫瘍の侵入が最も外側の弾性ラミナ(矢印で示される)を超えて侵入しない場合、サンプルは弾性と診断されるべきである。ラミナ非侵略(図2C)。

図 1:ヴァン・ギーソンのカウンターステインの前に弾性染色の顕微鏡画像。弾性ラミナは矢印でマークされ、「T」は腫瘍細胞を表し、「S」は血清膜の方向を表す。弾性ラミナは弾性染色により明確に可視化できます。矢印は弾性ラミナを示します。スケールバーは200 μmです。

図 2: ヴァン・ギーソンのカウンターステインで弾性染色の代表的な結果。弾性ラミナは矢印でマークされ、「T」は腫瘍細胞を表し、「S」は血清膜の方向を表す。(A) 腫瘍細胞は弾性ラミナの近くで、それ以上に侵入することなく増殖する。(B) 腫瘍細胞は弾性ラミナを越えて侵入する。(C)腫瘍細胞は弾性ラミナ付近に侵入を示すが、最も外側の弾性ラミナを越えて浸透しない。この図のより大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。

Discussion

ここで提案されるこの方法は、皮下弾性ラミナを同定するための正確なアプローチを提供する。この方法は、腫瘍細胞がpT3N0M0胃^癌12において弾性ラミナに侵入したかどうかを評価するために使用することができる。弾性ラミナは、コラーゲン繊維と容易に区別できないH&E染色部で赤みを帯びており、細胞学や免疫組織化学などの既存の補助診断方法も、限られた診断値を発揮した。心膜灌漑液中の腫瘍細胞の所見は、必ずしも原発性腫瘍の血清侵来の存在を示すものではなく、これはリンパ節転移または他の遠隔転移に起因する可能性がある5。中皮細胞は線維性炎症によって破壊される可能性が高いため、免疫組織化学の診断は実現不可能であり、作業負荷は比較的大きい6.しかしながら、古典的な、特別な染色方法としての弾性染色は、弾性ラミナをはっきりと見えるようにすることができます^11,12,13.標準的な操作の後、このプロトコルによると、弾性ラミナは青黒色に染色することができ、コラーゲン繊維は赤色に染色することができ、筋線維と赤血球は黄色に染色することができ、病理学者が分布を評価することが容易になります。腫瘍細胞と弾性ラミナ。弾性染色はまた、診断基準にいくつかの制限を持つことができます。例えば、場合によっては、明らかな腫瘍関連線維性炎症による弾性層の構造が明らかではない。異なる観察者は、1つのケースで診断基準の理解と実用的な適用に違いを持っているかもしれませんが、一部の病理学者はまだ腫瘍組織が残りの弾性ラミナの片側を越えて侵入する場合、それは可能であると信じています。弾性ラミナ侵来と診断^{された 17}.それにもかかわらず、弾性染色の適用の継続的な普及と病理学者の診断コンセンサスの標準化により、この制限は将来的に弱まるでしょう。

このプロトコルの重要なステップは、分化プロセスおよび標準的な組織標本選択の適切な制御を含む。エラスチン溶液染色後、スライドは蒸留水で洗浄する必要はありませんが、分化スライドは分化の困難を避けるために1〜2分間95%エタノールに直接配置する必要があります。ヴァン・ギーソンのカウンターステインの後、スライドと水との接触は避けるべきです。代わりに、分化されたスライスは、数秒間95%エタノールで洗浄する必要があります。さもなければ、ヴァン・ギーソンのカウンターステインの色は弱まったり、さらされたりします。組織標本選択に関しては、最も重要な部分は、平らな中皮^組織4で覆われた領域ではなく、角膜の方向、特に急性角度領域を変化する領域である。この方法に従って本研究の全症例を採取し、腫瘍とセローザとの関係を評価するために、選択する組織標本の深さは可能な限り深かった。さらに、このプロトコルのすべてのステップは室温で行われます。エラスチン溶液は揮発性が容易であり、染色時間が比較的長いため、密閉容器に弾性染色液にスライドを浸漬するのが最善である。顕微鏡観察に関しては、弾性染色の結果は正確で信頼性が高い。ただし、いくつかの特殊なケースでは、Grinらによって提案されているように、いくつかの合理的な診断基準を考慮する必要があります。^16.腫瘍関連の線維性炎症が弾性層構造の明らかな不安定をもたらす場合には、腫瘍組織が片側の残留弾性層を越えて侵入すると、弾性ラミナ侵襲と診断することができる。粘膜腺癌の場合、細胞粘膜成分が弾性ラミナを越えて侵入した場合にのみ、弾性ラミナ侵入と診断することができる。弾性染色が反復的な弾性層構造を示す場合、試料は、腫瘍の侵入が最も外側の弾性層を超える場合にのみ、弾性ラミナ侵入と診断することができる。上記の状態が1つまたは複数のセクションで発生した場合、症例は弾性ラミナ侵^来16と診断することができる。

このプロトコルは、胃癌における弾性ラミナを視覚的に同定するための簡単な技術を示す。この技術は広く適応可能であり、食食癌または卵巣^癌17のような他の予後予測に対する血清侵来を判断するために拡張されてもよい。また、大腸癌および他の癌における血液およびリンパ管の侵入を識別するために、特にいくつかの困難な場合には、弾性ラミナが血管およびリンパ内皮にも存在するという理由で利用することができる。また、弾性染色は安価であり、異なる部^位18の病理学者によって容易に採用することができる。さらに、この技術は、腫瘍組織に限定されるものではなく、皮膚科および血管疾患の診断、例えば、眼科ループスエリテマトース、脱毛症、および頸動脈病変19、20などの診断に使用することができる。弾性染色技術の開発とサンプルサイズの大きい腫瘍の蓄積研究により、胃癌および大腸癌の血清侵襲を判断するAJCCステージングシステムによって弾性染色が受け入れられることが期待されます。

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Elastin-Van Gieson staining kit	Baso	BA4083B	Used for staining of elastic fibers, collagen fibers and myofibers
Permount TM Mounting Medium	MXB Biotechnologies	DAB-0033	Used for mounting
Ethanol	LMAI Bio	LM64-17-5	100%
Xylene	LMAI Bio	LX820585