Summary
Beskrevet er utarbeidelsen av antigen liposomal nanopartikler og deres bruk i stimulerende B-celle aktivering i vitro og vivo. Konsekvent og robust antistoff svar førte til utviklingen av en ny peanøttallergi modell. Protokollen for å generere antigen liposomer kan utvides til forskjellige antigener og immunisering modeller.
Abstract
Antistoff svar gi kritiske beskyttende immunitet mot en rekke patogener. Det er fortsatt en høy interesse for å generere robust antistoffer for vaksinasjon samt forstå hvordan patogene antistoff svar utvikle allergier og autoimmune sykdommer. Generere robust antigen-spesifikke antistoffer svar er ikke alltid trivielt. I musen modeller krever det ofte flere runder immunizations med adjuvant som fører til stor variasjon i nivåer av indusert antistoffer. Et eksempel er i musen modeller av peanut allergi der mer robust og reproduserbar modeller som minimerer musen tall og bruk av adjuvant ville være fordelaktig. Presenteres her er en svært reproduserbar musemodell peanøttallergi anafylaksi. Denne modellen er avhengig av to viktige faktorer: (1) antigen-spesifikke splenocytes overføres adoptively fra peanut-sensitivisert mus i en naiv mottaker mus, normalisere antall antigen-spesifikke minne B - og T-celler over en stor mengde av mus; og (2) mottakere mus er senere økt med en sterk multivalent immunogen i form av liposomal nanopartikler vise store peanut allergenet (Ara h 2). Den største fordelen ved denne modellen er dens reproduserbarhet, som til slutt senker antall dyr som brukes i hver studie, samtidig minimere antall dyr mottar flere injeksjoner av adjuvant. Modulære montering av disse immunogenic liposomer gir relativt lettvinte tilpasning til andre allergisk eller autoimmune modeller som involverer patogene antistoffer.
Introduction
Matallergi påvirker 8% av barn i USA, og har økt utbredelse siste tiåret1. Peanut allergi påvirker 1% av barn og er ikke vanligvis Forvokst2. Selv om flere lovende kliniske studier er underveis for behandling av matallergi, inkludert muntlige immunterapi (OIT), sublinguale immunterapi (SPLITT) og epicutaneous immunterapi (EPIT), er det for øyeblikket ingen FDA-godkjent behandling strategier for desensitizing peanut-allergiske personer3,4,5,6,7,8. Derfor må allergiske personer strengt unngå allergener for å unngå anafylaksi. Mange spørsmål fortsatt om ruter allergi og underliggende mekanismene mat allergi utvikling.
Musen modeller er et verdifullt verktøy for å studere mekanismer for allergi, samt utvikle nye tolerogenic og desensitization, terapier,9,,10,,11,,12. Dette gjelder særlig fordi store peanut allergenet (Ara h 2; Ah2) hos mennesker er også dominerende allergenet i flere beskrevet musen modeller13,14. Mens musen modeller av peanut allergi er uvurderlig i å studere mekanismer for allergi og toleranse, er en ulempe at de kan være variabel og krever bruk av adjuvans. Mer potent immunogens ville være en måte å minimere iboende variasjon av slike modeller. Siden B-celler er sterkt aktivert av multivalent antigener, er antigen liposomer vise allergenet et godt alternativ på grunn av deres evne til å potensielt aktivere B-celler gjennom B-celle reseptor (BCR) mens har for effektivt grunning T-celle rommet gjennom blir tatt opp ikke-spesielt av antigen presentere celler.
Her beskriver vi en detaljert protokoll for bøye protein antigener til liposomal nanopartikler ved hjelp av en lettvinte og modulære strategi. Bruker en surrogat antigen, anti-IgM Fab fragment, vi viser hvor potent slik antigen liposomer kan være i stimulerende B-celle aktivering. Antigen liposomer viser Ah2 antigen ble brukt til å utvikle en ny musemodell tillagt følsomhet. I denne modellen overføres splenocytes fra bekreftet peanut allergisk mus, inneholder peanut-spesifikke minne B - og T-celler, i naive congenic mus. Minne antistoff svar er indusert av injeksjon av liposomer konjugert med Ah2 i mottakerens mus, for å indusere antistoffer mot Ah2. Etterfulgt av eneste løft med løselig Ah2, gi Ah2-spesifikke antistoffer opphav til en sterk anafylaktisk reaksjon når disse musene er senere utfordret med Ah2. Mus gjennomgår allergisk reaksjon svare på en svært ensartet måte og ikke har mottatt en adjuvans, denne tilnærmingen er en ønskelig peanøttallergi modell og resultatene tyder på at det kan ha nytte i andre musen modeller drevet av antigener rettet mot allergener og eventuelt autoantigens.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Den generelle metoden av protein lipid og innlemme i liposomer er hovedsakelig basert på tidligere arbeid15. Alle dyr fremgangsmåtene nedenfor er godkjent ved University of North Carolina i Chapel Hill institusjonelle Animal Care og bruk Committee (IACUC). Alle mus brukes i peanøttallergi modellen er BALB/cJ hunner kjøpt fra 3 uker gamle. University of Alberta dyr omsorg og bruke Committee (ACUC) har godkjent eksperimenter som involverer bruk av mus spleens for ex vivo analyse fra C57Bl/6 mus i minst 6 ukens av alderen.
1. Bøyning av Protein antigenet pegylert Lipid
- Legge til 3 g av krysskoblet dekstran gel perler med en fraksjoneres rekke 1500-30.000 Daltons (Da) en 250 mL vakuum kolbe. Legg til 60 mL fosfat bufret saltoppløsning (PBS) og kontinuerlig rør med magnetic røre bar. Forsegle kolbe og legge til et vakuum å starte de gassing på en røre plate i minst 1 time.
- I en 1,0 cm x 30 cm glass kromatografi kolonne med omsetning stopper lukket, legge til PBS kolonnen å vaske. Åpne omsetning stopperen og avløp kolonnen. Etter vasking, Legg til slurry av de gasset perler til kolonnen. Kontinuerlig Legg til slurry til kolonnen er pakket som en perle høyde på ca 24 cm.
- Når kolonnen har en 'er hode' av ca 4-5 cm på PBS over pakket perler, har følgende klar.
- Opprette en gravitasjon flow siphon ved å måle et stykke rør lenge nok til å nå en hylle 1 2 feet over toppen av kolonnen og oppretter en loop som drops nær bunnen av kolonnen og returnerer til toppen av kolonnen. Legge til en omsetning stopper i ene enden av forbindelsesslangen, forlater ene rør åpen. Plass åpne røret slutten i en 500 mL flaske PBS og sted på sokkelen over kolonnen.
- Ta enden med omsetning stopper og fest en 10 mL sprøyte. Åpne omsetning disables ventilen på rør linjen og trekke PBS gjennom røret. Når PBS har nådd tre fjerdedeler av veien gjennom slangen, raskt fjerne sprøyten og legge til omsetning stopperen øverst i kolonnen-væske skal kjøre på kolonnen.
Merk: Mengden 'er hode' av PBS igjen på toppen av kolonnen bør være mellom 1 og 3 cm. Minimalt å vaske kolonnen er 3 kolonne volumer.
- Bestemme mengden av protein (mol) kobles til lipid basert på dens molekylvekt (MW).
Merk: Fab fragmentet geit anti-mus IgM (selv en IgG) brukes her som en universell surrogat antigen for polyklonale stimulering av B-celler. Følgelig Fab fragmentet av geit IgG har en MW ca 48 kiloDalton (kDa) og er kommersielt tilgjengelig i et antall 1.3 mg. Dermed er mengden av protein kobles 27.1 µmol. - Bestemme utryddelse koeffisient av protein av interesse. Hvis ukjent, måle protein absorbansen på 280 nm med et spektrofotometer og skillet A280 -verdien på antall føflekker beregnet i trinn 1.4.
Merk: Utryddelse co-effektive av Fab geit IgG på 280 nm er 64,600 M-1. - Slik som sporer mengder Amin inneholder bufferen er fjernet, desalt protein på kolonnen opprettet i trinnene 1,1-1,3 og samle protein fraksjoner i 1,5 mL microcentrifuge rør (~ 500 µL per brøkdel).
- Lukk omsetning disables ventilen koblet til toppen av kolonnen og fjerne toppen av kolonnen. Hvis ikke allerede åpne, åpne omsetning disables ventilen på bunnen av kolonnen og vente til 'leder' av PBS treffer toppen av perler.
- Sakte legge i protein rundt til toppen av perler med et glass Pasteur pipette, pass på minimerer forstyrrelser til toppen av perler.
- Når 'leder' av protein løsningen har nådd toppen av perler, legge 1 mL av PBS forsiktig via en Pasteur pipette. Repeter tre ganger. Legge til PBS for å opprette et hode av 4-5 cm og gjentar trinn 1.3 å vaske kolonnen.
Merk: Denne steg kan hoppet hvis det er sikkert at det finnes ingen Amin inneholder buffer.
- Bestemme fraksjoner som inneholder protein ved å måle A280 verdier og basseng fraksjoner som gir ca 90% utvinning av protein.
Merk: Dette vanligvis utvanner protein 1,5-2-fold. Bestemme protein konsentrasjonen etter pooling. Konsentrere protein på dette trinnet, om nødvendig, bruker en sentrifugering konsentrator. - Legge til 2,5 molar tilsvarende heterobifunctional crosslinker protein.
- Først veie ca 5 mg succinimidyl 3-(2-pyridyldithio) propionate (SPDP, MW = 314 g/mol) inn i et microcentrifuge rør. Å avgjøre volumet å oppløse SPDP, ta molar protein konsentrasjonen og multiplisere det med 250 x å generere en 100 x løsning som vil gi en 2,5 molar overskudd i reaksjonen.
Merk: For eksempel hvis protein konsentrasjonen er 50 µM, en løsning av SPDP på 12.5 mM er nødvendig. For SPDP 5 mg tilsvarer dette 1.27 mL dimethyl sulfoxide (DMSO).
- Først veie ca 5 mg succinimidyl 3-(2-pyridyldithio) propionate (SPDP, MW = 314 g/mol) inn i et microcentrifuge rør. Å avgjøre volumet å oppløse SPDP, ta molar protein konsentrasjonen og multiplisere det med 250 x å generere en 100 x løsning som vil gi en 2,5 molar overskudd i reaksjonen.
- Legg SPDP til protein av interesse på en 1: 100 fortynning. Plass reaksjonen på en oscillerende shaker ved romtemperatur (RT) ca 1t.
- Fjerne overflødig SPDP og beskytte endogene disulfide bond(s), i protein i påfølgende reduksjon trinn, equilibrate, og vask kolonnen opprettet i trinn 1,1-1,3 i 100 mM natrium acetate (NaOAc) ved pH 5.5 eller opprette en identisk kolonne utelukkende for bruk i dette buffer.
- Etter 1 h inkubasjon med SPDP desalt protein på kolonnen equilibrated i 100 mM NaOAc. Utføre dette trinnet i en identisk måte som trinn 1.6 unntatt med 100 mM NaOAc (pH 5.5) som eluent. Samle fraksjoner, bestemme A280og basseng topp fraksjoner. Vask kolonnen i PBS.
- Forberede en løsning av 2,5 M DTT (MW = 154 g/mol) i dobbeltrom destillert vann (ddH2O). Legg til 25 mM DTT gruppert fraksjoner av protein i 5-10 min.
- Måle A280 av protein og dele dette med utryddelse koeffisient. Også bestemme A343. Beregne knytte forholdet basert på molarity av protein (en280) og koblingsfunksjonalitet (en343).
Merk: Slå av den A340 kalibreringen hvis bruker et nanodrop spektrofotometer. A343 målingen representerer absorbansen av gruppen pyridine 2-thione (utryddelse koeffisienten = 7550 M-1) som er fjernet fra SPDP kryss-linker ved DTT. Molar forholdet linker: protein forholdet mellom 1.2-1.5 er generelt oppnås når reaksjon med en 2,5 molar overskudd av SDPD på en rekke proteiner. - Kjøre gruppert fraksjoner over kolonnen vasket i PBS som beskrevet ovenfor. Samle fraksjoner, bestemme A280og basseng topp fraksjoner. Bestemme konsentrasjonen av protein av A280 etter pooling fraksjoner.
- Forberede DSPE-pinne (2000)-Maleimide (1,2-distearoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine-N-[methoxy(polyethylene glycol)-2000)-Maleimide. Dette legges til proteinet i 10:1 molar forholdet. Forberede en 100 x lager av DSPE-pinne (2000)-Maleimide å oppnå ønsket konsentrasjonen.
- For eksempel hvis protein konsentrasjonen er 10 µM etter trinn 1.14, forberede et lager av DSPE-pinne (2000)-Maleimide på 10 mM. Nøye veie ut DSPE-pinne (2000)-Maleimide (MW = 3000 g/mol) og legge til riktig mengde DMSO. Flere runder med milde vortexing og sonicating kan få det fullt ut oppløst.
- Bestemme det totale volumet av fraksjoner fra trinn 1.14 og overføre løsningen nøye i en liten (10-25 mL) rundt bunnen kolbe (RBF). Legge til riktig mengde 100 x DSPE-pinne (2000)-Maleimide til protein å oppnå en 1 x, 10 ganger molar overflødig, siste konsentrasjon. Forsiktig swirl løsningen for å sikre at DMSO er helt spredt.
- Kjøre reaksjon natten under nitrogen i en forseglet RBF. Bruk en gummi septum og plassere i avtrekksvifte.
- Fjerne atmosfæren ved punktering septum med en 20 G nål festet til en 3 mL sprøyte på slutten av slangen festet til et vakuum, og slå på vakuum for 3-5 s.
- Erstatte atmosfæren med nitrogen. Fyll en ballong festet til en 3 mL sprøyte halvert med nitrogen og fest en 20 G nål. Punktering septum å fylle atmosfæren i runde bunnen kolbe med nitrogen. Gjenta fjerningen av atmosfæren og erstatning med nitrogen igjen og la nitrogen ballongen festet over natten.
- Forberede en separat krysskoblet dekstran gel perle kolonne med en fraksjoneres rekke 4000-150.000 Da i en 1,0 cm x 50 cm glass kromatografi kolonne (i trinn 1,1-1,3).
- Dagen fjerne protein fra rundt bunnen kolbe i trinn 1.17 og kjøre (Følg metoden som brukes i trinn 1.6) over kolonnen krysskoblet dekstran gel perle (fra trinn 1,18).
Merk: Det totale beløpet å laste inn kolonnen skal ikke mer enn 2 mL. Hvis du brukte en større reaksjon, delt i to og kjøre på separate kolonner eller kjøres på en større diameter-kolonne.- Samle fraksjoner, bestemme den A280, basseng topp fraksjoner, og bestemme konsentrasjonen av protein. Tilstedeværelsen av lipid vil ikke påvirke målingene.
- Lagre siste grupperte fraksjoner av lipid-tilknyttet protein på 4 ° C til du er klar for bruk.
2. liposome forberedelse
- Veier ut av lipider: DSPE-PEG(2000) (1,2-distearoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine-N-[methoxy(polyethylene glycol)-2000 MW = 2805.5 g/mol; Kolesterol (3b-Hydroxy-5-cholestene, 5-Cholesten-3b-ol) MW = 386.7 g/mol; og DSPC (1,2-distearoyl-sn-glycero-3-phosphocholine), MW = 790.1 g/mol. Opprett en 5 mg/mL løsning DSPC, 4 mg/mL løsningen av kolesterol og 2 mg/mL løsningen av DSPE-PEG(2000) i kloroform.
- Sikre at molar lipider i liposomer er: 57% DSPC, 38% kolesterol og 5% DSPE-PEG(2000), som vist i tabell 1.
Merk: Det er viktig å kontrollere mengden av antigen på liposome, som vanligvis varierer fra 0.01-0,1%. I tabell 1brukes 0,1% av geit anti-musen IgM Fab fragment knyttet til pegylert lipid. Det er viktig å ta i betraktning av den 10 ganger molar overkant av DSPE-pinne (2000)-Maleimide som ble lagt til proteinet i trinn 1.15, slik at den totale mengden pegylert lipid ikke overstiger 5%. - Vurdere endelige lipid beløpene (µmol) når du oppretter lipider for ekstrudering. Se tabell 1 for et eksempel på beregning av molar lipid konsentrasjoner for etableringen av liposomer i en 1,25 µM totale lipid konsentrasjon.
- Når riktig mengde hver lipid skal legges sammen er beregnet, kombinere alt i et 12 mL Borosilikatglass reagensrør.
-
Forsiktig blåse av kloroform.
- Bruke slangen og en 3 mL sprøyte med nål, utarbeidet i trinn 1.17.1, å forsiktig blåse av kloroform i røret med nitrogen. Forsiktig blåse en strøm av nitrogen på løsningen mens rotere røret med den andre hånden. Pass på å minimere sprut eller forårsaker væsken kjøre oppover siden av rør som det kan være vanskelig å få dette til løsning i neste trinn.
- Legg 100 µL av DMSO til hver rør og lyophilize denne løsningen over natten. Dekk toppen av røret med en ikke-statisk laboratorium tørke, sikre med en gummi band, og fryse-80 ° C.
3. liposome ekstrudering
- Legg 1 mL av PBS med lipid-tilknyttet protein til 12 mL røret som inneholder lipider. Sonicate løsningen for ca 30 å 1 min i et vannbad for sonication. Hvile i 5 minutter eller lenger mellom hver runde Gjenta 3-4 ganger.
-
Forberede en extruder som produsentens anvisninger.
- Legg filteret støtter interne membran støtte, plasserer noen dråper (10 µL hver) PBS på parafin film. Ved hjelp av pinsett, ta en kant av filteret støtte og dyppe den i 10 µL drop.
- Plass filteret i O-ring. Gjør dette for begge sider. Ved hjelp av pinsett, ta et 0,8 µm filter på kanten og dukkert i 10 µL drop og pels på utsiden av O-ring med PBS. Plass 0,8 µm filteret forsiktig på O-ring slik at filteret ikke ikke over henge interne membran støtte.
- Plass extruder Oppvarming blokk på en varm plate til Forvarm extruder. Bytt kokeplate på lav og tillate extruder Oppvarming blokk å nå ønsket temperatur. For å unngå potensielle problemer med protein aggregering, ikke varme blokken siste 37 ° C.
- Legg sonicated prøven i en av extruding sprøyter plassert i extruder. Plass extruder sprøyten i den andre enden av extruder. Kontroller at Tom sprøytestempelet er satt til null. Tom sprøyten ut som lipid er ekstrudert gjennom polykarbonat 0,8 µm membran. Prøv å unngå bestått bobler frem og tilbake gjennom membran.
- Plass ferdigmonterte extruder i oppvarming blokk. Skyv stempelet til sprøyten fylt med lipider på den tomme sprøyten. Avhengig av lipid konsentrasjonen, vil dette være vanskelig å presse gjennom. Gjenta 20 x.
- Fjern ferdigmonterte extruder fra oppvarming blokk. Sakte fjerne fylt sprøyten fra extruder, må du samle alle lipider som kan lekke ut når du fjerner. Plasser liposomer i ren ampuller. Gjenta trinn 3.4-3.6 bruke polykarbonat 0,2 µm og 0,1 µm membraner.
- Opprette en 0,7 x 50 cm2 krysskoblet agarose perle kolonne med separasjon rekkevidde på 0,7-10 Mega Daltons (MDa) equilibrated i PBS. Legg liposomer og kjøre som i trinn 1.6. Brøker som inneholder liposomer vil ha redusert overføring av lys i området 250-400 nm.
- Lagre liposomer på 4 ° C og fryser.
4. kalsium Flux overvåke B-celle aktivering av antigen liposomer
- Euthanize mus karbondioksid (CO2) eller isoflurane overdose, ifølge institusjonelle standard operasjonsprosedyrer. Bekreft euthanasia mus ved cervical forvridning.
- Sterilisere Kirurgiske instrumenter og mus carcass med 70% etanol. Bruk 10 cm lang, 0,8 mm tips, buet iris tang for å skille huden dekke brysthulen fra ribbe buret. Bruke 10 cm lang, rett dissekere saks for å gjøre en distale snitt med en bilaterale snitt.
- Bruke buede iris tang og dissecting saks for å trekke milten fra bukhulen. Fjern fatty vevet rundt milten og deretter plassere den i en 15 mL polystyren konisk rør fylt med RPMI1640 medium som inneholder 1% fosterets kalv serum (FCS) og penicillin-streptomycin.
- Overføre milten og media over en 40 µm celle sil montert på en 50 mL konisk tube. Bruke gummi slutten av en 3 mL sprøytestempelet, forsiktig knuse milten. Vask 40 µm celle silen med media. Gjenta denne prosessen til bare fettvev er igjen i 40 µm celle silen. Skyll silen med 3-5 mL media å øke celle utvinning.
- Sentrifuge celle homogenate på 300 x g i 5 min på RT. Etter sentrifugering, forkaste nedbryting og legge 10 mL 1 x RBC lyseringsbuffer til pellet. Pipetter opp og ned, forlate for 2-3 minutter til RT og deretter virvel på 300 x g i 5 min på RT.
- Forkast nedbryting og resuspend røde blodlegemer utarmet splenocytes i 10 mL av media. Bestemme total-celle tall ved hjelp av en hemocytometer eller annen celle teller enhet. Pellets cellene med sentrifugering som beskrevet ovenfor.
Merk: Den ideelle siste konsentrasjonen nødvendig for Indo-1 lasting av splenocytes er 10-20 x 106 celler/mL, men en lavere konsentrasjon av celler kan brukes. - Resuspend splenocytes på 15 x 106 celler/mL i kalsium flux lasting buffer (RPMI1640 medium som inneholder 1% FCS, 10 mM 4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic syre (HEPES), 1 mM magnesiumklorid (MgCl2), 1 mM etylenglykol-bis ( Β-aminoethyl Eter)-N, N, N', N'-tetraacetic syre (EGTA) og 5% penicillin-streptomycin). Legge i 1,5 µM Indo 1 fra en 1 mM DMSO lagerløsning, invertere røret flere ganger for å blande. Beskytte mot lyset, og ruge cellene på 37 ° C vannbad i 30 min.
- Etter 30 min incubation, legge i 5 x mengden kalsium flux lasting buffer. Sentrifuger 300 x g i 7 min på RT.
- For gating på B celler, beis celler med 1:200 anti-mus CD5-PE og anti-musen 1:200 B220-PE/Cy7 i 0,5 mL av laste buffer ved 4 ° C for 20 min, beskyttet mot lyset.
- Vask splenocytes i kalsium flux lasting buffer og sentrifuger på 300 x g i 7 min på RT. Resuspend celler på 10-20 x 106 celler/mL i kalsium flux kjører buffer (Hanks balansert salt løsning (HBSS) som inneholder 1% FCS, 1 mM MgCl2 og 1 mM veisalt (CaCl2)). Lagre på is, beskyttet fra lys helt klar til å kjøre på flyt cytometer.
-
Setup flowcytometri med unstained kvinne og enkelt flekken kontroller for kompensasjon.
- Kjør farget cellene å setup portene riktig (se figur 2A). Setup Indo-1 (fiolett) versus Indo-1 (blå) plot, justere spenninger i Indo-1 kanaler å plassere cellene flekker på en skråning av 45-60 ° å maksimere signalet: støyforhold av Indo-1 fiolett: blå endring i forholdet etter B-celle stimulering.
Merk: Sørg for at spenninger ikke er for høyt, slik at en betydelig andel av cellene (> 5%) mot toppen av tomten. - Oppretter en diagonal gate som omslutter den øverste venstre delen (Violet+blå-) av tomten, slik at uten stimulering < 10% av cellene er i porten, som bør ideelt øke til > 75% etter stimulering.
- Kjør farget cellene å setup portene riktig (se figur 2A). Setup Indo-1 (fiolett) versus Indo-1 (blå) plot, justere spenninger i Indo-1 kanaler å plassere cellene flekker på en skråning av 45-60 ° å maksimere signalet: støyforhold av Indo-1 fiolett: blå endring i forholdet etter B-celle stimulering.
-
Legge til 0,5 mL av cellene en avkortet 5 mL rundt bunnen polystyren tube (fluorescens-aktivert celle sortering (FACS) rør) og varme cellene til 37 ° C i 3-5 min i et vannbad. Sett FACS røret i 37 ° C water-jacketed kammeret som er koblet til et nytt sirkulerende vannbad.
- Kjører røret den water-jacket på flyt-cytometer og starte oppkjøpet, uten å lagre dataene på ca 5000-10.000 hendelser/s. Når cellene har stabilisert (15 – 30 s), starter data oppkjøp og samle data for minst 10 å etablere bakgrunnen.
- På 10 s merket, raskt fjerne røret fra flyt cytometer, legge til stimulering (5-50 mM antigen liposomer i 2 – 20 mL), puls vortex og returnere FACS røret på flyt-cytometer. Opprettholde datainnsamling og lagring gjennom denne tiden og samle inn data for 3-5 minutter.
- Analysere data i riktig analyseprogramvare under funksjonene kinetics.
5. forberedelse av Peanut ekstrakt
- Ekstra peanut proteiner ved å blande peanut mel i 1:5 (wt:vol) forholdet fosfat bufret saltoppløsning (PBS) med 1 M natriumklorid (NaCl). Bland løsning på magnetic røre plate 2 h på RT samtidig ved pH 8.5.
- Sentrifuger løsning på 3000 x g for 45 min på 4 ° C. Dekanter og filter-sterilisere nedbryting sekvensielt gjennom en 0,4 µm filter etterfulgt av en 0,2 µm filter. Bestemme protein konsentrasjon av bicinchoninic acid (BCA) analysen med bovin serum albumin (BSA) som standard.
- Reduser og denature et utvalg av peanut proteiner med 50 mM dithiothreitol (DTT) i en buffer som inneholder litium dodecyl sulfate på en pH på 8.4, noe som gir maksimal aktivitet reduksjonsmiddel og varme ved 70 ° C i 10 min.
- Kjør 10 µg denaturert peanut protein på en Bis-Tris 4-12% støpt polyakrylamid gel utformet for å gi optimal separasjon gradient gel med molekylvekt pre farget standard.
- Stain gel med disulfonated triphenylmethane og destain med ddH2O. identifisere kjent store peanut allergener Ara h 1, 2 og 3 i ekstra forberedelser. Ara h 1 vises 63 kDa, Ara h 2 skal vises som to isoformene på 17 og 19 kDa og Ara h 3 vises på 37 kDa (Sure delenhet).
6. allergi mus peanøtter
- Resuspend 1 mg kolera gift i 1 mL ultrapure vann. Forberede 200 µL utvannet peanut ekstrakt inneholder 2 mg peanut protein og 10 µg kolera giftstoffer i PBS.
- Administrere 200 µL av peanut ekstrakt som inneholder kolera gift (2 mg peanut protein og 10 µg kolera gift) via muntlig gavage hver 4-5 uke gamle BalB/cJ kvinnelige musen. Gjenta en gang i uken i tre uker (dvs. dager 0, 7 og 14).
- Administrere 300 µL utvannet peanut ekstrakt (inneholder 5 mg peanut protein og 10 µg kolera gift) via muntlig gavage hver musen i den fjerde uken (dvs. dag 21).
7. utfordring mus med Peanut ekstrakt
- På dag 28, forberede peanut pakke til en siste konsentrasjon av 1 mg/mL i PBS. Måle planlagte kropp temperatur bruke en endetarms termometeret (ca 37,5-38,5 ° C). Administrere 200 µL (200 µg) av peanut pakke via intraperitoneal (IP) injeksjon.
- Mål kroppstemperaturen med endetarms termometeret hvert 15 min 1t etter injeksjon. En dukkert i kroppstemperatur angir peanut allergi.
Merk: Nedkjøling er et kjennetegn på anafylaksi i mus. Denne utfordringen vil demonstrere at mus er allergisk mot peanøtter. Vanligvis utvikle 90% av Balb/cJ mus som gjennomgå sensibilisering protokollen allergiske reaksjoner under utfordring preget av minst 2-3 ° C temperatur nedgang.
8. isolering av Splenocytes fra allergiske mus og adopsjon overføring
-
Isolere splenocytes fra naive og peanut allergisk mus.
- På dag 30, euthanize både naive og bekreftet peanut allergisk mus ved å tilsette 3 L/min av CO2 i et gasskammer. Bekreft euthanasia mus ved bilaterale thoracotomy. Sterilisere Kirurgiske instrumenter og mus carcass med 70% etanol. Bruk tang til å skille huden dekke brysthulen fra ribbe buret. Bruke rett dissecting saks for å gjøre en bilaterale snitt bryte venstre og høyre ribben.
- Bruk tang og dissecting saks for å ekstra milten fra bukhulen. Fjerne fatty vevet rundt milt før du plasserer i polystyren 15 mL konisk tube, fylt med 10 mL RPMI 1640 medium.
- I sterilt laminær strømning hette, hell milten og media i en 35 mm polystyren Petriskål. Holde naiv og allergiske splenocytes i separate Petri retter og media under cellen Aisolering. Bruke steriliserte tang og dissekere saks å kutte milt tre og Petriskål.
- Bruke grovt, frostet kanten av to glass objektglass, forsiktig homogenize (i RPMI) milt bitene til hvit vev gjenstår mellom lysbilder. Endre lysbilder mellom grupper.
- Overføre celle homogenate fra Petriskål gjennom en 70 µm celle sil montert på en 50 mL konisk tube. Passere de gjenværende milt fragmentene gjennom silen med en stempelholderen fra en 1 mL sprøyte. Skyll silen med 5 mL RPMI å maksimere celle utvinning. Overføre filtratet til en polystyren 15 mL konisk rør, og sentrifuger (450 x g, 10 min, RT).
- Sug opp nedbryting og legge resuspend celle pellet i lyseringsbuffer 2 mL røde blodlegemer (0,83% salmiakk i 10 mM Tris buffer, pH 7.2). Bland og ruge på RT for 2-3 min. legge 10 mL PBS - 2% FBS og sentrifuger på 300 x g i 7 min på RT.
- Vask cellene igjen med 12 mL PBS - 2% FBS fjerne eventuelle gjenværende salmiakk, og sentrifuge 300 x g i 7 min ved RT. re suspendere celle pellets i 2 mL RPMI 1640 medium. Telle celler ved hjelp av enten hemocytometer eller automatisk hematologi analyzer.
- Bruke en 27 G, 5/8-tommers p på 1 mL insulin sprøyter, intravenøst injisere 15 x 106 allergisk eller naive splenocytes utdraget som beskrevet ovenfor (under 200 µL) via halen vene i naiv (unsensitized) mus.
9. injeksjon av mus med Ara h 2 antigen liposomer
- Forberede Ah2 liposomer 0,1 prosent Ah2 på 2,5 lipid. For beregning av protein konsentrasjon, er utryddelse koeffisient av Ah2 15 000 M-1. Fortynne liposomer til 300 µM i sterilt PBS.
- En dag etter adoptivforeldre overføring (dag 31) av allergisk eller naive splenocytes, intravenøst injisere 200 µL PBS eller Ah2 antigen liposomer (300 µM) inneholder totalt 1,38 µg av Ah2 via hale åre BALB/cJ mus som fikk splenocytes i trinn 8.2.
10. løft og utfordring for mus Ara h 2
- To uker etter injeksjon med Ah2 liposomer, dagen 45, bruk 4 mm dyr lancet samle 50-200 µL av blod fra submandibular krysset av musen. Samle blod en serum skilletegn tube uten heparin; separat serum av sentrifugering 6000 x g i 15 min. Bruk samlet serum senere på mål antigen-spesifikke antistoffer.
- På dag 46, to uker etter injisere mus med liposomer (trinn 9.2), øke mus ved IP injeksjon av 200 µL av PBS eller 200 µg av løselig Ah2 (renset som beskrevet tidligere16).
- I dag 60, samle 50-200 µL av blod fra submandibular krysset av musen og behandle blod som beskrevet tidligere.
- På dag 61, utfordre hver gruppe mus med en IP-injeksjon av 200 µL av 300 µg løselig Ah2. Måle kroppen temperaturer med endetarms sonde hvert 15 min som punkt 7.
11. kvantifisering av Ara h 2-spesifikke IgE og IgG1 med ELISA
- Coat en 96-brønns enzym knyttet immunosorbent analysen (ELISA)-kompatibel plate med 100 µL HSA-DNP (2,4-dinitrophenyl hapten konjugert til menneskelig serum albumin, 20 µg/mL) for standardkurve eller Ah2 (5 µg/mL) for serumprøver samlet i trinn 10.1 og 10.3, fortynnet i belegg buffer (50 mM carbonate-bikarbonat buffer, pH 9.6) ved 4 ° C over natten eller 37 ° C i > 1t.
- Vask tre ganger med 200 µL PBS-T (PBS 0,05% Tween-20) og blokkere brønner med 200 µL PBS-T som inneholder 2% BSA ved 37 ° C i > 2T.
- Ah2-spesifikk IgE ELISA, legge 50 µL IgE-anti-DNP standarder (2-0,002 µg/mL, utarbeidet av 1:2 føljetong fortynninger) eller musen serumprøver (1:20 fortynning) og ruge over natten på 4 ° C. Ah2-spesifikk IgG1 ELISA, legge 100 µL renset IgG1-anti-DNP standarder (2-0,002 µg/mL, utarbeidet av 1:2 føljetong fortynninger) eller mus serumprøver (1:500 fortynning) og ruge over natten på 4 ° C eller 1t på 37 ° C.
- Vask tre ganger med 200 µL PBS-T. Ah2-spesifikk IgE ELISA, legge 100 µL sauer anti-musen IgE (0,5 µg/mL) og Inkuber ved 37 ° C i 1 time. Ah2-spesifikk IgG1 ELISA, legge 100 µL HRP geit anti-musen IgG1 (utvannet 1:40,000 i PBS-T - 2% BSA). Inkuber ved 37 ° C i 1 time.
- Vask tre ganger med 200 µL PBS-T. For Ah2-spesifikke IgE ELISA, legge 100 µL biotinylated-esel anti-sauer IgG (0,5 µg/mL) og ruge på 37 ° C i 45 minutter. For Ah2-spesifikke IgG1 ELISA, hopper du til trinn 11,7.
- Vask tre ganger med 200 µL PBS-T. Ah2-spesifikk IgE ELISA, legge til 100 µL nøytralt belastet avidin-pepperrotperoksidase (f.eksNeutrAvidin-HRP, 0,3 µg/mL) og ruge på 37 ° C i 30 min.
- Legg 100 µL 3, 3', 5, 5-Tetramethylbenzidine (TMB) substrat, ruge 10-15 min eller til prøver mørkeblå, deretter legge 100 µL TMB stopp løsning. Lese platen ved 450 nm.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Bøyning av protein rundt med DSPE-PEG(2000) kan påvises ved å kjøre en redusert viser en økning i molekylvekt sammenlignet med unconjugated protein. Figur 1A viser en representant gel av anti-musen IgM F(ab) fragment Bøyning PEG-DSPE, som viser en 2-3 kDa bandshift for denaturert protein. Merk at ca 50% av protein vises endres, som er ventet at 1:1 støkiometri ble oppnådd på Fab fragmentet som en heterodimer av tunge og lette kjeden. Figur 1B viser en representant gel av Ah2 Bøyning PEG-DSPE. For å vurdere kalsium fluks av B-celler stimulert av antigen liposomer, to ting er avgjørende: (1) instrument-innstillingene er innstilt for å se en forskjell i forholdet mellom Indo-1 fluorescens i Ca2 + (fiolett) er bundet og ubundet (blå) skjemaer og (2) riktig gating strategi brukes til å vurdere B-celle aktivering. Figur 2A viser gating ordningen for flyt cytometri-baserte kalsium flux analysen. Live lymfocytter er gated in en SSC-A versus FSC-A (venstre panel), doublets er gated ut i en FSC-W versus SSC-W tomt (midtre panelet), og B200+CD5- B-celler er valgt fra en CD5-PE vs B220-PE/Cy7 tomt (høyre panel). Figur 2B viser forholdet mellom Indo-1 (fiolett) vs Indo-1 (blå) fluorescens over tid som analyseres. Merk at den totale protein konsentrasjonen av F(ab) og F(ab')2 i disse analyser var de samme, demonstrere overlegne evne til antigen liposomer i stimulerende B-celle aktivering. Etter å forberede peanut ekstrakt, kjøre en aliquot på en SDS side gel å bestemme den relative mengder Ara h 1, 2 og 3 i ekstraktet. Figur 3 viser en representant gel en peanut utvinning som ble kjørt sammen med renset Ah2. Figur 4 viser en skjematisk av samlet adoptivforeldre peanøttallergi musemodell, inkludert innledende sensibilisering peanut, utfordring til peanut, splenocyte isolasjon og adopsjon overføring, liposome injeksjoner, blod tegne etterfulgt av Ah2 løft, og utfordre til Ah2. Ah2-spesifikk IgE og IgG1 ELISAs ble drevet for å kvantifisere immunglobuliner i serum, som vist i figur 5A og B. Mus med tildelt følsomhet som har blitt styrket med Ah2 har Ah2-spesifikke IgE og IgG1 i deres serum. Kroppen temperaturer under Ah2 utfordringen er vist i figur 5C; allergisk mus hadde redusert kroppen temperaturer etter utfordringen, mens kroppen temperaturer i naiv mus forble konsekvent. Bilder som viser naiv mus sammenlignet med peanut-allergisk mus i utfordringen er vist i figur 6.
Figur 1: representant gel av anti-musen IgM F(ab) og Ah2 Bøyning til PEG-DSPE. (A, B) SDS side analyse av (A) geit anti-musen IgM F(ab) fragment og (B) Ah2 før og etter Bøyning til PEG-DSPE. Goat anti-musen IgM og Ah2 har molekylvekt av ca 48 og 18 kDa, henholdsvis. Etter modifisering, en litt større molekylvekt (~2.5 kDa) er tydelig observert for begge proteiner. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 2: representant gating strategi og kalsium flux resultater analyse. (A) celler ble analysert gjennom følgende gating strategien: live lymfocytter (FSC-A vs. SSC-A), enkeltceller (FSC-W vs SSC-W) og B-celler (B220+CD5-). (B) The Indo-1/Ca2 + flux svar (fiolett vs blue) av B-cellene. Vist er kalsium fluks for anti-IgM Fab fragment liposomer og anti-IgM F(ab')2 på samme protein konsentrasjonen (2,5 µg/mL) og buffer-stimulert celler som en kontroll. Merk at mellom 10-22 s når stimulering legges, og derfor ingen data er ervervet i løpet av denne tiden. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 3: representant gel viser peanut ekstrakt og Ah2. Peanut ekstrakt inneholder flere proteiner, inkludert allergener Ara h 1, 2, 3 og 6, i forhold til de to isoformene som vises for Ah2. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 4: skjematisk av adopsjon overføringsprotokollen. Naive BALB/cJ mus var sensitivisert med peanut ekstrakt (PN) og kolera gift (CT), og deretter utfordret til PN. Splenocytes fra bekreftet allergisk mus ble isolert og overført til naiv mus. Mus var senere primet med immunogenic Ara h 2 liposomer eller PBS, så økte med løselig Ah2. Til slutt, mus ble utfordret med Ah2 å overvåke anafylaksi. Blod på 45 og 60 ble brukt om å kvantifisere Ah2-spesifikke immunglobuliner. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 5: Immunogenic Ara h 2 liposome øker tildelt minne allergiske reaksjoner. Serum var isolert pre (dag 45) og post (dag 60) løft med PBS eller 200 µL av 300 µM immunogenic Ah2 liposome måle Ah2-sepcific IgE (A) og IgG1 (B). Individuelle mus er representert med linjer som indikerer medians. Mus som fikk allergisk splenocytes og ble administrert Ah2 liposomer dag 32 hadde betydelig høyere nivåer av Ah2-spesifikke IgE og IgG1. Anafylaksi ble målt i forskjellig behandlingsgrupper ved kroppen temperaturer etter Ah2challenge (C). Mener kropp temperatur med SEM. naiv: PBS (naive splenocytes og PBS prime), allergisk: PBS (bekreftet allergisk splenocytes og PBS prime), allergisk: Ah2 (bekreftet allergisk splenocytes og Ah2immunogenic liposome prime). * P < 0,05, ** P < 0,01, *** P < 0,001, *** P < 0,0001 bestemmes av unpaired 2-tailed Student t-test. Merk at disse resultatene er representant for to uavhengige eksperimenter. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 6: anafylaktisk symptomer observert under Ah2 utfordring. Naive mus være aktiv og ha rosa hud på føttene (A, C). Allergisk mus har redusert aktivitet, er ofte bøyd opp, har tung pust og oppleve cyanotisk, angitt av mørkere lilla hud på føttene (B, D). Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
| MW | 790 | 387 | 2900 | 3000 | 48000 | |
| DSPC | Kolesterol | PEG-DSPE | overflødig PEG-DSPE | en IgM-PEG-DSPE | TOTALT | |
| Molar forholdet | 57 | 38 | 3.9 | 1 | 0,1 | 100,00 |
| masse (mg) | 0,56 | 0,18 | 0.14 | 0,04 | 0,06 | 0,98 |
| m mol | 0.71 | 0.47 | 0,05 | 0,01 | 0,00 | 1.25 |
| mL | 112.50 | 45.93 | 70.64 | 0,00 | 525.97 | 755.03 |
| CONC. (mg/mL) | ||||||
| DSPC | 5 | |||||
| Kolesterol | 4 | |||||
| PEG-DSPE | 2 | |||||
| en IgM-PEG-DSPE | 0.114 |
Tabell 1: beregninger for å skape en 1,25 µM totale lipid konsentrasjon liposome. Eksempel på beregningstabell for geit anti-musen IgM F(ab) fragment liposomer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Metodene som er skissert her er en generell protokoll for Bøyning av et protein til en lipid som aktiverer visning av protein på liposomal nanopartikler. For svært store multi delenhet proteiner, kan denne protokollen ha begrenset nytte. Den ideelle metoden ville være innføringen av en områdespesifikk kode som gjør at en biorthogonal kjemiske linking strategi skal brukes. Hvis uttrykke protein recombinantly, kan dette være mulig å bruke tilgjengelig områdespesifikke strategier17, og en rekke funksjonelle grupper på slutten av pegylert lipid kommersielt tilgjengelige. Derfor denne protokollen er rettet mot kobling protein isolert fra naturlige kilder og er tilgjengelig for en rekke forskere ikke nødvendigvis kjent med kjemisk og biokjemiske transformasjoner.
Et viktig aspekt ved å kjøre en kalsium flux eksperiment som skal vektlegges er at cellene ikke skal aktiveres før du kjører dem på flowcytometri. Hvis sterilt teknikken ikke brukes strengt, vil dette utgjøre et høye signal fra aktivert celler (Indo-1 fluorescens forvrenges mot sine utslipp i fiolett kanalen). Tilsvarende bør celler holdes på is før du kjører analysen for å unngå unormale nivåer av bakgrunn signal i Indo-1 kanaler. Det er også viktig å sikre at cellene er varmet i 2-3 min før anskaffelse av flowcytometri og hele stimulering under datainnsamling. Hvis cellene ikke vedlikeholdes på 37 ° C i løpet av datainnsamling, kan det forventes at cellene ikke svarer maksimalt. Siden antigen-spesifikke B-celler finnes i mus på svært små tall, er ved hjelp av en surrogat antigen for å stimulere alle B-celler fra mus ideelt. Selv om mange transgene musen stammer er tilgjengelig som uttrykke antigen-spesifikke B-celler, formålet med denne teknikken er at den gjennomsnittlige brukeren å kunne validere utføre antigen liposomer med vill-type mus. For å oppnå dette målet, var Fab fragmenter av anti-musen IgM knyttet til lipider og formulert i antigen liposomer som link B-celle reseptor (BCR) på en polyklonale måte. Det er bemerkelsesverdig at det var tidligere vist at denne metoden kan brukes å stimulere menneskets B-celler10 med riktig anti-IgM Fab fragmentet, som er viktig fordi det ikke er mulig å få tilgang til betydelig antall antigen-spesifikke menneskelig B-celler. I disse studiene, ble styrken på antigen liposomer å stimulere B-celle aktivering illustrert av deres forbedret evne til å indusere kalsium flux sammenlignet med like mengder av anti-musen IgM F(ab') 2.
Bruk av antigen liposomer har aktivert utvikling av en metode for sensitiverende BALB/cJ mus peanut, overføre splenocytes fra allergiske mus til naiv mus, injisere vert mus med Ah2 liposomer og utfordrende dem med Ah2. Antistoff nivåer og anafylaktisk svar i grupper av mus er reproduserbare i denne modellen. Det er blitt godt etablert som minne B - og T-celle svar er viktige i utviklingen av peanut-spesifikke antistoffer i mus. Videre en fersk studie har vist at minne B-celler gjenbefolke plasma celler i mus, som opprettholde forhøyede antigen-spesifikke IgE nivåer; Derfor allergen-spesifikke minne B-celler er et attraktivt mål for terapeutisk intervensjon18. Modellen beskrevet her nå gir en mulighet til å målrette direkte Ah2-spesifikke minne B-celler, i motsetning til suppressive tilnærming med bortezomib for å tømme hele plasmacelle repertoar19. En annen tilnærming for å bekjempe allergier er å indusere toleranse i T-celle rommet. En potensiell strategi er å kapsle toleranse-inducing adjuvans i liposome. Tidligere ble nanopartikler innkapsle rapamycin brukt til å indusere Tregs og minske autoimmun sykdom20. Denne type tilnærming kan brukes til å utvikle tolerogenic terapi for å behandle peanøttallergi. Total, manipulering av allergen-spesifikke liposome av bøye molekyler på overflaten gir skreddersydd immunreaksjoner og innkapsle narkotika-lignende molekyler kan levering av narkotika til allergen-spesifikke cellen.
De generelle begrensninger av denne musemodell peanut allergi er at allergi peanut med kolera gift og påfølgende peanut utfordring via IP injeksjon er ikke helt representant for peanøttallergi hos mennesker (f.eks mennesker har reaksjoner på oralt inntak). Men denne allergi modellen er den gjeldende standarden i feltet11,18,21, og tillater oss å undersøke molekylære mekanismer av allergiske sykdommer og utvikle romanen terapeutiske metoder. Sammenlignet med disse konvensjonelle tilnærminger, har denne adoptivforeldre overføring modellen tre hovedfordeler. Først er at det muliggjør minne B - og T-celler spesifikke for allergenet studier mer direkte. Faktisk implicates bevis nå sterkt minne B-celler som den viktigste kilden til langsiktig allergi18. Andre, fordi det samme nummeret av minne B - og T-celler er implantert inn hver mottaker musen, allergiske reaksjoner er minimal variabel. Tredje, denne modellen gir mulighet til å studere allergiske reaksjoner til individuelle allergener, noe som er nyttig i forbindelse med testing nye immunotherapies. En interessant anvendelse av denne modellen er å bruke den generelle tilnærmingen i sammenheng med en humanized musemodell, der allergiske reaksjoner har vært studert i vaksineres modeller22. Brukt i sammenheng med en adopsjon overføring modell, en humanized musemodell kan være en kraftig tilnærming til utvide og i vivo testing av B - og T-celler fra allergisk pasienter.
Antistoff sykdom patogenesen skjer ikke bare i allergisk modeller, men også i B-celle mediert autoimmune sykdommer23. Adoptively overføring sensibilisert splenocytes fra mus gitt en autoantigen ville til slutt være svært nyttig i å redusere antall dyr som brukes, minimere antallet av dyr mottar flere injeksjoner av adjuvans og øke reproduserbarhet av svar mellom kohorter mus i flere sykdom indikasjoner. Et eksempel ville være i en eksperimentell autoimmune modell av myasthenia gravis (EAMG) som utsatt musen stammer (C57BL/6, SJL og AKR) er vaksinert flere ganger med acetylcholin reseptor (AChR) i adjuvant å utvikle sykdomsfremkallende autoantistoffer. Disse autoantistoffer til slutt føre til immunopathological funksjoner hos mennesker som muskelsvakhet tretthet, innskudd immunglobuliner og supplement komponenter på nevromuskulær veikryss og i alvorlige tilfeller sykelighet/død24. I EAMG, sykdom forekomsten på varierer mellom 50 og 70%, så til denne variasjonen store dyr kohorter er nødvendig for å nå statistisk signifikans25,26. Metoden beskrevet her vil til slutt redusere antall dyr som brukes ved å redusere variasjon sykdom forekomsten. Som tidligere nevnt, EAMG er indusert av flere injeksjoner med AChR + adjuvans (komplett Freund Adjuvant og ufullstendig Freund Adjuvant) utløse auto-antistoff svar. Denne metoden vil redusere antall dyr som mottar flere injiserer med adjuvant. Endelig, på grunn av flere vaksinasjoner og øker er det relativt vanskelig å definere passende terapeutiske Vinduer for forebyggende og terapeutiske behandlinger. Denne metoden kan synkronisere antistoff respons og sykdom patogenesen vinduet slik at det blir en mer forutsigbar og reproduserbar. Den samme logikken kan brukes til mange andre musen modeller av antistoff mediert autoimmune sykdommer som revmatoid artritt27.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne ikke avsløre.
Acknowledgments
Denne forskningen ble støttet av bevilgninger fra Department of Defense (W81XWH-16-1-0302 og W81XWH-16-1-0303).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Model 2110 Fraction Collector | BioRad | 7318122 | |
| Cholestrol | Sigma | C8667 | Sigma grade 99% |
| SPDP | Thermo Fisher Scientific | 21857 | |
| DSPC | Avanti | 850365 | |
| DSPE-PEG 18:0 | Avanti | 880120 | |
| DSPE-PEG Maleimide | Avanti | 880126 | |
| Extruder | Avanti | 610000 | 1 mL syringe with holder/heating block |
| Filters 0.1 µm | Avanti | 610005 | |
| Filters 0.8 µm | Avanti | 610009 | |
| 10 mm Filter Supports | Avanti | 6100014 | |
| Glass Round Bottom Flask | Sigma | Z100633 | |
| Turnover stoppers | Thermo Fisher Scientific | P-301398 | |
| Tubing | Thermo Fisher Scientific | P-198194 | |
| Leur Lock | Thermo Fisher Scientific | k4201634503 | |
| Sephadex G50 Beads | GE Life Sciences | 17004201 | |
| Sephadex G100 Beads | GE Life Sciences | 17006001 | |
| Heat Inactivated Fetal Calf Serum | Thermo Fisher Scientific | 10082147 | |
| HEPES (1 M) | Thermo Fisher Scientific | 15630080 | |
| EGTA | Sigma | E3889 | |
| Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL) | Thermo Fisher Scientific | 15140122 | |
| 1x RBC lysis Buffer | Thermo Fisher Scientific | 00-4333-57 | |
| Indo-1 | Invitrogen | I1203 | |
| CD5-PE | BioLegend | 100608 | |
| B220-PE-Cy7 | BioLegend | 103222 | |
| HBSS | Thermo Fisher Scientific | 14170112 | without calcium and magnesium |
| MgCl2 | Sigma | M8266 | |
| CaCl2 | Sigma | C4901 | |
| Fab anti-mouse IgM | Jackson ImmunoResearch | 115-007-020 | |
| F(ab')2 anti-mouse IgM | Jackson ImmunoResearch | 115-006-020 | |
| Peanut flour | Golden Peanut Co. | 521271 | 12% fat light roast, 50% protein |
| Animal feeding needles | Cadence Science | 7920 | 22g x 1.5", 1.25 mm - straight |
| Microprobe thermometer | Physitemp | BAT-12 | |
| Rectal probe for mice | Physitemp | Ret-3 | |
| Cholera toxin, from Vibrio cholera | List Biological Laboratories, Inc. | 100B | Azide free |
| BCA Protein Assay Kit | Pierce | 23225 | |
| Carbonate-bicarbonate buffer | Sigma | C3041 | |
| TMB Stop Solution | KPL | 50-85-06 | |
| SureBlue TMB Microwell Peroxidase Substrate | KPL | 5120-0077 | |
| 96 well Immulon 4HBX plate | Thermo Scientific | 3855 | |
| Purified soluble Ara h 2 | N/A | N/A | purified as in: Sen, et al., 2002, Journal of Immunology |
| HSA-DNP | Sigma | A-6661 | |
| Mouse IgE anti-DNP | Accurate Chemical | BYA60251 | |
| Sheep anti-Mouse IgE | The Binding Site | PC284 | |
| Biotinylated Donkey anti-Sheep IgG | Accurate Chemical | JNS065003 | |
| NeutrAvidin Protein, HRP | ThermoFisher Scientific | 31001 | |
| Mouse IgG1 anti-DNP | Accurate Chemical | MADNP105 | |
| HRP Goat anti-mouse IgG1 | Southern Biotech | 1070-05 | |
| 1 mL Insulin Syringes | BD | 329412 | U-100 Insulin, 0.40 mm (27 G) x 16.0 mm (5/8") |
| Superfrost Microscope Slides | Fisher Scientific | 12-550-14 | 25 mm x 75 mm x 1.0 mm |
| ACK Lysing Buffer | gibco by Life Technologies | A10492-01 | 100 mL |
| RPMI 1640 Medium | Thermo Fisher Scientific | 11875093 | 500 mL |
| Cell Strainer | Corning | 352350 | 70 μm Nylon, White, Sterile, Individually packaged |
| NuPAGE 4-12% Bis-Tris Protein Gels | Invitrogen | NP0322BOX | 10 gels |
| NuPAGE LDS buffer, 4x | Invitrogen | NP0008 | 250 mL |
| SeeBlue Plus2 Pre-stained standard | Invitrogen | LC5925 | 500 µL |
| NuPAGE MES/SDS running buffer, 20x | Invitrogen | NP0002 | 500 mL |
| GelCode Blue Stain | Thermo Scientific | 24590 | 500 mL |
References
- Gupta, R. S., et al. The prevalence, severity, and distribution of childhood food allergy in the United States. Pediatrics. 128 (1), e9-e17 (2011).
- Sicherer, S. H., Munoz-Furlong, A., Godbold, J. H., Sampson, H. A. US prevalence of self-reported peanut, tree nut, and sesame allergy: 11-year follow-up. Journal of Allergy and Clinical Immunology. 125 (6), 1322-1326 (2010).
- Kim, E. H., et al. Sublingual immunotherapy for peanut allergy: clinical and immunologic evidence of desensitization. Journal of Allergy Clinical Immunology. 127 (3), 640-646 (2011).
- Vickery, B. P., et al. Sustained unresponsiveness to peanut in subjects who have completed peanut oral immunotherapy. Journal of Allergy and Clinical Immunology. 133 (2), 468 (2014).
- Jones, S. M., et al. Epicutaneous immunotherapy for the treatment of peanut allergy in children and young adults. Journal of Allergy and Clinical Immunology. 139 (4), 1242 (2017).
- Varshney, P., et al. A randomized controlled study of peanut oral immunotherapy: clinical desensitization and modulation of the allergic response. Journal of Allergy Clinical Immunology. 127 (3), 654-660 (2011).
- Anagnostou, K., et al. Assessing the efficacy of oral immunotherapy for the desensitisation of peanut allergy in children (STOP II): a phase 2 randomised controlled trial. Lancet. 383 (9925), 1297-1304 (2014).
- Sampson, H. A., et al. Effect of Varying Doses of Epicutaneous Immunotherapy vs Placebo on Reaction to Peanut Protein Exposure Among Patients With Peanut Sensitivity: A Randomized Clinical Trial. The Journal of the American Medical Association. 318 (18), 1798-1809 (2017).
- Bednar, K. J., et al. Human CD22 Inhibits Murine B Cell Receptor Activation in a Human CD22 Transgenic Mouse Model. Journal Immunology. 199 (9), 3116-3128 (2017).
- Macauley, M. S., et al. Antigenic liposomes displaying CD22 ligands induce antigen-specific B cell apoptosis. Journal Clinical Investigation. 123 (7), 3074-3083 (2013).
- Orgel, K. A., et al. Exploiting CD22 on antigen-specific B cells to prevent allergy to the major peanut allergen Ara h 2. Journal Allergy Clinical Immunology. 139 (1), 366-369 (2017).
- Smarr, C. B., Hsu, C. L., Byrne, A. J., Miller, S. D., Bryce, P. J. Antigen-fixed leukocytes tolerize Th2 responses in mouse models of allergy. Journal of Immunology. 187 (10), 5090-5098 (2011).
- Kulis, M., et al. The 2S albumin allergens of Arachis hypogaea, Ara h 2 and Ara h 6, are the major elicitors of anaphylaxis and can effectively desensitize peanut-allergic mice. Clinical and Experimental Allergy. 42 (2), 326-336 (2012).
- Dang, T. D., et al. Increasing the accuracy of peanut allergy diagnosis by using Ara h 2. Journal of Allergy Clinical Immunology. 129 (4), 1056-1063 (2012).
- Loughrey, H. C., Choi, L. S., Cullis, P. R., Bally, M. B. Optimized procedures for the coupling of proteins to liposomes. Journal Immunological Methods. 132 (1), 25-35 (1990).
- Sen, M., et al. Protein structure plays a critical role in peanut allergen stability and may determine immunodominant IgE-binding epitopes. Journal of Immunology. 169 (2), 882-887 (2002).
- Krall, N., da Cruz, F. P., Boutureira, O., Bernardes, G. J. Site-selective protein-modification chemistry for basic biology and drug development. Nature Chemistry. 8 (2), 103-113 (2016).
- Jimenez-Saiz, R., et al. Lifelong memory responses perpetuate humoral TH2 immunity and anaphylaxis in food allergy. Journal Allergy and Clinical Immunology. 140 (6), 1604-1615 (2017).
- Moutsoglou, D. M., Dreskin, S. C. Prolonged Treatment of Peanut-Allergic Mice with Bortezomib Significantly Reduces Serum Anti-Peanut IgE but Does Not Affect Allergic Symptoms. International Archives of Allergy and Immunology. 170 (4), 257-261 (2016).
- LaMothe, R. A., et al. Tolerogenic Nanoparticles Induce Antigen-Specific Regulatory T Cells and Provide Therapeutic Efficacy and Transferrable Tolerance against Experimental Autoimmune Encephalomyelitis. Frontiers in Immunology. 9, 281 (2018).
- Srivastava, K. D., et al. Investigation of peanut oral immunotherapy with CpG/peanut nanoparticles in a murine model of peanut allergy. J Allergy Clin Immunol. 138 (2), 536-543 (2016).
- Bellinghausen, I., Saloga, J. Analysis of allergic immune responses in humanized mice. Cellular Immunology. 308, 7-12 (2016).
- Pillai, S., Mattoo, H., Cariappa, A. B cells and autoimmunity. Curr Opin Immunol. 23 (6), 721-731 (2011).
- Mantegazza, R., Cordiglieri, C., Consonni, A., Baggi, F. Animal models of myasthenia gravis: utility and limitations. International Journal of General Medicine. 9, 53-64 (2016).
- Berman, P. W., Patrick, J. Experimental myasthenia gravis. A murine system. J Exp Med. 151 (1), 204-223 (1980).
- Berman, P. W., Patrick, J. Linkage between the frequency of muscular weakness and loci that regulate immune responsiveness in murine experimental myasthenia gravis. J Exp Med. 152 (3), 507-520 (1980).
- Derksen, V., Huizinga, T. W. J., van der Woude, D. The role of autoantibodies in the pathophysiology of rheumatoid arthritis. Seminars in Immunopathology. 39 (4), 437-446 (2017).
