Summary
Her presenterer vi en protokoll av elastiske flekker å identifisere elastiske fibre i pT3N0M0 magekreft vev på formalin-faste, parafin-embedded seksjoner. Deretter beskriver vi en metode for å fastslå om tumorceller invadere utover elastisk lamina.
Abstract
Den elastiske lamina, som vanligvis er plassert i det sub-Mesothelial laget, ved siden av peritoneum mesothelial celler, er amfifile på hematoksylin og eosin (H & E) farging, men kan bli visualisere gjennom elastisk farging. En av de viktigste fordelene med elastisk farging er at det gjør det enkelt å fastslå om tumorceller har invadert utover elastisk lamina. Dette bidrar til å undersøke omfanget av bukhulen overflate invasjon, og dermed skille pT3 og pT4 stadier i Gastrointestinal kreft. I denne studien presenterer vi en protokoll for å identifisere elastiske fibre i formalin-faste, parafin-embedded pT3N0M0 magekreft vev seksjoner. Vi klargjør 5 μm parafin seksjoner fast på lysbilder, og deretter alle lysbildene er deparaffinated og rehydrert under farging prosedyren. Deretter er alle seksjonene oksidert av kalium kaliumpermanganat, bleket av oksalsyre syre, beiset av elastiske flekker, og counterstained av van Gieson ' s. Til slutt undersøker vi effekten av farging; elastisk lamina er beiset blå-svart og kollagen fibre er farget rødt, mens kreftcellene er beiset i varierende nyanser av gult. I detalj beskriver vi også metodene som brukes for å bestemme posisjons Forholdet mellom kreftceller og elastiske lamina. Denne metoden er enkel, lav pris, og mye som gjelder i identifisering av bukhulen overflate invasjon i Gastrointestinal kreft på grunn av sin fremragende selektivitet for elastiske fibre og autentiske resultater.
Introduction
I henhold til tumor, node, og metastasering (TNM) kreft staging system, prognosen for magekreft ved patologisk stadium pT4 er betydelig verre enn at pT3 (8th UICC/AJCC)1. Med magekreft, klassifisering av den primære tumor (pT) vanligvis avhenger av dybden av tumor invasjon2. Patologisk scenen pT3 magekreft er definert som kreft invadere gjennom muscularis propria i subserosal vev, mens pT4 magekreft er definert som kreft trengende til overflaten av visceral peritoneum. Tilstedeværelsen av bukhulen overflaten invasiveness er nøkkelen til å skille de to stadiene2. Men fordi den bukhulen mesothelial celle laget er svært tynn, kan det bli skadet under operasjonen, postoperativ behandling, og fiksering3. Videre tumor-relaterte inflammatoriske forandringer og fibrose kan skade den normale anatomi av peritoneum, som gjør det svært vanskelig å nøyaktig bedømme den bukhulen overflaten invasjon med bare H & E farging4. Gjeldende metoder for hjelpe diagnostisering, for eksempel Cytologi og immunhistokjemi, er av begrenset diagnostisk verdi på5,6 fordi de er falske positive eller har lavkostnads effektivitet.
Serosal membranen inkluderer peritoneum, pleura og pericardium, og er sammensatt av mesothelium, en kjeller membran, og et sub-mesothelial lag7. En vanlig histologiske funksjon i serosal membranen er tilstedeværelsen av en elastisk lamina i sub-mesothelial lag, ved siden av mesothelial cellene8,9. Elastisk lamina har en sterk anti-ødeleggende evne og kan tjene som en alternativ Prognostisk markør hvis mesothelial celler er ødelagt av alvorlig tumor-relaterte betennelser eller fibrose3. Elastisk lamina består hovedsakelig av elastin og microfibril10, som kan bli sett av elastiske flekker. Den viktigste årsaken bak bruken av elastisk farging er at elastin danner et hydrogen bånd med fenoliske gruppe resorcinol i elastin løsning, forårsaker elastisk fiber skal beiset blå-svart. Etter van Gieson (VG) kontrasterende flekker, kan kollagen fibre være farget rød og muskelfibre og røde blodlegemer kan være farget gul8,11,12,13.
Den åttende utgaven av TNM oppsetning av lungekreft definerer visceral pleural invasjon (T2) som en svulst invasjon utover elastisk lamina eller en invasjon på overflaten av visceral pleura2. Studier på tykktarmskreft har vist at elastisk lamina invasjon i pT3 tykktarmskreft kan være årsaken til dårlig prognoser. Den 5 år sykdom-fri og generell overlevelse av tykktarmskreft har også vist seg å være som pT4a13,14,15. Basert på våre tidligere studier på elastiske flekker, har elastisk lamina invasjon blitt funnet å ha en betydelig negativ innflytelse på prognosen for pT3 magekreft og bør behandles på samme måte som pT4a magekreft12. Derfor kan denne enkle og kostnadseffektive metoden bidra til å eliminere usikkerhet i resultatene som oppnås gjennom H & E farging, og andre vanlige begrensninger knyttet til andre metoder for hjelpe diagnostisering, inkludert Cytologi og immunhistokjemi, blant Andre. Denne metoden kan brukes effektivt til å diagnostisere overflate invasjoner av magekreft, spesielt i noen tvetydige tilfeller. Det er praktisk siden H & E flekk og andre flekker vanligvis gjør det vanskelig å identifisere slike invasjoner. Denne metoden sikrer også en pålitelighet av resultater siden det er svært selektiv, spesielt til elastiske fibre. Her gjennomfører vi elastiske flekker for å avgjøre om tumorceller har invadert den elastiske lamina i pT3N0M0 magekreft12.
Denne metoden brukes for å identifisere elastiske fibre i vev på formalin-faste, parafin-embedded seksjoner, og kan brukes til frosne seksjoner også. Her velger vi parafin-embedded seksjoner for best vedlikehold av cellulære og vev morfologi. Alle trinnene i denne protokollen finner sted ved romtemperatur. En reklamen flekk utstyr hvilke inkluderer en kalium kaliumpermanganat løsning, en oksalsyre syren løsning, en elastin løsning, og en Van Gieson ' løsning er anvendt inne det forevist studere.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Mellom 1994 og 2005 ble pasientprøvene utvalgt av to erfarne gastrointestinale patologer i det tilknyttede Cancer Hospital of Xiangya School of Medicine, Central South University, fra pasienter som LED gastrektomi av mage svulster, med en postoperativ patologisk diagnose av magekreft på pT3N0M0 scenen (i henhold til den syvende TNM staging). Denne studien ble godkjent av etikk Review Committee.
1. snitting
- Plasser para fin blokken i en fast holder på sleden mikrotomen, som kan bevege seg bakover og forover over bladet. Juster den optimale vinkelen mellom blokken og mikrotomen.
Merk: den optimale vinkelen ikke bare avhenger av bladets geometri, men også på skjærehastighet og teknikk. - Trim para fin blokken etter behov og skjær den i 5-μm-tykke tverrsnitt.
- Plasser parafin 5-μm seksjoner i et vannbad på ca 40-45 ° c og Monter den, deretter, fra vann til glass slide, en seksjon per lysbilde.
- Trykk den monterte delen forsiktig mot et papir håndkle for å fjerne gjenværende vann og potensielle luftbobler.
- La delene lufttørke i 30 minutter og stek dem deretter i en ovn ved 45-50 ° c for 2 timer.
2. Deparaffinization og rehydrering av alle lysbilder
- Dypp lysbildene i xylen i en Coplin krukke i 10 min.
- Ta lysbildene ut fra den første xylen jar og dyppe dem i xylen i en annen krukke i 10 min.
- Nå, dyppe lysbildene i 100% etanol i en Coplin krukke i 5 min.
- Dypp lysbildene i 100% etanol i en annen Coplin krukke, også i 5 min.
- Dypp lysbildene i 95% etanol i en Coplin krukke i 2 minutter.
- Dypp lysbildene i 70% etanol i en Coplin krukke i 2 minutter.
Merk: Kontroller at lysbildene er fullstendig nedsenket i løsningene mens du utfører trinnene ovenfor. - Skyll lysbildene kort med destillert vann i en ny krukke.
3. farging
- Før du fortsetter for farging, tørk av overflødig løsninger rundt vevet på lysbildet med et silkepapir.
- Plasser lysbildene with private temperatur og rom fuktighet for å unngå uttørking av vevet på lysbildet gjennom hele fargeprosessen.
- Oksidere lysbildene med noen få dråper kalium kaliumpermanganat i 5 min. Kontroller at volumet av kalium kaliumpermanganat er nok til å dekke vevs delen på hvert lysbilde.
- Skyll oksidert lysbilder med destillert vann i en Coplin krukke med 2-3 endringer. Observer den blå fargen på vevet.
- Nå bleke disse lysbildene ved å legge noen dråper oksalsyre syre i 5 min. Kontroller at volumet av oksalsyre syre er nok til å dekke fullstendig vevs delen på hvert lysbilde.
- Skyll lysbildene ved å dyppe dem i Coplin glasset fylt med destillert vann. Utfør skylling 2x-3x.
- Nå, vask disse lysbildene kort i 95% alkohol, og deretter dyppe lysbildene i en elastin løsning (5 g/L) for 8-24 h.
Merk: elastin løsning er flyktig, og dens farging tid er relativt lang, så det er best å dyppe lysbildene med elastiske flekker i en forseglet container, for eksempel en gjennomsiktig glass flaske med en forsegling cap. Kapasiteten på beholderen og volumet av den elastin løsning avhenger av antall nedsenket lysbilder, så lenge det muliggjør fullstendig nedsenking av alle lysbildene. - Dypp disse lysbildene direkte i 95% etanol for 1-2 min å skille hver vev delen godt.
Merk: differensiering refererer til endring i belastningen av vevet delen, som fjerner overflødig flekker absorberes av vevet og gjør fargene klarere. Etter elastin løsning flekker, bør prøvene ikke vaskes med destillert vann for å unngå problemer med differensiering. Sjekk mikroskopisk, etter behov, for blå-svart elastisk fiber farging og grå bakgrunn. Det er bedre å litt underdifferentiate vevet siden den påfølgende van Gieson ' s counterstain kan også noe trekke ut elastisk flekken. - Skyll disse lysbildene med destillert vann etter differensiering.
- Counterstain lysbildene i en Van Gieson løsning i 1 min.
Merk: volumet av van Gieson er løsningen må være nok til å kunne dyppe vevet delen på hvert lysbilde helt. - Raskt slippe 95% etanol på disse skiver i noen sekunder for å skille hver vev delen godt.
Merk: ikke skyll lysbildene med noe vann etter at Van Gieson er counterstaining, som det kan svekke eller til og med eluere fargen på Van Gieson ' s counterstaining.
4. dehydrering og montering
- Dypp lysbildene i 95% alkohol i 5 min for å la dem tørke raskt.
- Fortsett å tørke disse sektorene med 2 endringer av 100% alkohol, hver gang fordype lysbildene i 5 min.
- Dypp lysbildene i 2 endringer av xylen, hver gang i 3 min.
- Legg en dråpe resinous montering medium til raset og plasser dekkglass på toppen.
5. mikroskopisk observasjon av slides
- Finn serosal retning og observere resultatene av elastiske flekker: elastiske fibre (lamina) er beiset blå-svart, kollagen fibrene er farget rødt, og muskelfibre er farget gult.
- Se etter kreftcellene i hele lysbildet: kreftceller er farget gul12.
- Bestem posisjons Forholdet mellom kreftcellene og elastisk lamina.
Merk: det vil være to situasjoner her. Så lenge det er en svulst celle som har invadert utover elastisk lamina i hele lysbildet, så dette tilfellet kan betraktes som elastisk lamina invasjon. På den annen side, bare når det ikke er tumor celle som har invadert utover den elastiske lamina i hele lysbildet, kan denne saken betraktes som elastisk lamina ikke-invasjon.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
En vellykket elastisk flekker avslører tydelig elastisk lamina og kreftceller i pT3 magekreft. Figur 1 -lav effektfeltet, mikroskopisk sjekket etter elastin løsning flekker, før van Gieson ' s counterstain som per protokollen nevnt-viser elastisk lamina er nær den serosal mesothelial celler og er farget blå-svart i form av filamenter, og det er fortsatt en viss avstand mellom tumorceller og elastisk lamina. Figur 2 er en typisk elastisk farging med Van Gieson ' s counterstain, hvor elastisk lamina er beiset blå-svart, kollagen fibre er farget rødt, og muskelfibre og kreftceller er farget gult. Elastisk lamina invasjon kan betraktes som kreftceller gjennomtrengende elastisk lamina (figur 2B), mens elastisk lamina ikke-invasjon kan betraktes som kreftceller som er nær elastisk lamina, men ikke invaderende (figur 2 A). I tilfelle elastisk flekker avslører en repeterende struktur, som antyder det er mer enn ett lag med elastisk lamina, hvis tumor invasjonen ikke invadere utover ytterste elastiske lamina (indikert av piler), bør prøven diagnostiseres som elastisk lamina ikke-invasjon (figur 2C).
Figur 1 : Det mikroskopiske bildet av elastiske flekker før van Gieson ' s counterstaining. Den elastiske lamina er merket med piler, "T" representerer tumorceller, "S" representerer retningen av serosal membranen. Den elastiske lamina kan tydelig vises ved elastiske flekker. Pilene viser elastisk lamina. Skalaen baren er 200 μm. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 2 : Representant resultatet av elastisk farging med Van Gieson ' s counterstain. Den elastiske lamina er merket med piler, "T" representerer tumorceller, "S" representerer retningen av serosal membranen. (A) tumor celler vokser nær elastisk lamina uten å invadere utover det. (B) tumor celler invadere utover elastisk lamina. (C) tumor celler Exhibit invasjon i nærheten av elastisk lamina, men ikke trenge utover de ytterste elastiske lamina. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Denne metoden foreslås her gir en nøyaktig tilnærming for å identifisere subserosal elastisk lamina. Metoden kan brukes til å evaluere om tumorceller har invadert den elastiske lamina i pT3N0M0 magekreft12. Elastisk lamina er rødlig i H & E-beiset seksjoner, som ikke kunne lett skilles fra kollagen fibre, og andre eksisterende ekstra diagnose metoder, for eksempel Cytologi og immunhistokjemi, også utøvde begrenset diagnostisk verdi. Funn av tumorceller i bukhulen vanner væsken ikke nødvendigvis indikere tilstedeværelsen av en serosal invasjon av den primære tumor, som kan skyldes lymfe noden metastasering eller andre fjernt metastasering5. Som mesothelial cellene er sannsynlig å bli ødelagt av fiber betennelse, en immunhistokjemi diagnose kan ikke gjennomførbart, og arbeidsmengden er relativt stor6. Men elastiske flekker som en klassisk, spesiell farge metoden kan gjøre elastisk lamina godt synlig11,12,13. Etter standard drift, i henhold til denne protokollen, elastisk lamina kan beiset blå-svart, kollagen Fibre kan beiset rødt, og muskelfibre og røde blodlegemer kan bli farget gul, noe som gjør det lettere for patologer å vurdere fordelingen av tumorceller og elastisk lamina. Elastiske flekker kan også ha noen begrensninger i diagnose kriteriene. For eksempel, i noen tilfeller, strukturen av elastisk lamina er ikke klart på grunn av åpenbare tumor-relaterte fiber betennelse. Ulike observatører kan ha forskjeller i forståelsen og praktisk anvendelse av diagnostiske kriterier i ett tilfelle, selv om noen patologer fortsatt tror at hvis tumorvevet invaderer utover den ene siden av de resterende elastiske lamina, kan det være diagnostisert som en elastisk lamina invasjon17. Likevel, med fortsatt popularisering av anvendelsen av elastiske flekker og standardisering av diagnosen konsensus av patologer, vil denne begrensningen bli svekket i fremtiden.
Kritiske trinn i denne protokollen inkluderer riktig kontroll av den unike prosessen og standard Vevsprøve valg. Etter elastin løsning flekker, bør lysbildene ikke vaskes av destillert vann, men differensiert lysbilder må plasseres direkte i 95% etanol for 1-2 minutter for å unngå vanskeligheter med differensiering. Etter van Gieson ' s counterstaining, kontakt av lysbilder med vann bør unngås; i stedet, de differensiert skiver raskt må vaskes i 95% etanol i noen sekunder. Ellers vil fargen på Van Gieson ' s counterstain bli svekket eller til og med eluert. Som for vevsprøven utvalg, den viktigste delen er området der peritoneum endringer retning, spesielt den akutte vinkelen området, snarere enn området dekket av flatt mesothelial vev4. Alle tilfellene i denne studien ble trukket i henhold til denne metoden, og dybden av vevsprøven velge var så dypt som mulig for å vurdere forholdet mellom tumor og serosa. I tillegg vil alle trinnene i denne protokollen finne sted ved romtemperatur. Siden elastin løsning er lett å fordamme og farging tiden er relativt lang, er det best å dyppe lysbildene i elastisk farging løsning i en forseglet container. Når det gjelder mikroskopisk observasjon, er resultatet av elastisk farging nøyaktig og pålitelig. Men i noen spesielle tilfeller, noen rimelige diagnostiske kriterier må tas i betraktning, som foreslått av grin et al. 16. i tilfeller der tumor-relaterte fiber betennelse resulterer i en åpenbar ustabilitet av elastisk lamina strukturen, når tumorvevet invaderer utover den gjenværende elastiske lamina på den ene siden, kan det bli diagnostisert som elastisk lamina invasjon. I tilfelle av mucinous adenokarsinom, bare hvis den cellulære slimete komponenten invaderer utover den elastiske lamina kan det bli diagnostisert som elastisk lamina invasjon. Hvis elastiske flekker viser en repeterende elastisk lamina struktur, kan prøven diagnostiseres som elastisk lamina invasjon bare når tumor invasjonen er hinsides den ytterste elastiske lamina. Hvis ovenstående tilstand oppstår i en eller flere seksjoner, saken kan diagnostiseres som elastisk lamina invasjon16.
Denne protokollen demonstrerer en grei teknikk for visuelt å identifisere den elastiske lamina i magekreft. Denne teknikken er allment tilpasningsdyktig og kan utvides til å bedømme serosal invasjon for andre Prognostisk spådommer, for eksempel esophageal eller eggstokkene kreft17. Det kan også benyttes til å identifisere blod og lymfatisk fartøy invasjon i tykktarmskreft så vel som i andre kreftformer, spesielt i noen vanskelige tilfeller, av den grunn at elastiske lamina også finnes i fartøy og lymfatisk endotelet. Dessuten er elastisk farging billig og kan lett vedtatt av patologer på ulike steder18. Videre er denne teknikken ikke er begrenset til tumor vev, men kan også brukes for diagnoser av dermatologic og vaskulære sykdommer, slik som discoid lupus erythematosus, alopecia, og hals-arterien lesjon19,20. Med utviklingen av den elastiske farge teknologi og akkumulere studier av svulster med store utvalgsstørrelser, forventer vi at elastisk farging kan aksepteres av AJCC staging-systemet i å bedømme den serosal invasjonen av magekreft og tykktarmskreft.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ingenting å avsløre.
Acknowledgments
Forfatterne takker støtten delvis fra National Natural Science Foundation (NO. 81401902 og NO. 81501992) og Hunan Natural Science Foundation (NO. 2017SK2134, NO. 2018JJ2238). Manuskriptet er skrevet av Guang lei. Hele eksperimentet er utført av Guang lei og Haiyan Yang. Forfatterne takker assistanse av patologer og av stipendiater som følger opp pasientenes data.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Elastin-Van Gieson staining kit | Baso | BA4083B | Used for staining of elastic fibers, collagen fibers and myofibers |
| Permount TM Mounting Medium | MXB Biotechnologies | DAB-0033 | Used for mounting |
| Ethanol | LMAI Bio | LM64-17-5 | 100% |
| Xylene | LMAI Bio | LX820585 |
References
- Jiang, C. G., et al. Clinicopathologic characteristics and prognosis of gastric cancer invading the subserosa. Journal of Surgical Oncology. 102 (7), 737-741 (2010).
- Amin, M. B., et al. AJCC Cancer Staging Manual. 8th ed. , Springer. New York, NY. (2017).
- Kojima, M., et al. Elastic laminal invasion in colon cancer: diagnostic utility and histological features. Frontiers in Oncology. 2, 179 (2012).
- Ludeman, L., Shepherd, N. A. Serosal involvement7 in gastrointestinal cancer: its assessment and significance. Histopathology. 47 (2), 123-131 (2005).
- Shepherd, N. A., Baxter, K. J., Love, S. B. The prognostic importance of peritoneal involvement in colonic cancer: a prospective evaluation. Gastroenterology. 112 (4), 1096-1102 (1997).
- Liang, W. Y. Retrospective evaluation of elastic stain in the assessment of serosal invasion of pT3N0 colorectal cancers. American Journal of Surgical Pathology. 37 (10), 1565-1570 (2013).
- Carter, D., True, L., Otis, C. N. Serosal membranes. Histology for Pathologists. 3rd ed. Mills, S. E. , Lippincott Williams and Wilkins. Philadelphia, PA. 547-562 (2007).
- Knudsen, P. J. The peritoneal elastic lamina. Journal of Anatomy. 177, 41-46 (1991).
- Shepherd, N. A., Baxter, K. J., Love, S. B. Influence of local peritoneal involvement on pelvic recurrence and prognosis in rectal cancer. Journal of Clinical Pathology. 48 (9), 849-855 (1995).
- Uitto, J., Li, Q., Urban, Z. The complexity of elastic fibre biogenesis in the skin--a perspective to the clinical heterogeneity of cutis laxa. Experimental Dermatology. 22 (2), 88-92 (2013).
- Kazlouskaya, V., et al. The utility of elastic Verhoeff-Van Gieson staining in dermatopathology. Journal of Cutaneous Pathology. 40 (2), 211-225 (2013).
- Lei, G., et al. Elastic staining-a rejuvenated method to reassess prognosis and serosal invasion in patients with pT3N0M0 gastric cancer. Human Pathology. 65, 79-84 (2017).
- Hernández-Morera, P., Travieso-González, C. M., Castaño-González, I., Mompeó-Corredera, B., Ortega-Santana, F. Segmentation of elastic fibres in images of vessel wall sections stained with Weigert's resorcin-fuchsin. Computer Methods and Programs in Biomedicine. 142, 43-54 (2017).
- Kojima, M., Nakajima, K., Ishii, G., Saito, N., Ochiai, A. Peritoneal elastic laminal invasion of colorectal cancer: the diagnostic utility and clinicopathologic relationship. American Journal of Surgical Pathology. 34 (9), 1351-1360 (2010).
- Nakanishi, Y., et al. Reappraisal of Serosal Invasion in Patients With T3 Colorectal Cancer by Elastic Stain. ARCHIVES OF PATHOLOGY & LABORATORY MEDICINE. 140 (1), 81-85 (2016).
- Grin, A., et al. Peritoneal elastic lamina invasion: limitations in its use as a prognostic marker in stage II colorectal cancer. Human Pathology. 44 (12), 2696-2705 (2013).
- Stewart, C. J., Brennan, B. A., Crook, M. L., Russell, P. Value of elastin staining in the assessment of peritoneal implants associated with ovarian serous borderline tumours. Histopathology. 51 (3), 313-321 (2007).
- Kojima, M., et al. Pathological diagnostic criterion of blood and lymphatic vessel invasion in colorectal cancer: a framework for developing an objective pathological diagnostic system using the Delphi method, from the Pathology Working Group of the Japanese Society for Cancer of the Colon and Rectum. Journal of Clinical Pathology. 66 (7), 551-558 (2013).
- Elston, C. A., Kazlouskaya, V., Elston, D. M. Elastic staining versus. fluorescent and polarized microscopy in the diagnosis of alopecia. Journal of the American Academy of Dermatology. 69 (2), 288-293 (2013).
- Vos, A., et al. Predominance of Nonatherosclerotic Internal Elastic Lamina Calcification in the Intracranial Internal Carotid Artery. Stroke. 47 (1), 221-223 (2016).
