Summary
Açıklanan antijenik liposomal nano tanecikleri ve kullanımları uyarıcı B-hücre harekete geçirmek vitro ve in vivohazırlıktır. Tutarlı ve güçlü antikor yanıt-e doğru yeni bir fıstık alerjisi model gelişmesine yol açtı. Antijenik lipozomlar oluşturmak için protokol farklı antijenleri ve bağışıklama modeller için genişletilebilir.
Abstract
Antikor yanıt patojenlerin geniş bir dizi kritik koruyucu bağışıklık sağlar. Aşılama nasıl patojen antikor yanıt-e doğru geliştirmek alerjileri ve otoimmün hastalığı anlamak yanı sıra güçlü antikor üreten bir yüksek ilgi kalır. Sağlam antijen spesifik antikor yanıt üreten her zaman önemsiz değildir. Fare modellerinde bu kez Aşı indüklenen antikor düzeyleri değişkenlik büyük bir yol açar adjuvan ile birden fazla mermi gerektirir. Fıstık alerjisi nerede fare numaraları ve adjuvan kullanımını en aza indirmek daha sağlam ve tekrarlanabilir modelleri faydalı olacağını fare modellerinde bir örnektir. Burada sunulan bir çok tekrarlanabilir fare fıstık alerjisi anafilaksi modeldir. Bu yeni model iki önemli faktöre dayanıyor: (1) antijen spesifik splenocytes adoptively aktarılır bir fıstık hassas fare fareler; büyük bir takım karşısında antijen spesifik bellek B ve T hücrelerinin sayısı normale saf alıcı fare içine ve (2) alıcı fareler daha sonra büyük fıstık allerjen (Ara h 2) görüntüleme liposomal nano tanecikleri şeklinde güçlü multivalent immunogen ile artırdı. Bu model büyük avantajı sonuçta birden çok adjuvan enjeksiyonlari alma hayvan sayısını en aza indirirken her çalışmada kullanılan hayvan sayısını düşürür, tekrarlanabilirlik olmasıdır. İmmunojenik Bu lipozomlar modüler montaj patojenik antikorlar içeren diğer alerjik ya da otoimmün modelleri için nispeten facile uyum sağlar.
Introduction
Besin allerjisi ABD çocuklarda % 8'i etkiler ve yaygınlığı son artmıştır on yıl1. Fıstık alerjisi çocuk % 1'i etkiler ve genellikle geçmek2değil. Birkaç umut verici klinik çalışmalarda oral immünoterapi (OIT), sublingual immünoterapi (yırtık) ve epicutaneous immünoterapi (EPIT), dahil olmak üzere gıda alerji tedavisi için devam etmektedir rağmen orada şu anda yok FDA onaylı tedavi stratejileri Fıstık alerjisi bireyler3,4,5,6,7,8desensitizing için. Bu nedenle, Alerjik kişiler kesinlikle alerjenler anafilaksi önlemek için kaçınmak gerekir. Çok soru Sensitizasyonu yolları ile ilgili olarak ve mekanizmaları gıda Anti gelişiminin temel kalır.
Fare modelleri Anti mekanizmaları eğitim hem de yeni tolerogenic ve duyarsızlaştırma terapiler9,10,11,12geliştirmek için değerli bir araç vardır. Bu özellikle doğrudur çünkü büyük fıstık allerjen (Ara h 2; Ah2) insanlarda olduğunu da birkaç baskın alerjen açıklanan fare modelleri13,14. Fıstık alerjisi fare modelleri mekanizmaları Sensitizasyonu ve hoşgörü eğitim çok değerli olmakla birlikte, bir onlar değişken olabilir ve adjuvan kullanımını gerektiren dezavantajıdır. Daha güçlü immunogens modelleri gibi içsel değişkenliği en aza indirmek için bir yol olurdu. B-hücreleri şiddetle multivalent antijenleri tarafından etkinleştirilir beri antijenik lipozomlar alerjen görüntüleme yeteneklerini nedeniyle potansiyel olarak B-hücreleri de mülkiyeti verimli bir şekilde sahip iken B hücre reseptörü (BCR) etkinleştirmek için iyi bir seçenek vardır Özellikle antijen-sunarak alınan ile T-hücre bölmesi priming hücreleri.
Burada, protein antijenleri için facile ve modüler bir strateji kullanarak liposomal nano tanecikleri conjugating için detaylı bir protokol açıklayın. Kullanarak bir vekil antijen, anti-IgM Fab parçası, biz göstermek nasıl güçlü antijenik böyle lipozomlar uyarıcı B-hücre harekete geçirmek içinde olabilir. Antijenik lipozomlar toplam sayı Ah2 antijen bir yeni doğan duyarlılık fare modeli geliştirmek için kullanıldı. Bu modelde, splenocytes fıstık özel bellek B ve T hücreleri, içeren doğrulanmadı fıstık alerjisi fareler gelen saf congenic fareler aktarılır. Bellek antikor yanıt Ah2 karşı antikor ikna etmek için alıcı fareler Ah2 ile Birleşik lipozomlar enjeksiyon tarafından indüklenir. Ne zaman bu fareler daha sonra Ah2 ile meydan çözünür Ah2 ile tek bir artırmak ardından, Ah2 özel antikorlar neden bir güçlü anafilaktik yanıt-e doğru olmaktadır. Alerjik reaksiyon geçiren fareler son derece düzgün bir şekilde yanıt ve bir adjuvan almadım, bu yaklaşım bir arzu fıstık alerjisi modeldir ve sonuçları bu yardımcı programı diğer fare modelleri yönelik antijenleri ile tahrik olabilir öneririz alerjenler ve muhtemelen autoantigens.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Lipid ve lipozomlar birleşmeyle için protein kaplin genel yöntem büyük ölçüde önceki çalışma15üzerinde temel alır. Aşağıda açıklanan tüm hayvan yordamları Chapel Hill kurumsal hayvan bakım ve kullanım Komitesi (IACUC), Kuzey Carolina Üniversitesi tarafından onaylanmıştır. Fıstık alerjisi modelinde kullanılan tüm fareler BALB/cJ dişiler 3 haftalık satın vardır. Alberta Üniversitesi hayvan bakımı ve kullanmak Komitesi (ACUC) C57Bl/6 fareler en az 6 hafta-in yaş ve ex vivo analiz için fare dalağı kullanımını içeren deneyler onayladı.
1. Protein antijen pegile Lipid için konjugasyon
- Çapraz bağlı dextran jel boncuklar 3 g ile 1.500 – 30.000 Dalton (Da) ayırma aralığı 250 mL vakum şişe ekleyin. Fosfat tamponlu tuz (PBS) 60 mL ekleyin ve sürekli bir manyetik heyecan bar ile karıştırın. Şişeye mühür ve de-en az 1 h heyecan tabakta gazlama başlatmak için bir vakum ekleyin.
- Bir 1.0 cm x 30 cm cam Kromatografi sütununda kapalı ciro tıpa ile PBS yıkamak için sütun ekleyin. Ciro tıpa açın ve sütun drenaj. Çamaşır, takip de-gazla boncuk Bulamaç için sütun eklemek. Sütun bir boncuk yüksekliği yaklaşık 24 cm doludur kadar sürekli Bulamaç ekleyin.
- Bir kez bir 'baş' yaklaşık 4 – 5 cm PBS Paketli boncuk yukarıda sütun varsa, aşağıdaki adımları hazır var.
- Bir yerçekimi akışı sifon yeterince uzun bir raf sütunun üst üzerinde 1-2 feet ulaşmak ve sütunun altına düşer ve sütunun üstüne döndüren bir döngü oluşturmak için boru bir parçası ölçerek oluşturun. Bir ciro kapalı tüp boru açık bir yana bırakarak, tek bir amaç için ekleyin. PBS ve yer üstünde sütun rafta bir 500 mL şişe açık tüp sonuna yerleştirin.
- Ciro tıpa ile ucundan tut ve bir 10 mL şırınga ekleyebilirsiniz. Ciro Tıpa vana boru satırındaki açın ve PBS tüpten çizin. Bir zamanlar PBS tüm yol tüp dörtte üçü ulaştı, hızlı bir şekilde şırınga çıkarın ve ciro tıpa sütunun en üstüne ekleyin — Sıvı sütun çalışıyor olması.
Not: PBS 'sütunun üst kısmında sol baş' miktarı 1 ve 3 cm arasında olmalıdır. Sütun yıkamak için en az 3 sütun cilt tutardır.
- Moleküler ağırlığı (MW) göre lipid bağlantılı olabilir protein (mol) belirlemek.
Not: Keçi Anti-fare IgM Fab parçası (kendisi bir IgG) kullanılır burada poliklonal B-hücreleri uyarılması için evrensel vekil antijen olarak. Buna göre keçi IgG Fab parçası yaklaşık 48 kiloDalton (kDa) MW ve 1.3 mg bir toplam miktarı ticari olarak kullanılabilir. Böylece, bağlanacak şekilde protein 27.1 µmol miktarıdır. - Protein ilgi yok olma katsayısı belirlemek. Bilinmiyorsa, 280 protein absorbans ölçmek bir spektrofotometre ve mol sayısı A280 değeriyle hesaplanır adım 1.4 bölmek kullanarak nm.
Not: Co-verimli keçi IgG 280, Fab, tükenme nm olduğunu 64,600 M-1. - Bu izleme sağlamak için Amin içeren miktarda arabellek kaldırılır, protein 1.1-1.3 adımlarda oluşturduğunuz sütun üzerinde desalt ve 1.5 mL microcentrifuge tüpler (~ 500 µL kesir başına) içine protein kesirleri toplamak.
- Sütunun üstüne bağlı ciro Tıpa vana kapatmak ve sütunun üstüne kaldırın. Zaten değilse açın, ciro Tıpa vana sütunun altındaki açın ve PBS 'Başkanı' boncuk üst hits kadar bekleyin.
- Yavaş yavaş faiz protein Pasteur pipet rahatsızlık boncuk tepesine en aza indirmek için dikkatli olmak, bir cam kullanarak boncuk başına ekleyin.
- Protein çözüm 'Başkanı' boncuk tepesine ulaştı sonra PBS 1 mL yavaşça ekleyin üzerinden Pasteur pipet. Üç kere tekrar edin. 4 – 5 cm Başkanı oluşturmak ve adımları yineleyin sütun yıkamak için 1.3 için PBS ekleyin.
Not: hiçbir Amin içeren tampon mevcut olduğundan emin Eğer bu adım atlanır olabilir.
- A280 değerleri ölçerek protein içeren kesirleri belirlemek ve yaklaşık % 90'ı kurtarma protein vermek kesirler Havuzu.
Not: Bu genellikle 1,5-2-kat protein sulandırır. Havuzu sonra protein konsantrasyonu belirlemek. Protein gerekiyorsa, Santrifüjü yoğunlaştırıcı kullanarak bu adımda, konsantre ol. - Heterobifunctional crosslinker 2.5 molar denk için protein ekleyin.
- İlk olarak, yaklaşık 5 mg succinimidyl 3-(2-pyridyldithio) tartmak propiyonat (SPDP, MW 314 g/mol =) microcentrifuge tüp içine. SPDP çözülmeye birim belirlemek için molar protein konsantrasyonu al ve 2.5 molar aşırı tepki verecek bir 100 x çözüm üretmek için 250 x tarafından ile çarpın.
Not: protein konsantrasyonu 50 µM ise, örneğin, SPDP bir çözüm 12,5 mm gereklidir. SPDP 5 mg için bu 1.27 mL dimetil sülfoksit (DMSO) karşılık gelir.
- İlk olarak, yaklaşık 5 mg succinimidyl 3-(2-pyridyldithio) tartmak propiyonat (SPDP, MW 314 g/mol =) microcentrifuge tüp içine. SPDP çözülmeye birim belirlemek için molar protein konsantrasyonu al ve 2.5 molar aşırı tepki verecek bir 100 x çözüm üretmek için 250 x tarafından ile çarpın.
- SPDP 1: 100 seyreltme faiz protein ekleyin. Tepki yaklaşık 1 h için oda sıcaklığında (RT) salınan bir shaker yerleştirin.
- 1.1-1.3 içinde 100 mM sodyum asetat (NaOAc) pH 5.5 adımlarını aşırı SPDP kaldırmak ve sonraki azaltma adımda protein endojen disülfür bond(s) korumak, equilibrate ve oluşturulan sütun yıkamak için ya da bu sadece kullanımı için özdeş bir sütun oluşturmak bir arabellek.
- SPDP ile 1 h kuluçka sonra protein 100 mM NaOAc equilibrated sütun üzerinde desalt. Bu adım 100 mM NaOAc (pH 5.5) eluent kullanarak dışında adım 1.6 olarak benzer bir şekilde taşı. Kesirler toplamak, A280belirlemek ve üst kesirler havuz. Sütun PBS içinde yıkayın.
- DTT 2.5 M çözeltisi hazırlamak (MW 154 g/mol =) içinde çift distile su (GKD2O). 25 mM DTT protein 5-10dk için havuza alınan kesirler ekleyin.
- Protein A280 ölçmek ve bu nesli katsayısı tarafından bölmek. Ayrıca, A343belirleyin. Protein (bir280) ve bağlayıcı (bir343) derişim tabanlı bağlama oranını hesaplamak.
Not: Eğer bir nanodrop spektrofotometre kullanarak A340 auto-kalibrasyon çevrilir. A343 ölçüm pyridine 2-kimbilir grup absorbans temsil eder (extinction katsayısı 7550 M-1=) DTT tarafından SPDP cross-linker kaldırılır. Bağlayıcı bir molar oranı: 1.2-1.5 protein oranı genellikle elde SDPD 2.5 molar fazlalığı ile reaksiyonu geniş bir protein gerçekleştirirken. - Havuza alınan kesirler yukarıda açıklandığı gibi PBS yıkanmış sütun üzerinde çalıştırın. Kesirler toplamak, A280belirlemek ve üst kesirler havuz. Kesirler havuzu sonra A280 tarafından protein konsantrasyonu belirlemek.
- DSPE-PEG hazırlamak (2000)-Maleimide (1,2-distearoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine-N-[methoxy(polyethylene glycol)-2000)-Maleimide. Bu 10:1 molar oranında protein eklenir. DSPE-PEG (2000)-Maleimide bir 100 x hazır istenen konsantrasyonu elde etmek için hazır olun.
- Protein konsantrasyonu 10 µM 1.14 adımdan sonra ise, örneğin, DSPE-PEG (2000)-Maleimide 10 mm bir hazır hazır olun. Dikkatlice tartmak DSPE-PEG (2000)-Maleimide (MW 3000 g/mol =) ve DMSO uygun miktarda ekleyin. Birden fazla mermi nazik vortexing ve sonicating bu tamamen çözülmüş alabilirsiniz.
- 1.14. adımdaki kesirler hacmi belirlemek ve çözüm dikkatle küçük (10-25 mL) alt kabı (RBF) transfer.. 100 uygun miktarda ekleyin DSPE-1 x 10 kat molar aşırı, final toplama ulaşmak için PEG (2000)-Maleimide protein x. Yavaşça DMSO tümüyle dağıldı emin olmak için çözüm girdap.
- Reaksiyon gecede azot altında kapalı bir RBF çalıştırın. Kauçuk septum kullanma ve duman mahallede yer.
- 3 mL şırınga bir vakuma bağlı boru ucunda bağlı 20 G iğne ile septum delinme atmosfer kaldırmak ve vakum için 3-5 s açmak.
- Atmosfer nitrojen ile değiştirin. Dolgu bir balon azot ile ikiye böldüm 3 mL şırınga bağlı ve bir 20 G iğne ekleyin. Yuvarlak alt balonun içinde atmosfer nitrojen ile doldurmak için septum delik. Atmosfer ve yerine azot ile bir kez daha yineleyin ve gecede bağlı azot balon bırakın.
- Bir ayrı çapraz bağlı dextran jel boncuk sütun 4.000-150.000 Da (aynı derecede adımları 1.1-1.3) 1.0 cm x 50 cm cam Kromatografi sütundaki ayırma aralığı ile hazırlayın.
- Ertesi gün, adım 1.17 ve koşmak (takip adım 1.6 kullanılan yöntem) hazırlanan yuvarlak alt şişeye protein kaldırmak çapraz bağlı dextran jel boncuk sütun (Kimden adım 1,18) üzerinde.
Not: sütun yüklemek için toplam tutarı en fazla 2 mL olmalıdır. Daha büyük bir tepki kullandıysanız, ikiye bölünmüş ve ayrı sütunlarda çalıştırmak veya daha büyük bir çap sütun üzerinde çalıştırın.- Kesirler toplamak, A280, havuzu üst kesirler, belirlemek ve protein konsantrasyonu belirlemek. Lipid varlığı ölçümleri etkilemez.
- Kullanım için hazır kadar son havuza alınan kesirler lipid bağlı protein 4 ° C'de depolayın.
2. lipozom hazırlık
- Lipidler tartmak: DSPE-PEG(2000) (1,2-distearoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine-N-[methoxy(polyethylene glycol)-2000, MW 2805.5 g/mol; = Kolesterol (3b-Hidroksi-5-cholestene, 5-Cholesten-3b-ol), MW 386.7 g/mol; = ve DSPC (1,2-distearoyl-sn-glycero-3-phosphocholine), MW 790.1 g/mol. oluşturma DSPC, 4 mg/mL solüsyon kolesterol ve DSPE-PEG(2000) 2 mg/mL solüsyon kloroform içinde 5 mg/mL solüsyon =.
- Lipidler lipozomlar molar oranı olduğundan emin olun: %57 DSPC, %38 kolesterol ve %5 DSPE-PEG(2000), Tablo 1' de temsil edildiği gibi.
Not: Antijen genellikle 0,01 – 0.1 aralıkları lipozom üzerinde miktarını denetlemek önemlidir %. Tablo 1' de, % 0,1 oranında keçi Anti-fare IgM Fab parçası pegile lipid için bağlantılı kullanılır. (2000)-protein adım 1,15 pegile lipid miktarı %5 fazla olamaz emin olmak için ' eklenen Maleimide DSPE-PEG aşırı 10 kat azı dikkate almak önemlidir. - Son lipid (µmol) tutarların lipidler ekstrüzyon için oluştururken göz önünde bulundurun. Tablo 1 molar lipit konsantrasyonları bir 1,25 µM toplam lipid konsantrasyon, lipozomlar oluşturulması için hesaplama bir örnek için bkz:.
- Birbirine eklenmesini her lipid doğru miktarda hesapladıktan sonra her bir 12 mL borosilikat cam tüp birleştirmek.
-
Dikkatle kloroform kapalı darbe.
- Adım 1.17.1, dikkatle kloroform ile azot tüp kapalı darbe için hazır iğne ile tüp ve 3 mL şırınga kullanın. Yavaşça azot çözüm üzerinde bir akış tüp diğer elinizle döndürme sırasında havaya. Sıçramasına veya sıvı olarak bu çözüm sonraki adımda içine almak daha zor olabilir tüp tarafı yukarı yol çalıştırılacak neden en aza indirmek için dikkatli olun.
- Her tüpün DMSO 100 µL ekleyin ve bu çözüm bir gecede lyophilize. Statik olmayan laboratuar Temizleme işlemi, bir lastik bant ile güvenli ile tüp üst kapak ve Don-80 ° C.
3. lipozom ekstrüzyon
- Lipidler içeren 12 mL tüp için lipid bağlı protein içeren PBS 1 mL ekleyin. Çözüm için yaklaşık 30 solüsyon içeren temizleyicide sonication su banyosunda 1 dk s. 5 dakika veya daha uzun her turun arasında dinlenmek ve 3-4 kez tekrarlayın.
-
Bir ekstruder üretici tarafından belirtilen şekilde hazırlayın.
- İç zar desteklemek için filtre destekler ekleyebilir, birkaç damla (10 µL her) PBS parafin filmde yer. Cımbız kullanarak, bir kenar filtresi destek al ve 10 µL düşüş daldırma.
- O-ring içerisindeki filtre yerleştirin. Her iki taraf için bunu. Cımbız kullanarak, kenar 0.8 µm filtre kapmak ve 10 µL düşüş daldırma ve O-ring PBS ile dış ceket. Filtre değil asmak üzerinde iç zar destek yapar 0.8 µm filtre O-ring üzerinde yavaşça yerleştirin.
- Ekstruder Isıtma blok ekstruder önceden ısıtmak için sıcak bir tabak üzerine yerleştirin. Sıcak plaka üzerinde düşük geçiş ve istenilen sıcaklık ulaşmak blok ısıtma ekstruder izin. Protein toplama ile olası sorunları önlemek için son 37 ° c blok ısı değil
- Sonicated örnek bir ekstruder yerleştirilen extruding şırınga yüklemek. Ekstruder şırınga ekstruder diğer ucunu yerleştirin. Boş şırınga pistonu sıfıra ayarlandığından emin olun. Lipid Polikarbonat 0,8 µm membran kalıptan çekilmiş gibi boş şırınga doldurur. Kabarcıklar ve geriye membran aracılığıyla geçen önlemek için deneyin.
- Tam olarak birleştirilmiş ekstruder ısıtma bloğu içine yerleştirin. Yavaşça lipidler ile doldurulmuş şırınga pistonu boş şırınga itin. Lipid konsantrasyon bağlı olarak, bu itmek zor olacak. 20 x tekrarlayın.
- Tam olarak birleştirilmiş ekstruder Isıtma bloğundan kaldırın. Yavaş yavaş dolu şırınga ekstruder kaldırmak için ne zaman izale sızıntı herhangi bir lipidler toplamak emin olun. Lipozomlar temiz bir şişe yerleştirin. 3.4 – 3,6 kullanarak adımları yineleyin Polikarbonat 0.2 µm ve 0,1 µm membran.
- 0,7 x 50 cm2 çapraz bağlı özel boncuk sütun 0,7-10 ayrılık yelpazesi ile PBS içinde equilibrated Mega Dalton (MDa) oluşturun. Lipozomlar ekleyin ve adım 1,6 olduğu gibi çalıştırın. Kesirler lipozomlar içeren 250-400 nm aralığında ışığın iletim azalmış.
- 4 ° C'de lipozomlar depolamak ve değil Don.
4. kalsiyum akı B-hücre aktivasyonu antijenik lipozomlar tarafından izlemek için
- Fareler karbondioksit (CO2) veya isoflurane aşırı doz, kurumsal standart işletim yordamlar göre ötenazi. Ötenazi farelerin tarafından servikal çıkığı onaylayın.
- Cerrahi aletler ve % 70 etanol kullanarak fare leşi sterilize. Kullanım 10 cm uzunluğunda, 0.8 mm uç, göğüs kafesi göğüs boşluğundan kapsayan cilt ayırmak için Iris forseps kavisli. 10 cm uzun, düz makas dissekan ikili bir kesi ile distal bir kesi yapmak için kullanın.
- Eğri Iris forseps ve diseksiyon makası dalak Karın boşluğundan ayıklamak için kullanın. Dalak çevreleyen yağ dokusunda kaldırın ve sonra 15 mL polistren konik tüp dolu RPMI1640 orta içeren % 1 fetal buzağı serum (FCS) ve penisilin-streptomisin içinde yerleştirin.
- Transfer dalak ve medya üzerinden 40 µm hücre süzgeç bir 50 mL konik tüp takılmıştır. Kauçuk sonuna 3 mL şırınga lavabo pompası kullanarak, yavaşça dalak ezmek. 40 µm hücre süzgeç medya ile yıkayın. Sadece yağ dokusu 40 µm hücre süzgeç terk edene kadar bu işlemi yineleyin. 3-5 mL hücre kurtarma artırmak için medya ile elek durulayın.
- Hücre homogenate 300 x g RT., 5 min için de santrifüj kapasitesi Santrifüjü sonra süpernatant atın ve 10 mL 1 x RBC lizis arabellek için Pelet ekleyin. Yukarı ve aşağı pipet, RT, 2-3 dakika için bırakın ve 300 x g RT., 5 min için de santrifüj kapasitesi
- Süpernatant atın ve alyuvar tükenmiş splenocytes 10 mL medya resuspend. Toplam hücre sayıları bir hemasitometre veya aygıt sayma diğer hücre kullanarak belirleyin. Hücreleri tarafından Santrifüjü yukarıda açıklandığı gibi cips.
Not: 10 – 20 x 106 hücre/mL splenocytes ideal son konsantrasyonu Indo-1 yükleme için gerekli olduğunu, ancak düşük yoğunluklu hücre-ebilmek var olmak kullanılmış. - 15 x 106 hücre/mL kalsiyum akı arabellek (%1 FCS, 10 mM 4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic asit (HEPES), 1 mM magnezyum klorür (MgCl2), 1 mM etilen glikol bis (içeren RPMI1640 orta yükleme, splenocytes resuspend β-aminoethyl eter)-N, N, N', N'-tetraacetic asit (EGTA) ve % 5 penisilin-streptomisin). 1,5 µM eklemek Indo-1 ile 1 mM DMSO hisse senedi çözüm, ters çevir'i tüp birkaç kez karıştırmak için. Işıktan korumak ve 37 ° C su banyosu 30 dk için hücreleri kuluçkaya.
- 30 dk kuluçka kalsiyum akı arabellek yükleme miktarı x 5 ekleyin. 7 dk RT. az için 300 x g , santrifüj
- B hücreleri üzerinde geçişi için hücreleri 1: 200 Anti-fare CD5-PE ve anti-fare 1 B220-PE/Cy7: 200 arabellek 20 dk, ışıktan korunan için 4 ° C'de yükleme 0.5 ml leke.
- Splenocytes arabellek ve dik Resuspend hücreleri 10-20 x 106 hücre/mL kalsiyum akı (tuz solüsyonu (HBSS) % 1 FCS, 1 mM MgCl2 ve 1 mM içeren Hank'in dengeli tampon çalıştıran, 7 dk için 300 x g , santrifüj yükleme kalsiyum akı yıkayın Kalsiyum klorür (CaCl2)). Buz üzerinde akış sitometresi üzerinde çalıştırmak için hazır kadar ışıktan korunan saklayın.
-
Akış Sitometresi tazminat günahı ve tek leke denetimleriyle Kur.
- Lekeli hücrelere kapıları uygun şekilde ( Şekil 2Abakınız) kurulum çalıştırın. Indo-1 (menekşe) karşı Indo-1 (mavi) Arsa kurulum, gerilim bir eğim 45-60 sinyal en üst düzeye çıkarmak için ° lik boyama hücreleri yerleştirmek için Indo-1 kanalları ayarlayın: Hint-1 menekşe gürültü oranı: mavi değişim oranı B hücreli stimülasyon takip.
Not: gerilim çok yüksek olmadığından emin olun öyle ki hücreleri önemli bir yüzdesi (> % 5) Arsa top karşı bulunmaktadır. - Üst sol kısmındaki (Violet+mavi-) Arsa, Kapsüller bir çapraz kapısı oluşturmak öyle ki stimülasyon olmadan < hücrelerin % 10 olan ideal için yükseltmeniz gerekir kapısında > stimülasyon sonrasında % 75.
- Lekeli hücrelere kapıları uygun şekilde ( Şekil 2Abakınız) kurulum çalıştırın. Indo-1 (menekşe) karşı Indo-1 (mavi) Arsa kurulum, gerilim bir eğim 45-60 sinyal en üst düzeye çıkarmak için ° lik boyama hücreleri yerleştirmek için Indo-1 kanalları ayarlayın: Hint-1 menekşe gürültü oranı: mavi değişim oranı B hücreli stimülasyon takip.
-
Alt polistren tüp (floresan aktif hücre (FACS) tüp sıralama) yuvarlak bir kaplama 5 mL 0.5 mL hücre eklemek ve 37 ° C 3-5 dk içinde bir su banyosu için hücrelere sıcak. Yeniden dolaşan bir su banyosu bağlı 37 ° C water-jacketed odasında FACS tüpü yerleştirin.
- Tüp çalıştırmak üzerinde akış sitometresi water-jacket ve satın alma, yaklaşık 5.000 – 10.000 olayları/s hızında veri depolamadan işlemini başlatın. Sonra hücreleri (15 – 30 s) stabilize, en az 10 için veri toplama ve toplamak veri başlatmak s arka plan kurmak için.
- 10 s işareti, hızlı bir şekilde akış sitometresi tüpü çıkarması, eklemek stimülasyon (5-50 mM antijenik lipozomlar 2 – 20 ml), darbe girdap ve akış sitometresi üzerine FACS tüp dönmek. Veri toplama ve Depolama Birimi'ni bu sefer korumak ve 3-5 min için veri toplamak.
- Uygun analiz yazılımı kinetik işlevler altında verileri analiz.
5. fıstık özü hazırlanması
- Fıstık proteinler 1 M sodyum klorür (NaCl) 1:5 (wt:vol) oranında fosfat tamponlu tuz (PBS) fıstık unu karıştırılarak ayıklayın. RT 2 h için manyetik heyecan tabakta çözüm pH 8,5 koruyarak karıştırın.
- 3000 x g 4 ° C'de 45 dk santrifüj çözüm Dikkatle boşaltmak ve filtre-süpernatant ardışık olarak 0.2 µm filtre tarafından takip 0.4 µm filtresi ile sterilize. Bicinchoninic asit (BCA) tahlil standart olarak sığır serum albumin (BSA) kullanarak tarafından protein konsantrasyonu belirlemek.
- Azaltmak ve lityum Lauryl sülfat indirgeyici ve 10 dk 70 ° C ısıda maksimal faaliyeti için izin veren bir 8.4, pH içeren arabellekte bir örnek 50 mM dithiothreitol (DTT) ile fıstık protein denatüre.
- 10 µg denatüre fıstık protein bir Bis-Tris 4 – %12 precasted polyacrylamide en iyi ayrılık degrade jel molekül ağırlığı ile önceden standart lekeli vermek için tasarlanmış jel üzerinde çalıştırın.
- Jel ile disulfonated triphenylmethane leke ve GKD2O. büyük fıstık allerjen Ara h 1, 2 ve 3 özü müstahzarları bilinen tespit destain. Ara h 1 63 kDa görünür, Ara h 2 17 ve 19 kDa adlı iki izoformlarının olarak görünmesi gereken ve Ara h 3 37 kDa (asidik alt birim) görünür.
6. fıstık için farelerin Sensitizasyonu
- 1 mg Kolera toksin 1 mL Ultrasaf Su resuspend. 200 seyreltilmiş µL fıstık özü içeren 2 mg fıstık protein ve 10 µg Kolera toksin PBS içinde hazır olun.
- Kolera toksin (2 mg fıstık protein ve 10 µg Kolera toksin) yolu ile oral gavaj her 4-5 hafta eski BalB/cJ dişi fare için içeren fıstık ekstresinin 200 µL yönetmek. Haftada üç hafta (Örneğin, gün 0, 7 ve 14) için bir kez yineleyin.
- Oral gavaj yolu ile 300 seyreltilmiş µL fıstık özü (5 mg fıstık protein ve 10 µg Kolera toksin içeren) her fare için (Yani, gün 21) dördüncü haftasında yönetmek.
7. meydan fareler fıstık özü ile
- 28 günde bir son konsantrasyonu 1 mg/ml PBS içinde fıstık özü hazırlayın. Rektal termometreyi (yaklaşık 37.5 – 38,5 ° C) kullanarak temel vücut sıcaklığı ölçmek. 200 µL (200 µg) mayi (IP) enjeksiyon yolu ile fıstık özü yönetmek.
- Vücut ısısı ile rektal termometreyi enjeksiyon sonra her 15 dk 1 h için ölçmek. Vücut ısısı havuza bir fıstık alerjisi gösterir.
Not: Hipotermi anafilaksi farelerde bir özelliğidir. Bu meydan okuma fareler için fıstık alerjisi olduğunu gösterecektir. Genellikle, sensitizasyon Protokolü geçmesi Balb/cJ fareler % 90'ı tarafından en az 2-3 ° C sıcaklık azalma ile karakterize meydan okuma sırasında alerjik reaksiyonlar geliştirmek.
8. yalıtım Splenocytes Alerjik fareler ve evlat edinen Transfer
-
Splenocytes saf ve fıstık alerjisi fareler yalıtmak.
- 30 günde 3 L/dak CO2 gaz odasında yönetmek olarak saf ve teyit fıstık alerjisi fareler ötenazi. Ötenazi farelerin tarafından ikili torakotomi onaylayın. Cerrahi aletler ve % 70 etanol kullanarak fare leşi sterilize. Forseps göğüs kafesi göğüs boşluğundan kapsayan cilt ayırmak için kullanın. Sol ve sağ kaburga kırılması ikili bir kesi yapmak için düz diseksiyon makası kullanın.
- Forseps ve diseksiyon makası dalak Karın boşluğundan ayıklamak için kullanın. Dalak 10 mL RPMI 1640 orta ile dolu polistren 15 mL konik tüp yerleştirmeden önce çevreleyen yağ dokusunda kaldırın.
- Bir steril laminar akış başlık, dalak ve medya bir 35 mm polistren Petri kabına dökün. Naif ve alerjik splenocytes ayrı Petri yemekler ve medya hücre izolasyon sırasında tutmak. Steril forseps ve diseksiyon makası dalak üç parçalar halinde kesilmiş ve Petri kabına döndürmek için kullanın.
- Beyaz doku slaytlar arasında kalır kadar kaba, buzlu cam kenarına iki cam mikroskop slayt kullanarak, yavaşça dalak parçaları (RPMI) homojenize. Slaytlar gruplar arasında değiştirin.
- Hücre homogenate bir 50 mL konik tüp donatılmış bir 70 µm hücre süzgeç aracılığıyla Petri kabına aktarın. Kalan dalak parçaları 1 mL şırıngadan süzgeç lavabo pompası ile geçer. Elek hücre kurtarma maksimize etmek için RPMI 5 mL ile yıkayın. Filtrate bir polistren 15 mL konik tüp ve santrifüj (450 x g, 10 min, RT) aktarın.
- Süpernatant Aspire edin ve resuspend hücre Pelet 2 mL kırmızı kan hücre lizis arabellek (10 mM Tris tampon pH 7.2 %0,83 amonyum klorür) ekleyin. Mix ve RT 2-3 dk. eklemek 10 mL PBS - %2 FBS ve RT. 7 min için 300 x g , santrifüj için kuluçkaya
- Hücreleri yıkayın tekrar ile 12 mL 2 mL RPMI 1640 orta PBS - %2 tamamen herhangi bir kalıntı amonyum klorür kaldırmak ve vasıl 300 x g RT. yeniden askıya hücre, 7 dk santrifüj kapasitesi FBS cips. Hemasitometre veya otomatik Hematoloji analyzer kullanarak hücreleri saymak.
- 27 G, 5/8-inç iğne 1 mL insülin şırınga üzerinde kullanarak intravenöz enjekte 15 x 106 Alerjik ya da saf splenocytes (içinde 200 µL) yukarıda açıklandığı gibi çıkarılan kuyruk (unsensitized) saf fareler damar yolu ile .
9. Ara h 2 antijenik lipozomlar ile fareler enjeksiyon
- %0,1 Ah2 2.5 mM lipid içeren Ah2 lipozomlar hazırlayın. Protein konsantrasyonu hesaplamak için Ah2 tükenme katsayısı 15.000 M-1olduğunu. Seyreltik lipozomlar 300 µM steril PBS için.
- Bir gün sonra üvey transferi (gün 31) Alerjik ya da saf splenocytes, intravenöz enjekte Ah2 ile kuyruk ven splenocytes adımda aldığınız BALB/cJ farelerin, 1.38 µg toplam içeren 200 µL PBS veya Ah2 antijenik lipozomlar (300 µM) 8.2.
10. destek ve fareler Ara h 2 ile sorun
- İki hafta sonra enjeksiyon ile Ah2 lipozomlar, 45 günde 50-200 µL kan fare kavşak submandibular toplamak için 4 mm hayvan lanset kullanın. Heparin olmadan bir serum ayırıcı tüp kan toplamak; ayrı serum 6.000 x g 15 dakika süreyle de centrifuging tarafından daha sonra üstünde-e doğru ölçü antijen spesifik antikorlar toplanan serum kullanın.
- Fareler lipozomlar (adım 9.2) ile enjekte sonra gün 46, iki hafta, fareler tarafından PBS 200 µL veya çözünür Ah2 (16daha önce açıklandığı gibi saf) 200 µg ı.p. iğne artırmak.
- Günde 60, 50-200 µL kan fare kavşak submandibular toplamak ve daha önce açıklandığı gibi kan işlemek.
- 61 günde 300 µg 200 µL ı.p. enjeksiyonu ile fareler her grup meydan çözünür Ah2. Vücut sıcaklığı ile rektal sonda her 15dk olduğu gibi bölüm 7 ölçmek.
11. miktar Ara h 2 özgü IgE ve Igg1 ELISA tarafından
- Bir 96-şey enzim bağlı immunosorbent assay (ELISA) kat-100 µL ile uyumlu plaka HSA-DNP (2,4-dinitrophenyl hapten konjuge insan serum albümin, 20 µg/mL) standart eğri veya Ah2 için serum numuneleri adımda 10.1 ve 10.3, toplanan için (5 µg/mL) seyreltilmiş gecede 4 ° C veya 37 ° C için kaplama arabellek (50 mM karbonat-bikarbonat tampon, pH 9,6) > 1 h.
- Üç kez ile 200 µL yıkama PBS-T (PBS % 0.05 ile ara-20) ve blok 200 µL PBS-T içeren ile wells için 37 ° C'de % 2 BSA > 2 h.
- Ah2 özgü IgE ELISA için 50 µL IgE-anti-DNP standartlar Ekle (2-0,002 µg/mL, 1:2 seri dilutions hazırlanan) veya fare serum numuneleri (1:20 seyreltme) ve gecede 4 ° C'de kuluçkaya 100 µL saf Igg1-anti-DNP standartları Ah2 özgü Igg1 ELISA için Ekle (2-0,002 µg/mL, 1:2 seri dilutions hazırlanan) veya fare serum numuneleri (1:500 seyreltme) ve gecede 4 ° C veya 1 h 37 ° C'de kuluçkaya
- Üç kez ile 200 µL yıkama PBS-T. Ah2 özgü IgE ELISA için 100 µL eklemek koyun Anti-fare IgE (0,5 µg/mL) ve 1 h için 37 ° C'de kuluçkaya. Ah2 özgü Igg1 ELISA için 100 µL eklemek HRP keçi Anti-fare Igg1 (seyreltilmiş PBS-T - %2 BSA 1:40,000). 1s için 37 ° C'de kuluçkaya.
- Üç kez ile 200 µL yıkama PBS-T. Ah2 özgü IgE ELISA, eklemek için 100 µL biotinylated-eşek Anti-koyun (0,5 µg/mL) IgG ve 45 dk 37 ° C'de kuluçkaya. Ah2 özgü Igg1 ELISA için 11,7 adıma atlayın.
- Üç kez ile 200 µL yıkama PBS-T. Ah2 özgü IgE ELISA için 100 µL yansıtmaya avidin-horseradish peroksidaz (Örneğin, NeutrAvidin-HRP, 0.3 µg/mL) ücret ekleyin ve 30 dk 37 ° C'de kuluçkaya.
- 100 µL 3, 3', 5, 5'-Tetramethylbenzidine (TMB) substrat ekleyin, 10-15 dk kuluçkaya veya örnekleri koyu mavi olana kadar 100 µL TMB durak çözüm ekleyin. 450 de plaka okuma nm.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Konjugasyon protein DSPE-PEG(2000) ile ilgi gösterilen moleküler ağırlık çekimsiz protein göre azalan bakiyeli bir artış çalıştırarak göstermiş olabilir. Şekil 1A Anti-fare IgM F(ab) parçası konjugasyon temsilcisi bir jel PEG-DSPE, 2-3 kDa bandshift denatüre protein için gösterir gösterir. Protein yaklaşık % 50'si değiştirilecek, verilen bu 1:1 stoichiometry ağır ve hafif zincir heterodimerdir olduğunu Fab parçası üzerinde elde hangi beklenen göründüğünü unutmayın. Şekil 1B Ah2 konjugasyon temsilcisi bir jel PEG-DSPE için gösterir. Kalsiyum akı B-hücre değerlendirmek için antijenik lipozomlar tarafından uyarılan çok önemli şeylerdir: (1 araç ayarları Indo-1 floresans Ca2 + oranı bir fark (menekşe) bağlı ve ilişkisiz formları (mavi) ve (2 uygun bir şekilde görmek için ayarlanmış strateji geçişi B-hücre aktivasyonu değerlendirmek için kullanılır. Şekil 2A akış sitometresi tabanlı kalsiyum akı tahlil için gating düzeni gösterir. Canlı lenfositler bir SSC-A karşı FSC-A (sol panelde) geçişli, birini kapı dışarı karşı SSC-W FSC-W Arsa (orta Masası) ve B200+CD5- B-hücreleri CD5-PE vs B220-PE/Cy7 Arsa (doğru kapı aynası) seçilir. Şekil 2B Indo-1 (menekşe) vs Indo-1 (mavi) Floresan analiz gibi zaman içinde oranını gösterir. F(ab) ve F(ab')2 ' de bu deneyleri toplam protein konsantrasyonu, uyarıcı B-hücre aktivasyonu antijenik lipozomlar üstün yetenek gösteren aynı olduğunu unutmayın. Fıstık özü hazırladıktan sonra bir aliquot Ara h 1, 2 ve 3 özü içinde göreli miktarlarını belirlemek için bir SDS-sayfa jel çalıştırın. Şekil 3 saf Ah2 çalıştırıldığı bir fıstık ekstraksiyon temsilcisi bir jel gösterir. Şekil 4 genel olarak evlat edinen fıstık alerjisi fare modeli, fıstık, fıstık, splenocyte yalıtım ve evlat edinen transferi, lipozom enjeksiyonları, meydan için de dahil olmak üzere ilk Sensitizasyonu şematik gösterir kan alımı Ah2 destek tarafından takip ve Ah2 için meydan. Ah2 özgü IgE ve Igg1 ELISAs immünoglobulinler, serumda ölçmek için Şekil 5A ve Bgösterildiği gibi işletilmiştir. Ah2 ile artırdığını fareler haiz hassasiyetle Ah2 özgü IgE ve Igg1 onların serumu vardır. Vücut sıcaklığı Ah2 meydan okuma sırasında kaydedilen Şekil 5Ciçinde gösterilir; Alerjik fareler vücut sıcaklığı vücut sıcaklığı saf farelerde tutarlı kaldı meydan takip azalma. Fotoğraflar fıstık alerjisi fareler için meydan okuma sırasında göre saf fareler gösteren Şekil 6' da gösterilmiştir.
Şekil 1: PEG-DSPE için anti-fare IgM F(ab) ve Ah2 konjugasyon temsilcisi jöleyi. (A, B) SDS-sayfa analizi(a)keçi Anti-fare IgM F(ab) parça ve (B) Ah2 öncesi ve sonrası konjugasyon PEG-DSPE için. Keçi Anti-fare IgM ve Ah2 sırasıyla yaklaşık 48 ve 18 kDa, moleküler ağırlıkları var. Değişiklik, bir biraz daha büyük molekül ağırlığı (~2.5 kDa) her iki proteinler için açıkça görülmektedir. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Şekil 2: temsilcisi strateji, kalsiyum akı sonuçları ve analiz geçişi. (A)hücreleri aşağıdaki gating stratejisi analiz: canlı lenfositler (FSC-A vs SSC-A), (FSC-W vs SSC-W) tek hücre ve B-hücre (B220+CD5-). (B) Indo-1/Ca2 + akı yanıt (menekşe vs mavi) B-hücre. Anti-IgM Fab parçası lipozomlar ve anti-IgM F(ab')2 aynı protein konsantrasyonu (2,5 µg/mL) için kalsiyum akı arabellek teşvik hücreleri yanı sıra bir denetim olarak gösterilir. 10-22 s uyarımı eklenir ve bu nedenle, herhangi bir veri bu dönemde kazanılır zaman olduğuna dikkat edin. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Şekil 3: fıstık özü ve Ah2 gösterilen temsilcisi jel. Fıstık özü alerjenler Ara h 1, 2, 3 ve 6, Ah2 için görünür iki izoformlarının göre de dahil olmak üzere çeşitli protein içerir. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Şekil 4: şematik evlat edinen Aktarım Protokolü'nün. Saf BALB/cJ fareler fıstık özü (PN) ve kolera toksin (CT) sensitize ve daha sonra PN için meydan. Splenocytes teyit Alerjik fareler gelen izole ve saf fareler transfer edildi. Fareler daha sonra immünojenik Ara h 2 lipozomlar veya PBS ile astarlanmalıdır sonra çözünür Ah2 ile artırdı. Son olarak, fareler Ah2 ile anafilaksi izlemek için meydan. Kan 45 ve 60 gün toplanan Ah2 özgü immünglobulin ölçmek için kullanılmıştır. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Şekil 5: immünojenik Ara h 2 lipozom artırır doğan-bellek Alerjik yanıt. Serum olduğunu izole öncesi (gün 45) ve PBS veya 300 µM immünojenik Ah2 lipozom 200 µL Ah2-sepcific IgE(a)ölçmek için ile yazı (60 gün) artırmak ve Igg1 (B). Bireysel fareler medians gösteren çizgilerle gösterilir. Alerjik splenocytes alınan ve fareler Ah2 lipozomlar gün 32 anlamlı olarak daha yüksek düzeyde Ah2 özgü IgE ve Igg1 vardı yönetilen. Anafilaksi Ah2challenge sonra vücut sıcaklığı kaydederek farklı tedavi gruplarında ölçülen (C). Vücut sıcaklığı ile SEM saf tasvir demek: PBS (saf splenocytes ve PBS Başbakan), allerjik: PBS (teyit Alerjik splenocytes ve PBS Başbakan), allerjik: Ah2 (alerjik splenocytes ve Ah2immunogenic lipozom Başbakan teyit). * P < 0,05, ** P < 0,01, *** P < 0,001, *** P < 0,0001 tarafından belirlenen unpaired 2 kuyruklu öğrenci t-test. Bu sonuçlar iki bağımsız deney temsilcisi olduğunu unutmayın. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Şekil 6: anafilaktik semptomlar Ah2 meydan okuma sırasında gözlenen. Saf fareler etkin devam ve pembe ten (A, C) ayağa gerekir. Alerjik fare aktivite düştü, kez kamburlaşmış, nefes çok çalışan ve siyanoz, (B, D) kendi ayakları üzerinde daha koyu mor cilt tarafından belirtilen deneyim. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
| MW | 790 | 387 | 2900 | 3000 | 48000 | |
| DSPC | Kolesterol | PEG-DSPE | aşırı PEG-DSPE | bir IgM-PEG-DSPE | TOPLAM | |
| Molar oranı | 57 | 38 | 3.9 | 1 | 2.s | 100,00 |
| kütle (mg) | 0.56 | 0.18 | 0,14 | 0,04 | 0,06 | 0,98 |
| m mol | 0.71 | 0,47 | 0,05 | 0,01 | 0,00 | 1,25 |
| mL | 112.50 | 45.93 | 70.64 | 0,00 | 525.97 | 755.03 |
| Konsantrasyonlu (mg/mL) | ||||||
| DSPC | 5 | |||||
| Kolesterol | 4 | |||||
| PEG-DSPE | 2 | |||||
| bir IgM-PEG-DSPE | 0.114 |
Tablo 1: 1,25 µM toplam lipid konsantrasyon lipozom oluşturmak için hesaplamalar. Keçi Anti-fare IgM F(ab) parçası lipozomlar için hesaplama tablosu örneği.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Burada özetlenen bir protein için protein liposomal nano tanecikleri üzerinde görüntülenmesini sağlayan bir lipid konjugasyon için genel bir iletişim kuralı yöntemlerdir. Çok büyük çok alt birim proteinler için bu protokolü yardımcı programını sınırlı olabilir. İdeal Yöntem bir biorthogonal kimyasal bağlanma strateji kullanılmak üzere sağlayan bir siteye özgü etiket getirilmesi olacaktır. Protein recombinantly ifade, bu mevcut siteye özgü stratejileri17ve fonksiyonel grupların geniş bir dizi ticari olarak kullanılabilir durumdaki pegile lipid sonunda kullanarak mümkün olabilir. Buna göre bu iletişim kuralını doğal kaynaklardan izole protein bağlama doğru dişli ve çeşitli bilim adamları değil mutlaka bildik ile kimyasal ve biyokimyasal dönüştürmeleri için erişilemez.
Vurguladı için gereken bir kalsiyum akı deneme gerçekleştirme bir anahtar hücreleri üzerinde akış sitometresi çalıştırmadan önce etkinleştirilmesini değil yönüdür. Steril tekniği titizlikle kullanılmazsa, bu yüksek arka plan sinyal için aktif hücrelerden (kendi emisyon menekşe kanaldaki doğru eğilmiş Indo-1 floresan) sorumlu. Benzer şekilde, hücre arka plan sinyal Indo-1 kanallarında anormal düzeyde önlemek için tahlil çalıştırmadan önce buz üzerinde tutulmalıdır. Hücreleri tarafından akış sitometresi ve stimülasyon sırasında veri toplama boyunca alınıyor önce 2-3 dk sıcak emin olmak önemlidir. Hücreleri veri toplama sırasında 37 ° C'de korunmaz, hücreleri sonuna kadar yanıtlamaz beklenebilir. Antijen spesifik B-hücreleri çok küçük sayılar, farelerde mevcut olduğundan, fareler tüm B-hücreleri uyarmak için bir vekil antijen kullanarak idealdir. Çok sayıda transgenik fare suşların mevcut olmasına rağmen antijen spesifik B-hücreleri express, bu teknik amacı antijenik lipozomlar vahşi tipi fare kullanarak yapmak için yeteneklerini doğrulamak ortalama kullanıcı sağlamaktır. Bu amacı gerçekleştirmek için anti-fare IgM Fab parçaları lipidler için bağlı ve poliklonal moda B hücre reseptörü (BCR) bölünmelerini antijenik lipozomlar içine formüle. Bu daha önce bu yöntemi kullanarak önemli miktarda erişmek mümkün değildir çünkü önemli olan uygun anti-insan IgM Fab parçası insan B-hücreleri10 uyarmak için kullanılabilir gösterilmiştir çekicidir antijen spesifik insan B-hücreleri. Bu çalışmalarda, B-hücre aktivasyonu uyarmak için antijenik lipozomlar potens karşılaştırıldığında Anti-fare IgM F(ab') 2 parçaları eşit miktarda kalsiyum akı ikna etmek için gelişmiş yeteneklerini tarafından betimlenir.
Antijenik lipozomlar kullanımı BALB/cJ fareler fıstık için duyarlılığı, splenocytes alerjisi fareler saf fareler aktarılması, ana bilgisayar fare Ah2 lipozomlar ile enjekte ve onları Ah2 ile zorlu bir yöntem geliştirilmesini sağladı. Antikor düzeyleri ve farelerin grupları içinde anafilaktik yanıt bu modelde tekrarlanabilir. Köklü olmuştur bellek B ve T hücreli yanıtları fıstık özel antikorlar farelerde gelişiminde önemlidir. Ayrıca, yeni yapılan bir çalışmada bu bellek göstermiştir B-hücreleri yeniden doldurmanız plazma hücrelerinin antijen spesifik IgE düzeyleri; korumak farelerde Bu nedenle alerjen özel bellek B-hücreleri terapötik müdahale18için cazip bir hedef vardır. Şimdi burada açıklanan model doğrudan hedef Ah2 özel bellek B hücreleri, aksine tüm plazma hücre repertuar19tüketmek için bortezomib kullanarak immünsüpresif bir yaklaşım için bir fırsat verir. Alerjiler savaşmak için başka bir yaklaşım hoşgörü içinde T-hücre bölme teşvik etmektir. Bir potansiyel tolerans-inducing adjuvan lipozom içinde kapsüllemek için stratejisidir. Daha önce rapamycin Kapsüllenen nano tanecikleri Tregs neden ve otoimmün hastalık20azaltmak için kullanılmıştır. Bu tür bir yaklaşım fıstık alerjisi tedavisi için tolerogenic tedaviler geliştirmek için istihdam olabilir. Genel olarak, özel bağışıklık yanıtı için yüzey molekülleri conjugating tarafından alerjen özgü lipozom manipülasyon sağlar ve uyuşturucu gibi moleküller Kapsüllenen alerjen özel hücre için ilaç teslim sağlar.
Fıstık alerjisi bu fare modeli genel sınırlamalar bu Sensitizasyonu Kolera toksin ile fıstık için ve ı.p. enjeksiyon yolu ile sonraki fıstık meydan tamamen (Örneğin, insanlar sahip insanlarda fıstık alerjisi temsilcisi değildir tepkiler üzerine oral alımından). Ancak, bu anti model alan11,18,21geçerli standart 's ve alerjik hastalık moleküler mekanizmaları araştırmak ve yeni tedavi yaklaşımları geliştirmek için bize izin verir. Bu geleneksel yaklaşımlar karşılaştırıldığında, bu üvey transfer modeli üç birincil avantajı sağlar. İlk bellek B ve T-hücreleri daha doğrudan belirlenmesi için allerjen belirli sağlar olduğunu. Gerçekten de, kanıt şimdi güçlü bellek B-hücreleri uzun vadeli alerji18ana kaynağı olarak implicates. İkinci olarak, aynı sayı, bellek B ve T-hücreleri alıcı her fare implante edilir çünkü Alerjik yanıt en az değişkendir. Üçüncü olarak, bu model yeni immunotherapies test bağlamında yararlı olduğu bireysel alerjenler, Alerjik yanıt çalışma fırsatı sağlar. Bu modelin bir ilginç uygulama nerede Alerjik yanıt aşılı modelleri22incelenmiştir bir insanlaşmış fare modeli bağlamında genel yaklaşım kullanmaktır. Bir evlat edinen transfer model kapsamında uygulanan, insanlaşmış fare modeli güçlü olabilir yaklaşım genişletilmesi ve in vivo , B ve T-hücreleri Alerjik hastalardan sınama.
Antikor hastalık patogenezinde sadece Alerjik modellerinde oluşmaz, ama aynı zamanda otoimmün hastalıklar23içinde B-hücre aracılı. Adoptively duyarlilasmis splenocytes bir autoantigen verilen fareler aktarma sonuçta kullanılan hayvan sayısını düşürerek çok yararlı, birden çok adjuvan enjeksiyonlari alma hayvan sayısını en aza indirmek ve tekrarlanabilirlik, artırmak Yanıt arasında birden çok hastalık göstergeler fareler tabur. Bir örnek olacak Miyasteni gravis (EAMG) deneysel bir otoimmün modeli hangi duyarlı fare suşları (C57BL/6, SJL ve AKR) birden çok kez asetilkolin reseptörü (AChR) ile adjuvan patojenik otoantikorlar geliştirmek için aşı. Bu otoantikorlar sonuçta immunopathological özellikleri kas yorgunluk/halsizlik, immünglobulin ve kompleman nöromüsküler kavşak üzerinde para yatırma gibi insanlarda ve ağır vakalarda morbidite/ölüm24yol. EAMG içinde hastalık insidansı yaygın 50 – %70 arasında bu değişkenliği için hesap için büyük hayvan tabur istatistiksel anlamlılık25,26ulaşmak için gerekli böylece, değişir. Burada açıklanan yöntemi sonuçta hastalığı insidansı değişkenliğin azaltarak kullanılan hayvan sayısını azaltacaktır. Daha önce belirtildiği gibi EAMG AChR + adjuvan (tam Freund'ın adjuvan ve eksik Freund'ın adjuvan) ile birden çok enjeksiyonları tarafından indüklenen tetikleyici otomatik-antikor yanıt-e doğru. Bu yöntem birden çok almak hayvan sayısını azaltmak adjuvan ile enjekte eder. Son olarak, birden fazla aşı ve artırır doğası nedeniyle, koruyucu ve tedavi edici tedaviler için uygun tedavi windows tanımlamak oldukça zordur. Bu yöntem daha öngörülebilir yapma antikor yanıt ve hastalık patogenezinde penceresinin, senkronize yardımcı olacağını ve tekrarlanabilir. Aynı mantık antikor aracılı otoimmün hastalıklar, romatoid artrit27gibi birçok diğer fare modelleri için uygulanabilir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarlar ifşa gerek yok.
Acknowledgments
Bu araştırma hibe (W81XWH-16-1-0302 ve W81XWH-16-1-0303) Savunma Bakanlığı tarafından desteklenmiştir.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Model 2110 Fraction Collector | BioRad | 7318122 | |
| Cholestrol | Sigma | C8667 | Sigma grade 99% |
| SPDP | Thermo Fisher Scientific | 21857 | |
| DSPC | Avanti | 850365 | |
| DSPE-PEG 18:0 | Avanti | 880120 | |
| DSPE-PEG Maleimide | Avanti | 880126 | |
| Extruder | Avanti | 610000 | 1 mL syringe with holder/heating block |
| Filters 0.1 µm | Avanti | 610005 | |
| Filters 0.8 µm | Avanti | 610009 | |
| 10 mm Filter Supports | Avanti | 6100014 | |
| Glass Round Bottom Flask | Sigma | Z100633 | |
| Turnover stoppers | Thermo Fisher Scientific | P-301398 | |
| Tubing | Thermo Fisher Scientific | P-198194 | |
| Leur Lock | Thermo Fisher Scientific | k4201634503 | |
| Sephadex G50 Beads | GE Life Sciences | 17004201 | |
| Sephadex G100 Beads | GE Life Sciences | 17006001 | |
| Heat Inactivated Fetal Calf Serum | Thermo Fisher Scientific | 10082147 | |
| HEPES (1 M) | Thermo Fisher Scientific | 15630080 | |
| EGTA | Sigma | E3889 | |
| Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL) | Thermo Fisher Scientific | 15140122 | |
| 1x RBC lysis Buffer | Thermo Fisher Scientific | 00-4333-57 | |
| Indo-1 | Invitrogen | I1203 | |
| CD5-PE | BioLegend | 100608 | |
| B220-PE-Cy7 | BioLegend | 103222 | |
| HBSS | Thermo Fisher Scientific | 14170112 | without calcium and magnesium |
| MgCl2 | Sigma | M8266 | |
| CaCl2 | Sigma | C4901 | |
| Fab anti-mouse IgM | Jackson ImmunoResearch | 115-007-020 | |
| F(ab')2 anti-mouse IgM | Jackson ImmunoResearch | 115-006-020 | |
| Peanut flour | Golden Peanut Co. | 521271 | 12% fat light roast, 50% protein |
| Animal feeding needles | Cadence Science | 7920 | 22g x 1.5", 1.25 mm - straight |
| Microprobe thermometer | Physitemp | BAT-12 | |
| Rectal probe for mice | Physitemp | Ret-3 | |
| Cholera toxin, from Vibrio cholera | List Biological Laboratories, Inc. | 100B | Azide free |
| BCA Protein Assay Kit | Pierce | 23225 | |
| Carbonate-bicarbonate buffer | Sigma | C3041 | |
| TMB Stop Solution | KPL | 50-85-06 | |
| SureBlue TMB Microwell Peroxidase Substrate | KPL | 5120-0077 | |
| 96 well Immulon 4HBX plate | Thermo Scientific | 3855 | |
| Purified soluble Ara h 2 | N/A | N/A | purified as in: Sen, et al., 2002, Journal of Immunology |
| HSA-DNP | Sigma | A-6661 | |
| Mouse IgE anti-DNP | Accurate Chemical | BYA60251 | |
| Sheep anti-Mouse IgE | The Binding Site | PC284 | |
| Biotinylated Donkey anti-Sheep IgG | Accurate Chemical | JNS065003 | |
| NeutrAvidin Protein, HRP | ThermoFisher Scientific | 31001 | |
| Mouse IgG1 anti-DNP | Accurate Chemical | MADNP105 | |
| HRP Goat anti-mouse IgG1 | Southern Biotech | 1070-05 | |
| 1 mL Insulin Syringes | BD | 329412 | U-100 Insulin, 0.40 mm (27 G) x 16.0 mm (5/8") |
| Superfrost Microscope Slides | Fisher Scientific | 12-550-14 | 25 mm x 75 mm x 1.0 mm |
| ACK Lysing Buffer | gibco by Life Technologies | A10492-01 | 100 mL |
| RPMI 1640 Medium | Thermo Fisher Scientific | 11875093 | 500 mL |
| Cell Strainer | Corning | 352350 | 70 μm Nylon, White, Sterile, Individually packaged |
| NuPAGE 4-12% Bis-Tris Protein Gels | Invitrogen | NP0322BOX | 10 gels |
| NuPAGE LDS buffer, 4x | Invitrogen | NP0008 | 250 mL |
| SeeBlue Plus2 Pre-stained standard | Invitrogen | LC5925 | 500 µL |
| NuPAGE MES/SDS running buffer, 20x | Invitrogen | NP0002 | 500 mL |
| GelCode Blue Stain | Thermo Scientific | 24590 | 500 mL |
References
- Gupta, R. S., et al. The prevalence, severity, and distribution of childhood food allergy in the United States. Pediatrics. 128 (1), e9-e17 (2011).
- Sicherer, S. H., Munoz-Furlong, A., Godbold, J. H., Sampson, H. A. US prevalence of self-reported peanut, tree nut, and sesame allergy: 11-year follow-up. Journal of Allergy and Clinical Immunology. 125 (6), 1322-1326 (2010).
- Kim, E. H., et al. Sublingual immunotherapy for peanut allergy: clinical and immunologic evidence of desensitization. Journal of Allergy Clinical Immunology. 127 (3), 640-646 (2011).
- Vickery, B. P., et al. Sustained unresponsiveness to peanut in subjects who have completed peanut oral immunotherapy. Journal of Allergy and Clinical Immunology. 133 (2), 468 (2014).
- Jones, S. M., et al. Epicutaneous immunotherapy for the treatment of peanut allergy in children and young adults. Journal of Allergy and Clinical Immunology. 139 (4), 1242 (2017).
- Varshney, P., et al. A randomized controlled study of peanut oral immunotherapy: clinical desensitization and modulation of the allergic response. Journal of Allergy Clinical Immunology. 127 (3), 654-660 (2011).
- Anagnostou, K., et al. Assessing the efficacy of oral immunotherapy for the desensitisation of peanut allergy in children (STOP II): a phase 2 randomised controlled trial. Lancet. 383 (9925), 1297-1304 (2014).
- Sampson, H. A., et al. Effect of Varying Doses of Epicutaneous Immunotherapy vs Placebo on Reaction to Peanut Protein Exposure Among Patients With Peanut Sensitivity: A Randomized Clinical Trial. The Journal of the American Medical Association. 318 (18), 1798-1809 (2017).
- Bednar, K. J., et al. Human CD22 Inhibits Murine B Cell Receptor Activation in a Human CD22 Transgenic Mouse Model. Journal Immunology. 199 (9), 3116-3128 (2017).
- Macauley, M. S., et al. Antigenic liposomes displaying CD22 ligands induce antigen-specific B cell apoptosis. Journal Clinical Investigation. 123 (7), 3074-3083 (2013).
- Orgel, K. A., et al. Exploiting CD22 on antigen-specific B cells to prevent allergy to the major peanut allergen Ara h 2. Journal Allergy Clinical Immunology. 139 (1), 366-369 (2017).
- Smarr, C. B., Hsu, C. L., Byrne, A. J., Miller, S. D., Bryce, P. J. Antigen-fixed leukocytes tolerize Th2 responses in mouse models of allergy. Journal of Immunology. 187 (10), 5090-5098 (2011).
- Kulis, M., et al. The 2S albumin allergens of Arachis hypogaea, Ara h 2 and Ara h 6, are the major elicitors of anaphylaxis and can effectively desensitize peanut-allergic mice. Clinical and Experimental Allergy. 42 (2), 326-336 (2012).
- Dang, T. D., et al. Increasing the accuracy of peanut allergy diagnosis by using Ara h 2. Journal of Allergy Clinical Immunology. 129 (4), 1056-1063 (2012).
- Loughrey, H. C., Choi, L. S., Cullis, P. R., Bally, M. B. Optimized procedures for the coupling of proteins to liposomes. Journal Immunological Methods. 132 (1), 25-35 (1990).
- Sen, M., et al. Protein structure plays a critical role in peanut allergen stability and may determine immunodominant IgE-binding epitopes. Journal of Immunology. 169 (2), 882-887 (2002).
- Krall, N., da Cruz, F. P., Boutureira, O., Bernardes, G. J. Site-selective protein-modification chemistry for basic biology and drug development. Nature Chemistry. 8 (2), 103-113 (2016).
- Jimenez-Saiz, R., et al. Lifelong memory responses perpetuate humoral TH2 immunity and anaphylaxis in food allergy. Journal Allergy and Clinical Immunology. 140 (6), 1604-1615 (2017).
- Moutsoglou, D. M., Dreskin, S. C. Prolonged Treatment of Peanut-Allergic Mice with Bortezomib Significantly Reduces Serum Anti-Peanut IgE but Does Not Affect Allergic Symptoms. International Archives of Allergy and Immunology. 170 (4), 257-261 (2016).
- LaMothe, R. A., et al. Tolerogenic Nanoparticles Induce Antigen-Specific Regulatory T Cells and Provide Therapeutic Efficacy and Transferrable Tolerance against Experimental Autoimmune Encephalomyelitis. Frontiers in Immunology. 9, 281 (2018).
- Srivastava, K. D., et al. Investigation of peanut oral immunotherapy with CpG/peanut nanoparticles in a murine model of peanut allergy. J Allergy Clin Immunol. 138 (2), 536-543 (2016).
- Bellinghausen, I., Saloga, J. Analysis of allergic immune responses in humanized mice. Cellular Immunology. 308, 7-12 (2016).
- Pillai, S., Mattoo, H., Cariappa, A. B cells and autoimmunity. Curr Opin Immunol. 23 (6), 721-731 (2011).
- Mantegazza, R., Cordiglieri, C., Consonni, A., Baggi, F. Animal models of myasthenia gravis: utility and limitations. International Journal of General Medicine. 9, 53-64 (2016).
- Berman, P. W., Patrick, J. Experimental myasthenia gravis. A murine system. J Exp Med. 151 (1), 204-223 (1980).
- Berman, P. W., Patrick, J. Linkage between the frequency of muscular weakness and loci that regulate immune responsiveness in murine experimental myasthenia gravis. J Exp Med. 152 (3), 507-520 (1980).
- Derksen, V., Huizinga, T. W. J., van der Woude, D. The role of autoantibodies in the pathophysiology of rheumatoid arthritis. Seminars in Immunopathology. 39 (4), 437-446 (2017).
