Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Immunology and Infection
Click here for the English version

Immunology and Infection

ליפוזומים antigenic לדור של נוגדנים מחלות ספציפיות

Published: October 25, 2018 doi: 10.3791/58285
Automatic Translation
*1, *2,3, *3,4, 5, 6, 3,4, 5,7
1Janssen R&D, 2Department of Microbiology and Immunology, University of North Carolina, 3UNC Food Allergy Initiative, University of North Carolina, 4Department of Pediatrics, University of North Carolina, 5Department of Chemistry, University of Alberta, 6Department of Molecular Medicine, Scripps Research Institute, 7Department of Medical Microbiology and Immunology, University of Alberta
* These authors contributed equally

Summary

המתואר הוא הכנת חלקיקים liposomal antigenic והשימוש שלהם עירור תאי B הפעלה במבחנה וב -vivo. תגובות נוגדנים חזקים ועקביים הוביל את הפיתוח של מודל חדש של אלרגיה לבוטנים. הפרוטוקול עבור יצירת ליפוזומים antigenic ניתן להרחיב אנטיגנים שונים ומודלים חיסונים.

Abstract

תגובות נוגדנים לחסינות קריטי מגן מגוון רחב של פתוגנים. יש עדיין עניין גבוהה על מנת לייצר נוגדנים חזקים לקבלת חיסון כמו גם להבין נוגדנים פתוגניים איך לפתח תגובות אלרגיות ומחלות אוטואימוניות. יצירת תגובות חזקות נוגדן אנטיגן ספציפי אינה טריוויאלית תמיד. במודלים של העכבר, זה דורש לעיתים קרובות מספר סיבובים של החיסונים עם אדג'וונט שמוביל כמות גדולה של השתנות רמות נוגדנים המושרה. דוגמה אחת היא במודלים של העכבר של אלרגיות בוטנים שם יותר חזקים לשחזור דגמים למזער מספרים העכבר ושימוש אדג'וונט יהיה מועיל. המוצג כאן הוא מודל העכבר מאוד לשחזור של אלרגיה לבוטנים אנפילקסיס. זה הדגם החדש מתבסס על שני גורמים מרכזיים: splenocytes (1) אנטיגן ספציפי הם adoptively מ רגיש-בוטן העכבר לתוך עכבר תמים הנמען, נרמול המספר של אנטיגן ספציפי זיכרון ו- T-לימפוציטים על פני מספר רב של עכברים; עכברים הנמען (2) הן לאחר מכן שיפרה עם immunogen multivalent חזק בצורה של חלקיקים liposomal הצגת האלרגן בוטנים הגדולות (Ara h 2). היתרון העיקרי של מודל זה הוא הפארמצבטית שלה, אשר בסופו של דבר מפחיתה את מספר בעלי החיים שבהם משתמשים במחקר כל, תוך צמצום מספר החיות מקבלים זריקות מרובות של אדג'וונט. מכלול מודולרי של אלה ליפוזומים immunogenic מספק הסתגלות יחסית נתיישב דגמים אחרים אלרגי או אוטואימוניות המערבות נוגדנים פתוגניים.

Introduction

אלרגיה למזון משפיע על 8% של ילדים בארצות הברית, עלה בשכיחות במהלך העשור1. אלרגיה בוטנים משפיע על 1% של ילדים ואינו בדרך כלל גדולים מדי.2. למרות מספר ניסויים קליניים מבטיח נערכים לטיפול של אלרגיה למזון, כולל אוראלי חיסוני (אוקיאנה), sublingual חיסוני (חריץ) חיסוני epicutaneous (EPIT), יש כיום אין טיפול שאושרו על-ידי ה-FDA אסטרטגיות עבור הרגישות יחידים בוטנים-אלרגית3,4,5,6,7,8. לכן, אנשים אלרגית אך ורק עליך להימנע אלרגנים להתחמק אנפילקסיס. שאלות רבות נותרו לגבי מסלולים של רגישות עולה, שבבסיס מנגנוני התפתחות אלרגיה למזון.

העכבר הן כלי רב ערך עבור הלומדים את המנגנונים של אלרגיה, כמו גם פיתוח חדש tolerogenic הקהיה טיפולים9,10,11,12. זה נכון במיוחד כי האלרגן בוטנים הגדולות (Ara h 2; Ah2) אצל בני אדם הוא גם האלרגן דומיננטי בכמה תיאר העכבר מודלים13,14. בעוד העכבר מודלים של אלרגיה לבוטנים בפז בלימוד מנגנונים של רגישות עולה וסובלנות, חיסרון הוא כי הם יכולים להיות משתנה, דורשים שימוש adjuvants. Immunogens יותר חזק תהיה דרך אחת כדי למזער את ההשתנות מהותי של מודל שכזה. מאז B-תאים מופעלים בחוזקה על ידי אנטיגנים multivalent, ליפוזומים antigenic הצגת האלרגן הם אפשרות טובה בשל יכולתם להפעלת פוטנציאל תאי-B באמצעות הקולטן B-cell (BCR), בעוד גם יש את המאפיין של יעילות הטרמה תא T-cell דרך נלקח הלא ספציפית על ידי אנטיגן תאים.

כאן, אנו מתארים את פרוטוקול מפורט עבור conjugating חלבונים אנטיגניים כדי liposomal חלקיקים באמצעות אסטרטגיה נתיישב ומודולרית. שימוש של הפונדקאית אנטיגן, מקטע Fab אנטי-IgM, נדגים כיצד חזק ליפוזומים antigenic כזה יכול להיות מגרה הפעלה B-cell. ליפוזומים antigenic הצגת אנטיגן Ah2 שימשו כדי לפתח מודל חדש עכבר שהוענקו רגישות. במודל זה, splenocytes מן מאומת עכברים אלרגית בוטנים, המכיל בוטנים ספציפיות זיכרון ו- T-לימפוציטים, מועברים לתוך תמים congenic עכברים. תגובות נוגדנים זיכרון הם המושרה על ידי הזרקה של ליפוזומים מצומדת עם Ah2 לתוך העכברים הנמען, לשם הפקת נוגדנים נגד Ah2. ואחריו דחיפה אחת בלבד עם Ah2 מסיסים, נוגדנים ספציפיים Ah2 להצמיח אנפילקטי תגובה חזקה כאשר אלו עכברים מאותגרים לאחר מכן עם Ah2. עכברים שעברו התגובה האלרגית מגיבים בצורה מאוד אחידה, לא קיבלו את אדג'וונט, גישה זו הוא מודל רצוי אלרגיה לבוטנים, התוצאות מציע כי זה יכול להיות כלי במודלים אחרים של העכבר מונע על ידי אנטיגנים מכוונת אלרגנים ואולי גם autoantigens.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

השיטה הכללית מצמד חלבונים שומנים בדם, שילוב ליפוזומים מבוססת במידה רבה על עבודה קודמת15. כל ההליכים בבעלי חיים המתוארים להלן אושרו על ידי מאוניברסיטת צפון קרוליינה בצ'אפל היל מוסדיים חיה על עצמך ועל שימוש הוועדה (IACUC). כל העכברים השתמשו במודל לבוטנים הן נקבות BALB/cJ שנרכשו רוב בגיל 3 שבועות. טיפול בבעלי חיים אוניברסיטת אלברטה של הוועדה להשתמש (ACUC) אישרה ניסויים הקשורים לשימוש של העכבר טחולים שמחוץ ניתוח של עכברים C57Bl/6 של מגיל 6 שבועות לפחות.

1. ההטיה של אנטיגן חלבונים כדי PEGylated השומנים

  1. להוסיף דור 3 של חרוזי ג'ל לתוספי צולבים עם מגוון fractionation של 1,500 – 30,000 Daltons (Da) flask ואקום 250 מ. להוסיף 60 מ ל תמיסת פוספט buffered (PBS) ומערבבים ללא הרף עם פס מגנטי מערבבים. לאטום את הבקבוקון וחבר ואקום ליזום מבטל את ההמתה על צלחת מערבבים למשך תקופה מינימלית של 1 h.
  2. בעמודה 1.0 ס"מ על 30 ס"מ זכוכית כרומטוגרפיה עם בלם מחזור סגור, להוסיף PBS העמודה לשטוף. פתח את הפקק מחזור, לרוקן את העמודה. בעקבות כביסה, להוסיף את slurry של חרוזים נודף גז מבטל את העמודה. הוסף את slurry ללא הרף עד העמודה הוא ארוז חרוז בגובה של 24 ס מ.
  3. ברגע העמודה יש ראש של 4 – 5 ס מ ל- PBS מעל חרוזים ארוזים, יש את השלבים הבאים מוכן.
    1. צור הקונכייה זרימת הכבידה על ידי מדידת חתיכה של אבובים מספיק זמן כדי להגיע מדף 1 – 2 מטר מעל החלק העליון של העמודה, ליצור לולאה טיפות ליד החלק התחתון של העמודה ומחזירה לחלק העליון של העמודה. להוסיף פקק מחזור קצה אחד של הצנרת, עוזבים בצד אחד של פתח לצנרת. מניחים בקצה צינור פתוח לתוך בקבוק 500 מ"ל של PBS ואת מקום על המדף מעל העמודה.
    2. את הקצה עם בלם מחזור וצרף מזרק 10 מ"ל. לפתוח את השסתום בסימפטומים ולא במחלה עצמה מחזור על הקו אבובים וצייר PBS דרך הצינורית. ברגע PBS הגיעה שלושת-רבעי הדרך דרך הצנרת, להסיר את המזרק ובמהירות להוסיף פקק מחזור את החלק העליון של העמודה — נוזל צריך לרוץ אל העמודה.
      הערה: הסכום של 'ראש' PBS נשאר בראש העמודה צריך להיות בין 1 ו-3 ס מ. הכמות המינימלית כדי לשטוף את העמודה היא עמודה 3 כרכים.
  4. לקבוע את כמות החלבון (שומות) כדי להיות מקושר ליפיד המבוסס על משקל מולקולרי (MW).
    הערה: את מקטע Fab עז אנטי עכבר IgM (עצמה IgG) משמש כאן כמו אנטיגן הפונדקאית אוניברסלי לגירוי polyclonal של תאי-B. בהתאם לכך, הרסיס Fab של עז IgG של MW של 48 kiloDalton (kDa) ונמצא זמינים מסחרית בכמות הכוללת של 1.3 מ ג. לכן, כמות חלבון כדי להיות מקושר הוא 27.1 µmol.
  5. לקבוע את מקדם הכחדה של החלבון עניין. אם לא ידוע, למדוד את ספיגת החלבון ב- 280 ננומטר באמצעות ספקטרופוטומטרים לחלק הערך280 A לפי מספר שומות שחושבו בצעד 1.4.
    הערה: הכחדה co-יעיל של Fab של עז IgG-280 ננומטר הוא 64,600 ז-1.
  6. כדי להבטיח את האיתור כמויות של אמין המכיל מאגר יוסרו, desalt החלבון על העמודה שנוצרו בשלבים 1.1-1.3 ולאסוף שברים החלבון לתוך צינורות microcentrifuge 1.5 mL (µL ~ 500 לכל שבר).
    1. סגור את השסתום מחזור בסימפטומים ולא במחלה עצמה מחוברת לחלק העליון של העמודה ולהסיר העליון של העמודה. אם לא כבר לפתוח, לפתוח את השסתום בסימפטומים ולא במחלה עצמה מחזור בחלק התחתון של העמודה והמתן עד 'ראשו' של PBS פוגע העליון של החרוזים.
    2. לאט לאט מוסיפים החלבון עניין לחלק העליון של החרוזים באמצעות כוס פיפטה פסטר, וישתדלו למזער הפרעה לחלק העליון של החרוזים.
    3. לאחר 'ראש' הפתרון חלבון. הגעת לשיא של החרוזים, להוסיף 1 מ"ל של PBS בעדינות באמצעות פיפטה פסטר. אני חוזר שלוש פעמים. הוסף PBS כדי ליצור ראש של 4 – 5 ס מ וחזור על שלב 1.3 לשטוף את העמודה.
      הערה: שלב זה ניתן יבוצע אם זה בטוח כי אין מאגר המכיל amine הנוכחי.
  7. לקבוע שברים המכילים חלבונים על ידי מדידת ערכים A280, בריכה שברים לתת כ 90% התאוששות של החלבון.
    הערה: זה בדרך כלל מדללת חלבון 1.5-2-הקיפול. לקבוע ריכוז חלבון לאחר איגוד. ריכוז החלבון בשלב זה, במידת הצורך, באמצעות רכז צנטריפוגה
  8. להוסיף 2.5 טוחנת המקבילה crosslinker heterobifunctional החלבון.
    1. ראשית, שוקל כ- 5 מ ג של succinimidyl 3-(2-pyridyldithio) propionate (SPDP, MW = g 314/mol) לתוך צינור microcentrifuge. כדי לקבוע את עוצמת הקול כדי להמיס את SPDP, לקחת את ריכוז חלבון טוחנת, הכפל אותה ב- 250 x כדי ליצור פתרון 100 x זה ייתן עודף טוחנת 2.5 ב התגובה.
      הערה: לדוגמה, אם ריכוז חלבון 50 מיקרומטר, פתרון של SPDP-12.5 מ מ נדרש. עבור 5 מ"ג של SPDP, זה מקביל 1.27 מ של דימתיל סולפוקסיד (דימתיל סולפוקסיד).
  9. להוסיף SPDP החלבון עניין לדילול מטריים. מניחים את התגובה על שאכר נדנוד בטמפרטורת החדר (RT) לשעה בערך.
  10. להסיר את עודף SPDP להגן על bond(s) דיסולפידי אנדוגני, בהחלבון של השלב הפחתת עוקבות, equilibrate ושל לשטוף את העמודה נוצר צעדים ב 1.1-1.3 ממוחשב 100 מ מ סודיום אצטט (NaOAc) ב- pH 5.5 או ליצור עמודת זהות אך ורק לשימוש הזה מאגר.
  11. לאחר דגירה 1 h עם SPDP, desalt החלבון על העמודה equilibrated ב 100 מ מ NaOAc. לבצע שלב זה בצורה זהה כשלב 1.6 למעט משתמשת 100 מ מ NaOAc (pH 5.5) eluent. לאסוף את השברים, לקבוע את A280, הבריכה העליונה שברים. לשטוף את העמודה ב- PBS.
  12. להכין פתרון של 2.5 מטר של DTT (MW = g 154/mol) בכפול (ddH2O) מים מזוקקים. להוסיף 25 מ מ DTT שברים במאגר של חלבון למשך 5-10 דקות.
  13. למדוד את A280 של החלבון ולחלק זה על ידי המקדם הכחדה. כמו כן, קובעות את A343. חישוב היחס המקשר בהתבסס על molarity של חלבונים (280), מקשר (343).
    הערה: לבטל את כיול האוטומטי A340 אם משתמש ספקטרופוטומטרים nanodrop. המדידה343 A מייצגת את ספיגת בקבוצה 2-הבנת פירידין (מקדם הכחדה = 7550 M-1) זה יוסר מחדש SPDP על ידי DTT. יחס טוחנת של מקשר: חלבון יחס של 1.2-1.5 מושגת בדרך כלל בעת ביצוע התגובה עם עודף שן טוחנת 2.5 של וינפב על מגוון רחב של חלבונים.
  14. שברים במאגר לדרוס את העמודה שטף ב- PBS כמתואר לעיל. לאסוף את השברים, לקבוע את A280, הבריכה העליונה שברים. לקבוע את הריכוז של חלבון מאת A280 לאחר איגוד השברים.
  15. להכין DSPE-יתד (2000)-Maleimide (1,2-distearoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine-N-[methoxy(polyethylene glycol)-2000)-Maleimide. זה יתווסף החלבון ביחס טוחנת של 10:1. להכין מלאי 100 x של DSPE-יתד (2000)-Maleimide על מנת להשיג את הריכוז הרצויה.
    1. לדוגמה, אם ריכוז חלבון 10 מיקרומטר לאחר שלב 1.14, להכין מלאי של DSPE-יתד (2000)-Maleimide-10 מ מ. לשקול בקפידה את DSPE-יתד (2000)-Maleimide (MW = 3000 g/mol) ולהוסיף את הכמות המתאימה של דימתיל סולפוקסיד. מספר סיבובים של vortexing עדין, sonicating עלול לקבל את זה להתמוססות מלאה.
  16. לקבוע את הנפח הכולל של שברים מהשלב 1.14 ולהעביר את הפתרון בזהירות לתוך קטן (10-25 מ ל) סביב הבקבוק התחתון (RBF). להוסיף את הכמות המתאימה של 100 x DSPE-יתד (2000)-Maleimide את החלבון כדי להשיג סימן x 1, 10-fold ריכוז מולרי עודף, סופי. מערבולת בעדינות את הפתרון כדי להבטיח דימתיל סולפוקסיד מפוזרת באופן מלא.
  17. להפעיל תגובת בן לילה תחת חנקן RBF אטום. להשתמש על מחצה גומי ולמקם בשכונה fume.
    1. הסר את האווירה על-ידי ניקב מחצה עם מחט 20 גרם המצורפת מזרק 3 מ ל סוף צינורות המחוברים ואקום, והפעל ואקום עבור s 3-5.
    2. החלף את האווירה חנקן. מילוי בלון מחובר מזרק 3 מ"ל לחצי עם חנקן וצרף מחט 20 גרם. לנקב במחיצה כדי למלא את האווירה בתוך הבקבוק העגול התחתון עם חנקן. חזור על הסרת האווירה ואת החלפת עם חנקן פעם נוספת ולהשאיר את הבלון חנקן מצורף בן לילה.
  18. להכין עמודה נפרדת לתוספי צולבים חרוז ג'ל עם מגוון fractionation של 4,000 – 150,000 Da בעמודה כרומטוגרפיה זכוכית 1.0 ס"מ על 50 ס"מ (לפי השלבים 1.1-1.3).
  19. למחרת, להסיר את החלבון הבקבוק העגול התחתון המבושלות שלב 1.17 ולהפעיל (בעקבות השיטה בשלב 1.6) מעל העמודה חרוז ג'ל לתוספי צולבים (מתוך שלב 1.18).
    הערה: הסכום הכולל כדי להעמיס על העמודה צריך להיות לא יותר מ 2 מ"ל. אם תגובת גדול שימש, תתפצלו, לרוץ על עמודות נפרדות או לרוץ על עמודה בקוטר גדול יותר.
    1. לאסוף את השברים, לקבוע את A280, הבריכה העליונה שברים, ולקבוע את הריכוז של חלבון. הנוכחות של השומנים לא ישפיעו על המדידות.
  20. לאחסן במאגר שברים הסופי של חלבון מקושרים השומנים ב 4 ° C עד מוכן לשימוש.

2. ליפוזום הכנה

  1. שוקלים לצאת ליפידים: DSPE-PEG(2000) (1,2-distearoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine-N-[methoxy(polyethylene glycol)-2000, MW = 2805.5 גרם/מול; כולסטרול (3b-הידרוקסי-5-cholestene, 5-Cholesten-3b-ol), MW = 386.7 גרם/מול; ו DSPC (1,2-distearoyl-sn-glycero-3-phosphocholine), MW = g 790.1/יצירת פתרון 5 מ"ג/מ"ל של DSPC, 4 מ"ג/מ"ל תמיסת כולסטרול ו- 2 מ"ג/מ"ל תמיסת DSPE-PEG(2000) ב כלורופורם mol..
  2. ודא כי היחס טוחנת של ליפידים בתוך ליפוזומים: 57% DSPC, 38% כולסטרול ו- 5% DSPE-PEG(2000), כפי שמוצג בטבלה1.
    הערה: חשוב לשלוט בכמות אנטיגן על ליפוזום, שנעה בדרך כלל החל מ- 0.01 – 0.1%. טבלה 1, משמש 0.1% של עז אנטי-העכבר IgM חיובי המקטע מקושר PEGylated השומנים. חשוב לקחת בחשבון של השן הטוחנת 10-fold עודף של DSPE-יתד (2000)-Maleimide שנוסף החלבון בשלב 1.15, כדי להבטיח כי הסכום הכולל של השומנים PEGylated לא יעלה על 5%.
  3. שקול את סכומי השומנים הסופי (µmol) בעת יצירת שומנים לשחול. לקבלת דוגמה של חישוב ריכוז השומנים טוחנת להקמת ליפוזומים-ריכוז השומנים סה כ 1.25 מיקרומטר, ראה טבלה 1 .
  4. פעם אחת הסכום הנכון של כל השומנים שיתווספו יחד חושבה, לשלב כל 12 מ ל זכוכית בורוסיליקט מבחנה.
  5. בזהירות לנפנף את הכלורופורם.
    1. השתמש הצנרת, מזרק 3 מ עם המחט, מוכן בשלב 1.17.1, לשחרר בזהירות כלורופורם בצינור עם חנקן. בעדינות לפוצץ זרם של חנקן על הפתרון תוך כדי סיבוב הצינור עם היד השנייה. להיות זהירים כדי למזער להתיז או גרימת הנוזל לרוץ במעלה הצד צינור ככל שיהיה יותר קשה להיכנס זה פתרון בשלב הבא.
  6. להוסיף 100 µL של דימתיל סולפוקסיד כל שפופרת, lyophilize פתרון זה בין לילה. מכסים העליון של הצינור עם מגבון שאינו סטטי מעבדה, מאובטחים באמצעות גומייה, ומקפיאים -80 מעלות צלזיוס.

3. ליפוזום שחול

  1. להוסיף 1 מ"ל של PBS המכיל החלבון השומנים-מקושר אל הצינור 12 mL המכיל ליפידים. Sonicate הפתרון עבור 30 s כדי 1 דקות באמבט מים sonication. לנוח במשך 5 דקות או יותר בין כל סיבוב וחזור על 3 – 4 פעמים.
  2. להכין extruder לפי הוראות היצרן.
    1. להוסיף את תומך מסנן התמיכה ממברנה פנימית, מקום כמה טיפות (10 µL כל) של PBS בסרט פרפין. באמצעות פינצטה, תפוס על קצה של התמיכה מסנן וטובל בתיבה הנפתחת 10 µL.
    2. מקם את המסנן פנימה o-ring. . לעשות את זה עבור שני הצדדים. באמצעות פינצטה, תפוס מסנן מיקרומטר 0.8 בקצה וטבול הירידה 10 µL, המעיל החיצוני של o-ring עם PBS. הנח את המסנן מיקרומטר 0.8 בעדינות על o-ring המסנן עושה לא מעל לתלות את התמיכה ממברנה פנימית.
  3. מקם את הבלוק חימום extruder על גבי צלחת חמה לחמם מראש את מכבש. להחליף את הכיריים על אש נמוכה ולאפשר המתקן חימום לחסום להגיע לטמפרטורה הרצויה. כדי למנוע בעיות אפשריות עם חלבון צבירה, שלא לחמם הרחוב האחרונות 37 מעלות צלזיוס.
  4. לטעון את הדגימה sonicated לאחד מזרקים extruding ימוקם המתקן. למקם את המזרק extruder הקצה השני של המתקן. הקפד שהבוכנה מזרק ריק נקבע לאפס. המזרק הריק ימלא ככל השומנים הנמתח דרך קרום מיקרומטר פוליקרבונט 0.8. נסה להימנע עובר בועות הלוך ושוב דרך הקרום.
  5. למקם את המתקן שהרכבתם הבלוק חימום. בעדינות לדחוף את הבוכנה של המזרק מלא עם שומנים המזרק ריק. בהתאם ריכוז השומנים, זה יהיה קשה להמשיך. חזור על 20 x.
  6. הסרת המתקן שהרכבתם מהגוש חימום. אט-אט להסיר את המזרק מלא של המתקן, הקפד לאסוף כל שומנים זה עלול לדלוף החוצה בעת הסרת. הצב ליפוזומים לתוך בקבוקון נקי. חזור על השלבים 3.4-3.6 באמצעות פוליקרבונט 0.2 µm וממברנות מיקרומטר 0.1.
  7. ליצור עמודה חרוז 0.7 x 50 ס מ agarose צולבים2 ההפרדה במגוון של 0.7-10 מגה Daltons (מד א) equilibrated ב- PBS. להוסיף ליפוזומים ולהפעיל כמו שלב 1.6. שברים המכיל ליפוזומים פחתו שידור של אור בטווח 250 – 400 nm.
  8. לאחסן ליפוזומים ב 4 ° C, אין להקפיא.

4. סידן השטף לפקח B-cell להפעלה באמצעות ליפוזומים Antigenic

  1. המתת חסד עכברים על ידי פחמן דו-חמצני (CO2) או איזופלוריין יתר, על פי נהלי מוסדיים. לאשר המתת חסד של עכברים מאת נקע בצוואר הרחם.
  2. לחטא כלי כירורגי, עכברים קארקאס באמצעות אתנול 70%. שימוש 10 ס מ, עצה 0.8 מ מ, מעוקל איריס מלקחיים כדי להפריד את העור המכסה את חלל החזה של כלוב הצלעות. להשתמש 10 ס מ ארוך, ישר לנתח מספריים לעשות חתך דיסטלי עם חתך הדו-צדדיים.
  3. שימוש מעוקל איריס מלקחיים ומספריים ויבתר לחלץ את חלל הבטן של הטחול. הסרת רקמות שומן סביב הטחול ולאחר מכן מקם אותו 15 מ"ל פוליסטירן חרוט צינור מלא בינוני RPMI1640 ממוחשב המכיל 1% עגל עוברית סרום (FCS), פניצילין-סטרפטומיצין.
  4. העברת הטחול ומדיה מעל מסננת תא 40 µm מצויד על צינור חרוטי 50 מ. בעדינות בעזרת גומי סוף פומפה מזרק 3 מ"ל, לרסק את הטחול. לשטוף את מסננת תא 40 מיקרומטר עם התקשורת. חזור על תהליך זה עד רק רקמת השומן שנשאר בתוך מסננת תא 40 מיקרומטר. לשטוף את המסננת עם 3-5 מ של המדיה כדי להגדיל את התא השחזור.
  5. צנטריפוגה תא homogenate ב x 300 גרם במשך 5 דקות ב- RT. לאחר צנטריפוגה, למחוק את תגובת שיקוע ולהוסיף 10 מ ל 1 x RBC פירוק מאגר בגדר. פיפטה למעלה ולמטה, להשאיר למשך 2-3 דקות ב RT ו צנטריפוגה ואז ב x 300 גרם במשך 5 דקות ב- RT.
  6. למחוק את תגובת שיקוע, resuspend תא דם אדום דלה splenocytes ב- 10 מ"ל של מדיה. לקבוע את מספרי הטלפון הנייד הכולל שימוש של hemocytometer או הפלאפון האחר ספירת ההתקנים. גלולה התאים על ידי צנטריפוגה כמתואר לעיל.
    הערה: הריכוז הסופי האידיאלי הדרושים לטעינה הינדו-1 של splenocytes הוא 10 – 20 x 106 תאים למ"ל, אך ניתן להשתמש ריכוז נמוך יותר של תאים.
  7. Resuspend splenocytes ב- 15 x 106 תאים למ"ל סידן זורמים טעינת מאגר (בינוני RPMI1640 המכיל 1% FCS, 10 מ מ 4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic חומצה (HEPES), 1 מ מ מגנזיום כלוריד (MgCl2), (אתילן גליקול-bis 1 מ מ אתר β-aminoethyl)-N, N, N', N'-tetraacetic חומצה (EGTA) ו- 5% פניצילין סטרפטומיצין). להוסיף 1.5 מיקרומטר הינדו-1 מתוך 1 מ"מ דימתיל סולפוקסיד מניות פתרון, היפוך ברכבת התחתית מספר פעמים כדי לערבב. להגן מפני אור, דגירה תאים ב- 37 מעלות צלזיוס המים הרותחים למשך 30 דקות.
  8. בעקבות הדגירה 30 דקות, מוסיפים 5 x כמות סידן השטף טעינת מאגר. צנטריפוגה ב x 300 גרם במשך 7 דקות ב- RT.
  9. עבור gating בתאי B, כתם תאים עם העכבר אנטי 1:200 CD5-PE, אנטי-העכבר 1:200 B220-PE/Cy7 ב 0.5 מ של טעינת מאגר ב 4 מעלות צלזיוס למשך 20 דקות, מוגן מפני אור.
  10. לשטוף splenocytes סידן זורמים טעינת מאגר, צנטריפוגה ב x 300 גרם במשך 7 דקות ב- RT. Resuspend תאים ב 10 – 20 x 106 תאים למ"ל סידן זורמים הפעלת מאגר (של האנק מאוזנת תמיסת מלח (HBSS) המכיל 1% FCS, 1 מ MgCl2 ו- 1 מ מ סידן כלורי (2CaCl)). לאחסן בקירור, מוגן מפני אור עד מוכן לרוץ על זרימה cytometer.
  11. תוכנית ההתקנה cytometry זרימה עם הכתם וללא רבב, רווק פקדים לפיצוי.
    1. להפעיל את התאים מוכתם להגדיר את השערים כראוי (ראה איור 2 א). ההתקנה הינדו-1 (סגול) לעומת מגרש הינדו-1 (כחול), להתאים את המתחים בערוצים הינדו-1 כדי למקם את התאים מכתים על מדרון של 45 – 60 ° כדי למקסם את האות: יחס לרעש של הסגול הינדו-1: כחול בשינוי היחס בעקבות גירוי B-cell.
      הערה: ודא המתחים הם לא גבוה מדי, כך אחוז משמעותי של התאים (> 5%) הם נגד העליון של העלילה.
    2. יצירת שער אלכסוני המכיל בחלק השמאלי העליון (סגול+כחול–) של העלילה, כך ללא גירוי < 10% של התאים נמצאים בשער, אשר צריך להגדיל באופן אידיאלי כדי > 75% בעקבות גירוי.
  12. להוסיף 0.5 מ"ל של תאים רצ'ט 5 מ ל סביב צינור פוליסטירן התחתון (לפעיל על-ידי קרינה פלואורסצנטית תא מיון (FACS) tube), התאים 37 º C למשך 3-5 דקות באמבט מים חמים. מקם את הצינור FACS בחדר מכסה מים של 37 ° C מחובר אליו באמבט מים ומחזור.
    1. להפעיל את הצינורית water-jacket על cytometer זרימת וליזום רכישה, ללא אחסון הנתונים, כ 5,000 – 10,000 אירועים/s. ברגע התאים מיוצב (15-30 s), ליזום רכישה ולאסוף נתונים לפחות 10 s כדי ליצור את הרקע.
    2. -הסימן s 10, במהירות להסיר את הצינור cytometer הזרימה, להוסיף את גירוי (5-50 mM, antigenic ליפוזומים ב 2 – 20 מ ל), דופק מערבולת, ולחזור FACS צינור אל cytometer הזרימה. לשמור על רכישת נתונים ואחסון בתקופה זו ולאסוף נתונים למשך 3-5 דקות.
  13. ניתוח נתונים בתוכנה המתאימה ניתוח תחת הפונקציות קינטיקה.

5. הכנת תמצית בוטנים

  1. תמצית חלבונים בוטנים על ידי ערבוב הקמח בוטנים על יחס 1:5 (wt:vol) של פוספט buffered תמיסת מלח (PBS) עם 1 מ' נתרן כלורי (NaCl). לערבב פתרון בצלחת מערבבים מגנטי עבור 2 h ב- RT תוך שמירה ב- pH 8.5.
  2. צנטריפוגה פתרון ב x 3000 g למשך 45 דקות ב 4 º C. Decant ולחטא מסנן-תגובת שיקוע ברצף דרך מסנן מיקרומטר 0.4 ואחריו מסנן 0.2 µm. לקבוע ריכוז החלבון על ידי חומצה bicinchoninic assay (BCA) באמצעות אלבומין שור (BSA) התקנית.
  3. להפחית, denature מדגם של חלבונים בוטנים עם 50 מ מ dithiothreitol (DTT) במאגר המכילות ליתיום dodecyl סולפט ב- pH של 8.4, אשר מאפשר פעילות מקסימאלית של צמצום הסוכן, חום ב- 70 מעלות צלזיוס למשך 10 דקות.
  4. הפעל µg 10 שפגע בסימני החלבון בוטנים על Bis-טריס 4 – 12% precasted לזיהוי ג'ל שנועד לתת ההפרדה אופטימלית מעבר צבע ג'ל עם משקל מולקולרי מראש צבעונית סטנדרטי.
  5. מכתים את הג'ל עם disulfonated triphenylmethane, destain עם ddH2O. זיהוי ידוע אלרגנים בוטנים הגדולות עארה h 1, 2 ו- 3 בהכנות תמצית. עארה h 1 מופיע 63 kDa, עארה h 2 אמור להופיע כמו איזופורמים שני-kDa 17, 19, ומופיע עארה h 3-kDa 37 (חומצי יחידה משנית).

6. רגישות עולה של עכברים כדי בוטנים

  1. Resuspend 1 מ ג טוקסין הכולרה במים הנדסה גנטית 1 מ"ל. להכין 200 µL מדולל בוטנים תמצית המכילה 2 מ ג חלבון בוטנים 10 µg טוקסין הכולרה ב- PBS.
  2. לנהל µL 200 של התמצית בוטנים המכיל כולרה, רעלן (2 מ ג חלבון בוטנים ו 10 טוקסין הכולרה µg) דרך gavage אוראלי העכבר הנשי BalB/cJ כל 4-5 בשבוע הישן. חזור על פעם בשבוע במשך שלושה שבועות (קרי, ימים 0, 7, ו- 14).
  3. לנהל 300 µL מדולל תמצית בוטנים (המכילה חלבון בוטנים 5 מ"ג ו 10 טוקסין הכולרה µg) דרך הפה gavage את העכבר כל בשבוע הרביעי (קרי, 21 יום).

7. האתגר עכברים עם תמצית בוטנים

  1. ביום 28, להכין תמצית בוטנים כדי ריכוז סופי של 1 מ"ג/מ"ל ב- PBS. למדוד חום הגוף בסיסית באמצעות מדחום רקטלי (כ 37.5-38.5 מעלות צלזיוס). לנהל µL 200 (200 µg) של תמצית בוטנים באמצעות הזרקת בקרום הבטן (i.p.).
  2. למדוד את חום הגוף עם חום לרקטום כל 15 דקות לשעה לאחר ההזרקה. אפשר לטבול טמפרטורת הגוף עולה אלרגיה בוטנים.
    הערה: היפותרמיה מהווה סימן היכר של אנפילקסיס בעכברים. האתגר הזה תדגים עכברים אלרגיים בוטנים. בדרך כלל, 90% של עכברים Balb/cJ עוברים פרוטוקול רגישות עולה לפתח תגובות אלרגיות במהלך אתגר מאופיין לפחות על ירידה בטמפרטורה של 2 – 3 ° C.

8. בידוד של Splenocytes של עכברים אלרגית והעברת המאמצת

  1. לבודד את splenocytes של תמים ועכברים אלרגית בוטנים.
    1. ביום 30, המתת חסד תמימה והן מאושרות עכברים אלרגית בוטנים על ידי מתן 3 L/דקה של CO2 בחדר גזים. לאשר המתת חסד של עכברים על ידי ניקור חזה דו צדדיים. לחטא כלי כירורגי, קארקאס העכבר באמצעות אתנול 70%. להשתמש מלקחיים כדי להפריד את העור המכסה את חלל החזה של כלוב הצלעות. להשתמש במספריים ויבתר ישר לעשות חתך הדו-צדדיים שובר את הצלעות ימינה ושמאלה.
    2. להשתמש מלקחיים ומספריים ויבתר לחלץ את חלל הבטן של הטחול. הסרת רקמות שומן סביב הטחול לפני הנחת צינור חרוטי פוליסטירן 15 מ"ל, מלא בינוני 10 מ"ל RPMI 1640.
    3. ב תא סטרילי למינארי, שופכים הטחול ואת מדיה לתוך פוליסטירן 35 מ מ צלחת פטרי. לשמור תמים splenocytes אלרגית נפרד פטרי ומדיה במהלך תא בידוד. השתמש סטיריליים מלקחיים ומספריים ויבתר כדי לחתוך את הטחול לתוך שלוש חתיכות ולחזור אל צלחת פטרי.
    4. משתמש קצה מחוספס, עמומה שתי שקופיות מיקרוסקופ זכוכית, בעדינות homogenize (ב RPMI) החלקים הטחול עד לבן רקמת נשאר בין שקופיות. לשנות שקופיות בין קבוצות.
    5. להעביר תא homogenate פטרי דרך מסננת תא מיקרומטר 70 מצויד על צינור חרוטי 50 מ. עוברים בטחול והשריד מסננת עם פומפה של מזרק 1 מ"ל. יש לשטוף את המסננת עם 5 מ של RPMI כדי ששחזור התא. העברת פילטרט של צינור חרוטי פוליסטירן 15 mL, ו צנטריפוגה (450 x g, 10 דקות, RT).
    6. האחות תגובת שיקוע והוסף צניפה תא resuspend מאגר פירוק של תאי הדם האדומים 2 מ"ל (0.83% אמוניום כלוריד במאגר טריס 10 מ מ, pH 7.2). לערבב, תקופת דגירה-RT של 2-3 דקות להוסיף 10 מ של PBS - 2% FBS, צנטריפוגה ב x 300 גרם במשך 7 דקות ב- RT.
    7. לשטוף את התאים שוב עם 12 mL PBS - 2% FBS לחלוטין להסיר כל שיורית אמוניום כלוריד, צנטריפוגה ב 300 x גרם במשך 7 דקות בתא RT. מחדש להשעות הצניפה ב 2 mL RPMI 1640 בינוני. ספירת תאים באמצעות hemocytometer או מנתח המטולוגיה אוטומטית.
  2. באמצעות G 27, 5/8 אינץ מחט מזרק אינסולין 1 מ"ל, להזריק לווריד 15 x 106 אלרגית או תמים splenocytes חילוץ כמתואר לעיל (ב- 200 µL) דרך הזנב הווריד לתוך עכברים תמימה (unsensitized).

9. הזרקה של עכברים עם ליפוזומים Antigenic h 2 עארה

  1. להכין Ah2 ליפוזומים המכיל 0.1% Ah2-2.5 מ מ השומנים. לחישוב ריכוז חלבון, המקדם הכחדה של Ah2 היא 15,000 מ-1. לדלל ליפוזומים מיקרומטר 300 ב- PBS סטרילי.
  2. יום אחד לאחר העברתם המאמצת (יום 31) של אלרגיות או תמימה splenocytes, להזריק לווריד µL 200 של PBS או Ah2 antigenic ליפוזומים (300 מיקרומטר) המכיל סך של 1.38 אינץ µg של Ah2 דרך וריד הזנב BALB/cJ עכברים שקיבלו את splenocytes בשלב 8.2.

10. דחיפה והאתגר של עכברים עם עארה h 2

  1. שבועיים לאחר ההזרקה עם Ah2 ליפוזומים, ביום 45, להשתמש אזמל מנתחים בעלי חיים של 4 מ מ כדי לאסוף 50 – 200 µL של דם מצומת submandibular של העכבר. לאסוף דם בצינור מפרידים סרום ללא הפארין; נפרד הנסיוב על ידי צריך שתוציאו ב 6,000 x g עבור 15 דקות להשתמש הסרום שנאספו ולאחריה מידה אנטיגן ספציפי נוגדנים.
  2. ביום 46, שבועיים אחרי הזרקת עכברים עם ליפוזומים (שלב 9.2), להגביר את העכברים על ידי זריקה i.p. של µL 200 ל- PBS או 200 µg של Ah2 מסיסים (מטוהרים כפי שתואר לעיל16).
  3. ביום 60, לאסוף 50-200 µL של דם מצומת submandibular של העכבר, לעבד דם, כפי שתואר לעיל.
  4. ביום 61, אתגר לכל קבוצה של עכברים עם זריקה i.p. של 200 µL של 300 µg Ah2 מסיסים. למדוד חום הגוף עם בדיקה רקטלית כל 15 דקות כמו בסעיף 7.

11. כימות עארה h 2 ספציפיים IgE, IgG1 מאת אליסה

  1. מעיל של 96-ובכן מקושרים-אנזים immunosorbent assay (אליסה)-צלחת תואמת עם 100 µL HSA-DNP (2, 4-dinitrophenyl הפטן מצומדת האנושי אלבומין, µg 20/mL) עיקול רגיל או Ah2 (µg 5/mL) כי הדוגמאות סרום שנאספו בשלבים 10.1 ו- 10.3, מדולל ב מאגר ציפוי (מאגר קרבונט-ביקרבונט 50 מ מ, pH 9.6) 4 ° C בלילה או 37 ° C עבור > 1 h.
  2. תשטוף שלוש פעמים עם 200 µL PBS-T (PBS עם 0.05% Tween-20) ולחסום וולס עם PBS-T µL 200 המכיל 2% BSA ב 37 ° C עבור > 2 h.
  3. אליסה IgE ספציפי Ah2, להוסיף תקנים IgE-נגד-DNP µL 50 (2 – 0.002 µg/mL, המוכן דילולים טורי 1:2) או הדוגמאות סרום העכבר (1:20 דילול) דגירה בין לילה ב 4 º C. אליסה IgG1 ספציפית Ah2, להוסיף 100 µL מטוהרים IgG1-נגד-DNP סטנדרטים (2 – 0.002 µg/mL, המוכן דילולים טורי 1:2) או עכבר הדוגמאות סרום (דילול שבערך), דגירה בין לילה 4 ° C או h 1-37 מעלות צלזיוס.
  4. תשטוף שלוש פעמים עם 200 µL PBS-טי אליסה IgE ספציפי Ah2, להוסיף 100 µL כבשים אנטי-העכבר IgE (0.5 µg/mL) דגירה ב 37 ° C עבור 1 h. אליסה IgG1 ספציפית Ah2, להוסיף 100 µL IgG1 אנטי-העכבר HRP עז (מדולל 1:40,000 ב- PBS-T - 2% BSA). דגירה ב 37 ° C עבור 1 h.
  5. תשטוף שלוש פעמים עם 200 µL PBS-טי עבור IgE ספציפי Ah2 אליסה, להוסיף 100 µL biotinylated חמור נגד אג (0.5 µg/mL) הצאן דגירה ב 37 מעלות צלזיוס למשך 45 דקות. עבור Ah2 ספציפיים IgG1 אליסה, דלג לשלב 11.7.
  6. תשטוף שלוש פעמים עם 200 µL PBS-טי אליסה IgE ספציפי Ah2, להוסיף 100 µL טעונה נייטרליים אבידין-חזרת peroxidase (למשל, NeutrAvidin-HRP, 0.3 µg/mL), דגירה ב 37 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות.
  7. להוסיף 100 µL 3, 3', 5, 5-Tetramethylbenzidine (שוייץ) המצע, דגירה 10-15 דקות או עד דגימות כחול כהה, לאחר מכן להוסיף 100 µL שוייץ להפסיק פתרון. לקרוא את הצלחת ב 450 ננומטר.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

ניתן להדגים ההטיה של החלבון עניין עם DSPE-PEG(2000) על-ידי הפעלת תוך צמצום מראה עלייה משקל מולקולרי בהשוואה החלבון unconjugated. איור 1A מציג ג'ל נציג של העכבר אנטי IgM F(ab) פרגמנט ההטיה כדי פג-DSPE, אשר מראה על 2-3 kDa bandshift עבור החלבון denatured. שימו לב כי כ- 50% של החלבון מופיע כדי להיות שונה, אשר צפויה לאור העובדה 1:1 סטויכיומטריה הושגה על השבר Fab זה heterodimer של שרשרת קל. איור 1B מראה ג'ל נציג של Ah2 ההטיה פג-DSPE. כדי להעריך סידן שטף של תאי-B מגורה על ידי antigenic ליפוזומים, שני דברים מכריעים: (1) את הגדרות המכשיר מכוונים לראות הבדל ביחס של קרינה פלואורסצנטית הינדו-1 ב- Ca2 + מאוגדים (סגול) ואת לא מאוגדים טפסים (כחול) ו- (2) תקין gating אסטרטגיה משמש כדי להעריך את הפעלת B-cell. איור 2A מציג את ערכת חסימה עבור וזמינותו השטף סידן מבוססי cytometry זרימה. לימפוציטים בשידור חי הן פיקוח בחלונית האס-A לעומת FSC-A (שמאל), doublets הן פיקוח בחוץ FSC-W לעומת האס-W מגרש (לוח האמצעי), וכן B200+CD5– B-תאים נבחרים מן העלילה vs B220-PE/Cy7 CD5-PE (לוח נכון). איור 2B מדגים את היחס שבין הינדו-1 (סגול) לעומת הינדו-1 (כחול) זריחה לאורך זמן כמו ניתוח. שים לב כי ריכוז החלבון הכולל של F(ab) ו- F(ab')2 מבחני אלה היו זהים, הוכחת יכולת מעולה של ליפוזומים antigenic תוך הפעלת B-cell מגרה. לאחר הכנת תמצית בוטנים, הרץ aliquot ג'ל מרחביות-דף כדי לקבוע את כמויות יחסיות עארה h 1, 2 ו- 3 בתוך התמצית. איור 3 מראה ג'ל נציג של מיצוי בוטנים היה לפעול לצד Ah2 מטוהרים. איור 4 מראה סכימטי של המודל העכבר הכללית המאמצת אלרגיה לבוטנים, כולל רגישות עולה הראשונית כדי בוטנים, אתגר בוטנים, בידוד splenocyte, העברה המאמצת, זריקות ליפוזום, לקיחת הדם ואחריו דחיפה Ah2, ו אתגר כדי Ah2. IgE ספציפי Ah2 ו- IgG1 ELISAs נוהלו לכמת immunoglobulins בנסיוב, כפי שמוצג באיור 5A ו- B. עכברים עם רגישות שהוענקו יש כבר והציגה עם Ah2 יהיה IgE ספציפי Ah2 IgG1 בנסיוב שלהם. חום הגוף שנרשם במהלך האתגר Ah2 מוצגים באיור 5C; עכברים אלרגית שחלה ירידה בטמפרטורות הגוף בעקבות האתגר, בעוד טמפרטורות הגוף בעכברים תמים נותרה עקבית. תמונות המציגות עכברים תמימה לעומת עכברים בוטנים-אלרגית במהלך האתגר מוצגים באיור 6.

Figure 1
איור 1: ג'ל נציג של אנטי-העכבר ההטיה IgM F(ab) ו- Ah2 כדי פג-DSPE. (A, B) ניתוח מרחביות-דף של (A) עז העכבר אנטי IgM F(ab) המקטע וגם Ah2 (B) לפני ואחרי ההטיה כדי פג-DSPE. עז אנטי-העכבר IgM ו- Ah2 יש משקל מולקולרי kDa כ 48 ל 18, בהתאמה. בעקבות השינוי, משקל מולקולרי קצת יותר גדולים (~2.5 kDa) הוא ציין בבירור שני חלבונים. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

Figure 2
איור 2: נציג gating אסטרטגיה, התוצאות השטף סידן ו ניתוח. (א) תאים נותחו באמצעות האסטרטגיה המגביל הבאים: חיים לימפוציטים (FSC-A לעומת האס-A), תאים בודדים (FSC-W לעומת האס-W), תאי-B (B220+CD5–). (B) הינדו-1/2 + שטף את תגובת רשות האישורים (סגול לעומת כחול) של תאי B. המוצג הוא שטף סידן עבור ליפוזומים מקטע Fab אנטי-IgM anti-IgM F(ab')2 -ריכוז חלבון זהה (2.5 µg/mL) כמו גם תאים מגורה-מאגר כפקד. שימו לב כי בין 10-22 s כאשר הגירוי נוסף, לכן, אין נתונים היא רכשה בתקופה זו. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

Figure 3
איור 3: ג'ל נציג מציג תמצית בוטנים, Ah2. תמצית בוטנים מכיל חלבונים שונים, כולל אלרגנים עארה h 1, 2, 3 ו- 6, לעומת איזופורמים שני המופיעים על Ah2. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

Figure 4
איור 4: סכימטי של פרוטוקול העברת המאמצת. תמים BALB/cJ עכברים היו רגיש עם תמצית בוטנים (PN) וטוקסין הכולרה (CT), לאחר מכן אתגר PN. Splenocytes של עכברים אלרגית מאושרות היו מבודדים והועבר לתוך תמים עכברים. עכברים היו מאוחר יותר בשלה עם immunogenic עארה h 2 ליפוזומים או PBS ולאחר מכן שיפרה עם Ah2 מסיסים. לבסוף, עכברים לערער עם Ah2 כדי לפקח אנפילקסיס. הדם שנאספו בימים 45 ו-60 שימשו לכמת immunoglobulins ספציפית Ah2. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

Figure 5
איור 5: Immunogenic Ara h 2 ליפוזום מגביר את תגובות אלרגיות שהוענקו-זיכרון. סרום היה מבודד קדם (יום 45) ו פוסט (60 יום) דחיפה עם PBS או µL 200 של 300 מיקרומטר immunogenic Ah2 ליפוזום למדוד IgE Ah2-sepcific (א) ו- IgG1 (B). עכברים בודדים מיוצגים עם קווי המציין medians. עכברים זה התקבל splenocytes אלרגית והיו מנוהל Ah2 ליפוזומים ביום 32 היו רמות גבוהות יותר באופן משמעותי של IgE ספציפי Ah2 IgG1. אנפילקסיס נמדד בקבוצות טיפול שונה על ידי רישום טמפרטורות הגוף לאחר Ah2challenge (C). מתכוון טמפרטורות הגוף מתואר ב- SEM תמימה: PBS (תמימה splenocytes, ראש הממשלה PBS), Allergic: PBS (מאושרות splenocytes אלרגית ו ראש הממשלה PBS), Allergic: Ah2 (אישר splenocytes אלרגית Ah2immunogenic ליפוזום ראש הממשלה). * P < 0.05, * * P < 0.01, * * * P < 0.001, * * * P < 0.0001 נקבעים על-ידי אינטראקצית 2-זנבית של סטודנט t-מבחן. שימו לב כי תוצאות אלה הם נציגים של שני ניסויים עצמאית. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

Figure 6
איור 6: סימפטומים אנפילקטי ציין במהלך האתגר Ah2. עכברים תמים להישאר פעילה, יש גוון ורוד על רגליהם (א, ג). עכברים אלרגית פחתו פעילות, הם לעיתים קרובות שפופות, יש קשה לה לנשום, לחוות כיחלון, המצוין על-ידי עור סגול כהה על רגליהם (B, D). אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

MW 790 387 2900 3000 48000
DSPC כולסטרול פג-DSPE פג עודף-DSPE . IgM-פג-DSPE סה
יחס שן טוחנת 57 38 3.9 1 0.1 100.00
מסה (מ ג) 0.56 0.18 0.14 0.04 0.06 0.98
m mol 0.71 0.47 0.05 0.01 0.00 1.25
mL 112.50 45.93 70.64 0.00 525.97 755.03
Conc. (mg/mL)
DSPC 5
כולסטרול 4
פג-DSPE 2
. IgM-פג-DSPE 0.114

טבלה 1: חישובים ליצירת ליפוזום ריכוז השומנים הכולל של 1.25 מיקרומטר. דוגמה טבלת חישוב עבור עז העכבר אנטי IgM F(ab) פרגמנט ליפוזומים.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

השיטות המתוארות כאן הם עבור הבניין של חלבון כדי ליפופרוטאין אשר מאפשר את התצוגה של החלבון על חלקיקים liposomal פרוטוקול כללי. חלבונים יחידה משנית ריבוי גדול מאוד, פרוטוקול זה תהיה מוגבלת השירות. השיטה האידיאלי יהיה המבוא של תג בייעודי לאתר המאפשר אסטרטגיה כימי biorthogonal קישור לשמש. אם המבטאת את החלבון recombinantly, זה יכול להיות אפשרי באמצעות אסטרטגיות ספציפיות לאתר זמין17, ואת מגוון רחב של קבוצות פונקציונליות בסוף השומנים PEGylated כי הם זמינים מסחרית. בהתאם לכך, פרוטוקול זה מכוון לעבר החיבור של חלבון מבודד ממקורות טבעיים והוא נגיש מגוון רחב של מדענים לא בהכרח מוכר בהמרות כימי וביוכימי.

היבט מרכזי של ריצה ניסוי השטף סידן זה צריך להדגיש הוא כי לא יופעלו התאים לפני הפעלת אותם על cytometry זרימה. אם סטרילי טכניקה לא משמש בקפדנות, זה חשבון עבור אות רקע מתאי מופעל (Indo-1 זריחה מוטה כלפי שלה פליטה בערוץ סגול). באופן דומה, תאים יש לשמור על הקרח לפני הפעלת וזמינותו להימנע רמות חריגות של רקע שידור בערוצים הינדו-1. חשוב גם לוודא כי התאים מחוממות למשך 2-3 דקות לפני רכישת מאת cytometry זרימה וברחבי גירוי במהלך איסוף הנתונים. אם התאים אינם נשמרים ב- 37 מעלות צלזיוס במהלך איסוף הנתונים, ניתן לצפות כי תאים לא יגיבו מקסימאלית. מאז אנטיגן ספציפי B-תאים קיימים עכברים במספרים קטנים מאוד, באמצעות אנטיגן הפונדקאית לעורר כל תאי-B של עכברים הוא אידיאלי. למרות אינספור זנים העכבר הטרנסגניים זמינים אקספרס אנטיגן ספציפי תאי-B, שהמטרה של טכניקה זו היא כדי לאפשר למשתמש הממוצע שניתן יהיה לאמת את יכולתם לעשות ליפוזומים antigenic שימוש בעכברים פראי-סוג. כדי להשיג מטרה זו, Fab שברי אנטי-העכבר IgM היו קשורים שומנים, מנוסח לתוך ליפוזומים antigenic זה קשר צולב את הקולטן B-cell (BCR) בצורה polyclonal. ראוי לציין כי בעבר הוכח כי ניתן להשתמש בשיטה זו כדי לגרות את תאי-B האנושי10 שימוש המתאים נגד הרסיס IgM חיובי, אשר הוא משמעותי, כי אין אפשרות לגשת מספרי משמעותי של אנטיגן ספציפי B-תאים אנושיים. במחקרים אלה, העוצמה של ליפוזומים antigenic לגרות תאי B הפעלה היה מאויר על ידי יכולתם משופרת לזירוז השטף סידן בהשוואה כמויות שוות של אנטי-העכבר IgM F(ab') 2 קטעים.

השימוש ליפוזומים antigenic אפשרה הפיתוח של שיטת sensitizing BALB/cJ עכברים בוטנים מעביר splenocytes עכברים אלרגית לתוך תמים עכברים, מזריק העכברים המארח Ah2 ליפוזומים, מאתגרים אותם עם Ah2. רמות נוגדן אנפילקטי התגובות בתוך קבוצות של עכברים הם לשחזור במודל זה. . זה היה לצפותו תא B ו T זיכרון התגובות שחיוניים בפיתוח של נוגדנים ספציפיים בוטנים בעכברים. יתר על כן, מחקר שנערך לאחרונה הראה את הזיכרון הזה תאי-B לאכלס מחדש תאים פלזמה בעכברים, אשר לשמור על רמות גבוהות של IgE אנטיגן ספציפי; לכן הזיכרון אלרגן ספציפיים תאי-B הם ליעד אטרקטיבי עבור התערבות טיפולית18. המודל המתואר כאן ועכשיו מאפשר הזדמנות לפגוע ישירות תאי זיכרון B Ah2 ספציפי, לעומת גישה לדיכוי המערכת החיסונית באמצעות bortezomib כדי לרוקן את כל התא פלזמה רפרטואר19. גישה אחרת כדי להילחם אלרגיות היא לגרום סובלנות בתא T-cell. אסטרטגיה אפשרית אחת היא לתמצת בתדר סובלנות adjuvants בתוך ליפוזום. בעבר, חלקיקים לבצע rapamycin שימשו כדי לגרום Tregs ומפחית מחלות אוטואימוניות20. סוג זה של גישה יכול להיות מועסק לפתח טיפולים tolerogenic לטיפול אלרגיה לבוטנים. בסך הכל, מניפולציה של ליפוזום אלרגן ספציפיים על-ידי conjugating מולקולות על פני השטח מאפשר תגובות חיסוניות המותאמים ומאפשר לבצע, כמו סמים מולקולות משלוח של סמים לתא אלרגן ספציפיים.

מגבלות כללי של מודל זה העכבר של אלרגיה לבוטנים רגישות זו עולה כדי בוטנים עם טוקסין הכולרה, אתגר בוטנים עוקבות באמצעות הזרקת i.p. אינה לגמרי נציגם של בני אדם (למשל, לבני האדם יש אלרגיה לבוטנים תגובות על בליעה דרך הפה). עם זאת, מודל זה אלרגיה הוא תקן הנוכחי18,11,שדה21, ומאפשר לנו לחקור מנגנונים מולקולריים של מחלות אלרגיות ולפתח רומן גישות טיפוליות. לעומת אלה גישות קונבנציונליות, מודל זה העברה המאמצת מציע שלושה יתרונות העיקרי. הראשון הוא שהם מאפשרים זיכרון ו- T-לימפוציטים הספציפי לאלרגן להילמד באופן ישיר יותר. ואכן, עדויות עכשיו בחום מרמז זיכרון תאי-B כמקור העיקרי של אלרגיות לטווח ארוך18. שנית, בגלל מספר זהה של זיכרון ו- T-לימפוציטים מושתלים לתוך כל עכבר הנמען, לתגובות אלרגיות הם מינימלית המשתנה. שלישית, מודל זה מספק הזדמנות ללמוד תגובות אלרגיות לאלרגנים בודדים, אשר הוא שימושי בהקשר של בדיקות immunotherapies חדש. יישום אחד מסקרן של מודל זה היא להשתמש שהגישה הכללית בהקשר של מודל humanized העכבר, איפה תגובות אלרגיות נחקרו לחסן מודלים22. החלת בהקשר של מודל העברה המאמצת, מודל humanized העכבר יכול להיות רב עוצמה גישה הרחבה, ויוו בדיקות של ו T-לימפוציטים מחולים אלרגית.

נוגדנים למחלה הפתוגנזה אינה מתרחשת רק במודלים אלרגית, אך גם ב B-cell מתווכת מחלות אוטואימוניות23. Adoptively העברת sensitized splenocytes עכברים נתון של autoantigen בסופו של דבר להיות מאוד שימושי להורדת מספר בעלי החיים שבהם משתמשים, לצמצם את מספר בעלי החיים שקיבלו זריקות מרובות של אדג'וונט ולהגדיל את הפארמצבטית של תגובות בין גדודים של עכברים ב מספר סימנים למחלה. דוגמה אחת יהיה במודל חיסון ניסיוני של מיאסטניה גרביס (EAMG) איזה עכבר רגישים זנים (C57BL/6, SJL ו AKR) נמצאים לחסן מספר פעמים עם קולטני אצטילכולין (AChR) ב אדג'וונט לפתח עצמיים פתוגניים. עצמיים אלה בסופו של דבר להוביל immunopathological תכונות קיימות בבני אדם כגון עייפות/חולשת שרירים, הפקדה של immunoglobulins ורכיבים המשלים על צמתי neuromuscular ואת התחלואה/מוות במקרים חמורים24. ב- EAMG, שכיחות המחלה משתנה מאוד בין 50 – 70%, אז לקחת בחשבון ההשתנות גדודים בעלי חיים גדולים יש צורך להגיע מובהקות סטטיסטית25,26. השיטה המתוארת כאן בסופו של דבר להפחית את מספר בעלי החיים שבהם משתמשים על-ידי הפחתת מידת ההשתנות של המחלה. כאמור, EAMG הנגרמת על ידי זריקות מרובות עם AChR + adjuvants (אדג'וונט של שלמה פרוינד ו אדג'וונט של פרוינד שלם) כדי להפעיל אוטומטית-נוגדן תגובות. שיטה זו יפחית את מספר בעלי החיים מקבלים מספר מזריק עם אדג'וונט. בסופו של דבר, בשל אופיו של החיסונים ומגביר מרובים, קשה יחסית להגדרת windows טיפולית המתאימה לטיפול מניעתי וטיפוליים. שיטה זו יעזור לסנכרן נוגדנים בתגובה ומחלות פתוגנזה החלון, שהופך אותו יותר לחיזוי, לשחזור. ההגיון הזה ניתן ליישם אחרים העכבר דגמים רבים של מחלות אוטואימוניות נוגדן מתווכת, כגון דלקת מפרקים שגרונית27.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

המחברים אין לחשוף.

Acknowledgments

מחקר זה נתמך על ידי מענקים משרד ההגנה (W81XWH-16-1-0302 ו- W81XWH-16-1-0303).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Model 2110 Fraction Collector BioRad 7318122
Cholestrol Sigma C8667 Sigma grade 99%
SPDP Thermo Fisher Scientific 21857
DSPC Avanti 850365
DSPE-PEG 18:0 Avanti 880120
DSPE-PEG Maleimide Avanti 880126
Extruder Avanti 610000 1 mL syringe with holder/heating block
Filters 0.1 µm Avanti 610005
Filters 0.8 µm Avanti 610009
10 mm Filter Supports Avanti 6100014
Glass Round Bottom Flask Sigma Z100633
Turnover stoppers Thermo Fisher Scientific P-301398
Tubing Thermo Fisher Scientific P-198194
Leur Lock Thermo Fisher Scientific k4201634503
Sephadex G50 Beads GE Life Sciences 17004201
Sephadex G100 Beads GE Life Sciences 17006001
Heat Inactivated Fetal Calf Serum Thermo Fisher Scientific 10082147
HEPES (1 M) Thermo Fisher Scientific 15630080
EGTA Sigma E3889
Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL) Thermo Fisher Scientific 15140122
1x RBC lysis Buffer Thermo Fisher Scientific 00-4333-57
Indo-1 Invitrogen I1203
CD5-PE BioLegend 100608
B220-PE-Cy7 BioLegend 103222
HBSS Thermo Fisher Scientific 14170112 without calcium and magnesium
MgCl2 Sigma M8266
CaCl2 Sigma C4901
Fab anti-mouse IgM Jackson ImmunoResearch 115-007-020
F(ab')2 anti-mouse IgM Jackson ImmunoResearch 115-006-020
Peanut flour Golden Peanut Co. 521271 12% fat light roast, 50% protein
Animal feeding needles Cadence Science 7920 22g x 1.5", 1.25 mm - straight
Microprobe thermometer Physitemp BAT-12
Rectal probe for mice Physitemp Ret-3
Cholera toxin, from Vibrio cholera List Biological Laboratories, Inc. 100B Azide free
BCA Protein Assay Kit Pierce 23225
Carbonate-bicarbonate buffer Sigma C3041
TMB Stop Solution KPL 50-85-06
SureBlue TMB Microwell Peroxidase Substrate KPL 5120-0077
96 well Immulon 4HBX plate Thermo Scientific 3855
Purified soluble Ara h 2 N/A N/A purified as in: Sen, et al., 2002, Journal of Immunology
HSA-DNP Sigma A-6661
Mouse IgE anti-DNP Accurate Chemical BYA60251
Sheep anti-Mouse IgE The Binding Site PC284
Biotinylated Donkey anti-Sheep IgG Accurate Chemical JNS065003
NeutrAvidin Protein, HRP ThermoFisher Scientific 31001
Mouse IgG1 anti-DNP Accurate Chemical MADNP105
HRP Goat anti-mouse IgG1 Southern Biotech 1070-05
1 mL Insulin Syringes BD 329412 U-100 Insulin, 0.40 mm (27 G) x 16.0 mm (5/8")
Superfrost Microscope Slides Fisher Scientific 12-550-14 25 mm x 75 mm x 1.0 mm
ACK Lysing Buffer gibco by Life Technologies A10492-01 100 mL
RPMI 1640 Medium Thermo Fisher Scientific 11875093 500 mL
Cell Strainer Corning 352350 70 μm Nylon, White, Sterile, Individually packaged
NuPAGE 4-12% Bis-Tris Protein Gels Invitrogen NP0322BOX 10 gels
NuPAGE LDS buffer, 4x Invitrogen NP0008 250 mL
SeeBlue Plus2 Pre-stained standard Invitrogen LC5925 500 µL
NuPAGE MES/SDS running buffer, 20x Invitrogen NP0002 500 mL
GelCode Blue Stain Thermo Scientific 24590 500 mL

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Gupta, R. S., et al. The prevalence, severity, and distribution of childhood food allergy in the United States. Pediatrics. 128 (1), e9-e17 (2011).
  2. Sicherer, S. H., Munoz-Furlong, A., Godbold, J. H., Sampson, H. A. US prevalence of self-reported peanut, tree nut, and sesame allergy: 11-year follow-up. Journal of Allergy and Clinical Immunology. 125 (6), 1322-1326 (2010).
  3. Kim, E. H., et al. Sublingual immunotherapy for peanut allergy: clinical and immunologic evidence of desensitization. Journal of Allergy Clinical Immunology. 127 (3), 640-646 (2011).
  4. Vickery, B. P., et al. Sustained unresponsiveness to peanut in subjects who have completed peanut oral immunotherapy. Journal of Allergy and Clinical Immunology. 133 (2), 468 (2014).
  5. Jones, S. M., et al. Epicutaneous immunotherapy for the treatment of peanut allergy in children and young adults. Journal of Allergy and Clinical Immunology. 139 (4), 1242 (2017).
  6. Varshney, P., et al. A randomized controlled study of peanut oral immunotherapy: clinical desensitization and modulation of the allergic response. Journal of Allergy Clinical Immunology. 127 (3), 654-660 (2011).
  7. Anagnostou, K., et al. Assessing the efficacy of oral immunotherapy for the desensitisation of peanut allergy in children (STOP II): a phase 2 randomised controlled trial. Lancet. 383 (9925), 1297-1304 (2014).
  8. Sampson, H. A., et al. Effect of Varying Doses of Epicutaneous Immunotherapy vs Placebo on Reaction to Peanut Protein Exposure Among Patients With Peanut Sensitivity: A Randomized Clinical Trial. The Journal of the American Medical Association. 318 (18), 1798-1809 (2017).
  9. Bednar, K. J., et al. Human CD22 Inhibits Murine B Cell Receptor Activation in a Human CD22 Transgenic Mouse Model. Journal Immunology. 199 (9), 3116-3128 (2017).
  10. Macauley, M. S., et al. Antigenic liposomes displaying CD22 ligands induce antigen-specific B cell apoptosis. Journal Clinical Investigation. 123 (7), 3074-3083 (2013).
  11. Orgel, K. A., et al. Exploiting CD22 on antigen-specific B cells to prevent allergy to the major peanut allergen Ara h 2. Journal Allergy Clinical Immunology. 139 (1), 366-369 (2017).
  12. Smarr, C. B., Hsu, C. L., Byrne, A. J., Miller, S. D., Bryce, P. J. Antigen-fixed leukocytes tolerize Th2 responses in mouse models of allergy. Journal of Immunology. 187 (10), 5090-5098 (2011).
  13. Kulis, M., et al. The 2S albumin allergens of Arachis hypogaea, Ara h 2 and Ara h 6, are the major elicitors of anaphylaxis and can effectively desensitize peanut-allergic mice. Clinical and Experimental Allergy. 42 (2), 326-336 (2012).
  14. Dang, T. D., et al. Increasing the accuracy of peanut allergy diagnosis by using Ara h 2. Journal of Allergy Clinical Immunology. 129 (4), 1056-1063 (2012).
  15. Loughrey, H. C., Choi, L. S., Cullis, P. R., Bally, M. B. Optimized procedures for the coupling of proteins to liposomes. Journal Immunological Methods. 132 (1), 25-35 (1990).
  16. Sen, M., et al. Protein structure plays a critical role in peanut allergen stability and may determine immunodominant IgE-binding epitopes. Journal of Immunology. 169 (2), 882-887 (2002).
  17. Krall, N., da Cruz, F. P., Boutureira, O., Bernardes, G. J. Site-selective protein-modification chemistry for basic biology and drug development. Nature Chemistry. 8 (2), 103-113 (2016).
  18. Jimenez-Saiz, R., et al. Lifelong memory responses perpetuate humoral TH2 immunity and anaphylaxis in food allergy. Journal Allergy and Clinical Immunology. 140 (6), 1604-1615 (2017).
  19. Moutsoglou, D. M., Dreskin, S. C. Prolonged Treatment of Peanut-Allergic Mice with Bortezomib Significantly Reduces Serum Anti-Peanut IgE but Does Not Affect Allergic Symptoms. International Archives of Allergy and Immunology. 170 (4), 257-261 (2016).
  20. LaMothe, R. A., et al. Tolerogenic Nanoparticles Induce Antigen-Specific Regulatory T Cells and Provide Therapeutic Efficacy and Transferrable Tolerance against Experimental Autoimmune Encephalomyelitis. Frontiers in Immunology. 9, 281 (2018).
  21. Srivastava, K. D., et al. Investigation of peanut oral immunotherapy with CpG/peanut nanoparticles in a murine model of peanut allergy. J Allergy Clin Immunol. 138 (2), 536-543 (2016).
  22. Bellinghausen, I., Saloga, J. Analysis of allergic immune responses in humanized mice. Cellular Immunology. 308, 7-12 (2016).
  23. Pillai, S., Mattoo, H., Cariappa, A. B cells and autoimmunity. Curr Opin Immunol. 23 (6), 721-731 (2011).
  24. Mantegazza, R., Cordiglieri, C., Consonni, A., Baggi, F. Animal models of myasthenia gravis: utility and limitations. International Journal of General Medicine. 9, 53-64 (2016).
  25. Berman, P. W., Patrick, J. Experimental myasthenia gravis. A murine system. J Exp Med. 151 (1), 204-223 (1980).
  26. Berman, P. W., Patrick, J. Linkage between the frequency of muscular weakness and loci that regulate immune responsiveness in murine experimental myasthenia gravis. J Exp Med. 152 (3), 507-520 (1980).
  27. Derksen, V., Huizinga, T. W. J., van der Woude, D. The role of autoantibodies in the pathophysiology of rheumatoid arthritis. Seminars in Immunopathology. 39 (4), 437-446 (2017).

Tags

אימונולוגיה זיהום בעיה 140 חלקיקים ליפוזומים אנפילקסיס בוטנים אלרגיה סידן השטף Flow Cytometry אנטיגן ספציפי עארה h 2 אלרגיה למזון IgE
ליפוזומים antigenic לדור של נוגדנים מחלות ספציפיות
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Bednar, K. J., Hardy, L., Smeekens,… More

Bednar, K. J., Hardy, L., Smeekens, J., Raghuwanshi, D., Duan, S., Kulis, M. D., Macauley, M. S. Antigenic Liposomes for Generation of Disease-specific Antibodies. J. Vis. Exp. (140), e58285, doi:10.3791/58285 (2018).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter