Summary
Beskrevet er forberedelsen af antigene liposomal nanopartikler og deres anvendelse i stimulerende B-celle aktivering i in vitro og i vivo. Sammenhængende og robust antistof svar førte til udviklingen af en ny jordnøddeallergi model. Protokol til at generere antigene Liposomer kan udvides til at omfatte forskellige antigener og immunisering modeller.
Abstract
Antistof svar give kritisk beskyttende immunitet til en bred vifte af patogener. Der er stadig en stor interesse i at skabe robuste antistoffer for vaccination samt forstå hvordan patogene antistof reaktioner udvikle allergi og autoimmune sygdom. Generere robust antigen-specifikke antistof svar er ikke altid trivielt. I musemodeller kræver det ofte flere runder af vaccinationer med adjuvans, der fører til en stor variation i niveauer af inducerede antistoffer. Et eksempel er musemodeller af jordnøddeallergi hvor mere robust og reproducerbare modeller, der minimerer mus numre og brug af adjuvans ville være gavnligt. Præsenteres her er en yderst reproducerbare musemodel af jordnøddeallergi anafylaksi. Denne nye model bygger på to centrale faktorer: (1) antigen-specifikke splenocytes adoptively overføres fra en peanut-sensibiliseret mus til en naiv modtager mus, normalisere antallet af antigen-specifikke hukommelse B - og T-celler på tværs af en lang række mus; og (2) recipient mus er efterfølgende boostet med en stærk multivalent immunogenerne i form af liposomal nanopartikler viser den største peanut allergen (Ara h 2). Den største fordel ved denne model er dens reproducerbarhed, som i sidste ende sænker antallet af dyr, der anvendes i hver undersøgelse, og minimere antallet af dyr modtager flere injektioner af adjuvans. Modulære samling af disse immunogen Liposomer giver relativt letkøbt tilpasningsevne til andre allergisk eller autoimmun modeller, der involverer patogene antistoffer.
Introduction
Fødevareallergi rammer 8% af børn i USA, og er steget i prævalens i løbet af sidste ti år1. Allergi over for peanut påvirker 1% af børn og er ikke typisk forvokset2. Selv om flere lovende kliniske forsøg er på vej til behandling af fødevareallergi, herunder mundtlige immunterapi (OIT), sublingual immunterapi (SLIT) og epicutaneous immunterapi (EPIT), er der i øjeblikket ingen FDA-godkendt behandling strategier for desensibilisering peanut-allergiske personer3,4,5,6,7,8. Allergisk individer må derfor strengt undgå allergener for at undgå anafylaksi. Mange spørgsmål er fortsat med hensyn til ruter for overfølsomhed og underliggende mekanismer af mad allergi udvikling.
Musemodeller er et værdifuldt redskab til at studere mekanismerne af allergi samt udvikling af nye tolerogenic og desensibilisering terapier9,10,11,12. Dette gælder især fordi den største peanut allergen (Ara h 2; Ah2) i mennesker er også den dominerende allergen i flere beskrevet mus modeller13,14. Mens musemodeller af jordnøddeallergi er uvurderlige i at studere mekanismer af overfølsomhed og tolerance, er en ulempe, at de kan være variabel og kræver brug af adjuvans. Mere potent immunogens ville være en måde at minimere den iboende variation af sådanne modeller. Da B-celler er stærkt aktiveret af multivalent antigener, er antigene Liposomer vise allergen en god mulighed på grund af deres evne til potentielt aktivere B-celler gennem B-celle receptoren (BCR), mens også har ejendom effektivt priming af T-celle rum gennem taget op ikke-specifikt af antigen-præsenterer celler.
Her beskriver vi en detaljeret protokol for de tråddannende protein antigener til liposomal nanopartikler ved hjælp af en letkøbt og modulære strategi. Ved hjælp af et surrogat antigen, anti-IgM Fab fragmentet, vi viser, hvordan potent sådan antigene Liposomer kan være stimulerende B-celle aktivering. Antigene Liposomer vise Ah2 antigen blev brugt til at udvikle en ny musemodel konfererede følsomhed. I denne model overføres splenocytes fra verificerede peanut allergisk mus, der indeholder peanut-specifikke hukommelse B - og T-celler, til naive congenic mus. Hukommelse antistof svar er fremkaldt ved injektion af Liposomer konjugeret med Ah2 til de modtagende mus, for at inducere antistoffer mod Ah2. Efterfulgt af kun én løft med opløselig Ah2, give Ah2-specifikke antistoffer anledning til en stærk anafylaktisk reaktion, når disse mus er efterfølgende udfordret med Ah2. Som mus gennemgår den allergiske reaktion reagere meget ensartet og ikke har modtaget en adjuvans, denne tilgang er en ønskelig jordnøddeallergi model, og resultaterne tyder på, at det kan have nytte i andre musemodeller drevet af antigener rettet mod allergener og eventuelt autoantigens.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Den generelle metode for koblingen protein til lipid og indarbejde i Liposomer er hovedsageligt baseret på tidligere arbejde15. Alle dyr procedurer beskrevet nedenfor er blevet godkendt ved University of North Carolina i Chapel Hill institutionelle Animal Care og brug udvalg (IACUC). Alle musene brugt i modellen jordnøddeallergi er BALB/cJ hunner købt fra 3 uger gamle. University of Alberta dyrs pleje og bruge udvalg (ACUC) har godkendt eksperimenter, der involverer brug af musen milt for ex vivo analyse fra C57Bl/6 mus på mindst 6 uger gammel.
1. konjugation af Protein antigener til pegyleret Lipid
- Tilføje 3 g af krydsbundet dextran gel perler med en fraktionering vifte af 1.500 – 30.000 dalton (Da) til en 250 mL sugekolbe. Tilføj 60 mL af fosfatbufferet saltopløsning (PBS) og løbende rør med en magnetisk røre bar. Forsegle kolben og tillægger en vakuum til at indlede de gasning på en røre pladen for et minimum af 1 h.
- I en 1,0 cm x 30 cm glas kromatografi kolonne med omsætning proppen lukket, skal du tilføje PBS til kolonnen til at vaske. Åbn omsætning prop og afløb kolonnen. Efter vask, tilføje gylle af de gasset perler til kolonnen. Løbende tilføje gylle, indtil kolonnen er pakket til en perle højde af ca. 24 cm.
- Når kolonnen har en 'hoved' af ca 4-5 cm af PBS over pakket perlerne, har følgende trin klar.
- Oprette en tyngdekraft flow sifon ved at måle et stykke slange længe nok til at nå en hylde 1 – 2 fod over toppen af kolonnen og oprette en løkke, der falder nær bunden af kolonnen og vender tilbage til toppen af kolonnen. Tilføje en omsætning prop til den ene ende af slangen, forlader én side af slangen open. Placer åbent rør ende i en 500 mL flaske af PBS og sted på hylden over kolonnen.
- Tag udgangen med omsætning prop og vedhæfte en 10 mL sprøjte. Åbne omsætning prop ventilen på slangen linje og trække PBS gennem røret. Når PBS har nået tre fjerdedele af vejen igennem slangen, hurtigt at fjerne sprøjten og tilføje omsætning prop til toppen af kolonnen — væske skal køre på kolonnen.
Bemærk: Mængden af 'hoved' PBS tilbage på toppen af kolonnen skal være mellem 1 og 3 cm. Den minimale beløb at vaske kolonnen er 3 kolonne diskenheder.
- Bestemme mængden af protein (mol) at være forbundet med lipid baseret på dens molekylvægt (MW).
Bemærk: Fab fragmentet af ged anti-mus IgM (selv en IgG) bruges her som en universel surrogat antigen for polyklonale stimulation af B-celler. I overensstemmelse hermed, Fab fragmentet af ged IgG har en MW af cirka 48 kiloDalton (kDa) og er kommercielt tilgængelige i en samlet mængde på 1,3 mg. Således er mængden af protein skal knyttes 27,1 µmol. - Bestemme extinction koefficient af protein af interesse. Hvis ukendt, måle protein absorbans ved 280 nm med et spektrofotometer og kløft A280 værdi af antallet af modermærker beregnet i trin 1.4.
Bemærk: Extinction koefficient af Fab af ged IgG på 280 nm er 64,600 M-1. - At sikre at spore mængder af amin-holdige buffer er fjernet, desalt protein på kolonnen oprettet i trin 1.1-1.3 og indsamle protein fraktioner i 1,5 mL microcentrifuge rør (~ 500 µL pr. brøkdel).
- Luk omsætning proppen ventil forbundet til toppen af kolonnen og fjerne toppen af kolonnen. Hvis ikke allerede åbne, åbne omsætning proppen ventil i bunden af kolonnen og vente, indtil lederen af PBS rammer toppen af perlerne.
- Langsomt tilføje i protein af interesse til toppen af perlerne ved hjælp af et glas Pasteur pipette, være omhyggelig med at minimere forstyrrelser til toppen af perlerne.
- Når lederen af protein løsning har nået toppen af perlerne, tilsættes 1 mL PBS forsigtigt via Pasteur pipette. Gentag tre gange. Tilføje PBS for at oprette et hoved af 4 – 5 cm og Gentag trin 1.3 at vaske kolonnen.
Bemærk: Dette trin kan hoppet, hvis at ingen Amin-holdige buffer er til stede.
- Bestemme de fraktioner, der indeholder protein ved at måle A280 værdier og samle de fraktioner, der giver ca 90% genanvendelse af proteinet.
Bemærk: Dette typisk udvander protein 1,5-2-fold. Bestemme proteinkoncentration efter sammenlægning. Koncentrere protein på dette trin, hvis det er nødvendigt, ved hjælp af en centrifugering koncentrator. - Tilføje 2,5 kindtand svarer til heterobifunctional crosslinker til protein.
- Først, vejer ca 5 mg af succinimidyl 3-(2-pyridyldithio) propionat (SPDP, MW = 314 g/mol) ind i et microcentrifuge rør. For at bestemme lydstyrken til at opløse SPDP, tage den molære proteinkoncentration og ganger det med 250 x til at generere en 100 x løsning, der vil give en 2,5 kindtand overskud i reaktionen.
Bemærk: For eksempel, hvis proteinkoncentration er 50 µM, en løsning af SPDP på 12,5 mM er nødvendig. For 5 mg af SPDP svarer dette til 1,27 mL af dimethylsulfoxid (DMSO).
- Først, vejer ca 5 mg af succinimidyl 3-(2-pyridyldithio) propionat (SPDP, MW = 314 g/mol) ind i et microcentrifuge rør. For at bestemme lydstyrken til at opløse SPDP, tage den molære proteinkoncentration og ganger det med 250 x til at generere en 100 x løsning, der vil give en 2,5 kindtand overskud i reaktionen.
- Føje SPDP til protein af interesse ved 1: 100. Placer reaktionen på en oscillerende shaker ved stuetemperatur (RT) for ca. 1 h.
- At fjerne overskydende SPDP og beskytte endogene disulfid bond(s) i protein taktfast efterfølgende reduktion, Reagensglasset og vaske kolonnen oprettet i trin 1.1-1.3 i 100 mM natriumacetat (NaOAc) pH-værdi 5.5 eller oprette en identisk kolonne udelukkende til brug i denne buffer.
- Efter 1 h inkubation med SPDP, desalt protein på kolonnen ekvilibreres i 100 mM NaOAc. Udføre dette trin på samme måde som skridt 1,6 undtagen ved hjælp af 100 mM NaOAc (pH 5,5) som elueringsvæsken. Indsamle fraktioner, bestemme A280, og samle de øverste fraktioner. Kolonnen udvaskes i PBS.
- Der fremstilles en opløsning af 2,5 M af DTT (MW = 154 g/mol) i dobbelt destilleret vand (ddH2O). Oveni de poolede fraktioner af protein i 5-10 min. 25 mM DTT.
- Måle A280 af protein og deler dette med koefficienten, extinction. Også fastlægge A343. Beregne forbinder forholdet baseret på molariteten af protein (en280) og linker (en343).
Bemærk: Sluk A340 auto-kalibrering hvis bruger Spektrofotometer nanodrop. A343 mål repræsenterer absorbansen af pyridin 2-thion gruppe (udryddelse koefficient = 7550 M-1) der er fjernet fra SPDP tværs linker af DTT. En kindtand forholdet mellem linker: protein-forhold på 1,2-1,5 opnås generelt, når du udfører reaktion med en 2,5 kindtand overskud af SDPD på en bred vifte af proteiner. - Køre de poolede fraktioner over kolonnen vasket i PBS som beskrevet ovenfor. Indsamle fraktioner, bestemme A280og pool top fraktioner. Bestemme koncentrationen af protein af A280 efter pooling fraktioner.
- Forberede DSPE-PEG (2000)-Maleimide (1,2-distearoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine-N-[methoxy(polyethylene glycol)-2000)-Maleimide. Dette vil blive tilføjet til protein i forholdet 10:1 molar. Forberede et 100 x lager af DSPE-PEG (2000)-Maleimide til at opnå den ønskede koncentration.
- For eksempel, hvis proteinkoncentration 10 µM efter trin 1.14, forberede en bestand af DSPE-PEG (2000)-Maleimide på 10 mM. Omhyggeligt afvejes DSPE-PEG (2000)-Maleimide (MW = 3000 g/mol) og tilføje den passende mængde DMSO. Flere runder af blide vortexing og sonicating kan få det helt opløst.
- Bestemme den samlede mængde af fraktioner fra trin 1.14 og oploesningen omhyggeligt til en lille (10-25 mL) rund bund kolbe (RBF). Tilføje den passende mængde på 100 x DSPE-PIND (2000)-Maleimide til protein til at opnå en 1 x, 10-fold kindtand overskydende, endelige koncentration. Forsigtigt swirl løsning for at sikre, at DMSO er fuldt spredt.
- Køre reaktion natten under kvælstof i en forseglet RBF. Bruger en gummi septum og anbringes i et stinkskab.
- Fjerne atmosfæren af punktering septum med en 20 G kanyle tilknyttes en 3 mL sprøjte for enden af slangen er knyttet til et vakuum, og tænd vakuum for 3-5 s.
- Erstatte atmosfæren med kvælstof. Fylde en ballon er knyttet til en 3 mL sprøjte skåret i halve med kvælstof og vedhæfte en 20 G kanyle. Punktere septum for at fylde atmosfæren inde i rund bund kolben med kvælstof. Gentag fjernelse af atmosfære og udskiftning med kvælstof endnu engang og forlade kvælstof ballonen knyttet natten over.
- Forberede en separat krydsbundet dextran gel perle kolonne med en fraktionering vifte af 4.000 – 150.000 Da i en 1,0 cm x 50 cm kromatografi glaskolonne (ifølge trin 1.1-1.3).
- Den følgende dag, fjerne protein fra rund bund kolben udarbejdet i trin 1.17 og run (Følg metoden bruges i trin 1,6) over krydsrefererede dextran gel perle kolonne (fra trin 1.18).
Bemærk: Det samlede beløb til at indlæse på kolonnen skal være højst 2 mL. Hvis en større reaktion blev brugt, delt i to og køre på separate kolonner eller køre på en større diameter kolonne.- Indsamle fraktioner, bestemme A280, pool top fraktioner, og bestemme koncentrationen af protein. Tilstedeværelsen af lipid vil ikke påvirke målingerne.
- Gemme de endelige poolede brøkdele af lipid-forbundet protein ved 4 ° C indtil klar til brug.
2. Liposom forberedelse
- Veje ud af lipider: DSPE-PEG(2000) (1,2-distearoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine-N-[methoxy(polyethylene glycol)-2000, MW = 2805.5 g/mol; Kolesterol (3b-Hydroxy-5-cholestene, 5-Cholesten-3b-ol), MW = 386.7 g/mol; og DSPC (1,2-distearoyl-sn-glycero-3-phosphocholine), MW = 790.1 g/mol. Opret en 5 mg/mL opløsning af DSPC, 4 mg/mL opløsning af Cholesterol og 2 mg/mL opløsning af DSPE-PEG(2000) i chloroform.
- Sikre, at den molære forhold af lipider i Liposomer er: 57% DSPC, 38% kolesterol, og 5% DSPE-PEG(2000), som er repræsenteret i tabel 1.
Bemærk: Det er vigtigt at kontrollere mængden af antigen på Liposom, som generelt varierer fra 0,01-0,1%. I tabel 1bruges 0,1% af ged anti-mus IgM Fab fragmentet knyttet til pegyleret lipid. Det er afgørende at tage højde for den 10-fold molar overskydende af DSPE-PIND (2000)-Maleimide der blev føjet til protein i trin 1.15, til at sikre, at det samlede beløb for pegyleret lipid ikke overstiger 5%. - Overveje de endelige lipid beløb (µmol), når du opretter lipider til ekstrudering. Se tabel 1 for et eksempel på beregning af kindtand lipid koncentrationer for oprettelsen af Liposomer på en 1,25 µM samlede lipid koncentration.
- Når den korrekte mængde af hver lipid skal lægges sammen er blevet beregnet, kombinere alle i et 12 mL borsilikatglas reagensglas.
-
Omhyggeligt blæse chloroform.
- Bruge slangen og en 3 mL sprøjte med kanyle, forberedt i trin 1.17.1, at omhyggeligt blæse chloroform i røret med kvælstof. Forsigtigt blæse en strøm af kvælstof på løsningen mens roterende tube med anden hånden. Vær omhyggelig med at minimere sprøjt eller forårsager væske til at køre måde op på siden af røret, da det kan være vanskeligere at få dette i løsning i næste trin.
- Tilsæt 100 µL af DMSO til hvert rør og lyophilize denne løsning natten over. Dække toppen af røret med en ikke-statisk laboratorium tørre, sikkert med en elastik, og fryse-80 ° C.
3. Liposom ekstrudering
- Der tilsættes 1 mL PBS, som indeholder den lipid-forbundet protein til 12 mL rør indeholdende lipider. Der sonikeres løsning for ca 30 s til 1 min i vandbad sonikering. Hvile i 5 min eller længere mellem hver runde og Gentag 3-4 gange.
-
Forberede en ekstruder, som anvist af fabrikanten.
- Tilføj filter understøtter indre membran støtte, sted et par dråber (10 µL) af PBS på paraffin film. Brug af pincet, grab en kant af filter støtte og dyppe den i 10 µL drop.
- Sted filter inde o-ringen. Gøre dette til begge sider. Brug af pincet, grab en 0,8 µm filter på kanten og dyp i 10 µL drop og pels på ydersiden af O-ring med PBS. Placer 0,8 µm filter forsigtigt på o-ringen så filteret understøtter ikke over hænge den indre membran.
- Placer ekstruder varme blok på en varmeplade til pre heat ekstruder. Tænd varmepladen lavt og tillade ekstruder varme blok til at nå den ønskede temperatur. For at undgå potentielle problemer med protein sammenlægning, ikke varme blok sidste 37 ° C.
- Indlæse sonicated prøven i et af de extruding sprøjter placeret i ekstruder. Sted i ekstruder sprøjten ind i anden enden af ekstruder. Sørg for den tomme sprøjte stemplet er indstillet til nul. Den tomme sprøjte vil fylde som lipid er ekstruderet gennem polycarbonat 0,8 µm membran. Prøv at undgå passerer bobler frem og tilbage gennem membranen.
- Placere den færdigsamlede ekstruder i varme blok. Forsigtigt skubbe stemplet af den fyldte sprøjte med lipider til den tomme sprøjte. Afhængigt af lipid koncentration, vil dette være vanskeligt at trænge igennem. Gentag 20 x.
- Fjerne den færdigsamlede ekstruder fra den varme blok. Langsomt fjerner den fyldte sprøjte fra ekstruder, Sørg for at indsamle enhver lipider, som kan sive ud, når du fjerner. Placere Liposomer i en ren hætteglas. Gentag trin 3.4 – 3.6 ved hjælp af polycarbonat 0,2 µm og 0,1 µm membraner.
- Oprette en 0,7 x 50 cm2 krydsbundet Agarosen perle kolonne med adskillelse række 0,7-10 Mega Dalton (MDa) ekvilibreres i PBS. Tilføj Liposomer og køre som i trin 1,6. Fraktioner der indeholder Liposomer vil være faldet transmission af lys i området 250-400 nm.
- Gemme Liposomer ved 4 ° C og ikke fryse.
4. calcium Flux at overvåge B-celle aktivering af antigene Liposomer
- Aflive mus af kuldioxid (CO2) eller isofluran overdosis, ifølge institutionelle standardforskrifter. Bekræfte eutanasi af mus af cervikal dislokation.
- Sterilisere kirurgiske instrumenter og mus slagtekroppen med 70% ethanol. Brug 10 cm lange, 0,8 mm spids, buet iris pincet til at adskille huden dækker brysthulen fra brystkassen. Brug 10 cm lange, lige dissekere saks til at gøre en distal snit med en bilateral indsnit.
- Bruge buede iris pincet og dissekere saks til at udtrække milten fra bughulen. Fjerne fedtvævet omkring milt og derefter placere den i en 15 mL polystyren koniske rør fyldt med RPMI1640 medium indeholdende 1% føtalt kalveserum (FCS) og penicillin-streptomycin.
- Overførsel milt og medier over en 40 µm celle si monteret på et 50 mL konisk rør. Bruger gummi slutningen af en 3 mL sprøjte stemplet, blidt knuse milten. Vask 40 µm celle si med medierne. Gentag denne proces, indtil kun fedtvæv er tilbage i 40 µm celle sien. Skyl sigte med 3-5 mL af medier til at øge celle opsving.
- Centrifugeres celle homogenatet på 300 x g i 5 min på RT. Efter centrifugering, supernatanten fjernes og der tilsættes 10 mL af 1 x RBC lysisbuffer til pellet. Pipetteres op og ned, forlader i 2-3 min. på RT og derefter centrifugeres ved 300 x g i 5 min på RT.
- Supernatanten og resuspend røde blodlegemer forarmet splenocytes i 10 mL af medier. Fastlægge samlede celle numre ved hjælp af en hemocytometer eller anden celle tælle enhed. Sammenpresse cellerne ved centrifugering som beskrevet ovenfor.
Bemærk: Den ideelle endelige koncentration nødvendige for Indo-1 læsning af splenocytes er 10-20 x 106 celler/mL, men en lavere koncentration af celler kan bruges. - Resuspend splenocytes på 15 x 106 celler/mL i calcium flux loading bufferen (RPMI1640 medium indeholdende 1% FCS, 10 mM 4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic syre (HEPES), 1 mM magnesiumchlorid (MgCl2), 1 mM ethylenglycol-bis ( Β-aminoethyl æter)-N, N, N', N'-tetraacetic syre (EGTA), og 5% penicillin-streptomycin). Tilføj i 1,5 µM Indo-1 fra en 1 mM DMSO stamopløsning, vend røret flere gange for at blande. Beskytte mod lys, og Inkuber celler ved 37 ° C vandbad i 30 min.
- Efter 30 min inkubation, tilføje i 5 x mængden af calcium flux loading bufferen. På 300 x g der centrifugeres i 7 min. ved RT.
- For gating på B-celler, pletten celler med 1:200 anti-mus CD5-PE og anti-mus 1:200 B220-PE/Cy7 i 0,5 mL af loading bufferen ved 4 ° C i 20 min., beskyttet mod lys.
- Vask splenocytes i calcium flux loading bufferen og på 300 x g der centrifugeres i 7 min. ved RT. Resuspend celler på 10 – 20 x 106 celler/mL i calcium flux kører buffer (Hanks afbalanceret saltopløsning (HBSS) indeholdende 1% FCS, 1 MgCl2 og 1 mM calcium chloride (CaCl2)). Opbevares på is, beskyttet mod lys indtil klar til at køre på flow Flowcytometret.
-
Setup flowcytometri med unstained og enkelt pletten styringer til kompensation.
- Køre de farvede celler for at setup portene hensigtsmæssigt (Se figur 2A). Opsætning af Indo-1 (violet) versus Indo-1 (blå) plot, justere spændinger i Indo-1 kanaler at placere celler farvning på en skråning af 45 – 60 ° til at maksimere signalet: støjforhold af Indo-1 violet: blå ændring i forholdet efter B-celle stimulation.
Bemærk: Sørg for, at spændinger ikke er for høj, således at en betydelig procentdel af cellerne (> 5%) er op mod toppen af plottet. - Opretter en diagonal gate, der indkapsler den øverste venstre del (Violet+blå-) af plottet, således at uden stimulation < 10% af cellerne er i porten, som bør ideelt stige til > 75% efter stimulation.
- Køre de farvede celler for at setup portene hensigtsmæssigt (Se figur 2A). Opsætning af Indo-1 (violet) versus Indo-1 (blå) plot, justere spændinger i Indo-1 kanaler at placere celler farvning på en skråning af 45 – 60 ° til at maksimere signalet: støjforhold af Indo-1 violet: blå ændring i forholdet efter B-celle stimulation.
-
Tilføje 0,5 mL af celler til et udjævnet 5 mL rund bund polystyren tube (Fluorescens-aktiveret celle sortering (FACS) tube) og varm celler til 37 ° C i 3-5 min i et vandbad. FACS røret anbringes i 37 ° C water-jacketed kammer, der er tilsluttet en re cirkulerende vandbad.
- Køre røret den water-jacket på flow forskellige og indlede erhvervelse, uden at gemme data på ca. 5.000-10.000 begivenheder/s. Når cellerne har stabiliseret (15-30 s), indlede data erhvervelse og indsamle data for mindst 10 s at etablere baggrunden.
- På de 10 s mark, hurtigt fjerne røret fra flow forskellige, tilføje stimulation (5-50 mM antigene Liposomer i 2-20 mL), puls vortex, og returnere FACS tube på flow-Flowcytometret. Vedligeholde data og lagring gennem denne tid og indsamle data for 3-5 min.
- Analysere data i relevant analyse software under funktionerne kinetik.
5. forberedelse af Peanut ekstrakt
- Uddrag peanut proteiner ved at blande peanut mel i forholdet 1:5 (wt:vol) af fosfatbufferet saltopløsning (PBS) med 1 M natriumchlorid (NaCl). Bland løsning på magnetiske rør tallerken for 2 h i RT fastholdes ved pH 8,5.
- Centrifuge løsning på 3.000 x g i 45 min. ved 4 ° C. Dekanteres og filter-sterilisere supernatanten sekventielt gennem en 0,4 µm filter efterfulgt af en 0,2 µm filter. Bestemme proteinkoncentration ved bicinchoninic syre (BCA) analyse ved hjælp af bovint serumalbumin (BSA) som standard.
- Reducere og denaturere et udsnit af peanut protein med 50 mM dithiothreitol (DTT) i en buffer, som indeholder lithium dodecyl sulfat ved en pH på 8,4, der giver mulighed for maksimal aktivitet af reduktionsmiddel og varme ved 70 ° C i 10 min.
- Køre 10 µg denatureret peanut protein på en Bis-Tris 4 – 12% precasted polyacrylamid gel designet til at give optimal adskillelse gradient gel med molekylvægt pre farves standard.
- Pletten gel med disulfonated triphenylmethane og destain med ddH2O. identificere kendt store peanut allergener Ara h 1, 2 og 3 i uddrag præparater. Ara h 1 vises på 63 kDa, Ara h 2 skal vises som to isoformer på 17 og 19 kDa og Ara h 3 vises på 37 kDa (sure subunit).
6. sensibilisering af mus til Peanut
- Resuspend 1 mg kolera toksin i 1 mL ultrarent vand. Forberede 200 µL fortyndet peanut ekstrakt indeholder 2 mg peanut protein og 10 µg kolera toksin i PBS.
- Administrere 200 µL af peanut ekstraktet indeholdende kolera toksin (2 mg peanut protein og 10 µg kolera toksin) via mundtlige sonde til hver 4-5 uge gamle BalB/cJ kvindelige mus. Gentag en gang om ugen i tre uger (dvs., dag 0, 7 og 14).
- Administrere 300 µL fortyndet peanut ekstrakt (som indeholder 5 mg peanut protein og 10 µg kolera toksin) via mundtlige sonde til hver mus i den fjerde uge (dvs., dag 21).
7. udfordring mus med Peanut ekstrakt
- Dag 28, forberede peanut ekstrakt til en endelig koncentration på 1 mg/mL i PBS. Måle baseline krop temperaturer ved hjælp af en rektal termometer (ca 37,5-38,5 ° C). Administrere 200 µL (200 µg) af peanut ekstrakt via intraperitoneal (i.p.) injektion.
- Måle kropstemperaturen med rektal termometer hver 15 min til 1 time efter injektion. En dukkert i kropstemperatur angiver allergi over for peanut.
Bemærk: Hypotermi er kendetegnende for anafylaksi hos mus. Denne udfordring vil demonstrere, at musene er allergisk over for peanut. Typisk, 90% af Balb/cJ mus, der undergår sensibilisering protokol udvikle allergiske reaktioner under challenge karakteriseret ved mindst en 2-3 ° C temperatur fald.
8. isolering af Splenocytes fra allergiske mus og adoptiv overførsel
-
Isolere splenocytes fra naiv og peanut allergisk mus.
- Dag 30, aflive både naive og bekræftet peanut allergisk mus ved at administrere 3 L/min. af CO2 i et gaskammer. Bekræft eutanasi af mus ved bilaterale torakotomi. Sterilisere kirurgiske instrumenter og mus slagtekroppen med 70% ethanol. Bruge pincet til at adskille huden dækker brysthulen fra brystkassen. Brug lige dissekere saks til at lave en bilateral snit bryde de venstre og højre ribben.
- Bruge dissekere saks og pincet til at udtrække milten fra bughulen. Fjerne fedtvævet omkring milt før du placerer i polystyren 15 mL konisk rør, fyldt med 10 mL RPMI 1640 medium.
- I en steril laminar flow hætte, hæld milt og medier i en 35 mm polystyren petriskål. Holde naive og allergisk splenocytes i separate petriskåle og medier under celle isolation. Bruge steriliseret pincet og dissekere saks klippe milten i tre stykker og vende tilbage til petriskål.
- Ved hjælp af den ru, matteret kanten af to glas objektglas, forsigtigt homogeniseres (i RPMI) milt stykker indtil hvid væv forbliver mellem dias. Ændre dias mellem grupper.
- Overføre celle homogenatet fra petriskål gennem en 70 µm celle si monteret på et 50 mL konisk rør. Passere de resterende milt fragmenter gennem sien med et stempel fra en 1 mL sprøjte. Skyl sigte med 5 mL af RPMI til at maksimere celle opsving. Overføre filtratet til en polystyren 15 mL konisk røret, og der centrifugeres (450 x g, 10 min, RT).
- Opsug supernatanten og tilføje resuspend celle pellet i 2 mL rød blod celle lysisbuffer (0,83% ammoniumchlorid i 10 mM Tris buffer, pH 7,2). Blandes og inkuberes ved RT for 2-3 min. tilføje 10 mL PBS - 2% FBS og på 300 x g der centrifugeres i 7 min. ved RT.
- Cellerne vaskes igen med 12 mL PBS - 2% FBS til helt at fjerne enhver resterende ammoniumchlorid og centrifugeres ved 300 x g i 7 min. ved RT. genopslæmmes celle pellet i 2 mL af RPMI 1640 medium. Tælle celler ved hjælp af enten en hemocytometer eller automatiske hæmatologi analyzer.
- Ved hjælp af en 27 G, 5/8-inch nål på en 1 mL insulin sprøjte, intravenøst injicere 15 x 106 allergisk eller naive splenocytes udtrukket som beskrevet ovenfor (i 200 µL) via halen vene til naive (unsensitized) mus.
9. indsprøjtning af mus med Ara h 2 antigene Liposomer
- Forberede Ah2 Liposomer som indeholder 0,1% Ah2 på 2,5 mM lipid. Til beregning af proteinkoncentration, lig extinction Ah2 med 15.000 M-1. Fortyndet Liposomer til 300 µM i steril PBS.
- En dag efter adoptiv overførsel (dag 31) af allergisk eller naive splenocytes, indsprøjtes intravenøst 200 µL af PBS eller Ah2 antigene Liposomer (300 µM) der indeholder ialt 1,38 µg af Ah2 via hale vene af BALB/cJ mus, der fik splenocytes i skridt 8.2.
10. boost og udfordring af mus med Ara h 2
- To uger efter injektion med Ah2 Liposomer, dag 45, bruge en 4 mm animalske lancet til at indsamle 50-200 µL af blod fra submandibulære krydset af musen. Indsamle blod i en serum separator reagensglas uden heparin; separat serum ved centrifugering ved 6.000 x g i 15 min. bruge de indsamlede serum senere videre til foranstaltning antigen-specifikke antistoffer.
- Dag 46, to uger efter indsprøjtning mus med Liposomer (trin 9.2), øge mus ved en i.p. injektion af 200 µL af PBS eller 200 µg af opløselige Ah2 (renset som tidligere beskrevet16).
- Dag 60, indsamle 50-200 µL af blod fra submandibulære krydset af musen og behandle blod som beskrevet tidligere.
- Dag 61, udfordre hver gruppe af mus med en i.p. indsprøjtning af 200 µL af 300 µg opløselige Ah2. Måle krop temperaturer med rektal sonde hvert 15 min som i afsnit 7.
11. kvantificering af Ara h 2-specifikke IgE og IgG1 ved ELISA
- Coat en 96-brønd enzymmaerket assay (ELISA)-kompatibel plade med 100 µL HSA-DNP (2,4-dinitrophenyl hapten konjugeret til human serumalbumin, 20 µg/mL) til standardkurven eller Ah2 (5 µg/mL) for serumprøver indsamlet i trin 10.1 og 10.3, fortyndes i coatingbuffer (50 mM karbonat-bikarbonatbuffer, pH 9,6) på 4 ° C natten over eller 37 ° C i > 1 h.
- Vaskes tre gange med 200 µL PBS-T (PBS med 0,05% Tween-20) og blokere brønde med 200 µL PBS-T indeholdende 2% BSA ved 37 ° C for > 2 h.
- For Ah2-specifikke IgE ELISA, tilsættes 50 µL IgE-anti-DNP standarder (2-0,002 µg/mL, tilberedt af 1:2 serielle fortyndinger) eller mus serumprøver (1:20 fortynding), og der inkuberes natten over ved 4 ° C. For Ah2-specifikke IgG1 ELISA, tilføje 100 µL renset IgG1-anti-DNP standarder (2-0,002 µg/mL, tilberedt af 1:2 serielle fortyndinger) eller mus serumprøver (1: 500 fortynding) og der inkuberes natten over ved 4 ° C eller 1 h ved 37 ° C.
- Vaskes tre gange med 200 µL PBS-T. For Ah2-specifikke IgE ELISA, tilføje 100 µL får anti-mus IgE (0,5 µg/mL) og inkuberes ved 37 ° C i 1 time. For Ah2-specifikke IgG1 ELISA, tilføje 100 µL HRP ged anti-mus IgG1 (fortyndet 1:40,000 i PBS-T - 2% BSA). Der inkuberes ved 37 ° C i 1 time.
- Vaskes tre gange med 200 µL PBS-T. For Ah2-specifikke IgE ELISA, tilføje 100 µL biotinylated-æsel anti-får IgG (0,5 µg/mL) og inkuberes ved 37 ° C i 45 min. For Ah2-specifikke IgG1 ELISA, spring til trin 11,7.
- Vaskes tre gange med 200 µL PBS-T. For Ah2-specifikke IgE ELISA, tilføje 100 µL neutralt opkrævet begærlighed peberrodsperoxidase (f.eks.NeutrAvidin-HRP, 0,3 µg/mL) og inkuberes ved 37 ° C i 30 min.
- Tilsæt 100 µL 3, 3', 5, 5'-Tetramethylbenzidine (TMB) substrat, Ruger 10-15 min, eller indtil prøver igen mørkeblå, derefter tilsættes 100 µL TMB stopopløsning. Læs plade ved 450 nm.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Konjugation af protein af interesse med DSPE-PEG(2000) kan påvises ved at køre en reducerende viser en stigning i Molekylær vægt i forhold til den ukonjugeret protein. Figur 1A viser en repræsentativ gel af anti-mus IgM F(ab) fragment konjugation til PIND-DSPE, som viser en 2 – 3 kDa bandshift for den denaturerede proteiner. Bemærk, at ca. 50% af protein vises ændres, hvilket forventes at 1:1 støkiometrisk blev opnået på Fab fragmentet, der er en heterodimer af tunge og lette kæde. Figur 1B viser en repræsentativ gel af Ah2 konjugation til PIND-DSPE. For at vurdere calcium flux af B-celler stimuleret af antigene Liposomer, to ting er afgørende: (1) Apparatindstillingen er tunet til at se en forskel i forholdet mellem Indo-1 fluorescens i Ca2 + bundet (violet) og ubundet (blå) former og (2) korrekt gating strategi anvendes til at vurdere B-celle aktivering. Figur 2A viser den gating ordningen for flow flowcytometri-baserede calcium flux assay. Live lymfocytter er gated i en SSC-A versus FSC-A (venstre panel), dubletter er gated ud i en FSC-W versus SSC-W plot (midterste panel) og B200+CD5- B-celler er valgt fra en CD5-PE vs B220-PE/Cy7 plot (højre panel). Figur 2B viser forholdet mellem Indo-1 (violet) vs Indo-1 (blå) Fluorescens over tid som analyseres. Bemærk at den samlede proteinkoncentration af F(ab) og F(ab')2 i disse assays var de samme, demonstrere den overlegne evne af antigene Liposomer stimulerende B-celle aktivering. Efter udarbejdelsen af peanut ekstrakt, skal du køre en alikvot på en SDS-PAGE gel til at bestemme de relative mængder af Ara h 1, 2 og 3 i ekstraktet. Figur 3 viser en repræsentativ gel med en peanut ekstraktion, der blev kørt sideløbende med renset Ah2. Figur 4 viser en skematisk af samlede adoptiv jordnøddeallergi musemodel, herunder indledende sensibilisering at peanut, udfordring at peanut, splenocyte isolation og adoptiv overførsel, Liposom injektioner, blod tegne efterfulgt af Ah2 boost, og udfordre til Ah2. Ah2-specifikke IgE og IgG1 ringprøver blev kørt til at kvantificere immunglobuliner i serum, som vist i figur 5A og B. Mus med konfererede følsomhed, der er blevet forstærket med Ah2 vil have Ah2-specifikke IgE og IgG1 i deres serum. Krop temperaturer registreres under Ah2 challenge er vist i figur 5 c; allergisk mus var faldet krop temperaturer efter udfordring, mens kroppen temperaturer i naive mus forblev konsekvent. Billeder viser naive mus sammenlignet med peanut-allergisk mus under udfordringen er vist i figur 6.
Figur 1: repræsentative gel af anti-mus IgM F(ab) og Ah2 konjugation til PIND-DSPE. (A, B) SDS-page analyse af (A) ged anti-mus IgM F(ab) fragment og (B) Ah2 før og efter konjugation til PIND-DSPE. Ged anti-mus IgM og Ah2 har molekylvægte, inden for ca 48 og 18 kDa, henholdsvis. Efter ændringen, en lidt større molekylvægt (~2.5 kDa) ses klart for begge proteiner. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2: repræsentative gating strategi, calcium flux resultater og analyse. (A) celler blev analyseret via følgende gating strategien: live lymfocytter (FSC-A vs. SSC-A), enkelt celler (FSC-W vs SSC-W) og B-celler (B220+CD5-). (B) den Indo-1/Ca2 + flux svar (violet vs blå) af B-celler. Vist er calcium flux til anti-IgM Fab fragmentet Liposomer og anti-IgM F(ab')2 på den samme proteinkoncentration (2,5 µg/mL) samt buffer-stimuleret celler som kontrol. Bemærk, at mellem 10-22 s er når stimulation er tilføjet, og derfor ingen data er erhvervet i løbet af denne tid. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 3: repræsentant gel viser peanut ekstrakt og Ah2. Peanut ekstrakt indeholder flere proteiner, herunder allergener Ara h 1, 2, 3 og 6, i forhold til de to isoformer, der vises for Ah2. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 4: skematisk af adoptiv overførselsprotokollen. Naive BALB/cJ mus blev sensibiliseret med peanut ekstrakt (PN) og kolera toksin (CT) og efterfølgende udfordret til PN. Splenocytes fra bekræftede allergisk mus isoleret og overført til naive mus. Mus blev senere grundes med immunogen Ara h 2 Liposomer eller PBS, så boostet med opløselige Ah2. Endelig, mus blev udfordret med Ah2 at overvåge anafylaksi. Blod indsamlet på dage 45 og 60 blev brugt til at kvantificere Ah2-specifikke immunoglobuliner. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 5: immunogen Ara h 2 Liposom øger tillægges hukommelse allergiske reaktioner. Serum blev isoleret pre (dag 45) og post (dag 60) løft med PBS eller 200 µL af 300 µM immunogen Ah2 Liposom at måle Ah2-sepcific IgE (A) og IgG1 (B). Individuelle mus er repræsenteret med linjer, der angiver medianerne. Mus, der fik allergisk splenocytes og blev administreret Ah2 Liposomer dag 32 havde signifikant højere niveauer af Ah2-specifikke IgE og IgG1. Anafylaksi blev målt i de forskellige behandlingsgrupper ved at optage krop temperaturer efter Ah2challenge (C). Betyder krop temperaturer afbildet med SEM. naiv: PBS (naiv splenocytes og PBS prime), allergiske: PBS (bekræftet allergisk splenocytes og PBS prime), allergiske: Ah2 (bekræftet allergisk splenocytes og Ah2immunogenic Liposom prime). * P < 0,05, ** P < 0,01, *** P < 0,001, *** P < 0,0001 bestemmes af uparrede 2-tailed Student's t-test. Bemærk, at disse resultater er repræsentant for to uafhængige forsøg. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 6: anafylaktiske symptomer observeret under Ah2 challenge. Naive mus forblive aktive og har pink teint på fødderne (A, C). Allergisk mus har nedsat aktivitet, ofte er krum, har anstrengt åndedræt og opleve cyanose, angivet med mørkere lilla teint på fødderne (B, D). Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
| MW | 790 | 387 | 2900 | 3000 | 48000 | |
| DSPC | Kolesterol | PIND-DSPE | overskydende PIND-DSPE | en IgM-PIND-DSPE | I ALT | |
| Molære forhold | 57 | 38 | 3.9 | 1 | 0,1 | 100,00 |
| masse (mg) | 0,56 | 0,18 | 0,14 | 0,04 | 0,06 | 0,98 |
| m mol | 0,71 | 0,47 | 0,05 | 0,01 | 0,00 | 1,25 |
| mL | 112.50 | 45.93 | 70.64 | 0,00 | 525.97 | 755.03 |
| Koncentreret (mg/mL) | ||||||
| DSPC | 5 | |||||
| Kolesterol | 4 | |||||
| PIND-DSPE | 2 | |||||
| en IgM-PIND-DSPE | 0.114 |
Tabel 1: beregninger for at skabe en 1,25 µM samlede lipid koncentration Liposom. Eksempel på beregning tabel for ged anti-mus IgM F(ab) fragment Liposomer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
De metoder, der er skitseret her er en generel protokol til konjugation af et protein til et lipid, som giver mulighed for visning af protein på liposomal nanopartikler. For meget store multi subunit proteiner, kan denne protokol har begrænset nytte. Den ideelle metode ville være indførelse af en lokationsspecifik tag, der muliggør en biorthogonal kemiske forbinder strategi skal anvendes. Hvis udtrykker proteinet recombinantly, kan dette være muligt ved hjælp af tilgængelige lokationsspecifikke strategier17, og en bred vifte af funktionelle grupper i slutningen af de pegyleret lipid, der er kommercielt tilgængelige. Derfor denne protokol er gearet til sammenkædning af protein isoleret fra naturlige kilder og er tilgængelig for en lang række forskere ikke nødvendigvis fortrolig med kemiske og biokemiske omdannelser.
Et nøgleaspekt i kører en calcium flux eksperiment, der skal understreges, er, at cellerne ikke bør aktiveres før du kører dem på flowcytometri. Hvis steril teknik ikke bruges konsekvent, vil dette tegner sig for en stor baggrund signal fra aktiverede celler (Indo-1 fluorescens skæv i retning af dens emission i violet kanal). Ligeledes bør celler holdes på is, inden du kører assay for at undgå unormale niveauer af baggrunden signal i Indo-1 kanaler. Det er også vigtigt at sikre, at cellerne er varmet i 2-3 min. før erhvervelse ved flowcytometri og hele stimulering under dataopsamling. Hvis cellerne ikke opretholdes ved 37 ° C under dataopsamling, kan det forventes, at celler ikke reagerer maksimalt. Da antigen-specifikke B-celler er til stede i mus på meget små tal, er ved hjælp af et surrogat antigener til at stimulere alle B-celler fra mus ideel. Selv om mange Transgene mus stammer er tilgængelige som express antigen-specifikke B-celler, formålet med denne teknik er, at den gennemsnitlige bruger at validere deres evne til at gøre antigene Liposomer ved hjælp af wild-type mus. For at opnå dette mål, var Fab fragmenter af anti-mus IgM knyttet til lipider og formuleret i antigene Liposomer, at krydse-link B-celle receptoren (BCR) i en polyklonale mode. Det er bemærkelsesværdigt, at det tidligere var påvist, at denne metode kan bruges til at stimulere menneskelige B-celler10 ved hjælp af passende antihumant IgM Fab fragmentet, som er vigtig, fordi det ikke er muligt at få adgang til betydeligt antal antigen-specifikke humane B-celler. I disse undersøgelser, blev styrken af antigene Liposomer til at stimulere B-celle aktivering illustreret ved deres forbedret evne til at fremkalde calcium flux i forhold til lige store mængder af anti-mus IgM F(ab') 2 fragmenter.
Brugen af antigene Liposomer har aktiveret udvikling af en metode for sensibiliserende BALB/cJ mus til peanut, overføre splenocytes fra allergiske mus til naive mus, indsprøjte vært mus med Ah2 Liposomer og udfordrende dem med Ah2. Antistof niveauer og anafylaktiske reaktioner inden for grupper af mus er reproducerbare i denne model. Det har været veletableret som hukommelse B - og T-celle svar er kritiske i udviklingen af peanut-specifikke antistoffer i mus. Desuden, en nylig undersøgelse har vist at hukommelse B-celler repopulate plasmaceller i mus, der opretholder forhøjede antigen-specifikke IgE niveauer; allergen-specifikke hukommelse B-celler er derfor et attraktivt mål for terapeutisk intervention18. Modellen beskrevet her nu giver mulighed for direkte målrette Ah2-specifikke hukommelse B-celler, i modsætning til en immunosuppressive tilgang ved hjælp af bortezomib nedbryder hele plasma celle repertoire19. En anden tilgang til at bekæmpe allergier er at fremkalde tolerance i T-celle rum. Én potentielle strategi er at indkapsle tolerance-inducerende adjuvanser inden for Liposom. Tidligere blev nanopartikler indkapsling rapamycin brugt til at fremkalde Tregs og mindske autoimmun sygdom20. Denne form for tilgang kunne anvendes til at udvikle tolerogenic terapier til behandling af jordnøddeallergi. Samlet set manipulation af allergen-specifikke Liposom af de tråddannende molekyler på overfladen giver mulighed for skræddersyede immunrespons, og indkapsle narkotika-lignende molekyler muliggør levering af narkotika til cellen allergen-specifikke.
Generelle begrænsninger af denne musemodel af jordnøddeallergi er at sensibilisering at peanut med kolera toksin og efterfølgende peanut udfordring via i.p. injektion er ikke helt repræsentativ for peanut allergi hos mennesker (f.eks. mennesker har reaktioner efter oral indtagelse). Men denne allergi model er den nuværende standard i felt11,18,21, og tillader os at undersøge molekylære mekanismer allergisk sygdom og udvikle nye behandlingsformer. Sammenlignet med disse konventionelle tilgange, tilbyder denne adoptiv overførsel model tre primære fordele. Først er, at det giver hukommelse B - og T-celler specifikke til allergen undersøges mere direkte. Faktisk, beviser nu stærkt belastende hukommelse B-celler som den største kilde til langsigtet allergi18. For det andet, fordi det samme antal af hukommelse B - og T-celler er implanteret i hver modtagende mus, de allergiske reaktioner er minimalt variable. For det tredje, denne model giver mulighed for at studere allergiske reaktioner til individuelle allergener, hvilket er nyttigt i forbindelse med testning nye immunoterapi. Et spændende program af denne model er at bruge den generelle fremgangsmåde i forbindelse med en humaniseret musemodel, hvor allergiske reaktioner er blevet undersøgt i immuniserede modeller22. Anvendes i forbindelse med en adoptiv overførsel model, en humaniseret musen model kunne være en kraftfuld tilgang til udvidelse og i vivo test af B - og T-celler fra allergiske patienter.
Antistof sygdom patogenese kun forekommer ikke i allergiske modeller, men også i B-celle medieret autoimmune sygdomme23. Adoptively overføre overfølsomme over splenocytes fra mus givet en autoantigen ville i sidste ende være meget nyttigt i at sænke antallet af forsøgsdyr, minimere antallet af dyr modtager flere injektioner af adjuvans og øge reproducerbarhed svar mellem kohorter af mus i flere tegn på sygdom. Et eksempel ville være i en eksperimentel autoimmune model af myasthenia gravis (EAMG) i hvilken modtagelige mus stammer (C57BL/6, SJL og JONNAS) er immuniseret flere gange med acetylcholin receptor (AChR) i adjuvans at udvikle patogene autoantistoffer. Disse autoantistoffer i sidste ende føre til immunpatologiske funktioner, der findes i mennesker som muskel træthed/svaghed, indbetaling af immunoglobuliner og supplement komponenter på neuromuskulære vejkryds og i svære tilfælde sygelighed/død24. I EAMG varierer sygdomsforekomst meget mellem 50-70%, så for at tage hensyn til denne variabilitet store dyr kohorter er nødvendige for at opnå Statistisk signifikans25,26. Metoden beskrevet her ville i sidste ende reducere antallet af dyr, der anvendes ved at reducere variabiliteten i sygdomsforekomst. Som tidligere nævnt, EAMG er foranlediget af flere injektioner med AChR + adjuvanser (komplet Freund adjuvans og ufuldstændige Freund adjuvans) at udløse auto-antistof reaktioner. Denne metode ville reducere antallet af dyr, der modtager flere sprøjter med adjuvans. Endelig, på grund af flere vaccinationer og øger, det er forholdsvis svært at definere passende terapeutisk windows for profylaktiske og terapeutiske behandlinger. Denne metode vil hjælpe synkronisere antistof respons og sygdom patogenese vinduet, hvilket gør det en mere forudsigelig og reproducerbar. Denne samme logik kan anvendes til mange andre musemodeller af antistof medieret autoimmune sygdomme, såsom reumatoid arthritis27.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ikke noget at oplyse.
Acknowledgments
Denne forskning blev støttet af tilskud fra Department of Defense (W81XWH-16-1-0302 og W81XWH-16-1-0303).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Model 2110 Fraction Collector | BioRad | 7318122 | |
| Cholestrol | Sigma | C8667 | Sigma grade 99% |
| SPDP | Thermo Fisher Scientific | 21857 | |
| DSPC | Avanti | 850365 | |
| DSPE-PEG 18:0 | Avanti | 880120 | |
| DSPE-PEG Maleimide | Avanti | 880126 | |
| Extruder | Avanti | 610000 | 1 mL syringe with holder/heating block |
| Filters 0.1 µm | Avanti | 610005 | |
| Filters 0.8 µm | Avanti | 610009 | |
| 10 mm Filter Supports | Avanti | 6100014 | |
| Glass Round Bottom Flask | Sigma | Z100633 | |
| Turnover stoppers | Thermo Fisher Scientific | P-301398 | |
| Tubing | Thermo Fisher Scientific | P-198194 | |
| Leur Lock | Thermo Fisher Scientific | k4201634503 | |
| Sephadex G50 Beads | GE Life Sciences | 17004201 | |
| Sephadex G100 Beads | GE Life Sciences | 17006001 | |
| Heat Inactivated Fetal Calf Serum | Thermo Fisher Scientific | 10082147 | |
| HEPES (1 M) | Thermo Fisher Scientific | 15630080 | |
| EGTA | Sigma | E3889 | |
| Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL) | Thermo Fisher Scientific | 15140122 | |
| 1x RBC lysis Buffer | Thermo Fisher Scientific | 00-4333-57 | |
| Indo-1 | Invitrogen | I1203 | |
| CD5-PE | BioLegend | 100608 | |
| B220-PE-Cy7 | BioLegend | 103222 | |
| HBSS | Thermo Fisher Scientific | 14170112 | without calcium and magnesium |
| MgCl2 | Sigma | M8266 | |
| CaCl2 | Sigma | C4901 | |
| Fab anti-mouse IgM | Jackson ImmunoResearch | 115-007-020 | |
| F(ab')2 anti-mouse IgM | Jackson ImmunoResearch | 115-006-020 | |
| Peanut flour | Golden Peanut Co. | 521271 | 12% fat light roast, 50% protein |
| Animal feeding needles | Cadence Science | 7920 | 22g x 1.5", 1.25 mm - straight |
| Microprobe thermometer | Physitemp | BAT-12 | |
| Rectal probe for mice | Physitemp | Ret-3 | |
| Cholera toxin, from Vibrio cholera | List Biological Laboratories, Inc. | 100B | Azide free |
| BCA Protein Assay Kit | Pierce | 23225 | |
| Carbonate-bicarbonate buffer | Sigma | C3041 | |
| TMB Stop Solution | KPL | 50-85-06 | |
| SureBlue TMB Microwell Peroxidase Substrate | KPL | 5120-0077 | |
| 96 well Immulon 4HBX plate | Thermo Scientific | 3855 | |
| Purified soluble Ara h 2 | N/A | N/A | purified as in: Sen, et al., 2002, Journal of Immunology |
| HSA-DNP | Sigma | A-6661 | |
| Mouse IgE anti-DNP | Accurate Chemical | BYA60251 | |
| Sheep anti-Mouse IgE | The Binding Site | PC284 | |
| Biotinylated Donkey anti-Sheep IgG | Accurate Chemical | JNS065003 | |
| NeutrAvidin Protein, HRP | ThermoFisher Scientific | 31001 | |
| Mouse IgG1 anti-DNP | Accurate Chemical | MADNP105 | |
| HRP Goat anti-mouse IgG1 | Southern Biotech | 1070-05 | |
| 1 mL Insulin Syringes | BD | 329412 | U-100 Insulin, 0.40 mm (27 G) x 16.0 mm (5/8") |
| Superfrost Microscope Slides | Fisher Scientific | 12-550-14 | 25 mm x 75 mm x 1.0 mm |
| ACK Lysing Buffer | gibco by Life Technologies | A10492-01 | 100 mL |
| RPMI 1640 Medium | Thermo Fisher Scientific | 11875093 | 500 mL |
| Cell Strainer | Corning | 352350 | 70 μm Nylon, White, Sterile, Individually packaged |
| NuPAGE 4-12% Bis-Tris Protein Gels | Invitrogen | NP0322BOX | 10 gels |
| NuPAGE LDS buffer, 4x | Invitrogen | NP0008 | 250 mL |
| SeeBlue Plus2 Pre-stained standard | Invitrogen | LC5925 | 500 µL |
| NuPAGE MES/SDS running buffer, 20x | Invitrogen | NP0002 | 500 mL |
| GelCode Blue Stain | Thermo Scientific | 24590 | 500 mL |
References
- Gupta, R. S., et al. The prevalence, severity, and distribution of childhood food allergy in the United States. Pediatrics. 128 (1), e9-e17 (2011).
- Sicherer, S. H., Munoz-Furlong, A., Godbold, J. H., Sampson, H. A. US prevalence of self-reported peanut, tree nut, and sesame allergy: 11-year follow-up. Journal of Allergy and Clinical Immunology. 125 (6), 1322-1326 (2010).
- Kim, E. H., et al. Sublingual immunotherapy for peanut allergy: clinical and immunologic evidence of desensitization. Journal of Allergy Clinical Immunology. 127 (3), 640-646 (2011).
- Vickery, B. P., et al. Sustained unresponsiveness to peanut in subjects who have completed peanut oral immunotherapy. Journal of Allergy and Clinical Immunology. 133 (2), 468 (2014).
- Jones, S. M., et al. Epicutaneous immunotherapy for the treatment of peanut allergy in children and young adults. Journal of Allergy and Clinical Immunology. 139 (4), 1242 (2017).
- Varshney, P., et al. A randomized controlled study of peanut oral immunotherapy: clinical desensitization and modulation of the allergic response. Journal of Allergy Clinical Immunology. 127 (3), 654-660 (2011).
- Anagnostou, K., et al. Assessing the efficacy of oral immunotherapy for the desensitisation of peanut allergy in children (STOP II): a phase 2 randomised controlled trial. Lancet. 383 (9925), 1297-1304 (2014).
- Sampson, H. A., et al. Effect of Varying Doses of Epicutaneous Immunotherapy vs Placebo on Reaction to Peanut Protein Exposure Among Patients With Peanut Sensitivity: A Randomized Clinical Trial. The Journal of the American Medical Association. 318 (18), 1798-1809 (2017).
- Bednar, K. J., et al. Human CD22 Inhibits Murine B Cell Receptor Activation in a Human CD22 Transgenic Mouse Model. Journal Immunology. 199 (9), 3116-3128 (2017).
- Macauley, M. S., et al. Antigenic liposomes displaying CD22 ligands induce antigen-specific B cell apoptosis. Journal Clinical Investigation. 123 (7), 3074-3083 (2013).
- Orgel, K. A., et al. Exploiting CD22 on antigen-specific B cells to prevent allergy to the major peanut allergen Ara h 2. Journal Allergy Clinical Immunology. 139 (1), 366-369 (2017).
- Smarr, C. B., Hsu, C. L., Byrne, A. J., Miller, S. D., Bryce, P. J. Antigen-fixed leukocytes tolerize Th2 responses in mouse models of allergy. Journal of Immunology. 187 (10), 5090-5098 (2011).
- Kulis, M., et al. The 2S albumin allergens of Arachis hypogaea, Ara h 2 and Ara h 6, are the major elicitors of anaphylaxis and can effectively desensitize peanut-allergic mice. Clinical and Experimental Allergy. 42 (2), 326-336 (2012).
- Dang, T. D., et al. Increasing the accuracy of peanut allergy diagnosis by using Ara h 2. Journal of Allergy Clinical Immunology. 129 (4), 1056-1063 (2012).
- Loughrey, H. C., Choi, L. S., Cullis, P. R., Bally, M. B. Optimized procedures for the coupling of proteins to liposomes. Journal Immunological Methods. 132 (1), 25-35 (1990).
- Sen, M., et al. Protein structure plays a critical role in peanut allergen stability and may determine immunodominant IgE-binding epitopes. Journal of Immunology. 169 (2), 882-887 (2002).
- Krall, N., da Cruz, F. P., Boutureira, O., Bernardes, G. J. Site-selective protein-modification chemistry for basic biology and drug development. Nature Chemistry. 8 (2), 103-113 (2016).
- Jimenez-Saiz, R., et al. Lifelong memory responses perpetuate humoral TH2 immunity and anaphylaxis in food allergy. Journal Allergy and Clinical Immunology. 140 (6), 1604-1615 (2017).
- Moutsoglou, D. M., Dreskin, S. C. Prolonged Treatment of Peanut-Allergic Mice with Bortezomib Significantly Reduces Serum Anti-Peanut IgE but Does Not Affect Allergic Symptoms. International Archives of Allergy and Immunology. 170 (4), 257-261 (2016).
- LaMothe, R. A., et al. Tolerogenic Nanoparticles Induce Antigen-Specific Regulatory T Cells and Provide Therapeutic Efficacy and Transferrable Tolerance against Experimental Autoimmune Encephalomyelitis. Frontiers in Immunology. 9, 281 (2018).
- Srivastava, K. D., et al. Investigation of peanut oral immunotherapy with CpG/peanut nanoparticles in a murine model of peanut allergy. J Allergy Clin Immunol. 138 (2), 536-543 (2016).
- Bellinghausen, I., Saloga, J. Analysis of allergic immune responses in humanized mice. Cellular Immunology. 308, 7-12 (2016).
- Pillai, S., Mattoo, H., Cariappa, A. B cells and autoimmunity. Curr Opin Immunol. 23 (6), 721-731 (2011).
- Mantegazza, R., Cordiglieri, C., Consonni, A., Baggi, F. Animal models of myasthenia gravis: utility and limitations. International Journal of General Medicine. 9, 53-64 (2016).
- Berman, P. W., Patrick, J. Experimental myasthenia gravis. A murine system. J Exp Med. 151 (1), 204-223 (1980).
- Berman, P. W., Patrick, J. Linkage between the frequency of muscular weakness and loci that regulate immune responsiveness in murine experimental myasthenia gravis. J Exp Med. 152 (3), 507-520 (1980).
- Derksen, V., Huizinga, T. W. J., van der Woude, D. The role of autoantibodies in the pathophysiology of rheumatoid arthritis. Seminars in Immunopathology. 39 (4), 437-446 (2017).
