Summary
Aquí, presentamos un protocolo de tinción elástica para identificar fibras elásticas en los tejidos de cáncer gástrico pT3N0M0 en secciones fijas de formalina, incrustadas en parafina. Posteriormente, describimos un método para determinar si las células tumorales invaden más allá de la lámina elástica.
Abstract
La lámina elástica, que generalmente se encuentra en la capa submesotelial, adyacente a las células mesoteliales del peritoneo, es anfifílica sobre la hematoxilina y la tinción de eosina (H&E), pero se puede visualizar a través de la tinción elástica. Uno de los beneficios importantes de la tinción elástica es que facilita la determinación de si las células tumorales han invadido más allá de la lámina elástica. Esto ayuda a examinar el alcance de la invasión de la superficie peritoneal, distinguiendo así las etapas pT3 y pT4 en el cáncer gastrointestinal. En este estudio, presentamos un protocolo para identificar fibras elásticas en las secciones de tejido de cáncer gástrico pT3N0M0 fijados por formalina, incrustados en parafina. Preparamos secciones de parafina de 5 m fijadas en los portaobjetos, y luego todas las diapositivas se desparanyan y se rehidratan durante el procedimiento de tinción. Posteriormente, todas las secciones son oxidadas por permanganato de potasio, blanqueados por ácido oxálico, manchados por manchas elásticas y contrarrestados por Van Gieson. Por último, examinamos el efecto de la tinción; la lámina elástica se tiñe de color azul-negro y las fibras de colágeno se tiñen de rojo, mientras que las células cancerosas se tiñen en diferentes tonos de amarillo. También describimos en detalle los métodos utilizados para determinar la relación posicional entre las células cancerosas y la lámina elástica. Este método es simple, de bajo costo, y ampliamente aplicable en la identificación de la invasión superficial peritoneal en el cáncer gastrointestinal debido a su excepcional selectividad para fibras elásticas y resultados auténticos.
Introduction
Según el sistema de estadificación del cáncer de tumor, nodo y metástasis (TNM), el pronóstico del cáncer gástrico en la etapa patológica pT4 es significativamente peor que el de pT3 (8o UICC/AJCC)1. Con el cáncer gástrico, la clasificación del tumor primario (pT) generalmente depende de la profundidad de la invasión tumoral2. El cáncer gástrico pT3 en estadio patológico se define como el cáncer invadiendo a través de la musculación propria en los tejidos subserosales, mientras que el cáncer gástrico pT4 se define como cáncer que penetra en la superficie del peritoneo visceral. La presencia de la invasividad de la superficie peritoneal es la clave para distinguir las dos etapas2. Sin embargo, debido a que la capa de células mesoteliales peritoneales esmuy delgada, podría dañarse durante la cirugía, el tratamiento postoperatorio y la fijación 3. Además, los cambios inflamatorios relacionados con tumores y la fibrosis pueden dañar la anatomía normal del peritoneo, lo que hace que sea muy difícil juzgar con precisión la invasión de la superficie peritoneal usando sólo la tinción H&E4. Los métodos actuales de diagnóstico auxiliar, como la citologíay la inmunohistoquímica, son de valor diagnóstico limitado 5,6 porque son falsos positivos o tienen una baja rentabilidad.
La membrana serosal incluye el peritoneo, la pleura y el pericardio, y se compone del mesotelio, una membrana del sótano y una capa submesotelial7. Una característica histológica común de la membrana serosal es la presencia de una lámina elástica en la capasubmesotelial, adyacente a las células mesoteliales 8,9. La lamina elástica tiene una fuerte capacidad antirticida y puede servir como un marcador de pronóstico alternativo si las células mesoteliales son destruidas por inflamación grave relacionada con tumores o fibrosis3. La lámina elástica se compone principalmente de elastina y microfibril10,que se puede visualizar mediante tinción elástica. La razón principal detrás del uso de la tinción elástica es que la elastina forma un enlace de hidrógeno con el grupo fenólico de resorcinol en la solución de elastina, haciendo que las fibras elásticas se tiñen de azul-negro. Después de van Gieson (VG) manchas contrastantes, las fibras de colágeno se pueden teñir de rojo y las fibras musculares y los glóbulos rojos se pueden teñir de amarillo8,11,12,13.
La octava edición de la estadificación TNM del cáncer de pulmón define la invasión pleural visceral (T2)como una invasión tumoral más allá de la lámina elástica o una invasión en la superficie de la pleura visceral 2. Los estudios sobre el cáncer colorrectal han demostrado que la invasión de la lámina elástica en el cáncer colorrectal pT3 puede ser la razón de los malos pronósticos. También se ha demostrado que la tasa de supervivencia global de 5 años libre de enfermedades y de supervivencia global del cáncer colorrectal es como pT4a13,14,15. Según nuestros estudios previos sobre tinción elástica, se ha encontrado que la invasión de lamina elástica tiene una influencia negativa significativa en el pronóstico del cáncer gástrico pT3 y debe tratarse de la misma manera que el cáncer gástrico pT4a12. Por lo tanto, este método simple y rentable puede ayudar a eliminar la incertidumbre en los resultados obtenidos a través de la tinción de H&E, y otras limitaciones comunes asociadas con otros métodos de diagnóstico auxiliar, incluyendo citología e inmunohistoquímica, entre Otros. Este método se puede utilizar eficientemente para diagnosticar invasiones superficiales peritoneales de cáncer gastrointestinal, especialmente en algunos casos ambiguos. Es conveniente ya que la mancha de H&E y otras manchas generalmente hacen que sea difícil identificar tales invasiones. Este método también garantiza una fiabilidad de los resultados ya que es muy selectivo, especialmente a las fibras elásticas. Aquí, llevamos a cabo la tinción elástica para determinar si las células tumorales han invadido la lámina elástica en el cáncer gástrico pT3N0M012.
Este método se utiliza para identificar fibras elásticas en tejidos en secciones fijas en formalina, incrustadas en parafina, y también se puede utilizar para secciones congeladas. Aquí, elegimos secciones incrustadas en parafina para el mejor mantenimiento de la morfología celular y tisular. Todos los pasos de este protocolo tienen lugar a temperatura ambiente. En el estudio presentado se utiliza un kit de tinción comercial que incluye una solución de permanganato de potasio, una solución de ácido oxálico, una solución de elastina y la solución de Van Gieson.
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Protocol
Entre 1994 y 2005, dos patólogos gastrointestinales experimentados en el Hospital Oncológico Afiliado de la Escuela de Medicina Xiangya de la Universidad Central del Sur, de pacientes que sufrieron gastrectomía de neoplasias estomacales, con un diagnóstico patológico postoperatorio de cáncer gástrico en la etapa pT3N0M0 (según la séptima escenificación de TNM). Este estudio fue aprobado por el comité de revisión ética.
1. Seccionamiento
- Coloque el bloque de parafina en un soporte fijo del microtomo de trineo, que puede moverse hacia atrás y hacia adelante a través de la hoja. Ajuste el ángulo óptimo entre el bloque y el cuchillo microtome.
NOTA: El ángulo óptimo no sólo depende de la geometría de la hoja, sino también de la velocidad de corte y la técnica. - Recorte el bloque de parafina según sea necesario y córtelo en secciones transversales de 5 m de espesor.
- Colocar las secciones de 5-m en un baño de agua a unos 40 - 45 oC y montarlo, posteriormente, desde el agua hasta el portaobjetos de vidrio, una sección por diapositiva.
- Presione la sección montada cuidadosamente contra una toalla de papel para eliminar cualquier agua residual y posibles burbujas de aire.
- Dejar secar al aire las secciones durante 30 minutos y luego hornearlas en un horno a 45 - 50 oC durante 2 h.
2. Desparafinación y rehidratación de todas las diapositivas
- Sumerja las diapositivas en xileno en un frasco de Coplin durante 10 min.
- Saca las diapositivas del primer frasco de xileno y sumérgelas en xileno en otro frasco durante 10 min.
- Ahora, sumerja las diapositivas en etanol 100% en un frasco de Coplin durante 5 min.
- Sumerja las diapositivas en etanol 100% en otro frasco de Coplin, también durante 5 min.
- Sumerja las diapositivas en etanol al 95% en un frasco de Coplin durante 2 min.
- Sumerja las diapositivas en 70% de etanol en un frasco de Coplin durante 2 min.
NOTA: Asegúrese de que las diapositivas estén completamente inmersas en las soluciones mientras realiza los pasos anteriores. - Enjuague los portaobjetos brevemente con agua destilada en un frasco nuevo.
3. Tinción
- Antes de proceder a la tinción, limpie cualquier exceso de soluciones alrededor del tejido en la diapositiva con un papel tisular.
- Coloque los portaobjetos en las condiciones de temperatura y humedad ambiente para evitar el secado del tejido en el portaobjetos durante todo el proceso de tinción.
- Oxida relincar los portaobjetos con unas gotas de permanganato de potasio durante 5 min. Asegúrese de que el volumen de permanganato de potasio sea suficiente para cubrir la sección de tejido en cada diapositiva.
- Enjuague los portaobjetos oxidados con agua destilada en un frasco de Coplin con 2 - 3 cambios. Observe el color azul del tejido.
- Ahora, blanquear estas diapositivas mediante la adición de unas gotas de ácido oxálico durante 5 min. Asegúrese de que el volumen de ácido oxálico es suficiente para cubrir completamente la sección de tejido en cada diapositiva.
- Enjuague los portaobjetos sumergiéndolas en el frasco de Coplin lleno de agua destilada. Realice el enjuague 2x - 3x.
- Ahora, lave estos portaobjetos brevemente en un 95% de alcohol y luego sumerja los portaobjetos en una solución de elastina (5 g/L) durante 8 - 24 h.
NOTA: La solución de elastina es volátil, y su tiempo de tinción es relativamente largo, por lo que es mejor sumergir las diapositivas con tinción elástica en un recipiente sellado, como una botella de vidrio transparente con una tapa de sellado. La capacidad del contenedor y el volumen de la solución de elastina depende del número de diapositivas sumergidas, siempre que permita la inmersión completa de todas las diapositivas. - Sumerja estas diapositivas directamente en etanol 95% durante 1 - 2 min para diferenciar bien cada sección tisular.
NOTA: La diferenciación se refiere al cambio en la carga de la sección del tejido, que elimina el exceso de tinción absorbido por el tejido y hace que los colores sean más claros. Después de la tinción de elastina, las muestras no deben lavarse con agua destilada para evitar cualquier dificultad en la diferenciación. Compruebe microscópicamente, según sea necesario, para ver si hay fibras elásticas azul-negras que tiñen y fondo gris. Es mejor subdiferenciar ligeramente el tejido ya que la contramancha posterior de Van Gieson también puede extraer un poco la mancha elástica. - Enjuague completamente estos portaobjetos con agua destilada después de la diferenciación.
- Contraventa de los portaobjetos en la solución de Van Gieson durante 1 min.
NOTA: El volumen de la solución de Van Gieson debe ser suficiente para poder sumergir completamente la sección de tejido en cada diapositiva. - Rápidamente caer 95% etanol sobre estas rodajas durante unos segundos para diferenciar bien cada sección de tejido.
NOTA: No enjuague los portaobjetos con agua después de la contramancha del Van Gieson, ya que eso podría debilitar o incluso eluir el color de la contramancha del Van Gieson.
4. Deshidratación y montaje
- Sumerja los portaobjetos en 95% de alcohol durante 5 minutos para dejar que se deshidraten rápidamente.
- Continúe deshidratando estas rodajas en 2 cambios de 100% de alcohol, cada vez que sumerce los portaobjetos durante 5 min.
- Sumerja las diapositivas en 2 cambios de xileno, cada vez durante 3 min.
- Agregue una gota de medio de montaje resinoso a la corredera y coloque el cubreobjetos en la parte superior.
5. Observación microscópica de las diapositivas
- Encuentra la dirección serosal y observa los resultados de la tinción elástica: las fibras elásticas (láminas) se tiñen de color azul-negro, las fibras de colágeno se tiñen de rojo, y las fibras musculares están teñidas de amarillo.
- Busque las células cancerosas en toda la diapositiva: las células cancerosas están teñidas de amarillo12.
- Determinar la relación posicional entre las células cancerosas y la lámina elástica.
NOTA: Habrá dos situaciones aquí. Mientras haya una célula tumoral que haya invadido más allá de la lámina elástica en toda la diapositiva, entonces este caso podría considerarse como invasión de lámina elástica. Por otro lado, sólo cuando no hay células tumorales que haya invadido más allá de la lámina elástica en toda la diapositiva, este caso podría considerarse como lamina elástica no invasión.
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Representative Results
Una tinción elástica exitosa revela claramente la lámina elástica y las células cancerosas en el cáncer gástrico pT3. La Figura 1 - campo de baja potencia, comprobada microscópicamente después de la tinción de la solución de elastina, antes de la contramancha de Van Gieson según el protocolo mencionado - muestra que la lámina elástica está cerca de las células mesoteliales serosales y está teñida de azul-negro en el forma de filamentos, y todavía hay una cierta distancia entre las células tumorales y la lámina elástica. La Figura 2 es una tinción elástica típica con la contramancha de Van Gieson, donde la lámina elástica se tiñe de color azul-negro, las fibras de colágeno se tiñen de rojo, y las fibras musculares y las células cancerosas se tiñen de amarillo. La invasión de láminas elásticas se puede considerar como células cancerosas que penetran en la lámina elástica (Figura2B),mientras que la no invasión de láminas elásticas se puede considerar como células cancerosas cercanas a la lámina elástica, pero no invasoras (Figura2 A). En caso de que la tinción elástica revele una estructura repetitiva, lo que sugiere que hay más de una capa de lámina elástica, si la invasión tumoral no invade más allá de la lámina elástica más externa (indicada por flechas), la muestra debe diagnosticarse como elástica lamina no invasión (Figura 2C).
Figura 1 : La imagen microscópica de la tinción elástica antes de la contramancha de Van Gieson. La lámina elástica está marcada por flechas, "T" representa las células tumorales, "S" representa la dirección de la membrana serosal. La lámina elástica se puede visualizar claramente mediante la tinción elástica. Las flechas indican lámina elástica. La barra de escala es de 200 m. Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2 : El resultado representativo de la tinción elástica con la contramancha de Van Gieson. La lámina elástica está marcada por flechas, "T" representa las células tumorales, "S" representa la dirección de la membrana serosal. (A) Las células tumorales crecen cerca de la lámina elástica sin invadir más allá de ella. (B) Las células tumorales invaden más allá de la lámina elástica. (C) Las células tumorales exhiben invasión en las proximidades de la lámina elástica, pero no penetran más allá de la lámina elástica más externa. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
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Discussion
Este método propuesto aquí proporciona un enfoque preciso para identificar la lámina elástica subserosal. El método se puede utilizar para evaluar si las células tumorales han invadido la lámina elástica en el cáncer gástrico pT3N0M012. La lámina elástica es rojiza en secciones teñidas con H&E, que no se podía distinguir fácilmente de las fibras de colágeno, y otros métodos de diagnóstico auxiliares existentes, como la citología y la inmunohistoquímica, también ejercieron un valor diagnóstico limitado. El hallazgo de células tumorales en el líquido de irrigación peritoneal no indica necesariamente la presencia de una invasión serosal deltumor primario, que puede deberse a la metástasis del ganglio linfático u otra metástasis distante 5. Como es probable que las células mesoteliales sean destruidas por la inflamación fibrosa,un diagnóstico de inmunohistoquímica puede no ser factible, y la carga de trabajo es relativamente grande 6. Sin embargo, la tinción elástica como un método de tinción clásico y especial puede hacer que la lámina elástica sea claramente visible11,12,13. Después del funcionamiento estándar, de acuerdo con este protocolo, la lámina elástica se puede teñir de color azul-negro, las fibras de colágeno se pueden teñir de rojo, y las fibras musculares y los glóbulos rojos se pueden teñir de amarillo, lo que facilita a los patólogos evaluar la distribución de células tumorales y lamina elástica. La tinción elástica también puede tener algunas limitaciones en los criterios de diagnóstico. Por ejemplo, en algunos casos, la estructura de la lámina elástica no está clara debido a la inflamación fibrosa relacionada con tumores. Diferentes observadores pueden tener diferencias en la comprensión y aplicación práctica de los criterios de diagnóstico en un caso, aunque algunos patólogos todavía creen que si el tejido tumoral invade más allá de un lado de la lámina elástica restante, puede ser diagnosticado como una invasión de lámina elástica17. No obstante, con la continua popularización de la aplicación de la tinción elástica y la estandarización del consenso de diagnóstico de los patólogos, esta limitación se debilitará en el futuro.
Los pasos críticos de este protocolo incluyen el control adecuado del proceso diferenciador y la selección estándar de muestras de tejido. Después de la tinción de elastina, los portaobjetos no deben lavarse con agua destilada, pero los portaobjetos diferenciados deben colocarse directamente en etanol al 95% durante 1 - 2 minutos para evitar la dificultad en la diferenciación. Después de la contramancha de Van Gieson, se debe evitar el contacto de los toboganes con agua; en cambio, las rodajas diferenciadas necesitan ser lavadas rápidamente en etanol 95% durante unos segundos. De lo contrario, el color de la contramancha del Van Gieson se debilitará o incluso se eluyará. En cuanto a la selección de muestras de tejido, la parte más importante es el área donde el peritoneo cambia de dirección, especialmente el área de ángulo agudo, en lugar de la zona cubierta por el tejido mesotelial plano4. Todos los casos en este estudio fueron dibujados de acuerdo con este método, y la profundidad de la selección de muestras de tejido fue lo más profunda posible con el fin de evaluar la relación entre el tumor y la serosa. Además, todos los pasos de este protocolo tienen lugar a temperatura ambiente. Dado que la solución de elastina es fácil de volatilizar y el tiempo de tinción es relativamente largo, lo mejor es sumergir las diapositivas en una solución de tinción elástica en un recipiente sellado. En cuanto a la observación microscópica, el resultado de la tinción elástica es preciso y fiable. Sin embargo, en algunos casos especiales, es necesario tener en cuenta algunos criterios de diagnóstico razonables, como proponen Grin et al. 16. En los casos en que la inflamación fibrosa relacionada con tumores produce una inestabilidad obvia de la estructura de la lámina elástica, cuando el tejido tumoral invade más allá de la lámina elástica residual en un lado, se puede diagnosticar como invasión de lámina elástica. En el caso del adenocarcinoma mucino, sólo si el componente mucoso celular invade más allá de la lámina elástica puede ser diagnosticado como invasión de lámina elástica. Si la tinción elástica muestra una estructura de lámina elástica repetitiva, la muestra se puede diagnosticar como invasión de lámina elástica solo cuando la invasión tumoral está más allá de la lámina elástica más externa. Si la condición anterior ocurre en una o más secciones, el caso puede ser diagnosticado como invasión de lámina elástica16.
Este protocolo demuestra una técnica sencilla para identificar visualmente la lámina elástica en cáncer gástrico. Esta técnica es ampliamente adaptable y puede ampliarse para juzgar la invasión serosal para otras predicciones de pronóstico, como el cáncer de esófago u ovario17. También se puede utilizar para identificar la invasión de la sangre y los vasos linfáticos en el cáncer colorrectal, así como en otros tipos de cáncer, especialmente en algunos casos difíciles, por la razón de que la lámina elástica también existe en el endotelio de los vasos y linfáticos. Además, la tinción elástica es barata y puede ser fácilmente adoptada por patólogos en diferentes sitios18. Además, esta técnica no se limita a los tejidos tumorales, sino que también se puede utilizar para diagnósticos de enfermedades dermatológicas y vasculares, como el lupus eritematoso discoide, la alopecia y la lesión de la arteria carótida19,20. Con el desarrollo de la tecnología de tinción elástica y la acumulación de estudios de tumores con grandes tamaños de muestra, esperamos que la tinción elástica pueda ser aceptada por el sistema de estadificación AJCC para juzgar la invasión serosal del cáncer gástrico y el cáncer colorrectal.
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Disclosures
Los autores no tienen nada que revelar.
Acknowledgments
Los autores agradecen el apoyo en parte de la Fundación Nacional de Ciencias Naturales (NO.81401902 y NO.81501992) y la Fundación de Ciencias Naturales de Hunan (NO.2017SK2134, NO.2018JJ2238). El manuscrito está escrito por Guang Lei. Todo el experimento es realizado por Guang Lei y Haiyan Yang. Los autores agradecen la asistencia de patólogos y de becarios que siguen los datos de los pacientes.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Elastin-Van Gieson staining kit | Baso | BA4083B | Used for staining of elastic fibers, collagen fibers and myofibers |
| Permount TM Mounting Medium | MXB Biotechnologies | DAB-0033 | Used for mounting |
| Ethanol | LMAI Bio | LM64-17-5 | 100% |
| Xylene | LMAI Bio | LX820585 |
References
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