Summary
Descrito, é a preparação de nanopartículas lipossomas antigênicas e seu uso em estimulando células B ativação in vitro e em vivo. Respostas consistentes e robustas anticorpo levaram ao desenvolvimento de um novo modelo de alergia ao amendoim. O protocolo para a geração de lipossomas antigênicos pode ser estendido para antígenos diferentes e modelos de imunização.
Abstract
Respostas de anticorpos fornecer imunidade protetora crítica para uma grande variedade de agentes patogénicos. Ainda há um grande interesse na geração de anticorpos robustos para a vacinação, bem como entender como patogênico anticorpo respostas desenvolvem alergias e doenças auto-imunes. Gerar respostas robusto anticorpos antígeno-específicos não é sempre trivial. Em modelos do rato, muitas vezes requer várias rodadas de vacinas com adjuvante que leva a uma grande variabilidade nos níveis de anticorpos induzidos. Um exemplo é em modelos do rato de alergias do amendoim onde modelos mais robustos e reprodutíveis que minimizam o rato números e o uso de adjuvantes seria benéficos. Apresentado aqui é um modelo de mouse altamente reprodutível de anafilaxia alergia ao amendoim. Esse novo modelo baseia-se em dois fatores principais: (1) antígeno-específicas splenocytes enviaram são transferidos de um rato de amendoim-sensibilizados para um rato de destinatário ingênuo, normalizando o número de memória antígeno-específicas e T-células B através de um grande número de ratos; e (2) destinatários ratos são posteriormente impulsionou com um forte immunogen multivalentes na forma de nanopartículas lipossomas exibindo o alérgeno amendoim principal (Ara h 2). A grande vantagem deste modelo é sua reprodutibilidade, que em última análise, reduz o número de animais utilizados em cada estudo, minimizando o número de animais recebendo injeções múltiplas de adjuvante. A montagem modular destes lipossomas imunogênicas fornece adaptabilidade facile relativamente a outros modelos alérgicas ou auto-imune que envolvem anticorpos patogênicos.
Introduction
Alergia alimentar afeta 8% das crianças nos Estados Unidos e tem aumentado em prevalência nos últimos década1. Alergia a amendoim afeta 1% das crianças e não é tipicamente Superdimensonada2. Embora vários ensaios clínicos promissores estão em andamento para o tratamento de alergias alimentares, incluindo imunoterapia oral (OIT), imunoterapia sublingual (fenda) e imunoterapia epicutâneos (EPIT), existem actualmente sem estratégias de tratamento aprovado pela FDA para a dessensibilização alérgica a amendoim indivíduos3,4,5,6,7,8. Portanto, indivíduos alérgicos estritamente devem evitar alérgenos para evitar a anafilaxia. Muitas questões permanecem sobre rotas de sensibilização e subjacente mecanismos de desenvolvimento de alergia alimentar.
Modelos de mouse são uma ferramenta valiosa para estudar os mecanismos da alergia, bem como desenvolver novo tolerogenic e dessensibilização terapias9,10,11,12. Isto é especialmente verdadeiro porque o principal alérgeno de amendoim (Ara h 2; Ah2) em humanos é também o alérgeno dominante em vários descrito rato modelos13,14. Enquanto modelos de rato de alergia são inestimáveis no estudo de mecanismos de sensibilização e tolerância, uma desvantagem é que pode ser variável e requerem o uso de adjuvantes. Imunogenos mais potentes seria uma maneira de minimizar a variabilidade intrínseca de tais modelos. Uma vez que as células B são fortemente ativadas por antígenos multivalentes, lipossomas antigênicos exibindo o alérgeno são uma boa opção, devido à sua capacidade de potencialmente ativar as células B através do receptor de células B (BCR), enquanto também ter a propriedade de forma eficiente escorva do compartimento de células T através de ser usada por não-especificamente apresentadoras células.
Aqui, descrevemos um protocolo detalhado para antígenos da proteína de nanopartículas lipossomas usando uma estratégia fácil e modular de conjugação. Usando um antígeno substituto, fragmento Fab anti-IgM, demonstramos como potente tais lipossomas antigênicos podem ser na ativação de células B estimulante. Antigênicos lipossomas exibindo Ah2 antígeno foram usados para desenvolver um novo modelo de rato de sensibilidade conferida. Neste modelo, splenocytes de verificadas amendoim ratos alérgicos, contendo memória de amendoim específicas células B e T, são transferidos para o ingênuo congenic ratos. Respostas de anticorpos de memória são induzidas pela injeção de lipossomas conjugados com Ah2 em ratos os destinatários, a fim de induzir anticorpos contra Ah2. Seguido por apenas um impulso com Ah2 solúvel, anticorpos específicos Ah2 dão origem a uma forte reação anafilática quando estes ratos posteriormente são desafiados com Ah2. Como ratos submetidos a reação alérgica respondem de uma forma altamente uniforme e não tem recebido um adjuvante, esta abordagem é um modelo desejável de alergia e os resultados sugerem que pode ter utilidade em outros modelos de rato conduzidos por antígenos dirigidos a alérgenos e possivelmente auto-antigénios.
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Protocol
O método geral de acoplamento proteína lipídios e incorporação em lipossomas é amplamente baseado em anterior trabalho15. Todos os procedimentos de animais descritos abaixo foram aprovados pela Universidade da Carolina do Norte em Chapel Hill institucional Animal Care e Comissão de utilização (IACUC). Todos os ratos usados no modelo de alergia são fêmeas BALB/cJ compradas em 3 semanas de idade. A Universidade de Alberta cuidados com animais e usar Comité (ACUC) aprovou experimentos envolvendo o uso de spleens do rato para análise ex vivo de camundongos C57Bl/6 pelo menos 6 semanas de idade.
1. a conjugação do antígeno de proteína para peguilado lipídico
- Adicione 3 g de grânulos do gel de dextrano reticulado com uma gama de fracionamento de 1.500 – 30.000 Daltons (Da) para um balão de vácuo de 250 mL. Adicione 60 mL de salina tamponada fosfato (PBS) e mexa continuamente com uma barra de agitação magnética. Feche o frasco e anexar a um vácuo para iniciar a desgaseificação em uma placa de agitação por um período mínimo de 1 h.
- Em uma coluna de cromatografia de vidro 1,0 cm x 30 cm com a rolha de volume de negócios fechada, adicione PBS para a coluna para lavar. Abra a tampa do volume de negócios e drenar a coluna. Lavagem, a seguir adicione o chorume de grânulos de intoxicar à coluna. Adicione continuamente o slurry até que a coluna está cheia de aproximadamente 24 cm altura do grânulo.
- Uma vez que a coluna tem uma 'cabeça' de aproximadamente 4 a 5 cm de PBS acima os grânulos embalados, tem as seguintes etapas prontas.
- Crie um sifão de fluxo de gravidade medindo um pedaço de tubo de tempo suficiente para chegar a uma prateleira 1 – 2 pés acima da parte superior da coluna e criar um loop que cai na parte inferior da coluna e retorna para o topo da coluna. Adicione uma rolha de volume de negócios de uma das extremidades do tubo, deixando um lado do tubo aberto. Coloque a extremidade aberta do tubo em uma garrafa de 500 mL de PBS e coloque na prateleira acima da coluna.
- Pegue a extremidade com o bujão do volume de negócios e anexar uma seringa de 10 mL. Abra a válvula de rolha de volume de negócios na linha de tubos e desenhar PBS através do tubo. Uma vez que o PBS alcançou três quartos do caminho através da tubulação, rapidamente, retire a seringa e adicionar o bujão do volume de negócios na parte superior da coluna — líquido deve estar em execução para a coluna.
Nota: A quantidade de 'cabeça' de PBS deixada no topo da coluna deve ser entre 1 e 3 cm. A quantidade mínima para lavar a coluna é 3 volumes de coluna.
- Determine a quantidade de proteína (moles) ser ligada à lipídios com base em seu peso molecular (MW).
Nota: O fragmento Fab de anti-rato de cabra IgM (em si um IgG) é usado aqui como um antígeno substituto universal para estimulação policlonal de células B. Nesse sentido, o fragmento Fab de cabra IgG tem um MW de aproximadamente 48 kiloDalton (kDa) e está disponível comercialmente em uma quantidade total de 1,3 mg. Assim, a quantidade de proteína a ser vinculado é 27,1 µmol. - Determine o coeficiente de extinção da proteína de interesse. Se desconhecido, medir a absorvância de proteína em 280 nm, utilizando um espectrofotômetro e divide o valor pelo número de moles280 calculado na etapa 1.4.
Nota: A extinção coeficiente de Fab de cabra IgG em 280 nm é 64.600 M-1. - Para garantir esse rastreamento quantidades de amina, contendo tampão são removidos, do desalt a proteína na coluna criada nas etapas 1.1 – 1.3 e coletar frações proteicas em tubos de microcentrifuga de 1,5 mL (~ 500 µ l por fração).
- Feche a válvula de rolha de volume de negócios ligada à parte superior da coluna e remover o topo da coluna. Se não já abrir, abra a válvula de batente de volume na parte inferior da coluna e esperar até que a 'cabeça' de PBS atinge o topo dos grânulos.
- Adicione lentamente na proteína de interesse para o topo dos grânulos usando um copo pipeta Pasteur, tendo o cuidado de minimizar a perturbação ao topo dos grânulos.
- Uma vez que a 'cabeça' da solução da proteína alcançou o topo dos grânulos, adicionar 1 mL de PBS lentamente através de uma pipeta Pasteur. Repeti três vezes. Adicione PBS para criar uma cabeça de 4 a 5 cm e repita a etapa 1.3 para lavar a coluna.
Nota: Esta etapa pode ser ignorada, se é certo que nenhum buffer contendo amina está presente.
- Determinar as frações que contêm a proteína medindo A280 valores e piscina as frações que dão cerca de 90% de recuperação da proteína.
Nota: Isto tipicamente dilui a proteína 1,5-2-fold. Determine a concentração de proteína depois de pool. Concentre a proteína neste passo, se necessário, utilizar um concentrador de centrifugação. - Adicione 2,5 equivalente molar da heterobifunctional agente reticulante à proteína.
- Primeiro, pesa cerca de 5 mg de grufo 3-(2-pyridyldithio) propionato (SPDP, MW = 314 g/mol) em um tubo de microcentrifugadora. Para determinar o volume a dissolver o SPDP, tirar a concentração molar de proteína e multiplique-o por 250 x para gerar uma solução de 100 x que dará um 2,5 molar excesso na reação.
Nota: por exemplo, se a concentração de proteína é de 50 µM, uma solução de SPDP em 12,5 milímetros é necessária. Para 5 mg de SPDP, isto corresponde a 1,27 mL de Dimetilsulfóxido (DMSO).
- Primeiro, pesa cerca de 5 mg de grufo 3-(2-pyridyldithio) propionato (SPDP, MW = 314 g/mol) em um tubo de microcentrifugadora. Para determinar o volume a dissolver o SPDP, tirar a concentração molar de proteína e multiplique-o por 250 x para gerar uma solução de 100 x que dará um 2,5 molar excesso na reação.
- Adicione SPDP à proteína de interesse a uma diluição de 1: 100. Coloque a reação em um agitador oscilação na temperatura de quarto (RT) para cerca de 1 h.
- Para remover o excesso SPDP e proteger o bond(s) de bissulfeto endógena, na proteína na etapa subsequente redução, equilibrar e lavar a coluna criada em passos 1.1-1.3 em 100 mM acetato de sódio (NaOAc) pH de 5,5 ou criar uma coluna idêntica exclusivamente para uso no presente Reserva.
- Após incubação de 1 h com SPDP, do desalt a proteína na coluna 100mm NaOAc equilibrada. Efectuar este passo de forma idêntica como passo 1.6 Exceto usando 100 mM NaOAc (pH 5,5) como eluente. Recolher as frações, determinar a um280e as frações superiores da piscina. Lave a coluna em PBS.
- Preparar uma solução de 2,5 M de TDT (MW = 154 g/mol) em dobro destilada água (ddH2O). Adicione 25 mM DTT as frações em pool de proteínas por 5-10 min.
- Medir a um280 da proteína e dividir isto pelo coeficiente de extinção. Além disso, determine o A343. Calcule a relação de vinculação baseada a molaridade de proteína (280) e vinculador (343).
Nota: Desligue o A340 autocalibração se usando um espectrofotômetro nanodrop. A medição de343 A representa a absorvância do grupo 2-thione piridina (coeficiente de extinção = 7550 M-1) que é retirado o cross-linker SPDP pela TDT. Uma relação molar de vinculador: proporção de proteína de 1,2 – 1,5 geralmente é conseguida ao realizar a reação com um 2,5 molar excesso de polícia em uma ampla gama de proteínas. - Atropelar as frações em pool a coluna lavada em PBS, como descrito acima. Recolher as frações, determinar a um280e frações superiores da piscina. Determine a concentração de proteína por A280 depois pool as frações.
- Preparar DSPE-PEG (2000)-Maleimide (1,2-distearoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine-N-[methoxy(polyethylene glycol)-2000)-Maleimide. Isto será adicionado à proteína em uma relação molar de 1:10. Prepare um estoque de 100 x de DSPE-PEG (2000)-Maleimide para obter a concentração desejada.
- Por exemplo, se a concentração de proteína é 10 µM após etapa 1.14, prepare um estoque de DSPE-PEG (2000)-Maleimide a 10 mM. Pesar cuidadosamente DSPE-PEG (2000)-Maleimide (MW = 3000 g/mol) e adicionar a quantidade apropriada de DMSO. Várias rodadas de suave num Vortex e sonicating podem obtê-lo totalmente dissolvido.
- Determinar o volume total das frações da etapa 1.14 e transferir a solução cuidadosamente em um pequeno (10-25 mL) redonda (RBF) do balão de fundo. Adicionar a quantidade apropriada de 100 x DSPE-PEG (2000)-Maleimide para a proteína para alcançar um 1x, 10 vezes concentração molar de excesso, final. Agite suavemente a solução para garantir que o DMSO é totalmente disperso.
- Execute a reação durante a noite sob nitrogênio em uma selada RBF. Use um septo de borracha e coloque em uma capa das emanações.
- Remova a atmosfera, perfurando o septo com uma agulha 20g anexada a uma seringa de 3 mL na extremidade de tubos ligados a um vácuo e ative a vácuo para 3-5 s.
- Substitua a atmosfera com nitrogênio. Encha um balão ligado a uma seringa de 3 mL, corte ao meio com azoto e anexar uma agulha 20g. Perfuração do septo para preencher a atmosfera dentro do balão de fundo redondo com nitrogênio. Repita a remoção da atmosfera e substituição com nitrogênio mais uma vez e deixar o balão de azoto ligado durante a noite.
- Prepare uma coluna de grânulo de gel de dextrano reticulado separado com uma gama de fracionamento de 4.000 – 150.000 em uma coluna de cromatografia de vidro 1,0 cm x 50 cm (de acordo com passos 1.1-1.3).
- No dia seguinte, retire o balão de fundo redondo preparado no passo 1.17 e gerência (siga o método usado na etapa 1.6) da proteína sobre a coluna de grânulo de gel reticulado dextran (da etapa 1.18).
Nota: O montante total a carga na coluna deve ser não mais de 2 mL. Se utilizou-se uma reação maior, dividido em dois e executado em colunas separadas ou executar em uma coluna de diâmetro maior.- Recolher as frações, determinar a um280, frações superior de piscina e determinar a concentração de proteína. A presença dos lipídios não afetará as medições.
- Armazene as frações em pool finais da proteína lipídios ligados a 4 ° C até que esteja pronto para uso.
2. em lipossomas preparação
- Pesar os lipídios: DSPE-PEG(2000) (1,2-distearoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine-N-[methoxy(polyethylene glycol)-2000, MW = 2805.5 g/mol; Colesterol (3b-hidroxi-5-cholestene, 5-Cholesten-3b-ol), MW = 386.7 g/mol; e DSPC (1,2-distearoyl-sn-glycero-3-phosphocholine), MW = 790.1 g/Astyanax criar uma solução de 5 mg/mL de DSPC, 4 mg/mL solução de colesterol e 2 mg/mL de solução de DSPE-PEG(2000) em clorofórmio.
- Certifique-se de que a relação molar de lipídios nos lipossomas é: 57% DSPC, 38% de colesterol e 5% DSPE-PEG(2000), conforme representado na tabela 1.
Nota: É importante controlar a quantidade de antígeno no lipossoma, que geralmente varia de 0,01 – 0,1%. Na tabela 1, 0,1% de anticabra rato, fragmento IgM Fab ligado à peguilado lipídica é usado. É fundamental ter em conta do 10 vezes molar excesso de DSPE-PEG (2000)-Maleimide que foi adicionado à proteína em passo 1.15, para garantir que a quantidade total de lipídios peguilado não exceda 5%. - Considere os montantes finais lipídico (µmol) ao criar lipídios para extrusão. Consulte a tabela 1 para obter um exemplo de cálculo de concentrações de lipídios molar para a criação de lipossomas em uma concentração de lipídios totais 1,25 µM.
- Uma vez que foi calculada a quantidade correta de cada lipídio a serem adicionados juntos, combinam-se em um tubo de ensaio de vidro de borosilicato de 12 mL.
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Cuidadosamente explodir o clorofórmio.
- Use o tubo e uma seringa de 3 mL com agulha, preparada na etapa 1.17.1, que cuidadosamente explodir clorofórmio no tubo com nitrogênio. Soprar suavemente um fluxo de nitrogênio na solução enquanto girando o tubo com a outra mão. Tenha cuidado para minimizar os salpicos ou fazendo com que o líquido executar o caminho até o lado do tubo que seja mais difícil conseguir isso em solução na próxima etapa.
- Adicione 100 µ l de DMSO a cada tubo e lyophilize esta solução durante a noite. Cubra a parte superior do tubo com uma limpeza de laboratório não-estático, seguro com um elástico e congelar a-80 ° C.
3. lipossoma extrusão
- Adicione 1 mL de PBS contendo a proteína lipídios-ligada ao tubo de 12 mL contendo os lipídios. Proceda à sonicação a solução para cerca de 30 s a 1 min em um banho de água sonication. Descanse por 5 min ou mais entre cada rodada e repita 3 a 4 vezes.
-
Prepare uma extrusora como indicado pelo fabricante.
- Adicionar o filtro oferece suporte para o suporte de membrana interna, coloque algumas gotas (10 µ l cada) de PBS na película de parafina. Usando uma pinça, pegue uma ponta do suporte do filtro e mergulhá-lo no drop-10 µ l.
- Coloca o filtro dentro do-Ring. Faça isso para ambos os lados. Usando uma pinça, pegue um filtro de 0,8 µm na borda e mergulhe no drop-10 µ l e revestimento exterior do-Ring com PBS. Coloque o filtro de 0,8 µm suavemente sobre o-ring para que o filtro faz não por pendurar o suporte de membrana interna.
- Coloque o bloco de aquecimento da extrusora em uma chapa quente para pré-aquecer a extrusora. Ligue a placa baixa e permitir que o bloco de aquecimento da extrusora chegar à temperatura desejada. Para evitar possíveis problemas com a agregação da proteína, não aqueça o bloco passado 37 ° C.
- Carrega a amostra lisada em uma das seringas de extrusão colocadas na extrusora. Coloque a seringa de extrusora na outra extremidade da extrusora. Certifique-se que o êmbolo da seringa vazia é definido como zero. A seringa vazia irá preencher como o lipídeo é extrudado através de membrana de policarbonato 0,8 µm. Tente evitar a passagem de bolhas e para trás através da membrana.
- Lugar da extrusora totalmente montada no bloco de aquecimento. Empurre suavemente o êmbolo da seringa preenchida com lipídios para a seringa vazia. Dependendo da concentração de lipídios, isso será difícil de ultrapassar. Repita 20 vezes.
- Retire o bloco de aquecimento da extrusora totalmente montada. Lentamente, remova a seringa da extrusora, certifique-se coletar qualquer lipídios que poderá vazar quando retirar. Coloque os lipossomas em um frasco limpo. Repita os passos usando o 3.4-3.6 policarbonato 0,2 µm e 0,1 µm de membranas.
- Crie uma coluna de grânulo de agarose reticulado de2 0,7 x 50 cm com intervalo de separação de 0.7-10 Mega Daltons (MDa) incubados em PBS. Adicione os lipossomas e executar etapa 1.6. Frações que contêm lipossomas serão diminuíram a transmissão da luz na faixa de 250 a 400 nm.
- Armazenar os lipossomas em 4 ° C e não congelar.
4. cálcio fluxo para monitorar a ativação de células B por lipossomas antigênicas
- Eutanásia em ratos por dióxido de carbono (CO2) ou overdose de isoflurano, de acordo com institucional de procedimentos operacionais padrão. Confirme a eutanásia de ratos por deslocamento cervical.
- Esterilize instrumentos cirúrgicos e carcaça de ratos usando etanol a 70%. Uso 10 cm de comprimento, dica de 0,8 mm, curvo fórceps de íris para separar a pele cobrindo a cavidade torácica da caixa torácica. Use 10 cm longo, reto dissecando a tesoura para fazer uma incisão distal com uma incisão bilateral.
- Use íris curva fórceps e a tesoura de dissecação para extrair o baço da cavidade abdominal. Remover tecido adiposo em torno de baço e coloque-o em um tubo cônico poliestireno 15ml, repleto de RPMI1640 médio com 1% bezerro fetal soro (FCS) e penicilina-estreptomicina.
- Transferência de baço e meios de comunicação sobre um coador de célula de 40 µm, montado sobre um tubo cónico de 50 mL. Usando a extremidade de borracha de um êmbolo de seringa de 3 mL, delicadamente esmaga o baço. Lave o filtro de célula de 40 µm com a mídia. Repita este processo até que apenas o tecido adiposo é deixado no 40 µm filtro célula. Enxágue o crivo com 3-5 mL de mídia para aumentar a recuperação celular.
- Centrifugue a célula homogenate a 300 x g durante 5 min à RT Após a centrifugação, descartar o sobrenadante e adicionar 10 mL de tampão de lise de RBC x 1 para a pelota. Pipetar para cima e para baixo, deixar por 2 – 3 min em RT e centrifugar a 300 x g durante 5 min à RT
- Desprezar o sobrenadante e ressuspender splenocytes de células vermelhas do sangue empobrecida em 10 mL de mídia. Determine o número de células totais usando um hemocytometer ou outras dispositivo de contagem de células. Granule as células por centrifugação, como descrito acima.
Nota: A concentração final ideal necessária para carregamento Indo-1 de splenocytes é 10-20 x 106 células/mL, mas uma menor concentração de células pode ser usada. - Resuspenda splenocytes 15 x 106 células/ml no fluxo de cálcio carregando buffer (meio RPMI1640 contendo 1% FCS, ácido de 10 mM 4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic (HEPES), 1 mM de cloreto de magnésio (MgCl2), (glicol de etileno-bis de 1 mM Éter de β-aminoetil)-N, N, N', N'-tetraacetic ácido (EGTA) e 5% penicilina-estreptomicina). Adicionar em 1,5 µM Indo-1 de uma solução stock de DMSO de 1mm, inverta o tubo várias vezes para misturar. Proteger da luz e incube as células em banho de água a 37 ° C por 30 min.
- Após a incubação de 30 min, adicione 5 x a quantidade de fluxo de cálcio, tampão de carregamento. Centrifugar x g por 7 min em RT.
- Para retenção de células B, mancha células com 1: 200 anti-rato CD5-PE e anti-rato 1: 200 B220-PE/Cy7 em 0,5 mL de carregamento de buffer no 4 ° C por 20 min, protegido da luz.
- Lave os splenocytes no fluxo de cálcio carregando buffer e centrifugar x g por 7 min em RT. Ressuspender as células em 10 – 20 x 106 células/mL em fluxo de cálcio executando o tampão (Hank está equilibrada solução salina (HBSS) contendo 1% FCS, 1 mM MgCl2 e 1 mM cloreto de cálcio (CaCl2)). Armazenar no gelo, protegido da luz, até que esteja pronto para ser executado no citômetro de fluxo.
-
Instalação de citometria de fluxo com controles de mancha imaculado e único para a compensação.
- Execute as células coradas para configurar as portas adequadamente (ver Figura 2A). Configuração de Indo-1 (violeta) contra enredo Indo-1 (azul), ajustar as tensões nos canais Indo-1 para colocar as células em uma inclinação de 45-60 ° para maximizar o sinal de coloração: ruído da Indo-1 violeta: azul mudança na relação após estimulação de células B.
Nota: Certifique-se que as tensões não são demasiado elevadas, tal que uma percentagem significativa das células (> 5%) são contra o topo da trama. - Criar um portão diagonal que encapsula a parte superior esquerda (Violet+azul–), do enredo, tal que sem estimulação < 10% das células estão no portão, que idealmente deve aumentar para > 75% após a estimulação.
- Execute as células coradas para configurar as portas adequadamente (ver Figura 2A). Configuração de Indo-1 (violeta) contra enredo Indo-1 (azul), ajustar as tensões nos canais Indo-1 para colocar as células em uma inclinação de 45-60 ° para maximizar o sinal de coloração: ruído da Indo-1 violeta: azul mudança na relação após estimulação de células B.
-
Adicionar 0,5 mL de células para um tampado 5 mL redondo fundo tubo poliestireno (fluorescência-ativado da pilha tubo (FACS) de classificação) e aquecer as células a 37 ° C por 3 – 5 min em um banho de água. Coloque o tubo de FACS na câmara water-jacketed de 37 ° C que é conectada a um banho de água de re-circulação.
- Executar o tubo water-jacket sobre o citômetro de fluxo e iniciar a aquisição, sem armazenar os dados, a aproximadamente 5.000 – 10.000 eventos/s. Uma vez que as células têm estabilizado (15 – 30 s), iniciar a aquisição e coleta de dados pelo menos 10 s para estabelecer o plano de fundo.
- Na marca de 10 s, rapidamente Retire o tubo do citômetro de fluxo, adicionar a estimulação (lipossomas antigênica 5-50 mM em 2 a 20 mL), pulso vortex e retornar o tubo de FACS sobre o citômetro de fluxo. Manter a aquisição de dados e armazenamento através desta vez e coletar dados para 3-5 min.
- Analise os dados no software de análise adequada sob as funções de cinética.
5. preparação do extrato de amendoim
- Extraia o amendoim proteínas através da mistura de farinha de amendoim em uma relação de 1:5 (wt:vol) de soro de tampão fosfato (PBS) com 1m de cloreto de sódio (NaCl). Misture a solução na placa de agitação magnética para 2h em RT, mantendo a pH 8,5.
- Solução de centrifugação a 3.000 x g durante 45 min a 4 ° C. Decantar e filtro-esterilizar sobrenadante sequencialmente através de um filtro de 0,4 µm, seguido por um filtro de 0,2 µm. Determine a concentração de proteína por bicinchoninic ácido (BCA) do ensaio usando albumina de soro bovino (BSA) como padrão.
- Reduzir e desnaturar uma amostra das proteínas de amendoim com 50mm ditiotreitol (DTT) em um buffer contendo Dodecil sulfato de lítio a um pH de 8,4, o que permite a máxima atividade do agente redutor e calor a 70 ° C por 10 min.
- Execute 10 µ g de proteína de amendoim desnaturada em um gel de polyacrylamide precasted de 4 – 12% Bis-Tris projetado para dar separação ideal gradient gel com peso molecular pre-manchado padrão.
- Manchar o gel com disulfonated trifenilmetano e destain com DDQ2O. Identify conhecido principais alérgenos amendoim Ara h 1, 2 e 3 em preparações de extrato. Ara h 1 aparece em 63 kDa, Ara h 2 deve aparecer como duas isoformas em 17 e 19 kDa e Ara h 3 aparece em 37 kDa (subunidade ácida).
6. sensibilização de ratos para amendoim
- Resuspenda toxina da cólera 1 mg em 1 mL de água ultrapura. Prepare-se 200 µ l diluída amendoim extrato contendo 2 mg proteína de amendoim e toxina da cólera 10 µ g em PBS.
- Administre 200 µ l de extracto de amendoim que contenha cólera toxina (2 mg de proteína de amendoim e 10 µ g toxina da cólera) via oral gavagem para cada rato fêmea BalB/cJ de 4-5 semanas. Repita uma vez por semana durante três semanas (ou seja, nos dias 0, 7 e 14).
- Administre 300 µ l diluída extrato de amendoim (contendo 5 mg de proteína de amendoim e 10 µ g toxina da cólera) via oral gavagem para cada rato na quarta semana (ou seja, dia 21).
7. desafio camundongos com extrato de amendoim
- No dia 28, prepare extrato de amendoim para uma concentração final de 1 mg/mL em PBS. Medir a temperatura do corpo da linha de base usando um termômetro retal (aproximadamente 37,5 a 38,5 ° C). Administre 200 µ l (200 µ g) de extrato de amendoim através de injeção intraperitoneal (i.p.).
- Medir a temperatura corporal com termômetro retal cada 15 min por 1h após a injeção. Um mergulho na temperatura corporal indica alergia a amendoim.
Nota: A hipotermia é uma marca registrada de anafilaxia em camundongos. Este desafio irá demonstrar que os ratos são alérgicos a amendoim. Normalmente, 90% dos camundongos Balb/cJ que submeter-se o protocolo de sensibilização desenvolver reações alérgicas durante o desafio, caracterizado pelo menos uma diminuição de temperatura de 2 – 3 ° C.
8. isolamento dos Splenocytes de ratos alérgicos e transferência adoptiva
-
Isole os splenocytes de amendoim ratos alérgicos e ingênua.
- No dia 30, eutanásia tanto ingênua e ratos alérgicos amendoim confirmados através da administração de 3 L/min de CO2 em uma câmara de gás. Confirme a eutanásia de ratos por toracotomia bilateral. Esterilize instrumentos cirúrgicos e carcaça do mouse usando o etanol a 70%. Use fórceps para separar a pele cobrindo a cavidade torácica da caixa torácica. Use tesoura reta de dissecação para fazer uma incisão bilateral quebrando as costelas esquerdas e direita.
- Usar o fórceps e a tesoura de dissecação para extrair o baço da cavidade abdominal. Remova tecido adiposo circundante baço antes de colocar em tubo cônico de poliestireno 15ml, preenchido com meio RPMI 1640 de 10 mL.
- Em uma capa de estéril de fluxo laminar, despeje baço e mídia um poliestireno 35 mm placa de Petri. Manter ingênua e splenocytes alérgica em separado de Petri e mídia durante o isolamento da célula. Use a pinça esterilizada e dissecando tesoura para cortar o baço em três pedaços e retornar à caixa de Petri.
- Usando a borda áspera, fosco de duas lâminas de microscópio, delicadamente homogeneizar (em RPMI) as peças do baço até tecido branco permanece entre os slides. Alterar slides entre grupos.
- Transferi homogenate de célula do prato de Petri através de um filtro de célula 70 µm montado em um tubo cónico de 50 mL. Passe os restantes fragmentos de baço através do filtro com um êmbolo de uma seringa de 1 mL. Enxágue o crivo com 5 mL de RPMI para maximizar a recuperação celular. Transferi o filtrado para um tubo cônico de poliestireno 15 mL e centrífuga (450 x g, 10 min, RT).
- Aspire o sobrenadante e ressuspender centrifugado, adicione em 2 mL de tampão de Lise células vermelhas do sangue (cloreto de amónio de 0,83% em tampão Tris de 10 mM, pH 7,2). Misturar e incubar a RT por 2 – 3 min. adicionar 10 mL de PBS - 2% FBS e centrifugar x g por 7 min em RT
- Lavar as células novamente com 12 mL de PBS - 2% FBS completamente remover qualquer residual de cloreto de amónio e centrifugar a 300 x g durante 7 min na célula RT. Ressuspender pelotas em 2 mL de meio RPMI 1640. Contar as células usando um hemocytometer ou analisador automático de hematologia.
- Usando um 27 G, 5/8-polegada agulha uma seringa de insulina 1 mL, por via intravenosa injectar 15 x 106 alérgica ou ingênuo splenocytes extraído como descrito acima (em 200 µ l) através da cauda da veia em camundongos ingênuo (unsensitized).
9. injeção de ratos com Ara h 2 antigênica lipossomas
- Prepare Ah2 lipossomas contendo 0,1% Ah2 em lipídios de 2,5 mM. Para calcular a concentração de proteína, o coeficiente de extinção de Ah2 é 15.000 M-1. Dilua os lipossomas para 300 µM em PBS estéril.
- Um dia depois da transferência adotiva (dia 31) do alérgico ou ingênuo splenocytes, injetar por via intravenosa 200 µ l de PBS ou os lipossomas antigênicos Ah2 (300 µM) contendo um total de 1,38 µ g de Ah2 através da veia da cauda de camundongos BALB/cJ que recebeu os splenocytes na etapa 8.2.
10. impulso e desafio de ratos com Ara h 2
- Duas semanas após a injeção com lipossomas Ah2, no dia 45, usar uma lanceta de animais de 4 mm para coletar 50 – 200 µ l de sangue da junção da submandibular do rato. Colheita de sangue em um tubo separador de soro sem heparina; separado o soro por centrifugação a 6.000 x g durante 15 min. Use o soro coletado mais tarde para anticorpos antígeno-específicos de medida.
- No dia 46, duas semanas após a injeção de ratos com lipossomas (passo 9.2), impulsionar os ratos por uma injeção i.p. de 200 µ l de PBS ou 200 µ g de solúvel Ah2 (purificado conforme descrito anteriormente,16).
- Em 60 dias, coletar 50-200 µ l de sangue da junção da submandibular do rato e processar o sangue, conforme descrito anteriormente.
- Dia 61, desafiar cada grupo de ratos com uma injeção i.p. de 200 µ l de 300 µ g Ah2 solúvel. Medir a temperatura do corpo com sonda rectal cada 15 min como na seção 7.
11. quantificação de Ara h 2 específico IgE e IgG1 por ELISA
- Revestir um ensaio de 96 poços imunoenzimático (ELISA)-placa compatível com 100 µ l HSA-DNP (2,4-dinitrophenyl hapteno conjugados ao ser humano soro albumina, 20 µ g/mL) para a curva padrão ou Ah2 (5 µ g/mL) para amostras de soro coletadas nas etapas 10.1 e 10.3, diluído em buffer de revestimento (tampão de carbonato de bicarbonato de 50 mM, pH 9,6) no 4 ° C durante a noite ou a 37 ° C para > 1 h.
- Lavar três vezes com 200 µ l PBS-T (PBS com 0,05% Tween-20) e bloquear poços com 200 µ l PBS-T contendo BSA de 2% a 37 ° C para > 2 h.
- Para Ah2 específicos IgE ELISA, adicionar padrões de IgE-anti-DNP 50 µ l (2 – 0,002 µ g/mL, preparado a partir de diluições em série 1:2) ou amostras de soro de rato (01:20 diluição) e incubar durante a noite a 4 ° C. Para ELISA de IgG1 Ah2 específicas, adicionar 100 µ l purificado padrões IgG1-anti-DNP (2 – 0,002 µ g/mL, preparado a partir de diluições em série 1:2) ou mouse (diluição 1: 500) de amostras de soro e incubar durante a noite a 4 ° C ou 1 h a 37 ° C.
- Lavar três vezes com 200 µ l PBS-T. Para Ah2 específicos IgE ELISA, adicionar 100 µ l ovelhas anti-rato IgE (0,5 µ g/mL) e incubar a 37 ° C, durante 1 h. Para ELISA de IgG1 Ah2 específicas, adicionar 100 µ l HRP cabra anti-rato IgG1 (diluído 1:40,000 em PBS-T - 2% BSA). Incube a 37 ° C, durante 1 h.
- Lavar três vezes com 200 µ l PBS-T. IgE específico Ah2 ELISA, adicionar 100 anti-ovelhas da biotinilado-burro µ l IgG (0,5 µ g/mL) e incubam a 37 ° C, durante 45 min. Para ELISA de IgG1 Ah2 específicos, pule para a etapa de 11,7.
- Lavar três vezes com 200 µ l PBS-T. Para Ah2 específicos IgE ELISA, adicionar 100 µ l neutra carregadas com peroxidase de rábano-avidina (por exemplo, NeutrAvidin-HRP, 0,3 µ g/mL) e incubar a 37 ° C por 30 min.
- Adicionar 100 µ l 3, 3', 5, 5'-tetrametilbenzidina (TMB) substrato, incube 10-15 min ou até as amostras fiquem azul escuro, em seguida, adicionar solução de paragem TMB 100 µ l. Leia a placa a 450 nm.
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Representative Results
Conjugação da proteína de interesse com DSPE-PEG(2000) pode ser demonstrada através da execução de um redutor mostrando um aumento no peso molecular em comparação com a proteína unconjugated. Figura 1A mostra um gel representativo de conjugação de fragmento de F(ab) de IgM antirato para PEG-DSPE, que mostra um bandshift de kDa 2-3 para a proteína desnaturada. Note-se que aproximadamente 50% da proteína parece ser modificado, que é esperado, dado que a estequiometria de 1:1 foi alcançada sobre o fragmento Fab que é um heterodímero da cadeia leve e pesada. A figura 1B mostra um gel representativo de conjugação Ah2 para PEG-DSPE. Para avaliar o fluxo de cálcio das células-B estimulados por lipossomas antigênicos, duas coisas são cruciais: (1) as configurações do instrumento são sintonizadas para ver uma diferença na proporção de Indo-1 fluorescência no Ca2 + vinculado (violeta) e desacoplado formas (azuis) e (2) o bom estratégia de retenção é usada para avaliar a ativação de células B. Figura 2A mostra o esquema de associada para o ensaio do fluxo de cálcio baseados em citometria de fluxo. Ao vivo linfócitos são bloqueados em um SSC-A contra o FSC-A (painel esquerdo), parelhas são bloqueadas para fora em uma FSC-W contra SSC-W trama (painel central) e B200+CD5– as células B são Selecionadodas a partir de uma trama de vs B220-PE/Cy7 CD5-PE (painel direito). Figura 2B demonstra a relação da fluorescência de Indo-1 (azul) vs (violeta) Indo-1 ao longo do tempo como analisados. Nota que a concentração de proteínas totais de F(ab) e F(ab')2 nestes ensaios eram os mesmos, demonstrando a capacidade superior de lipossomas antigênicas na ativação de células B estimulante. Depois de preparar o extrato de amendoim, execute uma alíquota em um gel de SDS-PAGE para determinar as quantidades relativas de Ara h 1, 2 e 3 dentro do extrato. A Figura 3 mostra um gel representativo de uma extração de amendoim que foi executado juntamente com Ah2 purificado. A Figura 4 mostra um diagrama esquemático do modelo de rato geral adotivos alergia, incluindo sensibilização inicial para amendoim, desafio de amendoim, splenocyte isolamento e transferência adoptiva, injeções de lipossomas, retirar sangue seguido por impulso Ah2, e desafio para Ah2. Ah2 específicos de IgE e IgG1 ELISAs foram executadas para quantificar imunoglobulinas no soro, como mostrado na Figura 5A e B. Ratos com sensibilidade conferida que tem sido impulsionados com Ah2 terá Ah2 específicos IgE e IgG1 no seu soro. Temperaturas de corpo gravadas durante o desafio Ah2 são mostradas na Figura 5; alérgicos ratos tinham diminuído após o desafio, enquanto a temperatura do corpo em ratos ingênuos permaneceu consistente a temperatura do corpo. Fotos mostrando ratos ingênuos em comparação com ratos alérgica a amendoim durante o desafio são mostradas na Figura 6.
Figura 1: gel de representante da conjugação de IgM F(ab) e Ah2 anti-rato para PEG-DSPE. (, B) Análise da SDS-página do (A) cabra anti-rato IgM F(ab) fragmento e Ah2 (B) antes e após a conjugação para PEG-DSPE. Cabra do anti-mouse IgM e Ah2 tem peso molecular de aproximadamente 48 e 18 kDa, respectivamente. Após a modificação, ligeiramente maior peso molecular (~2.5 kDa) é claramente observado por ambas as proteínas. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2: representante gating estratégia, análise e resultados do fluxo de cálcio. (A) células foram analisadas através da seguinte estratégia associada: viver linfócitos (FSC-A vs CCD-A), células únicas (FSC-W vs CCD-W) e as células B (B220+CD5–). (B) The Indo-1/Ca2 + fluxo resposta (violeta vs azul) das células-B. Mostrado é o fluxo de cálcio para lipossomas de fragmento Fab anti-IgM e anti-IgM F(ab')2 na mesma concentração da proteína (2,5 µ g/mL) bem como células de reserva-estimulada como um controle. Note que entre 10-22 s quando a estimulação é adicionada e, portanto, nenhum dado é adquirido durante este tempo. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3: gel de representante mostrando extrato de amendoim e Ah2. Extrato de amendoim contém várias proteínas, incluindo alérgenos Ara h 1, 2, 3 e 6, em comparação com as duas isoformas que aparecem para Ah2. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 4: esquemática do protocolo de transferência adotiva. Naïve BALB/cJ ratos foram sensibilizados com extrato de amendoim (PN) e a toxina da cólera (CT) e posteriormente desafiados a PN. Splenocytes de ratos alérgicos confirmados foram isolados e transferidos em ratos ingênuos. Ratos foram mais tarde ferrados com imunogênicas lipossomas de h 2 Ara ou PBS, em seguida, impulsionados com Ah2 solúvel. Finalmente, os ratos foram desafiados com Ah2 para monitorar a anafilaxia. Sangue coletado nos dias 45 e 60 foram usados para quantificar imunoglobulinas específicas Ah2. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 5: lipossomas de h 2 Ara imunogênicas aumenta a memória conferidos respostas alérgicas. Soro era pré isolado (dia 45) e post (60 dias) impulso com PBS ou 200 µ l de 300 µM imunogênicas Ah2 em lipossomas para medir IgE Ah2-sepcific (A) e IgG1 (B). Os ratos individuais são representados com linhas indicando medianas. Ratos que receberam splenocytes alérgica e foram administrados Ah2 lipossomas no dia 32 tinham níveis significativamente mais elevados de IgE específico Ah2 e IgG1. Anafilaxia foi medida nos grupos de tratamento diferentes, registrando temperaturas corporais após Ah2challenge (C). Quer dizer temperaturas de corpo retratadas com SEM. ingênua: PBS (splenocytes ingênuo e PBS prime), alérgicas: PBS (confirmado splenocytes alérgica e PBS prime), alérgicas: Ah2 (confirmado splenocytes alérgica e Ah2immunogenic em lipossomas prime). * P < 0.05, * * P < 0,01, * * * P < 0,001, * * * P < 0,0001 determinado da marcação sem paridade do aluno-de-cauda-2 t-teste. Note que estes resultados são representativas de dois experimentos independentes. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 6: anafiláticas sintomas observados durante o desafio Ah2. Ratos de ingênuo permanecem ativos e têm a cor da pele-de-rosa nos pés (A, C). Alérgicos ratos diminuíram a atividade, muitas vezes são curvados, têm a respiração ofegante e experimentam cianose, indicado pela tez roxa mais escura em seus pés (B, D). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
| MW | 790 | 387 | 2900 | 3000 | 48000 | |
| DSPC | Colesterol | PEG-DSPE | excesso de PEG-DSPE | um IgM-PEG-DSPE | TOTAL | |
| Relação molar | 57 | 38 | 3.9 | 1 | 0.1 | 100,00 |
| massa (mg) | 0,56 | 0.18 | 0,14 | 0,04 | 0,06 | 0,98 |
| m mol | 0,71 | 0,47 | 0.05 | 0.01 | 0,00 | 1.25 |
| mL | 112,50 | 45.93 | 70.64 | 0,00 | 525.97 | 755.03 |
| Conc. (mg/mL) | ||||||
| DSPC | 5 | |||||
| Colesterol | 4 | |||||
| PEG-DSPE | 2 | |||||
| um IgM-PEG-DSPE | 0.114 |
Tabela 1: cálculos para a criação de um lipossoma de concentração lipídica total 1,25 µM. Exemplo de tabela de cálculo para lipossomas de fragmento do bode anti-rato IgM F(ab).
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Discussion
Os métodos descritos aqui são um protocolo geral para a conjugação de uma proteína para um lipídio que permite a exibição da proteína sobre nanopartículas lipossomas. Para grandes subunidade várias proteínas, este protocolo pode ter limitado utilitário. O método ideal seria a introdução de uma marca específica do site que permite que uma estratégia de ligação química biorthogonal ser usado. Se expressar as proteínas recombinantes, isto pode ser possível usando estratégias específicas disponíveis17e uma grande variedade de grupos funcionais no final do peguilado lipídios disponíveis comercialmente. Nesse sentido, o presente protocolo é voltado para a ligação de proteínas isoladas de fontes naturais e é acessível a uma vasta gama de cientistas não estão necessariamente familiarizados com transformações químicas e bioquímicas.
Um aspecto fundamental da execução de um experimento de fluxo de cálcio que deve ser enfatizado é que as células não devem ser ativadas antes de executá-los na citometria de fluxo. Se técnica estéril com rigor não é usada, isto corresponderá a um sinal de fundo elevado de células ativadas (Indo-1 fluorescência desviada para a sua emissão no canal violeta). Da mesma forma, as células devem ser mantidas no gelo antes de executar o ensaio para evitar níveis anormais de fundo sinal nos canais de Indo-1. Também é importante garantir que as células são aquecidas por 2 – 3 min antes da aquisição por citometria de fluxo e ao longo de estimulação durante a aquisição de dados. Se as células não são mantidas a 37 ° C durante a aquisição de dados, pode esperar-se que as células não respondem màxima. Uma vez que as células B antígeno-específicos estão presentes em camundongos em números muito pequenos, utilizar um antígeno substituto para estimular todos os B-células de ratos é ideal. Embora numerosas estirpes de rato transgénico estão disponíveis que expressam as células B antígeno-específicos, o objetivo desta técnica é permitir que o usuário médio ser capaz de validar a sua capacidade de fazer lipossomas antigênicos usando ratos do selvagem-tipo. Para realizar este objectivo, fragmentos Fab de anti-rato IgM foram associados a lipídios e formulados em lipossomas antigênicos que cross-link o receptor de células B (BCR) de forma policlonal. Vale ressaltar que anteriormente foi demonstrado que este método pode ser usado para estimular o humano as células B10 usando o fragmento de IgM Fab anti-humano apropriado, que é significativo, porque não é possível aceder a um número significativo de antígeno-específicas B-células humanas. Nesses estudos, a potência antigênicas lipossomas para estimular a ativação de células B foi ilustrada por sua maior capacidade de induzir o fluxo de cálcio em comparação com quantidades iguais de anti-rato IgM F(ab') 2 fragmentos.
O uso de lipossomas antigênicos permitiu o desenvolvimento de um método para sensibilização camundongos BALB/cJ para amendoim, transferindo splenocytes dos ratos alérgicos para ratos ingênuos, injetando os ratos de anfitrião com lipossomas Ah2 e desafiá-los com Ah2. Níveis de anticorpos e respostas anafiláticas dentro de grupos de ratos são reprodutíveis neste modelo. Tem sido bem estabelecida que respostas e T-células B de memória são fundamentais para o desenvolvimento de anticorpos específicos de amendoim em camundongos. Além disso, um estudo recente demonstrou que a memória as células B repovoar células plasmáticas em ratos, que mantêm níveis elevados de IgE antígeno-específicas; Portanto o alérgeno-específica memória B-células são um alvo atraente para a intervenção terapêutica18. O modelo descrito aqui agora permite a oportunidade de atingir diretamente as células de memória B Ah2 específico, em oposição a uma abordagem imunossupressora usando bortezomib para esgotar o repertório de toda célula de plasma19. Outra abordagem para combater alergias é induzir tolerância no compartimento das células T. Uma estratégia potencial é encapsular adjuvantes indutora de tolerância dentro o lipossoma. Anteriormente, nanopartículas encapsulando rapamicina foram usadas para induzir Tregs e diminuir a doença auto-imune20. Este tipo de abordagem poderia ser empregado para desenvolver terapias de tolerogenic para tratar a alergia ao amendoim. Em geral, manipulação do lipossoma alérgeno específico por conjugação moléculas à superfície permite adaptadas respostas imunes, e droga-como moléculas de encapsulamento permite entrega de drogas à célula alérgeno-específicos.
Limitações gerais deste modelo de rato de alergia são a sensibilização para amendoim com toxina da cólera e posterior desafio amendoim via i.p. injeção não é inteiramente representante da alergia em seres humanos (por exemplo, os seres humanos têm reações após a ingestão oral). No entanto, este modelo de alergia é o padrão atual do campo11,18,21e nos permite investigar os mecanismos moleculares da doença alérgica e desenvolver novas abordagens terapêuticas. Comparado a essas abordagens convencionais, este modelo de transferência adotiva oferece três vantagens principais. A primeira é que ele permite que a memória B - e -células T específicas ao alérgeno para ser estudado mais diretamente. De fato, prova agora fortemente implica as células B de memória como a principal fonte de longo prazo alergias18. Em segundo lugar, porque o mesmo número de B - e T-células de memória é implantado em cada destinatário rato, as respostas alérgicas são minimamente variáveis. Em terceiro lugar, este modelo oferece a oportunidade de estudar respostas alérgicas aos alérgenos individuais, que é útil no contexto de testar novas imunoterapias. Uma aplicação interessante deste modelo é usar a abordagem geral no contexto de um modelo de mouse humanizado, onde respostas alérgicas têm sido estudadas em modelos imunizados22. Aplicado no contexto de um modelo de transferência adotiva, um modelo do rato humanizado pode ser uma poderosa abordagem para expandir e em vivo testando de B - e -células T de pacientes alérgicos.
Patogênese de doenças anticorpo não ocorre apenas em modelos alérgicos, mas também em células B mediada doenças auto-imunes23. Enviaram, transferindo splenocytes sensibilizadas de ratos dados um autoantigen iria, finalmente, ser muito útil na redução do número de animais utilizados, minimizar o número de animais recebendo injeções múltiplas de adjuvante e aumentar a reprodutibilidade do respostas entre coortes de ratos em várias indicações de doença. Um exemplo seria, em um modelo experimental auto-imune de miastenia gravis (EAMG), na qual mouse sensível cepas (C57BL/6, SJL e AKR) são imunizadas várias vezes com o receptor de acetilcolina (CADH) em adjuvante para desenvolver os autoanticorpos patogênicos. Estes auto-anticorpos acabará por levam a immunopathological características presentes nos seres humanos tais como o cansaço/fraqueza muscular, depósito de imunoglobulinas e componentes do complemento em junções neuromusculares e em casos severos de morbilidade/morte24. Em EAMG, a incidência da doença varia entre 50 e 70%, então para compensar esta variabilidade coortes animais grandes são necessárias para alcançar significância estatística25,26. O método descrito aqui, finalmente, reduzir o número de animais utilizados, diminuindo a variabilidade na incidência de doenças. Como mencionado anteriormente, EAMG é induzida por múltiplas injeções com cais + adjuvantes (adjuvante de Freund completo e adjuvante de Freund incompleto) às respostas de autoanticorpos do gatilho. Este método iria reduzir o número de animais que recebem múltiplas injeta com adjuvante. Finalmente, devido à natureza de múltiplas imunizações e impulsiona, é relativamente difícil definir windows terapêuticos adequados para tratamentos profiláticos e terapêuticos. Este método ajudaria a sincronizar o anticorpo resposta e doença patogênese janela, tornando-a mais previsível e reprodutível. Esta mesma lógica pode ser aplicada a muitos outros modelos de rato de anticorpo mediada doenças auto-imunes, como artrite reumatoide27.
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Disclosures
Os autores não têm nada para divulgar.
Acknowledgments
Esta pesquisa foi apoiada por subsídios do departamento de defesa (W81XWH-16-1-0302 e W81XWH-16-1-0303).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Model 2110 Fraction Collector | BioRad | 7318122 | |
| Cholestrol | Sigma | C8667 | Sigma grade 99% |
| SPDP | Thermo Fisher Scientific | 21857 | |
| DSPC | Avanti | 850365 | |
| DSPE-PEG 18:0 | Avanti | 880120 | |
| DSPE-PEG Maleimide | Avanti | 880126 | |
| Extruder | Avanti | 610000 | 1 mL syringe with holder/heating block |
| Filters 0.1 µm | Avanti | 610005 | |
| Filters 0.8 µm | Avanti | 610009 | |
| 10 mm Filter Supports | Avanti | 6100014 | |
| Glass Round Bottom Flask | Sigma | Z100633 | |
| Turnover stoppers | Thermo Fisher Scientific | P-301398 | |
| Tubing | Thermo Fisher Scientific | P-198194 | |
| Leur Lock | Thermo Fisher Scientific | k4201634503 | |
| Sephadex G50 Beads | GE Life Sciences | 17004201 | |
| Sephadex G100 Beads | GE Life Sciences | 17006001 | |
| Heat Inactivated Fetal Calf Serum | Thermo Fisher Scientific | 10082147 | |
| HEPES (1 M) | Thermo Fisher Scientific | 15630080 | |
| EGTA | Sigma | E3889 | |
| Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL) | Thermo Fisher Scientific | 15140122 | |
| 1x RBC lysis Buffer | Thermo Fisher Scientific | 00-4333-57 | |
| Indo-1 | Invitrogen | I1203 | |
| CD5-PE | BioLegend | 100608 | |
| B220-PE-Cy7 | BioLegend | 103222 | |
| HBSS | Thermo Fisher Scientific | 14170112 | without calcium and magnesium |
| MgCl2 | Sigma | M8266 | |
| CaCl2 | Sigma | C4901 | |
| Fab anti-mouse IgM | Jackson ImmunoResearch | 115-007-020 | |
| F(ab')2 anti-mouse IgM | Jackson ImmunoResearch | 115-006-020 | |
| Peanut flour | Golden Peanut Co. | 521271 | 12% fat light roast, 50% protein |
| Animal feeding needles | Cadence Science | 7920 | 22g x 1.5", 1.25 mm - straight |
| Microprobe thermometer | Physitemp | BAT-12 | |
| Rectal probe for mice | Physitemp | Ret-3 | |
| Cholera toxin, from Vibrio cholera | List Biological Laboratories, Inc. | 100B | Azide free |
| BCA Protein Assay Kit | Pierce | 23225 | |
| Carbonate-bicarbonate buffer | Sigma | C3041 | |
| TMB Stop Solution | KPL | 50-85-06 | |
| SureBlue TMB Microwell Peroxidase Substrate | KPL | 5120-0077 | |
| 96 well Immulon 4HBX plate | Thermo Scientific | 3855 | |
| Purified soluble Ara h 2 | N/A | N/A | purified as in: Sen, et al., 2002, Journal of Immunology |
| HSA-DNP | Sigma | A-6661 | |
| Mouse IgE anti-DNP | Accurate Chemical | BYA60251 | |
| Sheep anti-Mouse IgE | The Binding Site | PC284 | |
| Biotinylated Donkey anti-Sheep IgG | Accurate Chemical | JNS065003 | |
| NeutrAvidin Protein, HRP | ThermoFisher Scientific | 31001 | |
| Mouse IgG1 anti-DNP | Accurate Chemical | MADNP105 | |
| HRP Goat anti-mouse IgG1 | Southern Biotech | 1070-05 | |
| 1 mL Insulin Syringes | BD | 329412 | U-100 Insulin, 0.40 mm (27 G) x 16.0 mm (5/8") |
| Superfrost Microscope Slides | Fisher Scientific | 12-550-14 | 25 mm x 75 mm x 1.0 mm |
| ACK Lysing Buffer | gibco by Life Technologies | A10492-01 | 100 mL |
| RPMI 1640 Medium | Thermo Fisher Scientific | 11875093 | 500 mL |
| Cell Strainer | Corning | 352350 | 70 μm Nylon, White, Sterile, Individually packaged |
| NuPAGE 4-12% Bis-Tris Protein Gels | Invitrogen | NP0322BOX | 10 gels |
| NuPAGE LDS buffer, 4x | Invitrogen | NP0008 | 250 mL |
| SeeBlue Plus2 Pre-stained standard | Invitrogen | LC5925 | 500 µL |
| NuPAGE MES/SDS running buffer, 20x | Invitrogen | NP0002 | 500 mL |
| GelCode Blue Stain | Thermo Scientific | 24590 | 500 mL |
References
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