Summary
Здесь мы представляем протокол эластичного окрашивания для выявления эластичных волокон в тканях рака желудка pT3N0M0 на формалино-фиксированных, парафин-встроенных разделах. Впоследствии мы описываем метод, чтобы определить, являются ли опухолевые клетки вторгаются за эластичный ламина.
Abstract
Упругая ламина, которая обычно находится в субмезотелиальном слое, примыкающем к мезотелиальным клеткам, является амфифилическим на гематоксилине и эозине (Н и Е) окрашиванием, но может быть визуализирована через эластичное окрашивание. Одним из важных преимуществ эластичного окрашивания является то, что это позволяет легко определить, являются ли опухолевые клетки вторглись за эластичный ламина. Это помогает в изучении степени вторжения брюнейшей поверхности, тем самым различая pT3 и pT4 этапов рака желудочно-кишечного тракта. В этом исследовании мы представляем протокол для выявления эластичных волокон в формино-фиксированных, парафин-встроенных pT3N0M0 рака желудка разделов ткани. Мы готовим 5-мм парафинов разделы фиксированной на слайдах, а затем все слайды deparaffinated и регидратированных во время процедуры окрашивания. Впоследствии все секции окисляются перманганата калия, отбеливаются щавелевой кислотой, окрашиваются эластичным окрашиванием и counterstained Van Gieson's. Наконец, мы исследуем эффект окрашивания; эластичный ламина окрашенные сине-черные и коллагеновые волокна окрашены красным цветом, в то время как раковые клетки окрашены в различных оттенках желтого. Мы также подробно описываем методы, используемые для определения позиционной связи между раковыми клетками и эластичной ламиной. Этот метод прост, недорогой, и широко применяется в выявлении вторжения брюшной поверхности в желудочно-кишечного тракта рака из-за его выдающейся избирательности для эластичных волокон и подлинные результаты.
Introduction
В рамках опухолевой, узловой и метастазной (TNM) системы постановки рака, прогноз рака желудка на патологической стадии pT4 значительно хуже, чем у pT3 (8-й UICC / AJCC)1. При раке желудка классификация первичной опухоли (ПТ) обычно зависит от глубины опухоли вторжения2. Патологическая стадия pT3 рака желудка определяется как рак вторжения через muscularis propria в подсерозальные ткани, в то время как pT4 рака желудка определяется как рак проникает на поверхность висцеральной перитонеум. Наличие инвазивности перитонеальной поверхности являетсяключом к различению двух стадий 2. Однако, поскольку перитонеальный мезотелиальный слой клетки очень тонкий, он может быть поврежден во время операции, послеоперационного лечения и фиксации3. Кроме того, связанные с опухолью воспалительные изменения и фиброз может повредить нормальную анатомию перитонеума, что делает его очень трудно точно судить о вторжением перитонеальной поверхности, используя только Н И E окрашивания4. Современные вспомогательные методы диагностики, такие как цитологияи иммуногистохимия, имеют ограниченное диагностическое значение 5,6, поскольку они являются ложноположительными или имеют низкую рентабельность.
Серозная мембрана включает в себя перитонеум, плевру и перикард, и состоит из мезотелия, мембраны подвала, и суб-мезотелиального слоя7. Одной из распространенных гистологических особенностей серосальной мембраны является наличие эластичного ламина в субмезотелиальном слое, примыкающем к мезотелиальным клеткам8,9. Упругая ламина имеет сильную анти-повреждение способности и может служить в качестве альтернативного прогностирика, если мезотелиальные клетки разрушаются тяжелым воспалением опухоли или фиброз3. Упругая ламина в основном состоит из эластина и микрофибрила10,который может быть визуализирован эластичным окрашиванием. Основной причиной использования эластичного окрашивания является то, что эластин образует водородную связь с феноличной группой резоринола в растворе эластина, в результате чего эластичные волокна окрашены в сине-черный цвет. После Ван Гисон (VG) контрастные окрашивания, коллагеновые волокна могут быть окрашены в красный цвет и мышечные волокна и красные кровяные тельца могут быть окрашены желтый8,11,12,13.
Восьмое издание TNM постановка рака легких определяет висцерального плеврального вторжения (T2) как вторжение опухоли за упругой ламиной или вторжения на поверхности висцеральной плевры2. Исследования колоректального рака показали, что упругий ламина вторжения в pT3 колоректального рака может быть причиной плохих прогнозов. 5-летний без болезней и общая выживаемость колоректального рака также было доказано, как pT4a13,14,15. На основе наших предыдущих исследований по эластичной окрашивания, эластичная ламина вторжения было установлено, что значительное негативное влияние на прогноз рака желудка pT3 и должны рассматриваться так же, как pT4a рака желудка12. Таким образом, этот простой и экономически эффективный метод может помочь устранить неопределенность в результатах, полученных с помощью н и e окрашивания, и другие общие ограничения, связанные с другими вспомогательными методами диагностики, в том числе цитологии и иммуногистохимии, среди Другие. Этот метод может быть эффективно использован для диагностики перитонеальной поверхности вторжений рака желудочно-кишечного тракта, особенно в некоторых неоднозначных случаях. Это удобно, так как н и E пятна и другие пятна, как правило, затрудняет выявление таких вторжений. Этот метод также обеспечивает надежность результатов, так как он очень избирательный, особенно для эластичных волокон. Здесь мы проводим эластичное окрашивание, чтобы определить, вторглись ли опухолевые клетки в упругую ламину в рак желудка pT3N0M012.
Этот метод используется для выявления эластичных волокон в тканях на формалино-фиксированных, парафин-встроенных разделов, а также может быть использован для замороженных разделов, а также. Здесь мы выбираем парафин-встроенные разделы для лучшего обслуживания клеточной и тканевой морфологии. Все этапы в этом протоколе происходят при комнатной температуре. В представленном исследовании используется коммерческий комплект для окрашивания, включающий в себя раствор перманганата калия, раствор щавелевой кислоты, раствор эластина и раствор Ван Гисона.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Между 1994 и 2005, образцы пациента были отобраны двумя опытными желудочно-кишечных патологоанатомов в аффилированной онкологической больнице Xiangya школы медицины, Центральный южный университет, от пациентов, которые перенесли гастроэктомии желудка неоплазмы, с послеоперационная патологическая диагностика рака желудка на этапе pT3N0M0 (согласно седьмой постановке TNM). Это исследование было одобрено комитетом по обзору этики.
1. Секция
- Поместите парафин блок в фиксированный держатель саней микротом, который может двигаться вперед и назад через лезвие. Отрегулируйте оптимальный угол между блоком и ножом для микротомов.
ПРИМЕЧАНИЕ: Оптимальный угол зависит не только от геометрии лезвия, но и от скорости резки и техники. - Обрезать парафин блок по мере необходимости и разрезать его на 5 мкм толщиной сечения.
- Поместите парафин 5-мм разделов в водяной бане около 40 - 45 градусов по Цельсию и смонтировать его, впоследствии, из воды на стеклянную горку, один раздел на слайд.
- Прижмите установленный раздел тщательно против бумажного полотенца, чтобы удалить любые остаточные воды и потенциальные пузырьки воздуха.
- Разрешить разделы воздуха сухой в течение 30 мин, а затем выпекать их в духовке при температуре 45 - 50 градусов по Цельсию в течение 2 ч.
2. Депараффинизация и регидратация всех слайдов
- Погрузите горки в ксилен в банку Коплина в течение 10 минут.
- Возьмите слайды из первой банки ксилена и погрузите их в ксилен в другую банку в течение 10 минут.
- Теперь погрузите горки в 100% этанол в банку Коплина в течение 5 минут.
- Погрузите слайды в 100% этанол в другой банку Коплин, а также в течение 5 минут.
- Погрузите горки в 95% этанола в банку Коплин в течение 2 минут.
- Погрузите горки в 70% этанола в банку Коплин в течение 2 минут.
ПРИМЕЧАНИЕ: Убедитесь, что слайды полностью погружены в решения при выполнении вышеуказанных шагов. - Промыть слайды кратко дистиллированной водой в новой банке.
3. Окрашивание
- Прежде чем приступить к окрашиванию, стереть лишние растворы вокруг ткани на слайде с помощью бумаги.
- Поместите горки в комнате температуры и влажности комнате условиях, чтобы избежать сушки ткани на слайде на протяжении всего процесса окрашивания.
- Окислить слайды с несколькими каплями перманганата калия в течение 5 мин. Убедитесь, что объем перманганата калия достаточно, чтобы покрыть раздел ткани на каждом слайде.
- Промыть окисленные горки дистиллированной водой в банке Коплин с 2 - 3 изменениями. Наблюдайте за синим цветом ткани.
- Теперь, отбелить эти слайды, добавив несколько капель щавелевой кислоты в течение 5 мин. Убедитесь, что объем щавелевой кислоты достаточно, чтобы полностью покрыть ткани разделе на каждом слайде.
- Промыть горки, погрузив их в банку Коплин заполнены дистиллированной водой. Выполните промыть 2x - 3x.
- Теперь вымойте эти горки кратко в 95% алкоголя, а затем погрузить слайды в раствор эластина (5 г/л) для 8 - 24 ч.
ПРИМЕЧАНИЕ: Раствор эластина волатилен, и его время окрашивания относительно длинное, поэтому лучше всего погрузить горки с эластичным окрашиванием в герметичную емкость, например, прозрачную стеклянную бутылку с герметичной крышкой. Емкость контейнера и объем раствора эластина зависят от количества погруженных горок, если он обеспечивает полное погружение всех слайдов. - Погрузите эти слайды непосредственно в 95% этанола в течение 1 - 2 мин, чтобы дифференцировать каждый раздел ткани хорошо.
ПРИМЕЧАНИЕ: Дифференциация относится к изменению заряда ткани раздела, который удаляет избыток окрашивания поглощается ткани и делает цвета яснее. После эластина раствора окрашивания, образцы не следует мыть дистиллированной водой, чтобы избежать каких-либо трудностей в дифференциации. Проверьте микроскопически, по мере необходимости, для сине-черных эластичных волокон окрашивания и серого фона. Лучше слегка недодифференцировать ткани, так как последующие контрпятно Ван Гисон может также несколько извлечь упругое пятно. - Полностью промыть эти горки дистиллированной водой после дифференциации.
- Противопоставить слайды в растворе Ван Гисона в течение 1 мин.
ПРИМЕЧАНИЕ: Объем решения Van Gieson должен быть достаточно, чтобы иметь возможность погрузить ткани разделе на каждом слайде полностью. - Быстро падение 95% этанола на эти ломтики в течение нескольких секунд, чтобы дифференцировать каждый раздел ткани хорошо.
ПРИМЕЧАНИЕ: Не промыть горки с любой водой после противопоставления Ван Гисон, так как это может ослабить или даже украсить цвет противопоступления Ван Гисон.
4. Обезвоживание и монтаж
- Погрузите слайды в 95% алкоголя в течение 5 минут, чтобы позволить им обезвоживать быстро.
- Продолжайте обезвоживать эти ломтики на 2 изменения 100% алкоголя, каждый раз погружая горки в течение 5 минут.
- Погрузите слайды в 2 изменения ксилена, каждый раз в течение 3 мин.
- Добавьте одну каплю сыси монтажа среды к слайду и поместите крышку сверху.
5. Микроскопическое наблюдение за горками
- Найдите серозальное направление и наблюдайте за результатами эластичного окрашивания: эластичные волокна (ламина) окрашены в сине-черный цвет, коллагеновые волокна окрашены в красный цвет, а мышечные волокна окрашены в желтый цвет.
- Ищите раковые клетки в целом слайд: раковые клетки окрашенных желтый12.
- Определите позиционную связь между раковыми клетками и эластичной ламиной.
ПРИМЕЧАНИЕ: Там будет две ситуации здесь. До тех пор, пока есть одна опухолевая клетка, которая вторглась за эластичный ламина во всем слайде, то этот случай можно рассматривать как эластичную ламину вторжения. С другой стороны, только тогда, когда нет опухолевых клеток, которые вторглись за эластичный ламина в целом слайд, этот случай может рассматриваться как упругий ламина не-вторжения.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Успешное эластичное окрашивание ясно показывает эластичную ламину и раковые клетки при раке желудка pT3. Рисунок 1 - маломощный поле, микроскопически проверенное после окрашивания раствора эластина, до контрпятна Ван Гисона в соответствии с упомянутым протоколом - показывает, что эластичная ламина близка к серозалальным мезотелиальным клеткам и окрашена в сине-черный цвет форма нитей, и есть еще определенное расстояние между опухолевыми клетками и эластичной ламиной. Рисунок 2 является типичным эластичное окрашивание с контрпятном Ван Гисона, где эластичная ламина окрашена сине-черный, коллагена волокна окрашены в красный цвет, а мышечные волокна и раковые клетки окрашены желтым цветом. Упругие нашествие ламина можно рассматривать как раковые клетки, проникающие в эластичную ламину(рисунок 2В), в то время как эластичная ламина невторжение может рассматриваться как раковые клетки, которые близки к эластичной ламине, но не вторгаются (рисунок2 A). В случае, если упругое окрашивание показывает повторяющуюся структуру, которая предполагает, что существует более одного слоя эластичной ламины, если вторжение опухоли не вторгается за пределы внешней эластичной ламины (указанной стрелками), образец должен быть диагностирован как упругий ламина невторжение(рисунок 2C).
Рисунок 1 : Микроскопическое изображение эластичного окрашивания перед противозапятнанием Ван Гисона. Упругой ламиной отмеченстрела стрелки, "Т" представляет опухолевые клетки, "S" представляет направление серосальной мембраны. Упругая ламина может быть четко визуализирована эластичным окрашиванием. Стрелки указывают на упругую ламину. Панель масштаба составляет 200 мкм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Рисунок 2 : Репрезентативный результат эластичного окрашивания противопят Ван Гисона. Упругой ламиной отмеченстрела стрелки, "Т" представляет опухолевые клетки, "S" представляет направление серосальной мембраны. (A) Опухолевые клетки растут рядом с эластичной ламиной, не вторгаясь за ее пределы. (B) Опухолевые клетки вторгаются за эластичный ламина. (C) Опухолевые клетки проявляют вторжение в непосредственной близости от эластичной ламина, но не проникают за пределы внешней эластичной ламина. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Этот предложенный здесь метод обеспечивает точный подход для определения субсерозаля эластичной ламина. Метод может быть использован для оценки ли опухолевые клетки вторглись упругой ламина в pT3N0M0 рака желудка12. Упругая ламина является красноватой в H и E-окрашенных разделов, которые не могут быть легко отличить от коллагеновых волокон, и другие существующие вспомогательные методы диагностики, такие как цитология и иммуногистохимия, также прилагаются ограниченное диагностическое значение. Обнаружение опухолевых клеток в перитонеальной орошаемых жидкости не обязательно указывает на наличие серосального вторжения первичной опухоли, котораяможет быть вызвана метастазами лимфатических узлов или другими отдаленными метастазами 5. Поскольку мезотелиальные клетки, вероятно, будут уничтожены волокнистым воспалением, диагностика иммуногистохимии может оказаться неосуществимой, а рабочая нагрузка относительно велика6. Тем не менее, эластичное окрашивание как классический, специальный метод окрашивания может сделать упругую ламину четко видна11,12,13. После стандартной работы, в соответствии с этим протоколом, эластичная ламина может быть окрашена сине-черный, коллагеновы волокна могут быть окрашены в красный цвет, а мышечные волокна и красные кровяные тельца могут быть окрашены в желтый цвет, что облегчает для патологоанатомов оценку распределения опухолевых клеток и эластичной ламина. Упругое окрашивание может также иметь некоторые ограничения в диагностических критериях. Например, в некоторых случаях структура эластичной ламина не ясна из-за очевидного волокнистого волокниса, связанного с опухолью. Различные наблюдатели могут иметь различия в понимании и практическом применении диагностических критериев в одном случае, хотя некоторые патологоанатомы по-прежнему считают, что если опухолевая ткань вторгается за пределы одной стороны оставшейся эластичной ламины, это может быть диагностируется как эластичная ламина вторжения17. Тем не менее, с продолжающейся популяризацией применения эластичного окрашивания и стандартизации диагностики консенсуса патологоанатомов, это ограничение будет ослаблено в будущем.
Критические шаги в этом протоколе включают надлежащий контроль процесса дифференциации и выбор стандартных образцов ткани. После эластина раствора окрашивания горки не следует мыть дистиллированной водой, но дифференцированные горки нужно размещать непосредственно в 95% этанола в течение 1 - 2 минут, чтобы избежать трудностей в дифференциации. После встречного поступления Ван Гисона следует избегать контакта горок с водой; вместо этого, дифференцированные ломтики быстро необходимо мыть в 95% этанола в течение нескольких секунд. В противном случае, цвет противокорастителя Ван Гисона будет ослаблен или даже смягчен. Что касается выбора образца ткани, наиболее важной частью является область, где перитонеум меняет направление, особенно острый угол области, а не площадь, покрытая плоской мезотелиальной ткани4. Все случаи в этом исследовании были нарисованы в соответствии с этим методом, и глубина выбора образца ткани была как можно глубже, чтобы оценить связь между опухолью и серозой. Кроме того, все этапы в этом протоколе происходят при комнатной температуре. Так как раствор эластина легко volatilize и время окрашивания относительно длинно, то лучше погрузить горки в эластичную раствор окрашивания в запечатанный контейнер. Что касается микроскопического наблюдения, то результат эластичного окрашивания является точным и надежным. Однако в некоторых особых случаях необходимо принимать во внимание некоторые разумные диагностические критерии, предложенные Грином и др. 16. В тех случаях, когда связанные с опухолью волокнистое воспаление приводит к очевидной нестабильности эластичной структуры ламина, когда опухолевая ткань вторгается за остаточный эластичной ламина с одной стороны, она может быть диагностирована как эластичная ламина вторжения. В случае пленосовой аденокарциномы, только если клеточный слизистый компонент вторгается за эластичный ламина, он может быть диагностирован как эластичная ламиновая интродукацина. Если упругие окрашивания показывает повторяющиеся упругие структуры ламина, образец может быть диагностирован как эластичная ламина вторжения только тогда, когда вторжение опухоли за пределами внешней эластичной ламиной. Если вышеуказанное условие происходит в одном или нескольких разделах, случай может быть диагностирован как эластичная ламина вторжения16.
Этот протокол демонстрирует простой метод для визуального выявления эластичного ламина при раке желудка. Этот метод широко адаптируется и может быть расширен, чтобы судить сероза вторжения для других прогнозов, таких как пищевод или рак яичников17. Он также может быть использован для выявления крови и лимфатических сосудов вторжения в колоректального рака, а также в других раковых заболеваний, особенно в некоторых сложных случаях, по той причине, что эластичный ламина также существует в сосуде и лимфатических эндотелия. Кроме того, эластичное окрашивание дешево и может быть легко принят патологоанатомов на различных сайтах18. Кроме того, этот метод не ограничивается опухолевых тканей, но также может быть использован для диагностики дерматологических и сосудистых заболеваний, таких как дискоидная волчанка эритематос, алопеция, и сонной артерии поражения19,20. С развитием эластичной технологии окрашивания и накопления исследований опухолей с большими размерами выборки, мы ожидаем, что эластичное окрашивание может быть принято AJCC постановки системы в оценке серосального вторжения рака желудка и колоректального рака.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Авторам нечего раскрывать.
Acknowledgments
Авторы частично благодарят поддержку со стороны Национального фонда естественных наук (NO.81401902 и NO.81501992) и Фонда естествознания Хунань (NO.2017SK2134, NO.2018JJ2238). Рукопись написана Гуан Лэем. Весь эксперимент проводят Сяочан Лэй и Хайян Ян. Авторы благодарят помощь патологоанатомов и стипендиатов, которые следят за данными пациентов.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Elastin-Van Gieson staining kit | Baso | BA4083B | Used for staining of elastic fibers, collagen fibers and myofibers |
| Permount TM Mounting Medium | MXB Biotechnologies | DAB-0033 | Used for mounting |
| Ethanol | LMAI Bio | LM64-17-5 | 100% |
| Xylene | LMAI Bio | LX820585 |
References
- Jiang, C. G., et al. Clinicopathologic characteristics and prognosis of gastric cancer invading the subserosa. Journal of Surgical Oncology. 102 (7), 737-741 (2010).
- Amin, M. B., et al. AJCC Cancer Staging Manual. 8th ed. , Springer. New York, NY. (2017).
- Kojima, M., et al. Elastic laminal invasion in colon cancer: diagnostic utility and histological features. Frontiers in Oncology. 2, 179 (2012).
- Ludeman, L., Shepherd, N. A. Serosal involvement7 in gastrointestinal cancer: its assessment and significance. Histopathology. 47 (2), 123-131 (2005).
- Shepherd, N. A., Baxter, K. J., Love, S. B. The prognostic importance of peritoneal involvement in colonic cancer: a prospective evaluation. Gastroenterology. 112 (4), 1096-1102 (1997).
- Liang, W. Y. Retrospective evaluation of elastic stain in the assessment of serosal invasion of pT3N0 colorectal cancers. American Journal of Surgical Pathology. 37 (10), 1565-1570 (2013).
- Carter, D., True, L., Otis, C. N. Serosal membranes. Histology for Pathologists. 3rd ed. Mills, S. E. , Lippincott Williams and Wilkins. Philadelphia, PA. 547-562 (2007).
- Knudsen, P. J. The peritoneal elastic lamina. Journal of Anatomy. 177, 41-46 (1991).
- Shepherd, N. A., Baxter, K. J., Love, S. B. Influence of local peritoneal involvement on pelvic recurrence and prognosis in rectal cancer. Journal of Clinical Pathology. 48 (9), 849-855 (1995).
- Uitto, J., Li, Q., Urban, Z. The complexity of elastic fibre biogenesis in the skin--a perspective to the clinical heterogeneity of cutis laxa. Experimental Dermatology. 22 (2), 88-92 (2013).
- Kazlouskaya, V., et al. The utility of elastic Verhoeff-Van Gieson staining in dermatopathology. Journal of Cutaneous Pathology. 40 (2), 211-225 (2013).
- Lei, G., et al. Elastic staining-a rejuvenated method to reassess prognosis and serosal invasion in patients with pT3N0M0 gastric cancer. Human Pathology. 65, 79-84 (2017).
- Hernández-Morera, P., Travieso-González, C. M., Castaño-González, I., Mompeó-Corredera, B., Ortega-Santana, F. Segmentation of elastic fibres in images of vessel wall sections stained with Weigert's resorcin-fuchsin. Computer Methods and Programs in Biomedicine. 142, 43-54 (2017).
- Kojima, M., Nakajima, K., Ishii, G., Saito, N., Ochiai, A. Peritoneal elastic laminal invasion of colorectal cancer: the diagnostic utility and clinicopathologic relationship. American Journal of Surgical Pathology. 34 (9), 1351-1360 (2010).
- Nakanishi, Y., et al. Reappraisal of Serosal Invasion in Patients With T3 Colorectal Cancer by Elastic Stain. ARCHIVES OF PATHOLOGY & LABORATORY MEDICINE. 140 (1), 81-85 (2016).
- Grin, A., et al. Peritoneal elastic lamina invasion: limitations in its use as a prognostic marker in stage II colorectal cancer. Human Pathology. 44 (12), 2696-2705 (2013).
- Stewart, C. J., Brennan, B. A., Crook, M. L., Russell, P. Value of elastin staining in the assessment of peritoneal implants associated with ovarian serous borderline tumours. Histopathology. 51 (3), 313-321 (2007).
- Kojima, M., et al. Pathological diagnostic criterion of blood and lymphatic vessel invasion in colorectal cancer: a framework for developing an objective pathological diagnostic system using the Delphi method, from the Pathology Working Group of the Japanese Society for Cancer of the Colon and Rectum. Journal of Clinical Pathology. 66 (7), 551-558 (2013).
- Elston, C. A., Kazlouskaya, V., Elston, D. M. Elastic staining versus. fluorescent and polarized microscopy in the diagnosis of alopecia. Journal of the American Academy of Dermatology. 69 (2), 288-293 (2013).
- Vos, A., et al. Predominance of Nonatherosclerotic Internal Elastic Lamina Calcification in the Intracranial Internal Carotid Artery. Stroke. 47 (1), 221-223 (2016).
