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Immunology and Infection

प्रतिजनी रोग-विशिष्ट एंटीबॉडी के उत्पादन के लिए Liposomes

Published: October 25, 2018 doi: 10.3791/58285
Automatic Translation
*1, *2,3, *3,4, 5, 6, 3,4, 5,7
1Janssen R&D, 2Department of Microbiology and Immunology, University of North Carolina, 3UNC Food Allergy Initiative, University of North Carolina, 4Department of Pediatrics, University of North Carolina, 5Department of Chemistry, University of Alberta, 6Department of Molecular Medicine, Scripps Research Institute, 7Department of Medical Microbiology and Immunology, University of Alberta
* These authors contributed equally

Summary

वर्णित प्रतिजनी liposomal नैनोकणों और इन विट्रो में और vivoमें उत्तेजक बी सेल सक्रियण में उनके उपयोग की तैयारी है । लगातार और मजबूत एंटीबॉडी प्रतिक्रियाएं एक नई मूंगफली एलर्जी मॉडल के विकास के लिए नेतृत्व किया । प्रतिजनी liposomes पैदा करने के लिए प्रोटोकॉल अलग प्रतिजनों और प्रतिरक्षण मॉडल के लिए बढ़ाया जा सकता है ।

Abstract

एंटीबॉडी प्रतिक्रियाओं रोगजनकों की एक विस्तृत सरणी के लिए महत्वपूर्ण सुरक्षात्मक प्रतिरक्षा प्रदान करते हैं । वहां टीकाकरण के लिए मजबूत एंटीबॉडी पैदा करने में एक उच्च ब्याज के रूप में अच्छी तरह के रूप में समझ कैसे रोगजनक एंटीबॉडी प्रतिक्रियाओं एलर्जी और स्व-प्रतिरक्षित रोग में विकसित रहता है । मजबूत प्रतिजन-विशिष्ट एंटीबॉडी प्रतिक्रियाओं पैदा हमेशा तुच्छ नहीं है । माउस मॉडलों में, यह अक्सर सहायक के साथ प्रतिरक्षण के कई दौर की आवश्यकता है कि प्रेरित एंटीबॉडी के स्तर में परिवर्तनशीलता का एक बड़ा सौदा होता है । एक उदाहरण मूंगफली एलर्जी के माउस मॉडल में है, जहां अधिक मजबूत और reproducible मॉडल है कि माउस की संख्या को कम करने और सहायक के उपयोग के लिए फायदेमंद होगा । यहां प्रस्तुत मूंगफली एलर्जी तीव्रग्राहिता का एक अत्यधिक reproducible माउस मॉडल है । इस नए मॉडल दो प्रमुख कारकों पर निर्भर करता है: (1) प्रतिजन-विशिष्ट splenocytes एक भोली प्राप्तकर्ता माउस में एक मूंगफली-संवेदी माउस से स्थानांतरित adoptively रहे हैं, प्रतिजन की संख्या-विशिष्ट स्मृति बी और चूहों की एक बड़ी संख्या में टी कोशिकाओं को सामांय; और (2) प्राप्तकर्ता चूहों बाद में प्रमुख मूंगफली एलर्जी (आरा एच 2) प्रदर्शित liposomal नैनोकणों के रूप में एक मजबूत multivalent immunogen के साथ बढ़ाया जाता है । इस मॉडल का प्रमुख लाभ अपने reproducibility है, जो अंततः प्रत्येक अध्ययन में इस्तेमाल जानवरों की संख्या कम करती है, जबकि सहायक के कई इंजेक्शन प्राप्त पशुओं की संख्या को कम । इन immunogenic liposomes के मॉड्यूलर विधानसभा अंय एलर्जी या स्व-प्रतिरक्षित मॉडल है कि रोगजनक एंटीबॉडी शामिल करने के लिए अपेक्षाकृत सतही अनुकूलन प्रदान करता है ।

Introduction

खाद्य एलर्जी संयुक्त राज्य अमेरिका में बच्चों के 8% को प्रभावित करता है, और पिछले एक दशक से अधिक प्रसार में वृद्धि हुई है1। मूंगफली से एलर्जी बच्चों के 1% को प्रभावित करता है और आम तौर पर2से अधिक नहीं हो । हालांकि कई होनहार नैदानिक परीक्षण खाद्य एलर्जी के उपचार के लिए चल रहे हैं, मौखिक immunotherapy सहित (OIT), मांसल immunotherapy (भट्ठा), और epicutaneous immunotherapy (एपिट), वहां वर्तमान में कोई एफडीए-उपचार रणनीतियों को मंजूरी दे दी है मूंगफली-एलर्जी व्यक्तियों3,4,5,6,7,8को संवेदनशील बनाना । इसलिए, एलर्जी व्यक्तियों कड़ाई से एलर्जी तीव्रग्राहिता से बचने के लिए बचना चाहिए । कई सवाल संवेदीकरण और खाद्य एलर्जी विकास के अंतर्निहित तंत्र के मार्गों के बारे में रहते हैं ।

माउस मॉडल एलर्जी के तंत्र के अध्ययन के रूप में के रूप में अच्छी तरह से नए tolerogenic और संवेदी उपचार9,10,11,12के विकास के लिए एक महत्वपूर्ण उपकरण हैं । यह विशेष रूप से सच है क्योंकि प्रमुख मूंगफली एलर्जी (आरा एच 2; Ah2) मनुष्यों में भी है प्रमुख एलर्जी में कई वर्णित माउस13,14मॉडल । जबकि मूंगफली एलर्जी के माउस मॉडल संवेदीकरण और सहिष्णुता के तंत्र का अध्ययन करने में अमूल्य हैं, एक खामी यह है कि वे चर और adjuvants के उपयोग की आवश्यकता हो सकती है । अधिक शक्तिशाली immunogens एक तरह से इस तरह के मॉडल के आंतरिक परिवर्तनशीलता को कम करने के लिए किया जाएगा । के बाद से बी-कोशिकाओं दृढ़ता से सक्रिय है multivalent एंटीजन, प्रतिजनी प्रदर्शित liposomes एलर्जी की वजह से बी सेल रिसेप्टर (BCR) के माध्यम से संभावित ख कोशिकाओं को सक्रिय करने की क्षमता का एक अच्छा विकल्प है जबकि भी कुशलता की संपत्ति होने के माध्यम से टी सेल डिब्बे भड़काने गैर विशेष रूप से प्रतिजन प्रस्तुत कोशिकाओं द्वारा लिया जा रहा है ।

यहां, हम conjugating प्रोटीन एंटीजन के लिए एक विस्तृत प्रोटोकॉल का वर्णन करने के लिए एक सतही और मॉड्यूलर रणनीति का उपयोग नैनोकणों liposomal । एक किराए प्रतिजन, विरोधी आईजीएम फैब टुकड़ा का उपयोग कर, हम प्रदर्शन कैसे शक्तिशाली ऐसे प्रतिजनी liposomes बी में उत्तेजक हो सकता है-सेल सक्रियण । antigen liposomes प्रदर्शित Ah2 प्रतिजन लिटरेचर संवेदनशीलता का एक नया माउस मॉडल को विकसित करने के लिए उपयोग किया गया । इस मॉडल में, सत्यापित मूंगफली एलर्जी चूहों से splenocytes, मूंगफली विशिष्ट स्मृति बी और टी कोशिकाओं युक्त, भोले congenic चूहों में स्थानांतरित कर रहे हैं । स्मृति एंटीबॉडी प्रतिक्रियाओं Ah2 के खिलाफ एंटीबॉडी प्रेरित करने के क्रम में, प्राप्तकर्ता चूहों में Ah2 के साथ liposomes संयुग्मित के इंजेक्शन द्वारा प्रेरित कर रहे हैं. घुलनशील Ah2 के साथ केवल एक को बढ़ावा देने के बाद, Ah2-विशिष्ट एंटीबॉडी जब इन चूहों बाद में Ah2 के साथ चुनौती दी है एक मजबूत anaphylactic प्रतिक्रिया को जन्म दे । के रूप में एक अत्यधिक समान तरीके से एलर्जी प्रतिक्रिया के दौर से गुजर चूहों और एक सहायक प्राप्त नहीं किया है, इस दृष्टिकोण एक वांछनीय मूंगफली एलर्जी मॉडल है और परिणामों का सुझाव है कि यह अन्य माउस पर निर्देशित एंटीजन द्वारा संचालित मॉडल में उपयोगिता हो सकती है एलर्जी और संभवत: एंटीजन ।

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Protocol

प्रोटीन और लिपिड को liposomes में शामिल युग्मन के सामांय विधि काफी पहले काम15पर आधारित है । सभी जानवरों के नीचे वर्णित प्रक्रियाओं चैपल हिल संस्थागत पशु देखभाल और उपयोग समिति (IACUC) में उत्तरी केरोलिना विश्वविद्यालय द्वारा अनुमोदित किया गया है । मूंगफली एलर्जी मॉडल में इस्तेमाल सभी चूहों बालब/मुख्य ंयायाधीश उंर के 3 सप्ताह में से खरीदा महिलाओं रहे हैं । अलबर्टा पशु देखभाल और उपयोग समिति (ACUC) के विश्वविद्यालय के C57Bl से पूर्व vivo विश्लेषण के लिए माउस तिल्ली के उपयोग को शामिल प्रयोगों को मंजूरी दी है/

1. प्रोटीन प्रतिजन के विकार PEGylated लिपिड

  1. 1500 के एक अंश सीमा के साथ पार से जुड़े dextran जेल मोतियों की 3 जी जोड़ें-30000 Daltons (डीए) एक २५० मिलीलीटर वैक्यूम कुप्पी के लिए । फॉस्फेट बफर खारा (पंजाब) की ६० मिलीलीटर जोड़ें और लगातार एक चुंबकीय हलचल बार के साथ हलचल । सील कुप्पी और एक शूंय के लिए संलग्न करने के लिए एक हलचल प्लेट पर de-बक शुरू करने के लिए 1 ज की एक ंयूनतम ।
  2. कारोबार डाट बंद के साथ १.० सेमी x 30 सेमी ग् क्रोमैटोग्राफी कॉलम में, स् तंभ को धोने के लिए पंजाबियों को जोड़ें । कारोबार डाट खोलो और कॉलम नाली । धोने के बाद, स्तंभ के लिए de-मार डाला मोतियों का घोल जोड़ें । लगातार जब तक कॉलम लगभग 24 सेमी की एक मनका ऊंचाई को पैक है घोल जोड़ें ।
  3. एक बार कॉलम एक ' सिर ' के लगभग 4-5 पैक मोतियों से ऊपर पंजाबियों के cm, निंनलिखित कदम तैयार है ।
    1. लंबे समय तक एक शेल्फ 1 तक पहुंचने के लिए पर्याप्त टयूबिंग के एक टुकड़े को मापने के द्वारा एक गुरुत्व प्रवाह अपनाना बनाएं-कॉलम के ऊपर से 2 फीट और एक पाश है कि कॉलम के नीचे और रिटर्न कॉलम के ऊपर के पास बूंदें बनाने के लिए । टयूबिंग के एक छोर करने के लिए एक कारोबार डाट जोड़ें, खुली टयूबिंग के एक तरफ जा रहा है । खुली ट्यूब को पंजाब के ५०० मिलीलीटर की बोतल में समा और कॉलम के ऊपर शेल्फ पर रखें ।
    2. कारोबार डाट के साथ अंत ले लो और एक 10 मिलीलीटर सिरिंज देते हैं । टयूबिंग लाइन पर कारोबार डाट वाल्व खोलें और ट्यूब के माध्यम से पंजाबियों आकर्षित । एक बार पंजाबियों टयूबिंग के माध्यम से रास्ते के तीन तिमाहियों तक पहुंच गया है, जल्दी से सिरिंज को हटाने और कॉलम के शीर्ष करने के लिए कारोबार डाट जोड़ने-तरल कॉलम पर चलना चाहिए ।
      नोट: इस कॉलम के शीर्ष पर छोड़े गए पंजाबियों के ' हेड ' की राशि 1 से 3 सेमी के बीच होनी चाहिए । स्तंभ को धोने के लिए न्यूनतम राशि 3 स्तंभ वॉल्यूम है ।
  4. निर्धारित प्रोटीन की मात्रा (तिल) को अपने आणविक भार (मेगावॉट) के आधार पर लिपिड से जोड़ा जाए.
    नोट: बकरी विरोधी माउस आईजीएम के फैब टुकड़ा (ही एक आईजीजी) बी कोशिकाओं की polyclonal उत्तेजना के लिए एक सार्वभौमिक किराए प्रतिजन के रूप में यहां प्रयोग किया जाता है । तदनुसार, बकरी आईजीजी के फैब टुकड़ा लगभग ४८ kiloDalton (केडीए) की एक मेगावाट है और वाणिज्यिक १.३ मिलीग्राम की कुल मात्रा में उपलब्ध है । इस प्रकार, जोड़ा जा करने के लिए प्रोटीन की मात्रा २७.१ µmol है ।
  5. ब्याज के प्रोटीन के विलुप्त गुणांक का निर्धारण । यदि अज्ञात, एक spectrophotometer का उपयोग कर २८० एनएम पर प्रोटीन अवशोषक उपाय और १.४ चरण में गणना की तिल की संख्या से एक२८० मूल्य विभाजित ।
    नोट: विलुप्त सह २८० एनएम में बकरी आईजीजी के फैब के कुशल ६४,६०० एम-1है ।
  6. सुनिश्चित करें कि अमीन-बफ़र युक्त का पता लगाने मात्रा हटा रहे हैं, चरणों में बनाए गए कॉलम पर प्रोटीन नमक 1.1 – 1.3 और १.५ मिलीलीटर microcentrifuge ट्यूबों (~ ५०० µ एल अंश प्रति) में प्रोटीन भागों इकट्ठा ।
    1. स्तंभ के शीर्ष से कनेक्ट टर्नओवर डाट वाल्व बंद करें और स्तंभ के शीर्ष को निकालें । यदि पहले से ही खुला नहीं, कॉलम के तल पर कारोबार डाट वाल्व खोलो और इंतजार जब तक पंजाब के ' सिर ' मोतियों की चोटी हिट ।
    2. धीरे से एक गिलास पाश्चर पिपेट का उपयोग कर मोती के शीर्ष करने के लिए ब्याज की प्रोटीन में जोड़ें, मोती के शीर्ष करने के लिए अशांति को कम करने के लिए सावधान किया जा रहा.
    3. एक बार प्रोटीन समाधान के ' सिर ' मोतियों के ऊपर पहुंच गया है, एक पाश्चर पिपेट के माध्यम से धीरे से पंजाब के 1 मिलीलीटर जोड़ें । तीन बार दोहराएं । 4-5 सेमी का सिर बनाने के लिए पंजाबियों जोड़ें और कॉलम धोने के लिए १.३ कदम दोहराएं ।
      नोट: यदि यह निश्चित है कि कोई अमीन-युक्त बफ़र मौजूद नहीं है, तो यह चरण छोड़ा जा सकता है ।
  7. भागों है कि A280 मूल्यों और पूल भागों है कि प्रोटीन की लगभग ९०% वसूली देने को मापने के द्वारा प्रोटीन शामिल निर्धारित करते हैं ।
    नोट: यह आमतौर पर प्रोटीन 1.5-2-गुना पतला । निर्धारित करने के बाद प्रोटीन एकाग्रता पूलिंग । इस कदम पर प्रोटीन ध्यान केंद्रित, यदि आवश्यक हो, एक केंद्रापसारक ध्यान देने का प्रयोग ।
  8. जोड़ें २.५ दाढ़ प्रोटीन के लिए heterobifunctional crosslinker के बराबर ।
    1. सबसे पहले, succinimidyl 3 के लगभग 5 मिलीग्राम-(2-pyridyldithio) propionate (SPDP, मेगावाट = ३१४ ग्राम/microcentrifuge ट्यूब में) । SPDP भंग करने के लिए मात्रा का निर्धारण करने के लिए, दाढ़ प्रोटीन एकाग्रता लेने के लिए और 250x द्वारा यह गुणा एक 100x समाधान है कि प्रतिक्रिया में एक २.५ दाढ़ अतिरिक्त देना होगा उत्पन्न करने के लिए.
      नोट: उदाहरण के लिए, यदि प्रोटीन एकाग्रता ५० µ मीटर है, १२.५ mM पर SPDP के एक समाधान की जरूरत है । SPDP के 5 मिलीग्राम के लिए, यह dimethyl sulfoxide (DMSO) के १.२७ मिलीलीटर से मेल खाती है ।
  9. एक 1:100 कमजोर पड़ने पर ब्याज की प्रोटीन के लिए SPDP जोड़ें । लगभग 1 घंटे के लिए कमरे के तापमान (आरटी) पर एक दोलन शेखर पर प्रतिक्रिया प्लेस ।
  10. अतिरिक्त SPDP को हटाने और अंतर्जात डाइसल्फ़ाइड बांड (ओं) की रक्षा करने के लिए, बाद में कमी कदम में प्रोटीन में, equilibrate और धो चरण में बनाया स्तंभ 1.1 – 1.3 १०० मिमी सोडियम एसीटेट (NaOAc) में पीएच ५.५ पर या केवल इस में उपयोग के लिए एक समान स्तंभ बनाएँ बफ़र.
  11. SPDP के साथ 1 ज की गर्मी के बाद, १०० mM NaOAc में कॉलम equilibrated पर प्रोटीन नमक । eluent के रूप में १०० mM NaOAc (pH ५.५) का उपयोग कर के अलावा चरण १.६ के रूप में एक समान तरीके से इस चरण बाहर ले । भागों लीजिए, एक२८०निर्धारित करते हैं, और शीर्ष भागों पूल । पंजाबियों में कॉलम धो लें ।
  12. डबल आसुत जल (ddH2ओ) में डीटीटी के २.५ मीटर (मेगावाट = १५४ g/मोल) का समाधान तैयार करें । 5-10 मिनट के लिए प्रोटीन के परित अंशों में 25 mM डीटीटी जोड़ें ।
  13. एक प्रोटीन के२८० उपाय और विलुप्त होने गुणांक द्वारा इस विभाजन । भी, एक३४३निर्धारित करते हैं । प्रोटीन (a२८०) और linker (a३४३) के molarity के आधार पर लिंकिंग अनुपात की गणना करें ।
    नोट: यदि कोई nanodrop spectrophotometer का उपयोग करते हुए A340 ऑटो-अंशांकन बंद करें । एक३४३ माप pyridine 2-thione समूह (विलुप्त होने गुणांक = ७५५० एम-1) जो डीटीटी द्वारा SPDP क्रॉस-लिंकर से निकाल दिया जाता है के अवशोषण का प्रतिनिधित्व करता है । linker के एक दाढ़ अनुपात: 1.2-1.5 के प्रोटीन अनुपात आम तौर पर प्राप्त होता है जब प्रोटीन की एक विस्तृत श्रृंखला पर एक २.५ दाढ़ अधिक SDPD के साथ प्रतिक्रिया प्रदर्शन ।
  14. ऊपर वर्णित के रूप में पंजाब में धोया स्तंभ पर परित भागों भागो । भागों लीजिए, एक२८०, और पूल शीर्ष भागों का निर्धारण । अंशों को पूलिंग के बाद A280 करके प्रोटीन की एकाग्रता का निर्धारण करें ।
  15. तैयार DSPE-खूंटी (2000)-Maleimide (1, 2-distearoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine-N-[methoxy (पॉलीथीन ग्लाइकोल)-2000)-Maleimide. इसमें 10:1 दाढ़ अनुपात में प्रोटीन को जोड़ा जाएगा । DSPE-खूंटी (2000) के एक 100x शेयर तैयार-Maleimide वांछित एकाग्रता प्राप्त करने के लिए ।
    1. उदाहरण के लिए, यदि प्रोटीन एकाग्रता १.१४ कदम के बाद 10 µ मीटर है, DSPE-खूंटी (2000) के एक शेयर तैयार-10 मिमी पर Maleimide । ध्यान से DSPE बाहर वजन-खूंटी (2000)-Maleimide (मेगावाट = ३००० g/मोल) और DMSO की उचित मात्रा में जोड़ें । कोमल भंवर और sonicating के कई दौर यह पूरी तरह से भंग हो सकता है ।
  16. चरण १.१४ से भिन्नों की कुल मात्रा निर्धारित करें और समाधान को एक छोटे (10-25 मिलीलीटर) राउंड बॉटम कुप्पी (RBF) में सावधानी से हस्तांतरण. 100x DSPE-खूंटी (2000) की उपयुक्त मात्रा जोड़ें-प्रोटीन के लिए Maleimide एक 1x, 10 गुना दाढ़ अधिक, अंतिम एकाग्रता को प्राप्त करने के लिए । धीरे से हल है कि DMSO पूरी तरह से फैला हुआ है सुनिश्चित करने के भंवर ।
  17. भागो प्रतिक्रिया एक सील RBF में नाइट्रोजन के तहत रातोंरात । एक रबर पट और एक धुएं डाकू में जगह का प्रयोग करें ।
    1. एक वैक्यूम करने के लिए संलग्न टयूबिंग के अंत में एक 3 मिलीलीटर सिरिंज से जुड़ी एक 20 जी सुई के साथ पट puncturing द्वारा वातावरण को निकालें, और 3 के लिए निर्वात पर बारी-5 एस.
    2. वातावरण को नाइट्रोजन से बदलें । एक 3 मिलीलीटर सिरिंज से जुड़ी एक गुब्बारे भरें नाइट्रोजन के साथ आधे में कटौती और एक 20 ग्राम सुई देते हैं । पट को पंक्चर करने के लिए नाइट्रोजन के साथ गोल नीचे कुप्पी के अंदर वातावरण भर दें. वातावरण के हटाने और नाइट्रोजन के साथ प्रतिस्थापन एक बार और अधिक दोहराने और नाइट्रोजन गुब्बारा रात भर संलग्न छोड़ दें ।
  18. एक अलग क्रॉस-लिंक्ड dextran जेल मनका कॉलम एक १.० सेमी x ५० सेमी ग्लास क्रोमैटोग्राफी कॉलम में 4000-150000 दा के एक अंश सीमा के साथ तैयार (कदम के अनुसार 1.1-1.3) ।
  19. अगले दिन, दौर नीचे कुप्पी से १.१७ कदम में तैयार है और भागो से प्रोटीन निकालें (१.६ चरण में इस्तेमाल विधि का पालन करें) पार से जुड़े dextran जेल मनका कॉलम (से कदम १.१८) ।
    नोट: स्तंभ पर लोड करने के लिए कुल राशि 2 मिलीलीटर से अधिक नहीं होनी चाहिए । यदि एक बड़ी प्रतिक्रिया का इस्तेमाल किया गया था, दो में विभाजित है और अलग कॉलम पर चलाने के लिए या एक बड़ा व्यास स्तंभ पर चलाते हैं ।
    1. भागों लीजिए, एक२८०, पूल शीर्ष भागों का निर्धारण, और प्रोटीन की एकाग्रता का निर्धारण । लिपिड की उपस्थिति माप को प्रभावित नहीं करेगा ।
  20. उपयोग के लिए तैयार जब तक 4 डिग्री सेल्सियस पर लिपिड से जुड़े प्रोटीन के अंतिम परित भागों की दुकान ।

२. Liposome तयारी

  1. बाहर लिपिड वजन: DSPE-खूंटी (2000) (1, 2-distearoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine-N-[methoxy (पॉलीथीन ग्लाइकोल)-२०००, मेगावाट = २८०५.५ ग्राम/ कोलेस्ट्रॉल (3 बी-Hydroxy-5-cholestene, 5-Cholesten-3 बी-राजभाषा), मेगावाट = ३८६.७ g/ और DSPC (1, 2-distearoyl-sn-glycero-3-phosphocholine), मेगावाट = ७९०.१ g/एक 5 मिलीग्राम/एमएल DSPC के समाधान, 4 मिलीग्राम/एमएल कोलेस्ट्रॉल के समाधान, और 2 मिलीग्राम/DSPE में क्लोरोफॉर्म-खूंटी (2000) के समाधान ।
  2. सुनिश्चित करें कि liposomes में लिपिड का दाढ़ अनुपात है: ५७% DSPC, ३८% कोलेस्ट्रॉल, और 5% DSPE-खूंटी (2000), के रूप में तालिका 1में प्रतिनिधित्व किया ।
    नोट: यह liposome है, जो आम तौर पर 0.01 से पर्वतमाला-0.1% पर प्रतिजन की राशि को नियंत्रित करने के लिए महत्वपूर्ण है । 1 तालिकामें, बकरी विरोधी माउस आईजीएम फैब PEGylated लिपिड से जुड़े टुकड़ा का ०.१% प्रयोग किया जाता है । यह DSPE-खूंटी (2000) के 10 गुना दाढ़ अतिरिक्त के ध्यान में रखना महत्वपूर्ण है-Maleimide कि १.१५ कदम में प्रोटीन के लिए जोड़ा गया था, यह सुनिश्चित करने के लिए कि PEGylated लिपिड की कुल राशि 5% से अधिक नहीं है ।
  3. बाहर निकालना के लिए लिपिड बनाने जब अंतिम लिपिड मात्रा (µmol) पर विचार करें । एक १.२५ µ एम कुल लिपिड एकाग्रता पर liposomes के निर्माण के लिए दाढ़ लिपिड सांद्रता की गणना का एक उदाहरण के लिए 1 तालिका देखें ।
  4. एक बार एक साथ जोड़ा जा करने के लिए प्रत्येक लिपिड की सही मात्रा गणना की गई है, एक 12 मिलीलीटर borosilicate ग्लास टेस्ट ट्यूब में सभी गठबंधन ।
  5. ध्यान से क्लोरोफॉर्म से उड़ा ।
    1. टयूबिंग और एक 3 मिलीलीटर सुई, कदम 1.17.1 में तैयार के साथ सिरिंज का प्रयोग करें, ध्यान से नाइट्रोजन के साथ ट्यूब में क्लोरोफॉर्म को उड़ाने के लिए । धीरे समाधान पर नाइट्रोजन की एक धारा झटका जबकि दूसरे हाथ से ट्यूब घूर्णन । के रूप में इसे और अधिक मुश्किल हो सकता है अगले कदम में समाधान में इस पाने के लिए छप या तरल कारण ट्यूब के पक्ष को चलाने के लिए कम करने के लिए सावधान रहना ।
  6. प्रत्येक ट्यूब के लिए DMSO के १०० µ एल जोड़ें और इस समाधान lyophilize रातोंरात । एक गैर स्थैतिक प्रयोगशाला पोंछ, एक रबर बैंड के साथ सुरक्षित है, और फ्रीज-८० डिग्री सेल्सियस के साथ ट्यूब के शीर्ष कवर ।

3. Liposome बाहर निकालना

  1. लिपिड से युक्त 12 मिलीलीटर ट्यूब के लिए लिपिड से जुड़े प्रोटीन युक्त पंजाब के 1 मिलीलीटर जोड़ें । एक sonication पानी स्नान में लगभग 30 एस के लिए 1 मिनट के लिए समाधान Sonicate । 5 मिनट के लिए आराम या प्रत्येक दौर और दोहराने के बीच अब 3-4 बार ।
  2. निर्माता द्वारा निर्देशित के रूप में एक बाहर निकालना तैयार करें ।
    1. फ़िल्टर जोड़ें आंतरिक झिल्ली समर्थन करने के लिए समर्थन करता है, कुछ बूंदें (10 µ एल प्रत्येक) आयल फिल्म पर पंजाबियों की जगह । चिमटी का प्रयोग, फिल्टर समर्थन की एक धार हड़पने के लिए और 10 µ एल ड्रॉप में डुबकी ।
    2. फिल्टर को ओ-रिंग के अंदर रखें । दोनों पक्षों के लिए ऐसा करें । चिमटी का प्रयोग, किनारे पर एक ०.८ µm फ़िल्टर हड़पने और 10 µ एल ड्रॉप और कोट ओ के बाहर में डुबकी-पंजाबियों के साथ अंगूठी । तो फिल्टर आंतरिक झिल्ली का समर्थन लटका पर नहीं करता है तो ओ-अंगूठी पर धीरे ०.८ µm फिल्टर रखें ।
  3. एक गर्म थाली पर बाहर निकालना मशीन हीटिंग ब्लॉक रखें पूर्व गर्मी बाहर निकालना मशीन । कम पर गर्म थाली स्विच और बाहर निकालना हीटिंग ब्लॉक वांछित तापमान तक पहुंचने के लिए अनुमति देते हैं । प्रोटीन एकत्रीकरण के साथ संभावित मुद्दों से बचने के लिए, ३७ डिग्री सेल्सियस पिछले ब्लॉक गर्मी नहीं है ।
  4. बाहर निकालना में रखा सिरिंजों में से एक में sonicated नमूना लोड. बाहर निकालना मशीन के दूसरे छोर में सिरिंज सीरिंज रखें । सुनिश्चित करें कि खाली सिरिंज गोताख़ोर शूंय पर सेट है । खाली सिरिंज के रूप में लिपिड पाली कार्बोनेट ०.८ µm झिल्ली के माध्यम से बाहर निकाला जाता है भरना होगा । झिल्ली के माध्यम से आगे और पीछे बुलबुले गुजर से बचने की कोशिश करो ।
  5. हीटिंग ब्लॉक में पूरी तरह से इकट्ठे बाहर निकालना मशीन प्लेस । धीरे खाली सिरिंज के लिए लिपिड के साथ भरा सिरिंज के गोताख़ोर धक्का. लिपिड एकाग्रता के आधार पर, इस के माध्यम से धक्का करने के लिए मुश्किल हो जाएगा । दोहराएँ 20x.
  6. हीटिंग ब्लॉक से पूरी तरह से इकट्ठे बाहर निकालना बाहर निकालना । धीरे से बाहर निकालना से भरा सिरिंज निकालें, किसी भी लिपिड कि बाहर रिसाव हो सकता है जब हटाने को इकट्ठा करने के लिए सुनिश्चित करें । एक साफ शीशी में liposomes लगाएं । दोहराएं कदम 3.4 – 3.6 पाली कार्बोनेट ०.२ µm और ०.१ µm झिल्ली का उपयोग ।
  7. बनाएं एक ०.७ x ५० सेमी2 पार से जुड़े agarose मनका कॉलम 0.7 के जुदाई रेंज के साथ-10 मेगा Daltons (एमडीए) पंजाब में equilibrated । liposomes जोड़ें और चरण १.६ में के रूप में चलाएं । liposomes युक्त भागों 250-400 एनएम रेंज में प्रकाश की कम संचरण होगा ।
  8. 4 डिग्री सेल्सियस पर liposomes स्टोर और फ्रीज नहीं है ।

4. कैल्शियम फ्लक्स के लिए बी सेल सक्रियकरण की निगरानी प्रतिजनी Liposomes द्वारा

  1. Euthanize चूहों द्वारा कार्बन डाइऑक्साइड (CO2) या isoflurane ओवरडोज, संस्थागत मानक संचालन प्रक्रियाओं के अनुसार । गर्भाशय ग्रीवा के विस्थापन द्वारा चूहों की इच्छामृत्यु की पुष्टि करें ।
  2. सर्जिकल उपकरणों और चूहों लोथ ७०% इथेनॉल का उपयोग कर निष्फल । उपयोग 10 सेमी लंबी, ०.८ मिमी टिप, घुमावदार आईरिस संदंश रिब पिंजरे से छाती गुहा को कवर त्वचा को अलग करने के लिए । एक द्विपक्षीय चीरा के साथ एक बाहर का चीरा बनाने के लिए 10 सेमी लंबी, सीधे विदारक कैंची का प्रयोग करें ।
  3. तिल्ली को उदर गुहा से निकालने के लिए घुमावदार आइरिस संदंश और विदारक कैंची का प्रयोग करें. फैटी ऊतक आसपास के तिल्ली निकालें और फिर यह एक 15 मिलीलीटर polystyrene शंकु ट्यूब RPMI1640 मध्यम से युक्त 1% भ्रूण बछड़ा सीरम (FCS), और पेनिसिलिन-streptomycin से भरा में जगह है ।
  4. एक ४० µm सेल छलनी एक ५० एमएल शंकु ट्यूब पर लगे स्थानांतरण तिल्ली और मीडिया । एक 3 मिलीलीटर सिरिंज गोताख़ोर के रबर अंत का उपयोग करना, धीरे तिल्ली को कुचलने. मीडिया के साथ ४० µm सेल छलनी को धो लें । केवल वसा ऊतक ४० µm सेल छलनी में छोड़ दिया है जब तक इस प्रक्रिया को दोहराएँ । मीडिया के 3-5 मिलीलीटर के साथ छलनी कुल्ला सेल वसूली बढ़ाने के लिए ।
  5. केंद्रापसारक सेल homogenate पर ३०० एक्स जी में 5 मिनट के लिए आरटी । केंद्रापसारक के बाद, supernatant त्यागें और गोली को 1x आरबीसी lysis बफर के 10 मिलीलीटर जोड़ें । पिपेट ऊपर और नीचे, 2 के लिए छोड़ दो-rt पर 3 मिनट, और फिर आर टी पर 5 मिनट के लिए ३०० x g पर केंद्रापसारक ।
  6. supernatant को त्यागें और मीडिया के 10 मिलीलीटर में लाल रक्त कोशिका घट splenocytes को निरस्त करें । किसी hemocytometer या अंय कक्ष गणना डिवाइस का उपयोग करके कुल कक्ष संख्याओं का निर्धारण करें । ऊपर वर्णित के रूप में केंद्रापसारक द्वारा कोशिकाओं गोली ।
    नोट: आदर्श अंतिम एकाग्रता इंडो-1 splenocytes के लदान के लिए आवश्यक है 10 – 20 x 106 कोशिकाओं/एमएल, लेकिन कोशिकाओं के एक कम एकाग्रता इस्तेमाल किया जा सकता है ।
  7. splenocytes में 15 एक्स 106 कोशिकाओं/एमएल में कैल्शियम फ्लक्स लोड हो रहा है बफर (RPMI1640 मध्यम से 1% FCS, 10 मिमी 4-(2-hydroxyethyl) -1-piperazineethanesulfonic एसिड (HEPES), 1mM मैग्नीशियम क्लोराइड (MgCl2), 1mM ईथीलीन ग्लाइकोल-बीआईएस ( β-aminoethyl ईथर)-n, n, n ', N'-tetraacetic अम्ल (EGTA), और 5% पेनिसिलिन-streptomycin). इसमें जोड़ें १.५ µ एम इंडो-1 से 1 एमएम DMSO स्टॉक सॉल्यूशन, ट्यूब को कई बार पलटने के लिए मिलाइये । प्रकाश से रक्षा, और 30 मिनट के लिए ३७ ° c पानी स्नान पर कोशिकाओं को गर्मी ।
  8. 30 मिनट की मशीन के बाद, 5x में जोड़ें कैल्शियम प्रवाह की मात्रा बफर लोड हो रहा है । ३०० आरटी पर 7 मिनट के लिए एक्स जी में केंद्रापसारक
  9. बी कोशिकाओं पर गेटिंग के लिए, 1:200 विरोधी माउस के साथ दाग कोशिकाओं CD5-पीई और विरोधी माउस 1:200 B220-पीई/4 ° c पर बफर लदान के ०.५ मिलीलीटर में Cy7 20 मिनट के लिए, प्रकाश से सुरक्षित ।
  10. धो splenocytes में कैल्शियम फ्लक्स लोड हो रहा है बफर और ३०० x g पर 7 मिनट के लिए RT. resuspend पर कोशिकाओं 10-20 x 106 कोशिकाओं में/एमएल कैल्शियम फ्लक्स चल बफर (है हांक संतुलित नमक समाधान (HBSS) युक्त 1% FCS, 1 मिमी MgCl2 और 1 मिमी कैल्शियम क्लोराइड (CaCl2)). बर्फ पर स्टोर, प्रकाश से संरक्षित करने के लिए तैयार प्रवाह cytometer पर चलाने के लिए जब तक ।
  11. मुआवजा के लिए दाग और एकल दाग नियंत्रण के साथ सेटअप प्रवाह cytometry ।
    1. फाटकों उचित सेटअप करने के लिए दाग कोशिकाओं को चलाने ( चित्रा 2aदेखें) । सेटअप इंडो 1 (वायलेट) बनाम इंडो-1 (नीला) प्लॉट, सिग्नल को अधिकतम करने के लिए 45 – 60 ° की ढलान पर दाग लगाने वाली कोशिकाओं को रखने के लिए इंडो-1 चैनलों में वोल्टेज को समायोजित करें: इंडो-1 वायलेट के शोर अनुपात: बी-सेल उत्तेजना के बाद अनुपात में नीला परिवर्तन ।
      नोट: सुनिश्चित करें कि वोल्टेज बहुत अधिक नहीं हैं, ऐसा है कि कोशिकाओं का एक महत्वपूर्ण प्रतिशत (> 5%) साजिश के शीर्ष के खिलाफ हैं ।
    2. एक तिरछे फाटक है कि शीर्ष बाएं भाग encapsulates बनाएं (वायलेट+नीला-) साजिश के, कि इस तरह की उत्तेजना के बिना < 10% कोशिकाओं के गेट में हैं, जो आदर्श रूप में वृद्धि करनी चाहिए > 75% उत्तेजना के बाद ।
  12. एक छाया हुआ 5 मिलीलीटर दौर नीचे polystyrene ट्यूब करने के लिए कोशिकाओं के ०.५ मिलीलीटर जोड़ें (प्रतिदीप्ति-सक्रिय सेल छँटाई (FACS) ट्यूब) और एक पानी स्नान में 3-5 मिनट के लिए ३७ ° c करने के लिए कोशिकाओं को गर्म । ३७ ° c पानी-जैकेट चैंबर है कि एक पुनः घूम पानी स्नान से जुड़ा है में FACS ट्यूब प्लेस ।
    1. पानी में ट्यूब भागो-जैकेट फ्लो cytometer और आरंभ अधिग्रहण पर, डेटा भंडारण के बिना, पर लगभग 5000-10000 घटनाओं/ एक बार कोशिकाओं (15-30 एस) स्थिर है, डेटा अधिग्रहण शुरू करने और कम से कम 10 एस के लिए डेटा इकट्ठा करने के लिए पृष्ठभूमि की स्थापना ।
    2. 10 एस निशान पर, जल्दी से प्रवाह cytometer से ट्यूब को दूर, उत्तेजना जोड़ने (5-50 mM प्रतिजनी liposomes में 2-20 मिलीलीटर), नाड़ी भंवर, और वापसी FACS प्रवाह cytometer पर ट्यूब । इस समय के माध्यम से डेटा अधिग्रहण और भंडारण बनाए रखने और 3 के लिए डेटा इकट्ठा-5 मिनट ।
  13. कैनेटीक्स फ़ंक्शंस के अंतर्गत उपयुक्त विश्लेषण सॉफ़्टवेयर में डेटा का विश्लेषण करें.

5. मूंगफली निकालने की तैयारी

  1. 1 एम सोडियम क्लोराइड (NaCl) के साथ एक 1:5 (wt: vol) फॉस्फेट बफर खारा (पंजाब) के अनुपात में मूंगफली का आटा मिश्रण से मूंगफली प्रोटीन निकालें । आरटी पर 2 एच के लिए चुंबकीय हलचल प्लेट पर समाधान, जबकि पीएच ८.५ पर बनाए रखने ।
  2. 4 डिग्री सेल्सियस पर ४५ मिनट के लिए ३,००० x g पर समाधान केंद्रापसारक । एक ०.२ µm फ़िल्टर द्वारा पीछा एक ०.४ µm फ़िल्टर के माध्यम से क्रमिक रूप से supernatant और फिल्टर-बंध्याकरण । bicinchoninic एसिड (बीसीए) परख के मानक के रूप में गोजातीय सीरम एल्ब्युमिन (BSA) का उपयोग करके प्रोटीन एकाग्रता का निर्धारण ।
  3. कम और प्रकृति ५० mM dithiothreitol (डीटीटी) के साथ एक बफर में लिथियम dodecyl सल्फेट के साथ मूंगफली प्रोटीन का एक नमूना ८.४, जो 10 मिनट के लिए ७० डिग्री सेल्सियस पर कम करने के एजेंट और गर्मी की अधिक से अधिक गतिविधि के लिए अनुमति देता है ।
  4. भागो एक बीआईएस पर विकृत मूंगफली प्रोटीन के 10 µ जी-Tris 4 – 12% पहले से तैयार आणविक वजन पूर्व दाग मानक के साथ इष्टतम जुदाई ढाल जेल देने के लिए बनाया गया polyacrylamide जेल ।
  5. disulfonated triphenylmethane और ddH2ओ के साथ दाग के साथ जेल दाग ज्ञात प्रमुख मूंगफली एलर्जी की पहचान करें आरा एच 1, 2 और 3 निकालने की तैयारी में । आरा एच 1 ६३ पर प्रकट होता है केडीए, आरा एच 2 17 और 19 केडीए में दो isoforms के रूप में दिखाई देना चाहिए, और आरा एच 3 ३७ केडीए (अम्लीय उपइकाई) पर दिखाई देता है.

6. मूंगफली के लिए चूहों के संवेदीकरण

  1. 1 मिलीलीटर ultrapure पानी में 1 मिलीग्राम हैजा विष को फिर से निलंबित । तैयार २०० µ l पतला मूंगफली निकालने से युक्त 2 मिलीग्राम मूंगफली प्रोटीन और 10 µ g हैजा विष में पंजाबियों.
  2. प्रशासन २०० हैजा विष युक्त मूंगफली निकालने के µ एल (2 मिलीग्राम मूंगफली प्रोटीन और 10 µ ग्राम हैजा विष) मौखिक gavage के माध्यम से प्रत्येक 4-5 सप्ताह पुराने बालब/ दोहराएं सप्ताह में एक बार तीन सप्ताह के लिए (यानी, दिन 0, 7, और 14) ।
  3. प्रशासन ३०० µ एल पतला मूंगफली निकालने (युक्त 5 मिलीग्राम मूंगफली प्रोटीन और 10 µ ग्राम हैजा विष) मौखिक gavage के माध्यम से चौथे सप्ताह में प्रत्येक माउस को (यानी, 21 दिन) ।

7. मूंगफली निकालने के साथ चैलेंज चूहों

  1. 28 दिन पर, एक अंतिम एकाग्रता के लिए मूंगफली निकालने तैयार 1 मिलीग्राम/ एक गुदा थर्मामीटर (लगभग 37.5-38.5 डिग्री सेल्सियस) का उपयोग आधारभूत शरीर के तापमान को मापने । intraperitoneal (आईएफसआई) इंजेक्शन के माध्यम से मूंगफली निकालने के २०० µ l (२०० µ g) का व्यवस्थापन ।
  2. मलाशय थर्मामीटर के साथ शरीर के तापमान को मापने के इंजेक्शन के बाद 1 एच के लिए हर 15 मिनट । शरीर के तापमान में एक डुबकी मूंगफली को एलर्जी इंगित करता है ।
    नोट: हाइपोथर्मिया चूहों में तीव्रग्राहिता की एक बानगी है । यह चुनौती प्रदर्शित करेगा कि चूहों को मूंगफली से एलर्जी है । आमतौर पर, बालब/मुख्य न्यायाधीश चूहों के ९०% है कि संवेदीकरण प्रोटोकॉल से गुजरना चुनौती के दौरान एलर्जी से कम एक 2-3 डिग्री सेल्सियस तापमान में कमी से विशेषता प्रतिक्रियाओं का विकास ।

8. एलर्जी चूहों और दत्तक हस्तांतरण से Splenocytes का अलगाव

  1. भोली और मूंगफली एलर्जी चूहों से splenocytes को अलग करें ।
    1. 30 दिन पर, euthanize दोनों भोली और एक गैस चैंबर में2 CO के 3 एल/मिन प्रशासन द्वारा मूंगफली एलर्जी चूहों की पुष्टि की । द्विपक्षीय thoracotomy द्वारा चूहों की इच्छामृत्यु की पुष्टि करें । सर्जिकल उपकरणों और माउस लोथ ७०% इथेनॉल का उपयोग कर निष्फल । का प्रयोग करें संदंश रिब पिंजरे से छाती गुहा को कवर त्वचा को अलग करने के लिए । एक द्विपक्षीय चीरा छोड़ दिया और सही पसलियों को तोड़ने बनाने के लिए सीधे विदारक कैंची का प्रयोग करें ।
    2. उदर गुहा से तिल्ली निकालने के लिए संदंश और विदारक कैंची का प्रयोग करें । polystyrene 15 मिलीलीटर शंकु ट्यूब में रखने से पहले फैटी ऊतक आसपास के तिल्ली निकालें, 10 मिलीलीटर RPMI १६४० मध्यम से भरा ।
    3. एक बाँझ लामिना प्रवाह हुड में, तिल्ली और एक ३५ मिमी polystyrene पेट्री डिश में मीडिया डालो । सेल अलगाव के दौरान अलग पेट्री व्यंजन और मीडिया में भोली और एलर्जिक splenocytes रखें । उपयोग निष्फल संदंश और विदारक कैंची तिल्ली में कटौती करने के लिए तीन टुकड़ों में और वापस पेट्री डिश.
    4. दो गिलास माइक्रोस्कोप स्लाइड के किसी न किसी, फ्रॉस्टेड किनारे का उपयोग करना, धीरे homogenize (RPMI में) तिल्ली टुकड़े तक सफेद ऊतक स्लाइड के बीच रहता है. समूहों के बीच स्लाइड्स परिवर्तित करें ।
    5. स्थानांतरण सेल homogenate एक ७० µm सेल छलनी के माध्यम से पेट्री डिश से एक ५० मिलीलीटर शंकु ट्यूब पर लगे । एक 1 मिलीलीटर सिरिंज से एक गोताख़ोर के साथ छलनी के माध्यम से शेष तिल्ली टुकड़े पारित. RPMI के 5 मिलीलीटर के साथ छलनी कुल्ला करने के लिए सेल वसूली अधिकतम । स्थानांतरण छानने का एक polystyrene 15 मिलीलीटर शंकु ट्यूब, और केंद्रापसारक (४५० एक्स जी, 10 मिनट, आरटी) ।
    6. महाप्राण supernatant और 2 मिलीलीटर लाल रक्त कोशिका lysis बफर में (०.८३% अमोनियम क्लोराइड 10 मिमी Tris बफर, पीएच ७.२) में resuspend सेल गोली जोड़ें । मिश्रण और आरटी में 2 के लिए मशीन-3 मिनट । पंजाब के 10 मिलीलीटर-2% FBS जोड़ें और 7 पर आरटी के लिए ३०० x g पर केंद्रापसारक ।
    7. कोशिकाओं को फिर से धो 12 एमएल पंजाबियों के साथ-2% FBS पूरी तरह से किसी भी अवशिष्ट अमोनियम क्लोराइड को दूर करने के लिए, और ३०० x g पर 7 मिनट के लिए RT. Re में RPMI १६४० मध्यम के 2 मिलीलीटर में सेल गोली निलंबित केंद्रापसारक । या तो एक hemocytometer या स्वत: रुधिर विश्लेषक का उपयोग कोशिकाओं गिनती ।
  2. एक 1 मिलीलीटर इंसुलिन सिरिंज पर एक 27 जी, 5/8 इंच सुई का प्रयोग, नसों में 15 x 106 एलर्जी या भोली splenocytes (२०० µ एल में) के रूप में निकाले जाने वाले भोली (unsensitiz) चूहों में पूंछ नस के माध्यम से निकाला ।

9. आरा एच 2 एंटीजन Liposomes के साथ चूहों का इंजेक्शन

  1. २.५ mM लिपिड पर ०.१% Ah2 युक्त Ah2 liposomes तैयार करें । प्रोटीन एकाग्रता की गणना के लिए, Ah2 के विलुप्त गुणांक १५,००० एम-1है । बाँझ पंजाबियों में ३०० µ मीटर तक पतला liposomes.
  2. एक दिन गोद लेने के बाद (31 दिन) एलर्जी या भोली splenocytes, नसों के २०० µ के एल के इंजेक्षन या Ah2 प्रतिजनी liposomes (३०० µ m) µ की पूंछ की नस के माध्यम से १.३८ Ah2 जी की कुल युक्त/मुख्य ंयायाधीश चूहों कि बालब के चरण में प्राप्त ८.२.

10. को बढ़ावा देने और आरा एच 2 के साथ चूहों की चुनौती

  1. दो सप्ताह Ah2 liposomes के साथ इंजेक्शन के बाद, दिन ४५ पर, एक 4 मिमी पशु नुकीला का उपयोग करने के लिए 50-माउस के अवअधोहनुज जंक्शन से रक्त की 200 µ एल इकट्ठा । हेपरिन के बिना एक सीरम विभाजक ट्यूब में रक्त इकट्ठा; 15 मिनट के लिए ६,००० x g पर केंद्रापसारक द्वारा सीरम अलग करें antigen-विशिष्ट एंटीबॉडी को मापने के लिए बाद में एकत्र सीरम का उपयोग ।
  2. ४६ दिन पर, दो सप्ताह liposomes (कदम ९.२) के साथ चूहों इंजेक्शन के बाद, पंजाबियों या २०० µ जी के घुलनशील Ah2 के २०० µ एल के एक आईएफसआई इंजेक्शन द्वारा चूहों को बढ़ावा देने (पहले16वर्णित के रूप में शुद्ध) ।
  3. ६० दिवस पर, माउस के अवअधोहनुज जंक्शन से खून की 50-200 µ एल इकट्ठा, और प्रक्रिया रक्त के रूप में पहले वर्णित है ।
  4. ६१ दिवस पर, चुनौती चूहों के प्रत्येक समूह के साथ एक आईएफसआई इंजेक्शन की २०० µ l की ३०० µ जी घुलनशील Ah2. मलाशय जांच के साथ शरीर के तापमान को मापने 7 धारा के रूप में हर 15 मिनट ।

11. आरा एच 2 के ठहराव-विशिष्ट IgE और एलिसा द्वारा IgG1

  1. कोट एक ९६-अच्छी तरह से एंजाइम से जुड़े immunosorbent परख (एलिसा)-१०० µ l HSA-DNP के साथ संगत प्लेट (2, 4-dinitrophenyl hapten संयुग्मित मानव सीरम एल्ब्युमिन, 20 µ जी/एमएल) मानक वक्र या Ah2 के लिए (5 µ g/एमएल) सीरम नमूनों के लिए कदम १०.१ और १०.३ में एकत्र के लिए, पतला कोटिंग बफर (५० mM कार्बोनेट-बिकारबोनिट बफर, पीएच ९.६) में 4 ° c रातोंरात या ३७ ° c > 1 एच के लिए ।
  2. २०० µ एल पंजाबियों के साथ तीन बार धो-टी (०.०५% के बीच के साथ पंजाब-20) और २०० µ l पंजाबियों के साथ ब्लॉक कुओं-टी के लिए ३७ ° c पर 2% BSA युक्त > 2 एच ।
  3. Ah2-विशिष्ट IgE एलिसा के लिए, ५० µ l IgE-एंटी-DNP मानक (2 – 0.002 µ g/mL, 1:2 सीरियल कमजोर पड़ने से तैयार) या माउस सीरम नमूने (1:20 कमजोर पड़ने) और 4 डिग्री सेल्सियस पर रातोंरात मशीन जोड़ें । Ah2-विशिष्ट IgG1 एलिसा के लिए, जोड़ें १०० µ एल शुद्ध IgG1-विरोधी DNP मानक (2-0.002 µ जी/एमएल, 1:2 सीरियल कमजोर पड़ने से तैयार) या माउस सीरम नमूने (1:500 कमजोर पड़ने) और 4 ° c पर रात भर में मशीन या 1 ज ।
  4. २०० µ l पंजाबियों के साथ तीन बार धो-टी. Ah2-विशिष्ट IgE एलिसा के लिए, जोड़ें १०० µ एल भेड़ विरोधी माउस IgE (०.५ µ g/एमएल) और 1 एच के लिए ३७ ° c पर मशीन । त्यात Ah2-विशिष्ट IgG1 एलिसा, add १०० µ l एचआरपी गोट एंटी-माउस IgG1 (पतला 1:40000 में पंजाब-टी-2% BSA). 1 एच के लिए ३७ ° c पर मशीन ।
  5. २०० µ l पंजाबियों के साथ तीन बार धो-टी. Ah2-विशिष्ट IgE एलिसा के लिए, १०० µ l biotinylated-गधा विरोधी भेड़ आईजीजी (०.५ µ g/एमएल) जोड़ें और ४५ मिनट के लिए ३७ डिग्री सेल्सियस पर मशीन । Ah2-विशिष्ट IgG1 एलिसा के लिए, चरण ११.७ पर जाएं ।
  6. २०० µ l पंजाबियों के साथ तीन बार धो-टी. Ah2-विशिष्ट IgE एलिसा के लिए, जोड़ें १०० µ l तटस्थ आरोप लगाया avidin-सहिजन peroxidase (जैसे, NeutrAvidin-एचआरपी, ०.३ µ g/एमएल) और 30 मिनट के लिए ३७ ° c पर मशीन ।
  7. जोड़ें १०० µ एल 3, 3 ', 5, 5 '-Tetramethylbenzidine (TMB) सब्सट्रेट, मशीन 10-15 मिनट, या जब तक नमूने गहरे नीले रंग की बारी है, तो १०० µ l TMB रोकें समाधान जोड़ें. ४५० एनएम पर प्लेट पढ़ें ।

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Representative Results

विकार DSPE-खूंटी (2000) के साथ ब्याज की प्रोटीन की unconjugated प्रोटीन की तुलना में आणविक वजन में वृद्धि दिखाने एक को कम करके प्रदर्शन किया जा सकता है । चित्रा 1a विरोधी माउस आईजीएम एफ (अटल) टुकड़ा विकार के एक प्रतिनिधि जेल से पता चलता है खूंटी-DSPE, जो एक 2-3 केडीए bandshift के लिए विकृत प्रोटीन से पता चलता है । ध्यान दें कि प्रोटीन के लगभग ५०% को संशोधित प्रतीत होता है, जो कि 1:1 stoichiometry फैब टुकड़ा है कि भारी और हल्की श्रृंखला के एक heterodimer है पर प्राप्त किया गया था की उंमीद है । चित्रा 1b खूंटी-DSPE करने के लिए Ah2 विकार के एक प्रतिनिधि जेल से पता चलता है । के लिए बी कोशिकाओं के कैल्शियम फ्लक्स का आकलन प्रतिजनी liposomes द्वारा उत्तेजित, दो बातें महत्वपूर्ण हैं: (1) साधन सेटिंग्स में इंडो-1 प्रतिदीप्ति के अनुपात में एक अंतर देखने को देखते हैं सीए2 + बाउंड (वायलेट) और असीम (नीला) रूपों और (2) उचित गेटिंग रणनीति B-कक्ष सक्रियण का आकलन करने के लिए उपयोग किया जाता है । चित्रा 2a प्रवाह cytometry आधारित कैल्शियम फ्लक्स परख के लिए गेटिंग योजना से पता चलता है । Live लिम्फोसाइटों एक SSC-a बनाम FSC-a (बायां पैनल) में gated हैं, दोहरी एक FSC-w बनाम एसएससी-डब्ल्यू प्लाट (मिडिल पैनल) में gated हैं, और B200+CD5- बी-कोशिकाओं को एक CD5-पे vs B220-pe/Cy7 प्लाट (right पेनल) से चुना गया है । चित्र 2 बी भारत-1 (बैंगनी) बनाम इंडो-1 (नीला) प्रतिदीप्ति समय के अनुपात के रूप में विश्लेषण प्रदर्शित करता है । ध्यान दें कि कुल प्रोटीन की एकाग्रता एफ (अटल बिहारी) और एफ (' ab ')2 इन परख में ही थे, में प्रतिजनी liposomes की बेहतर क्षमता प्रदर्शन बी सेल सक्रियकरण उत्तेजक । मूंगफली निकालने की तैयारी के बाद, निकालने के भीतर आरा एच 1, 2 और 3 के सापेक्ष मात्रा निर्धारित करने के लिए एक एसडीएस-पृष्ठ जेल पर एक aliquot चलाते हैं । चित्रा 3 एक मूंगफली निष्कर्षण कि शुद्ध Ah2 के साथ चला गया था की एक प्रतिनिधि जेल से पता चलता है । चित्रा 4 मूंगफली के लिए प्रारंभिक संवेदीकरण सहित समग्र दत्तक मूंगफली एलर्जी माउस मॉडल, के एक योजनाबद्ध, मूंगफली के लिए चुनौती, splenocyte अलगाव और दत्तक हस्तांतरण, liposome इंजेक्शन, रक्त Ah2 को बढ़ावा देने के बाद आकर्षित दिखाता है, और Ah2 को चुनौती । Ah2-विशिष्ट IgE और IgG1 एलिसा सीरम में इम्युनोग्लोबुलिन यों तो चला रहे थे, जैसा चित्र 5 ए और बीमें दिखाया गया है । Ah2 के साथ बढ़ाया गया है कि लिटरेचर संवेदनशीलता के साथ चूहों Ah2-विशिष्ट IgE और उनके सीरम में IgG1 होगा । Ah2 चुनौती के दौरान दर्ज शरीर के तापमान चित्रा 5Cमें दिखाया गया है; एलर्जी चूहों को चुनौती के बाद शरीर के तापमान में कमी आई थी, जबकि भोले चूहों में शरीर का तापमान लगातार बना रहा. चैलेंज के दौरान मूंगफली-एलर्जी चूहों की तुलना में भोले चूहों को दिखाने वाली तस्वीरें चित्रा 6में दिखाई जाती हैं ।

Figure 1
चित्रा 1: विरोधी माउस आईजीएम एफ के प्रतिनिधि जेल (अटल बिहारी) और Ah2 विकार खूंटी-DSPE के लिए । (A, B) एसडीएस-के पृष्ठ विश्लेषण (क) बकरी विरोधी माउस आईजीएम च (ab) टुकड़ा और (ख) Ah2 से पहले और बाद विकार को खूंटी-DSPE. बकरी विरोधी माउस आईजीएम और Ah2 लगभग ४८ और 18 केडीए, क्रमशः की आणविक भार है । संशोधन के बाद, एक थोड़ा बड़ा आणविक भार (~ २.५ केडीए) स्पष्ट रूप से दोनों प्रोटीन के लिए मनाया जाता है । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 2
चित्रा 2: प्रतिनिधि गेटिंग रणनीति, कैल्शियम फ्लक्स परिणाम, और विश्लेषण । (एक) कोशिकाओं निंनलिखित गेटिंग रणनीति के माध्यम से विश्लेषण किया गया: लाइव लिम्फोसाइटों (FSC-ए बनाम एसएससी-ए), एकल सेल (FSC-डब्ल्यू बनाम एसएससी-डब्ल्यू), और बी कोशिकाओं (B220+CD5-) । (b) b-कक्षों की इंडो-1/Ca2 + फ्लक्स प्रतिक्रिया (वायलेट बनाम नीला) । दिखाया विरोधी के लिए कैल्शियम फ्लक्स-आईजीएम फैब टुकड़ा liposomes और विरोधी आईजीएम एफ (' एबी ')2 एक ही प्रोटीन एकाग्रता (२.५ µ g/एमएल) के रूप में के रूप में अच्छी तरह से बफर उत्तेजित कोशिकाओं को एक नियंत्रण के रूप में है । ध्यान दें कि 10-22 s के बीच है जब उत्तेजना और जोड़ा है, इसलिए, कोई डेटा इस समय के दौरान प्राप्त कर ली है । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 3
चित्रा 3: मूंगफली निकालने और Ah2 दिखा प्रतिनिधि जेल । मूंगफली निकालने में कई प्रोटीन होते हैं, जिनमें एलर्जी आरा एच 1, 2, 3 और 6, Ah2 के लिए आने वाले दो isoforms की तुलना में होता है । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 4
चित्रा 4: दत्तक स्थानांतरण प्रोटोकॉल की योजनाबद्ध । भोली बालब/मुख्य ंयायाधीश चूहों मूंगफली निकालने (PN) और हैजा विष (सीटी) के साथ संवेदनशील थे, और बाद में PN को चुनौती दी । पुष्टि एलर्जी चूहों से Splenocytes अलग और भोले चूहों में स्थानांतरित कर रहे थे । चूहों बाद में immunogenic आरा एच 2 liposomes या पंजाबियों के साथ प्रधानमंत्री थे, तो घुलनशील Ah2 के साथ बढ़ाया । अंत में, चूहों तीव्रग्राहिता पर नजर रखने के लिए Ah2 के साथ चुनौती दी गई । ४५ और ६० दिनों पर एकत्र रक्त Ah2-विशिष्ट इम्युनोग्लोबुलिन यों तो इस्तेमाल किया गया । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 5
चित्रा 5: Immunogenic आरा एच 2 liposome लिटरेचर-मेमोरी एलर्जी प्रतिक्रियाओं को बढ़ा देता है । सीरम अलग किया गया था पूर्व (दिन ४५) और पोस्ट (दिन ६०) पंजाबियों के साथ बूस्ट या २०० µ l के ३०० µ m immunogenic Ah2 liposome को मापने के लिए Ah2-sepcific IgE (A) और IgG1 (B). व्यक्तिगत चूहों औसत का संकेत लाइनों के साथ प्रतिनिधित्व कर रहे हैं. चूहों कि एलर्जी splenocytes प्राप्त किया और ३२ दिन पर Ah2 liposomes प्रशासित थे Ah2-विशिष्ट IgE और IgG1 के काफी उच्च स्तर था. तीव्रग्राहिता Ah2challenge (सी) के बाद शरीर के तापमान की रिकॉर्डिंग द्वारा अलग उपचार समूहों में मापा गया था । मतलब शरीर के तापमान SEM के साथ चित्रित । भोली: पंजाबियों (भोली splenocytes और पंजाबियों प्रधानमंत्री), एलर्जी: पंजाब (एलर्जी splenocytes और पंजाब के प्रधानमंत्री की पुष्टि की), एलर्जी: Ah2 (पुष्टि एलर्जी splenocytes और Ah2immunogenic liposome प्रधानमंत्री) । * p < ०.०५, * * p < ०.०१, * * * p < ०.००१, * * * * p < ०.०००१ द्वारा निर्धारित 2-पुच्छ छात्र का t-परीक्षण किया जाता है । ध्यान दें कि ये परिणाम दो स्वतंत्र प्रयोगों के प्रतिनिधि हैं. कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 6
चित्रा 6: Anaphylactic लक्षण Ah2 चुनौती के दौरान मनाया । भोले चूहे सक्रिय रहते हैं और उनके पैरों (ए, सी) पर गुलाबी रंग है । एलर्जी चूहों गतिविधि में कमी आई है, अक्सर ऊपर कूबड़ कर रहे हैं, परिश्रम श्वास और अनुभव नीलिमा, उनके पैरों (बी, डी) पर गहरा बैंगनी रंग के द्वारा संकेत दिया । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

मेगावाट ७९० ३८७ २९०० ३००० ४८०००
DSPC कोलेस्ट्रॉल खूंटी-DSPE अतिरिक्त खूंटी-DSPE ए आईजीएम-खूंटी-DSPE कुल
दाढ़ अनुपात ५७ ३८ ३.९ 1 ०.१ १००.००
मास (mg) ०.५६ ०.१८ ०.१४ ०.०४ ०.०६ ०.९८
मी मॉल ०.७१ ०.४७ ०.०५ ०.०१ ०.०० १.२५
मिलीलीटर ११२.५० ४५.९३ ७०.६४ ०.०० ५२५.९७ ७५५.०३
(mg/एमएल)
DSPC 5
कोलेस्ट्रॉल 4
खूंटी-DSPE 2
ए आईजीएम-खूंटी-DSPE ०.११४

तालिका 1:१.२५ बनाने के लिए परिकलन µ मी एकूण लिपिड एकाग्रता liposome. बकरी विरोधी माउस आईजीएम एफ के लिए गणना तालिका का उदाहरण (अटल बिहारी) टुकड़ा liposomes ।

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Discussion

यहां उल्लिखित विधियों में से एक प्रोटीन के विकार के लिए एक सामान्य प्रोटोकॉल है एक लिपिड जो liposomal नैनोकणों पर प्रोटीन के प्रदर्शन को सक्षम बनाता है. बहुत बड़ी बहु-उप इकाई प्रोटीन के लिए, इस प्रोटोकॉल सीमित उपयोगिता हो सकता है । आदर्श विधि एक साइट का परिचय-विशिष्ट टैग है कि एक biorthogonal रासायनिक जोड़ने के लिए रणनीति का इस्तेमाल किया जा सक्षम बनाता है । यदि प्रोटीन recombinantly व्यक्त, यह उपलब्ध साइट विशेष रणनीतियों17का उपयोग कर संभव हो सकता है, और PEGylated लिपिड के अंत में कार्यात्मक समूहों की एक विस्तृत सरणी है कि व्यावसायिक रूप से उपलब्ध हैं । तदनुसार, इस प्रोटोकॉल प्राकृतिक स्रोतों से अलग प्रोटीन को जोड़ने की दिशा में सक्षम है और रासायनिक और जैव रासायनिक परिवर्तनों के साथ जरूरी परिचित नहीं वैज्ञानिकों की एक विस्तृत रेंज के लिए सुलभ है ।

एक कैल्शियम फ्लक्स प्रयोग है कि बल दिया जाना चाहिए चलाने का एक महत्वपूर्ण पहलू यह है कि कोशिकाओं उंहें प्रवाह cytometry पर चलने से पहले सक्रिय नहीं किया जाना चाहिए । यदि बाँझ तकनीक कड़ाई से इस्तेमाल नहीं किया है, यह सक्रिय कोशिकाओं से एक उच्च पृष्ठभूमि संकेत के लिए खाते में होगा (इंडो-1 वायलेट चैनल में इसके उत्सर्जन की ओर टेढ़ा प्रतिदीप्ति) । इसी तरह, कोशिकाओं को भारत में पृष्ठभूमि संकेत के असामान्य स्तर से बचने के लिए परख चलाने से पहले बर्फ पर रखा जाना चाहिए-1 चैनल । यह भी सुनिश्चित करने के लिए कि कोशिकाओं 2 के लिए गरम कर रहे है महत्वपूर्ण है-3 मिनट के प्रवाह cytometry द्वारा प्राप्त करने से पहले और उत्तेजना भर में डेटा अधिग्रहण के दौरान । यदि डेटा प्राप्ति के दौरान कक्षों को ३७ ° c पर नहीं रखा जाता है, तो यह आशा की जा सकती है कि कक्ष अधिक से अधिक प्रतिसाद नहीं देंगे. के बाद से प्रतिजन-विशिष्ट बी कोशिकाओं को बहुत कम संख्या में चूहों में मौजूद हैं, एक किराए प्रतिजन का उपयोग करने के लिए सभी बी कोशिकाओं को उत्तेजित चूहों से आदर्श है । हालांकि कई ट्रांसजेनिक माउस उपभेदों उपलब्ध है कि एक्सप्रेस प्रतिजन-विशिष्ट बी-कोशिकाओं, इस तकनीक का उद्देश्य है औसत उपयोगकर्ता सक्षम करने के लिए अपने प्रतिजनी liposomes जंगली प्रकार के चूहों का उपयोग करने की क्षमता को मांय कर सकता है । इस उद्देश्य को पूरा करने के लिए, विरोधी माउस आईजीएम के फैब टुकड़े लिपिड से जुड़े हुए थे और प्रतिजनी liposomes कि पार से एक polyclonal फैशन में बी सेल रिसेप्टर (BCR) लिंक तैयार की । यह उल्लेखनीय है कि यह पहले से प्रदर्शित किया गया है कि इस विधि मानव बी-कोशिकाओं को उत्तेजित करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है10 उपयुक्त विरोधी मानव आईजीएम फैब टुकड़ा है, जो महत्वपूर्ण है क्योंकि यह महत्वपूर्ण संख्या का उपयोग करने के लिए संभव नहीं है का उपयोग प्रतिजन-विशिष्ट मानव बी कोशिकाओं । इन अध्ययनों में, प्रतिजनी liposomes की शक्ति B-सेल सक्रियण को उत्तेजित करने के लिए उनके बढ़ाया कैल्शियम प्रवाह के लिए विरोधी माउस आईजीएम एफ (' ab ') 2 टुकड़े की बराबर मात्रा की तुलना में प्रेरित करने की क्षमता से सचित्र था ।

प्रतिजनी liposomes का उपयोग करने के लिए एक विधि के विकास को सक्षम किया गया है बालब/मुख्य ंयायाधीश मूंगफली के लिए चूहों, भोले चूहों में एलर्जी चूहों से splenocytes स्थानांतरित, Ah2 liposomes के साथ मेजबान चूहों इंजेक्शन, और Ah2 के साथ उन्हें चुनौती दे । एंटीबॉडी स्तर और चूहों के समूहों के भीतर anaphylactic प्रतिक्रियाओं इस मॉडल में reproducible हैं । यह अच्छी तरह से स्थापित किया गया है कि स्मृति बी और टी सेल प्रतिक्रियाओं चूहों में मूंगफली विशेष एंटीबॉडी के विकास में महत्वपूर्ण हैं । इसके अलावा, एक ताजा अध्ययन से पता चला है कि स्मृति बी कोशिकाओं चूहों, जो ऊंचा प्रतिजन विशिष्ट IgE स्तर बनाए रखने में प्लाज्मा कोशिकाओं को फिर से आबाद; इसलिए एलर्जी-विशिष्ट स्मृति बी कोशिकाओं चिकित्सकीय हस्तक्षेप18के लिए एक आकर्षक लक्ष्य कर रहे हैं । मॉडल यहां वर्णित अब सीधे Ah2-विशिष्ट स्मृति बी कोशिकाओं को लक्षित करने के लिए एक अवसर की अनुमति देता है, के रूप में एक immunosuppressive bortezomib का उपयोग करने के लिए पूरे प्लाज्मा सेल की प्रदर्शनों की पड़ताल19के दृष्टिकोण का विरोध किया । एलर्जी का मुकाबला करने के लिए एक और दृष्टिकोण टी सेल डिब्बे में सहिष्णुता पैदा करने के लिए है । एक संभावित रणनीति को liposome के भीतर सहनशीलता-उत्प्रेरण adjuvants encapsulate है । पहले, नैनोकणों encapsulating rapamycin Tregs प्रेरित और स्व-प्रतिरक्षित रोग20कम करने के लिए इस्तेमाल किया गया । दृष्टिकोण के इस प्रकार के लिए tolerogenic चिकित्सा विकसित करने के लिए मूंगफली एलर्जी के इलाज के लिए नियोजित किया जा सकता है । कुल मिलाकर, एलर्जी की सतह के लिए conjugating अणुओं द्वारा विशिष्ट liposome के हेरफेर सिलवाया प्रतिरक्षा प्रतिक्रियाओं के लिए अनुमति देता है, और encapsulating दवा की तरह अणुओं एलर्जी-विशिष्ट कोशिका के लिए दवा के वितरण में सक्षम बनाता है ।

मूंगफली एलर्जी के इस माउस मॉडल की सामांय सीमाएं है कि हैजा विष और बाद मूंगफली आईएफसआई इंजेक्शन के माध्यम से चुनौती के साथ मूंगफली के लिए संवेदीकरण मनुष्यों में मूंगफली एलर्जी का पूरी तरह से प्रतिनिधि नहीं है (जैसे, मनुष्य है मौखिक घूस पर प्रतिक्रियाओं) । हालांकि, इस एलर्जी मॉडल क्षेत्र11,18,21में वर्तमान मानक है, और हमें एलर्जी रोग के आणविक तंत्र की जांच करने के लिए और उपंयास चिकित्सीय दृष्टिकोण विकसित करने की अनुमति देता है । इन पारंपरिक दृष्टिकोण की तुलना में, इस दत्तक हस्तांतरण मॉडल तीन प्राथमिक लाभ प्रदान करता है । पहला यह है कि यह स्मृति बी और टी कोशिकाओं एलर्जी के लिए विशिष्ट और अधिक सीधे अध्ययन किया जा करने के लिए सक्षम बनाता है । दरअसल, अब सबूत दृढ़ता से स्मृति बी कोशिकाओं लंबी अवधि एलर्जी18के प्रमुख स्रोत के रूप में फंसाती है । दूसरा, क्योंकि स्मृति बी की एक ही संख्या और टी कोशिकाओं प्रत्येक प्राप्तकर्ता माउस में प्रत्यारोपित कर रहे हैं, एलर्जी प्रतिक्रियाओं ंयूनतम चर रहे हैं । तीसरा, इस मॉडल को व्यक्तिगत एलर्जी है, जो नए immunotherapies परीक्षण के संदर्भ में उपयोगी है एलर्जी प्रतिक्रियाओं का अध्ययन करने का अवसर प्रदान करता है । इस मॉडल का एक पेचीदा आवेदन एक मानवीय माउस मॉडल है, जहां एलर्जी प्रतिक्रियाओं प्रतिरक्षित22मॉडल में अध्ययन किया गया है के संदर्भ में सामांय दृष्टिकोण का उपयोग करने के लिए है । एक adopter हस्तांतरण मॉडल के संदर्भ में लागू है, एक मानवीय माउस मॉडल का विस्तार करने के लिए एक शक्तिशाली दृष्टिकोण हो सकता है और vivo परीक्षण में बी-और टी कोशिकाओं से एलर्जी रोगियों ।

एंटीबॉडी रोग रोगजनन न केवल एलर्जी मॉडल में होते हैं, लेकिन यह भी बी सेल में मध्यस्थता स्व-प्रतिरक्षित रोगों23. Adoptively एक प्रतिजन दिया चूहों से संवेदनशील splenocytes स्थानांतरण अंततः इस्तेमाल किया जानवरों की संख्या को कम करने में बहुत उपयोगी होगा, सहायक के कई इंजेक्शन प्राप्त पशुओं की संख्या को कम करने, और के reproducibility में वृद्धि कई रोग संकेत में चूहों के साथियों के बीच प्रतिक्रियाएं । एक उदाहरण मायस्थेनिया ग्रेविस (EAMG), जिसमें अतिसंवेदनशील माउस उपभेदों (C57BL/6, SJL, और AKR) के एक प्रयोगात्मक स्व-प्रतिरक्षित मॉडल में प्रतिरक्षित रिसेप्टर (acetylcholine) के साथ कई बार AChR में रोगजनक एंटीबॉडी विकसित करने के लिए किया जाता है । इन एंटीबॉडी अंततः ऐसे मांसपेशियों की थकान के रूप में मनुष्यों में मौजूद immunopathological सुविधाओं के लिए नेतृत्व/कमजोरी, इम्युनोग्लोबुलिन के जमा, और neuromuscular जंक्शनों पर घटक पूरक और गंभीर मामलों में रुग्णता/ EAMG में, रोग की घटनाओं के बीच व्यापक रूप से बदलता है 50 – 70%, इसलिए इस परिवर्तनशीलता के लिए खाते में बड़े पशु साथियों सांख्यिकीय महत्व25,26तक पहुंचने की जरूरत है । यहां वर्णित विधि अंततः रोग की घटनाओं में परिवर्तनशीलता कम द्वारा इस्तेमाल जानवरों की संख्या को कम करेगा । जैसा कि पहले उल्लेख किया है, EAMG AChR + adjuvants के साथ कई इंजेक्शन द्वारा प्रेरित है (पूरा Freund है सहायक और अपूर्ण है Freund सहायक) ऑटो एंटीबॉडी प्रतिक्रियाओं को ट्रिगर करने के लिए । इस विधि सहायक के साथ कई इंजेक्शन प्राप्त पशुओं की संख्या को कम करेगा । अंत में, कई प्रतिरक्षण और बढ़ा देता है की प्रकृति के कारण, यह अपेक्षाकृत नियत्रंण और चिकित्सीय उपचार के लिए उपयुक्त चिकित्सीय खिड़कियों को परिभाषित करने के लिए मुश्किल है । यह विधि एंटीबॉडी प्रतिसाद और रोग रोगजनन विंडो सिंक्रनाइज़ करने में मदद मिलेगी, जिससे इसे और अधिक पूर्वानुमानित और reproducible । यह एक ही तर्क कई अंय माउस मॉडलों के लिए लागू किया जा सकता है एंटीबॉडी मध्यस्थता स्व-प्रतिरक्षित रोग, जैसे रुमेटी गठिया27के रूप में ।

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Disclosures

लेखकों का खुलासा करने के लिए कुछ नहीं है ।

Acknowledgments

इस शोध को रक्षा विभाग (W81XWH-16-1-0302 और W81XWH-16-1-0303) से अनुदान द्वारा समर्थित किया गया.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Model 2110 Fraction Collector BioRad 7318122
Cholestrol Sigma C8667 Sigma grade 99%
SPDP Thermo Fisher Scientific 21857
DSPC Avanti 850365
DSPE-PEG 18:0 Avanti 880120
DSPE-PEG Maleimide Avanti 880126
Extruder Avanti 610000 1 mL syringe with holder/heating block
Filters 0.1 µm Avanti 610005
Filters 0.8 µm Avanti 610009
10 mm Filter Supports Avanti 6100014
Glass Round Bottom Flask Sigma Z100633
Turnover stoppers Thermo Fisher Scientific P-301398
Tubing Thermo Fisher Scientific P-198194
Leur Lock Thermo Fisher Scientific k4201634503
Sephadex G50 Beads GE Life Sciences 17004201
Sephadex G100 Beads GE Life Sciences 17006001
Heat Inactivated Fetal Calf Serum Thermo Fisher Scientific 10082147
HEPES (1 M) Thermo Fisher Scientific 15630080
EGTA Sigma E3889
Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL) Thermo Fisher Scientific 15140122
1x RBC lysis Buffer Thermo Fisher Scientific 00-4333-57
Indo-1 Invitrogen I1203
CD5-PE BioLegend 100608
B220-PE-Cy7 BioLegend 103222
HBSS Thermo Fisher Scientific 14170112 without calcium and magnesium
MgCl2 Sigma M8266
CaCl2 Sigma C4901
Fab anti-mouse IgM Jackson ImmunoResearch 115-007-020
F(ab')2 anti-mouse IgM Jackson ImmunoResearch 115-006-020
Peanut flour Golden Peanut Co. 521271 12% fat light roast, 50% protein
Animal feeding needles Cadence Science 7920 22g x 1.5", 1.25 mm - straight
Microprobe thermometer Physitemp BAT-12
Rectal probe for mice Physitemp Ret-3
Cholera toxin, from Vibrio cholera List Biological Laboratories, Inc. 100B Azide free
BCA Protein Assay Kit Pierce 23225
Carbonate-bicarbonate buffer Sigma C3041
TMB Stop Solution KPL 50-85-06
SureBlue TMB Microwell Peroxidase Substrate KPL 5120-0077
96 well Immulon 4HBX plate Thermo Scientific 3855
Purified soluble Ara h 2 N/A N/A purified as in: Sen, et al., 2002, Journal of Immunology
HSA-DNP Sigma A-6661
Mouse IgE anti-DNP Accurate Chemical BYA60251
Sheep anti-Mouse IgE The Binding Site PC284
Biotinylated Donkey anti-Sheep IgG Accurate Chemical JNS065003
NeutrAvidin Protein, HRP ThermoFisher Scientific 31001
Mouse IgG1 anti-DNP Accurate Chemical MADNP105
HRP Goat anti-mouse IgG1 Southern Biotech 1070-05
1 mL Insulin Syringes BD 329412 U-100 Insulin, 0.40 mm (27 G) x 16.0 mm (5/8")
Superfrost Microscope Slides Fisher Scientific 12-550-14 25 mm x 75 mm x 1.0 mm
ACK Lysing Buffer gibco by Life Technologies A10492-01 100 mL
RPMI 1640 Medium Thermo Fisher Scientific 11875093 500 mL
Cell Strainer Corning 352350 70 μm Nylon, White, Sterile, Individually packaged
NuPAGE 4-12% Bis-Tris Protein Gels Invitrogen NP0322BOX 10 gels
NuPAGE LDS buffer, 4x Invitrogen NP0008 250 mL
SeeBlue Plus2 Pre-stained standard Invitrogen LC5925 500 µL
NuPAGE MES/SDS running buffer, 20x Invitrogen NP0002 500 mL
GelCode Blue Stain Thermo Scientific 24590 500 mL

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References

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इम्यूनोलॉजी और इंफेक्शन इश्यू १४० नैनोकणों Liposomes तीव्रग्राहिता मूंगफली एलर्जी कैल्शियम फ्लक्स फ्लो Cytometry प्रतिजन विशिष्ट आरा एच 2 फूड एलर्जी IgE
प्रतिजनी रोग-विशिष्ट एंटीबॉडी के उत्पादन के लिए Liposomes
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Bednar, K. J., Hardy, L., Smeekens, J., Raghuwanshi, D., Duan, S., Kulis, M. D., Macauley, M. S. Antigenic Liposomes for Generation of Disease-specific Antibodies. J. Vis. Exp. (140), e58285, doi:10.3791/58285 (2018).

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