Summary
만성 안구 고혈압 쥐와 쥐, 일치 녹 내장 망막 신경 절 세포의 기능 및 구조 저하로 이어지는 circumlimbal 봉합을 적용 하 여 유도 된다.
Abstract
Circumlimbal 봉합 만성 안구 내부 압력 (IOP), 녹 내장에 대 한 잘 알려진 위험 요소를 높이기에 의해 설치류의 실험 녹 내장을 유발 하는 기술 이다. 이 프로토콜에서는 긴 에반스 쥐 및 C57BL/6 쥐에이 기술에 대 한 단계별 가이드를 보여 줍니다. 일반 마 취, "지갑-문자열" 봉합 결, 적도 주위와 눈의 limbus 뒤에 적용 됩니다. 동료 눈 치료 컨트롤 역할을 합니다. 우리의 연구는 쥐에 대 한 8 주와 12 주 마우스의 기간의 기간 동안 IOP 리바운드 tonometry 국 소 마 취 없이 의식이 있는 동물에 의해 정기적으로 측정 된 높은, 남아. 두 종에서 sutured 눈 보여주었다 electroretinogram 기능을 우선 내부 망막 장애와 일치. 광학 일관성 단층 촬영 망막 신경 섬유 층의 선택적 숱이 보였다. 조직학 발견 횡단면에 쥐 망막의 신경 절 세포 층에 세포 밀도 하지만 다른 세포 층에 변화가 감소. 신경 절 세포 특정 표시 (RBPMS)와 함께 평면 탑재 마우스 retinae의 얼룩 ganglion 셀 손실 확인. Circumlimbal 봉합은 간단한, 최소한 침략 적이 고 비용 효율적인 방법으로 쥐 및 쥐에서 신경 절 세포 상해에 이르게 눈의 고혈압을 유발 하.
Introduction
동물 모델 평가 잠재적인 치료 내정간섭으로 기본 녹 병, 잘을 처리 하는 세포의 실험실 조사에 대 한 중요 한 플랫폼을 제공 합니다. 여러 모델을 유도할 수 있는 지속적인된 intraocular 압력 (IOP) 상승, 녹 내장에 대 한 가장 중요 한 위험 요소를 생산 하기 위해 개발 되었습니다. IOP 상승에 적용 된 방법은 다음과 같습니다: episcleral에 고 식 염 수 주입 혈관1, 레이저 photocoagulation 배수 채널2 의 또는 limbal 혈관3및 intracameral와 같은 물질의 주입 빨간 유령 혈4, microbeads5,6 , 점 탄성 요원7. 각 방법의 장점과 한계는 있습니다.
녹 내장에 대 한 좋은 모델 외상, 염증 및 미디어 불투명도 등 최소한의 합병증과 질병 과정을 모방 해야 합니다. 이러한 합병증 IOP 상승, 유도 하는 데 사용 하는 절차와 자주 연결 되 고 결과의 해석을 혼동 수 있습니다. 예를 들어 paracentesis 앞쪽 챔버의 이물질은 도입 되지, 하는 경우에 표시 되었습니다 외상 및 염증의 전형적인 glaucomatous 변경8,9은 아닙니다 원인. 염증 방지의 중요성 뿐만 아니라 vivo에서 이미징 및 질병의 진행을 모니터링 하는 생리학 용이 광학 선명도 유지. 이러한 합병증 질환 조사, 영향을 미칠 수 있지만 그것은 어느 정도까지 불분명 모델 유도 하는 동안 눈을 관통 하지 않도록 더 있을 수 있습니다. Circumlimbal 봉합 접근 세계의 침투를 방지 하 고 망막의 구조와 기능의 비보에 경도 평가 용이 하 게. 더 중요 한 것은,이 모델은 필요할 때 봉합의 제거에 의해 초기 계획 값을 IOP를 반환 에서 이전 그들에서 다릅니다. 되돌릴 수와 돌이킬 수 없는 신경 절의 분자 상호 세포 상해10,11,12,,1314그리고 IOP 정규화 세포를 공부 하는 데 유용 수 있습니다.
이 문서는 모델 유도 대 한 기술에 초점을 맞추고. 쥐와 쥐에이 모델에 의해 유도 된 망막 상해의15,,1617,,1819자세히 다른 곳에서 찾을 수 있습니다.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
모든 실험 절차는 과학적 목적, 호주에서 국민 건강 및 의료 연구 위원회에 의해 설정에 대 한 관심과 동물의 사용에 대 한 호주 코드 연습에 따라 실시 했다. 하 워드 Florey 연구소 동물 윤리 위원회에서 윤리 승인을 얻은 (승인 번호 13-044-UM 그리고 13-068-음 쥐와 생쥐, 각각).
1. 안 구내 압력 측정 의식 쥐에
- 실험실 리바운드 tonometer 쥐 설정으로 설정 합니다. 진정 동물을 부드러운 헝겊 조각에 깨어 쥐 swaddle 머리와 목 노출. 탐정의 가슴에 대하여 휴식 하는 동물의 다시 몸통 한 손에 부드럽게 잡으십시오.
참고: 국 소 마 취는 필요 하지 않습니다. - 사용 하 여 다른 손을가지고 쥐의 눈 근처 리바운드 tonometer IOP 프로브 팁은 약 2-3 m m에서 및 수직 각 막 정점에. 오른손을 사용 하 여 동물의 오른쪽 눈과 왼쪽된 눈에 대 한 왼손에 IOP를 측정.
- 진정 하 고 측정 한 번 하는 쥐에 대 한 몇 초 동안 기다립니다. IOP 프로브 팁 부드럽게 명 중 각 막 정점 한번; 관찰 그리고 리바운드 tonometer 비프음을 한 번 듣고.
참고: 단일 비프음은 tonometer의 성공적인 측정, LCD 화면에서 읽을 수 있는 확인 합니다. 이중 비프음 측정 오류를 나타냅니다. 측정 오류 조사 및 각 막, tonometer, 또는 눈 꺼 풀 또는 각 막의 중앙이 아닌 일부 눈에 띄는 조사 방향에 과도 한 기울기 사이의 부적절 한 작동 거리 같은 요인에서 발생할 수 있습니다. 측정 오류에 관한 더 세부 사항에 대 한 제조 업체에서 리바운드 tonometer 설명서를 참조 하십시오. - 10 번에 1-2 초의 간격 1.3 단계를 반복, 이러한 측정에서 그 시간 지점에 대 한 평균 IOP 값을 파생. 5번째 읽기 후에 tonometer를 다시 설정 합니다.
- 직렬 모니터링, IOP 하루의 고 일주 IOP 사이클20,21인 변화를 최소화 하기 위해 일관 된 조명 조건 하에서 같은 시간에 측정 합니다.
2. 의식이 쥐 안 구내 압력 측정
- 제조업체의 지시에 따라 마우스 설정에 리바운드 tonometer를 설정 합니다.
- 손으로 마우스를 억제, 그릴 케이지 위에 마우스 놓고 살짝 꼬리를 뒤로 당겨.
참고:이 동물 그것의 몸을 스트레칭 약간 앞 다리와 시도 자체를 앞으로, 금속 그릴에 그립을 자극할 것 이다.- 다른 손을 사용 하 여 즉시 귀 뒤에 느슨한 피부를 파악. 테일 링 손가락과 가운데 손가락 사이 (또는 작은 손가락과 손바닥 사이)를 개최 하 여 동물의 체를 보안 합니다.
참고: 질 식과 눈에 적용 압력을 피하기 위해 너무 꽉 피부를 파악 하지 않으려고.
- 다른 손을 사용 하 여 즉시 귀 뒤에 느슨한 피부를 파악. 테일 링 손가락과 가운데 손가락 사이 (또는 작은 손가락과 손바닥 사이)를 개최 하 여 동물의 체를 보안 합니다.
- 지금 무료 손 (처음 들고 꼬리), IOP 프로브 팁은 약 2-3 m m 및 수직 각 막 정점에 마우스의 눈 근처 리바운드 tonometer가지고. 다른 눈을 측정 하는 다른 눈 이제는 tonometer 앞 마우스를 회전 합니다.
- 진정 하 고 측정의 단추 한 번 마우스를 기다립니다. IOP 프로브 팁 부드럽게 칠 각 막 정점; 관찰 단일 경고음이 시스템이 성공 측정을 확인.
참고: 이중 비프음 측정 오류를 나타냅니다. 그것을 두 번째 실험 읽기 및 문서 IOP 읽기 첫 번째 실험은 측정 하는 동안 도움이 됩니다. - 2.4 파생 된 IOP 10 성공적인 읽기를 반복 합니다. 5번째 읽기 후에 tonometer를 다시 설정 합니다. 읽기 1-2 초 간격을 허용 한다.
- 쥐에서 직렬 측정에 의하여 오늘의 하 고 일관 된 조명 조건 하에서 동시에 마우스 IOP를 측정 합니다.
3. 마 취 쥐 및 쥐에 안구 내부 압력 상승의 유도
- 70% 에탄올에 0.5% 액체와 수술 도구를 청소 합니다. 무 균 커튼으로 벤치를 커버. 오토 클레이 브 모든 수술 장비 사전. 적절 한 개인 보호 장비 (스 쿠와 멸 균된 장갑, 가운)을 착용 하는 모든 경험을 확인 하십시오.
- 전신 마 취 유도, 유도 챔버에서 동물을 배치 합니다. 3 L/min의 유량에 O2 와 3-3.5 %isoflurane 제공 합니다.
- 1.5 %2 L/min 전달 통해 수술 내내 설치류 얼굴 마스크에서 isoflurane와 마 취를 유지 합니다. 발 핀치 반사의 부재에 의해 마 취의 충분 한 깊이 확인 합니다.
- 때 약 60 호흡/분 호흡 속도 유지 하기 위해 필요한 유량을 조정 하 여 호흡을 하지 마십시오.
- 치료 컨트롤 역할을 contralateral 눈으로, 눈의 고혈압을 유발 하는 눈 하나를 임의로 선택 합니다. 국 소 마 취에 대 한 0.5 %proxymetacaine 안과 솔루션의 한 방울을 주는. 눈 표면을 청소, 살 균 정상적인 염 분의 3 mL와 함께 눈을 씻어 하십시오.
- 커버는 살 균, fenestrated 수술 드 레이프, 봉합 될에 눈을 노출 된 동물.
- 전세계 안구 결 막에 지갑 문자열 봉합을 수행 합니다. 쥐, 7/0 나일론 봉합 병렬 및 2mm 후부 limbus (그림 1) 짜 다. 쥐, 장소 10/0 나일론 봉합 1 m m는 limbus를 후부.
- 알아서 하지 여 sclera에 침투. 수술 하는 동안 갑자기 동 공 팽창이 나타냅니다는 sclera 침투 가능성이 있다.
- 5-6 앵커 포인트 쥐, 및 쥐에 4-5 앵커 포인트를 사용 하 여 결 막에 봉합 앵커.
- 이러한 정 맥의 교차점에 결 막 아래 봉합을 스레딩 하 여 주요 episcleral 혈관에 직접 압축을 하지 마십시오.
참고: 쥐에 있는 주요 episcleral 정 맥의 압축을 피하는 것이 좋습니다, 하는 동안이 수행 되지 않습니다 정기적으로 쥐 마우스 눈에서 이러한 혈관의 낮은 가시성 때문에. 주요 정 맥 직접 압축 되지 않는다 하더라도 그것은 episcleral 정 맥 총에 작은 혈관 압력, 기여 지속적인된 IOP 상승 하는 요인이 될 수 있는 가능성이 (IOP 상승의 메커니즘에 대 한 논의 참조 하십시오).
- 두 번째 간단한 매듭 (그림 1)에 의해 다음 매듭을 매 서 지갑 문자열 봉합 고정. 지나치게 높은 수술 후 IOP 스파이크를 방지 하려면 조 두 번째 매듭을 체결 직전 IOP를 측정할 수가 있다.
- IOP 너무 높게 되 면 부분적으로 봉합 ( 그림 1A화살표)의 한쪽 끝에 긴장을 방출 하 여 슬립 매듭을 조정 합니다.
- 후 원하는 IOP 이루어집니다 (이상적으로 30-60 mmHg 쥐 또는 쥐에 30-40 mmHg), 봉합 ( 그림 1화살표)의 끝에는 연속 당기는 힘을 유지 하면서 두 번째 매듭에서 넥타이.
- 두 번째 후 매듭 강화 되었습니다, 그리고 어떤 외국 몸 센 세이 션을 최소화 하기 위해 봉합의 끝을 잘라. 전신 마 취에서 회복 하는 동안 동물을 모니터링 합니다.
참고: 그것은 눈에 적절 한 내부 압축 되도록 때 첫 매듭을 매는 매듭을 사용 하는 것이 중요입니다. 몇 주 후 끝 결 막에 포함 되 고 일반적으로 주의 된다.
4. 모니터링 IOP
- Post-operatively isoflurane 마 취 아래 2 분에서 첫 번째 IOP 측정을 가져가 라. 설치류는 앞서 언급 한 1 단계와 2 단계에 의하여 의식 회복 하는 때 그 후, IOP를 모니터링 합니다.
참고: 매일 첫 주에 한 번 또는 두 번 주당 그 후 두 번 (2 분, 1 시간), 첫 번째 하루 동안 IOP를 모니터링 합니다.
5. 시 금 망막 구조와 기능
- 설명 된 대로 측정 dark-adapted electroretinogram (에) 망막 기능을 원하는 실험 끝 지점에서 (이 경우에 8 주 쥐 및 쥐에 있는 12 주 후), 케 타 민/xylazine와 복 주입을 사용 하 여 일반 마 취, 자세히 다른15,,1617.
참고: 우리가 발견 강력한 신경 절 세포 기능 장애, 망막 신경 섬유 층 숱이 고 신경 절의 세포 손실 8 ~ 12 주 사이의 기간에 대 한. 다른 사람 성공적으로 IOP 상승14,15의 긴 기간을 고용 했다. - 직후에 측정, 망막 신경 섬유 층 (RNFL)의 두께 스펙트럼 도메인 광학 일관성 단층 촬영 (SD-10 월) 16,18를 사용 하 여 전체 망막 두께 측정 합니다.
- 종 적 연구의 끝에, 깊은 마 취 동물 안락사.
- 해 부 조직학18, 다중 접합 항 체 (RBPMS) 또는 뇌 특정 homeobox/POU 도메인 RNA 의무적인 단백질 등 망막 신경 절 세포 (RGC) 특정 항 체를 사용 하 여 전체 마운트 망막의 예를 들어 immunostaining에 대 한 망막 단백질 3A (Brn3a)16,,1922.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
쥐18 및 마우스16 다음 결과 이전에 보고 된 고 여기 요약 된다. Circumlimbal 봉합 사 생산 IOP 상승 쥐와 생쥐 (그림 2)에서 비슷한 패턴. 간단한 IOP 스파이크, 최대 58.1 ± 2.7 mmHg 쥐에서와 쥐, 38.7 ± 2.2 mmHg 봉합 수술 후 즉시 발견 되었다. 쥐, IOP 크기 3와 24 시간, 각각15에 44 ± 6 mmHg 그리고 32 ± 2 mm Hg, 수 시간이 지남에 따라 점차적으로 감소. 이 초기 IOP 스파이크 후 IOP 몇 주 동안 상대적으로 안정 유지. 실험 기간 동안, IOP 눈 고혈압 (OHT) 눈에 의해 높은 남아 ~ 쥐에 8 주 동안 9 mmHg ~ 쥐에서 12 주 동안 5 mmHg.
RGC 기능 평가, 매우 희미 한 자극 에너지에 scotopic 르 그 elicits 긍정적인 Scotopic 임계값 응답 (pSTR), 쥐 및 쥐 (그림 3)에서 제어 눈을 기준으로, OHT 눈에 감소 될 것 발견. 또한 있었다는 르 그의 작은 감소 a-와 b-파, 대뇌의 양극 세포, 가벼운 역을 각각 반영 것입니다. 그러나 가장 큰 적자는 pSTR, 온화한 만성 IOP 상승 후 우선 내부 망막 장애 확인에서 발견 되었습니다.
내부 망막 장애와 일치, RGC 계층에서 셀 밀도의 선택적 손실 또한 OHT 망막 (그림 4A -4 C)의 횡단면에서 분명 했다. 반면, 외부와 안 핵 층에서 핸드폰 번호 대상에서 허 혈 성 효과 최소화 했다 제안 변경 되지 않은18, 남아 있었다. 쥐에서 같은 결과 셀 카운트 RGC 특정 항 체와 confocal 현미경 검사 법 (그림 4E -4 G)를 사용 하 여 스테인드 전체 마운트 마우스 retinae에 의해 뒷받침 했다. 마찬가지로, 10 월 검사 시 신경 머리 주위 전체 망막 두께 남아 두 종 (그림 4D 4 H)에서 변형 하는 동안 만성 IOP 상승 감소 RNFL 두께, 결과 나타났다.
그림 1 . 눈의 적도 주위 Circumlimbal 봉합 응용. A: 첫째, 한 매듭을 사용 하 여 하나의 문자열 (화살표), 적절 한 내부 압축 보장 당겨서 지갑 문자열 봉합을 강화. 조 수는 두 번째 매듭을 체결 직전 IOP를 측정할 수 있습니다. B: 이후 첫 번째 매듭을 잠그려면 두 번째 간단한 매듭 넥타이. C: 마우스 눈에 circumlimbal 봉합의 사진. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 2 . Circumlimbal 봉합 제기 쥐에서 8 주 동안 intraocular 압력으로이 경우에 (A, n = 8) 쥐에 12 주 (B, n = 23). IOP contralateral 제어 눈에서 변하지 않게 남아 있었다. (개별 OHT 눈 빨간 기호 및 제어 눈 회색 기호로 표시). 평균 및 표준 편차는 블랙에 중첩 됩니다. 데이터는 합니다 허가 이전 작업 16,18). 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 3 . 만성 IOP 상승 유발 쥐 (A & B) 및 마우스 (C & D)에서 안 망막에서 특히 기능적인 적자. A: 평균에 파형 (n = 8 쥐) 밝고 희미 한 자극 (2.07 및-5.31 cd.s.m-2 상단에 대 한 로그 및 추적을 각각 아래쪽)에 대 한 응답 IOP 상승의 8 주 후. B: RGC 함수를 나타내는 pSTR의 상대적인 진폭 photoreceptoral 한 파 보다 더 영향을 받는 고는 바이 폴라 구동된 b-파 셀. C 와 D A 와 B 는 하지만 IOP 상승의 12 주 후 23 쥐의 평균에서 파생 된. 다시, RGC 부전 photoreceptoral와 양극 세포 역 기능 보다 더 심각 했다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 4 . 르 그: electroretinogram; OHT: 눈의 고혈압; IOP: intraocular 압력; pSTR: 긍정적인 Scotopic 임계값 응답; RGC: 망막 신경 절 세포; * P < 0.05. 오차 막대: 의미의 표준 오차. 데이터 이전 작업에서 허가 함께 다시는. 16 , 18 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Circumlimbal 봉합 만성 눈의 고혈압의 새로운 모델입니다. 연구는 대표적인 결과 공급된16,18, 뿐만 아니라이 동물 모델은 최근 연구15,,2324,25의 수에 이용 되어 ,26. 이러한 이전 보고서에 걸쳐 비교는 방법은 모델 유도 동안 IOP 상승, 간단한 IOP 스파이크의 크기를 포함 하 여 반복 결과 생성 보여줍니다 (나중에 토론을 참조 하십시오). IOP 상승 강력한 RGC 변화를 유도 하는 데 필요한 기간은 8과 12 주 사이, 비록 모델 수 유지에 대 한 이상, IOP 상승14,15의 15-16 주에 대 한 결과 보고 하는 연구와. 반복성, 뿐만 아니라이 방법은 비교적 간단 하 고 비용 효과적인 이며 쥐 및 쥐에서 사용할 수 있습니다. 때 모델 유도에 눈을 관통 하는 포함 하는 다른 방법에 비해,이 모델은 의무가 분명 광 미디어, 전기 생리학 또는 vivo에서 망막 이미징 등 필요로 하는 조사. 이것에 대 한 이유 중 하나는 피하 paracentesis, circumlimbal 봉합 방법 따라서 외상 관련 된 염증 및 백 내장을 최소화 하 고 눈의 면역 특권을 보존 목표입니다. 그러나 Iba 1 식, 발견이 기술을 채용 이전 연구, 염증에 대 한 마커가 아니었다 upregulated 망막15, 다른 염증 성 마커 또는 앞쪽 챔버 염증의 존재는 아직 계량 하지 에이 모델. 또 다른 장점은 IOP 상승 봉합 사 제거, 가벼운 진정 및 국 소 마 취14,15에서 할 수 있는 간단한 절차에 의해 반전 될 수 있다. 이 circumlimbal 봉합 녹 내장24에 신경 절 세포 상해의 잠재적인 가역 조사에 대 한 독특한 모델을 렌더링 합니다.
봉합 절차 IOP 발생 메커니즘은 완전히 이해 되지 않습니다, 하지만 여러 가지 다른 요인 배제 후 수성 유출의 방해는 가능성이 원인. 이전 연구에서 우리는 circumlimbal 봉합 두 쥐15 및 마우스16 에 전방 약 실 깊이 또는 iridocorneal 각도 크게 변경 하지 않습니다 및 아니다 따라서 각도 폐쇄 녹 내장의 모델 나타났습니다. 또한, 동 공 팽창, 눈동자 크기는 변경 되지 않은, 광학 미디어의 선명도, 보존 하 고 앞쪽 챔버 10 월 또는 망막 횡단면 솔직 염증 성 변화가 관찰 되었다, 우리 믿지 않는 그 안구 내부 압력 해발 고도 선 동적인 메커니즘을 통해 발생합니다. 마지막으로, 우리의 찾는 IOP 빠르게 circumlimbal 봉합 사 제거 후 정규화 될 수 염증 결과로 배수 채널의 개장 IOP 상승16,24의 가능성이 원인 것을 제안 합니다. 따라서, IOP 상승 수성 유출 방해, Schlemm의 운하의 통해 압축 또는 episcleral 정 맥에서에서 발생 가능성이 높습니다. 추가 조사 진행이 모델에 의해 유도 된 수성 유출 방해의 정확한 원인을 결정 하는.
Circumlimbal 봉합은 몇 가지 제한이 있습니다. 하나의 명백한 관심사는 몇 시간 동안 점차 감소 봉합의 응용 프로그램 동안 발생 하는 초기 IOP 스파이크. 실제로, 과도 한 IOP 스파이크는 만성 개방 각 녹 내장의 전형적인 허 혈 성 reperfusion 상해를 유발 가능성이 있다. 수술로 게시 하는이 점에서 정상 망막 관류 ophthalmoscopy 또는 10 월 제품은 사용 하 여 확인 합니다.
IOP 스파이크의 잠재적인 기여 최근 봉합, 위에서 설명한 고 2 일 후 제거 다음 방법에 의하여 적용 된 가짜 제어 그룹 치료 제어 눈을 비교 하 여 해결 했다. 즉, 이러한 가짜 제어 눈 같은 급성 IOP 스파이크 하지만 48 시간 이상 만성 IOP 상승 하지를 받게 되었다. 우리는 긴 기간 결과, 10 월에에 의해 측정 및 RGC, 유지 치료 컨트롤16와 비교할 때 가짜 컨트롤에 변경 되지 않은 초기 IOP 스파이크 RGC 적자가이 모델에서 볼 수 있는 중요 한 역할을가지고 하지 않았다 보여주는 발견. 반면 만성 IOP 상승15중요 한 상관 관계가 또한 눈의 고혈압 (OHT) 눈, IOP 스파이크의 규모와 긴 기간에 RGC 장애 사이의 상관 관계가 있다고 하는 사실에 의해 지원 됩니다. 또한, 한 연구 후 8 주 보여줍니다 신경 절 세포는 완전히 봉합을 제거 하는 복구, pSTR24, 모델 유도에서 발생 하는 간단한 IOP 스파이크에 작은 기여를 만드는 아이디어를 지 원하는 기준으로 측정 된 망막 장애 만성 IOP 상승 후 발견입니다. 일시적인 IOP 스파이크 신경 절의 세포 상해에 기여 요인이 있었다면, 한 것 기대 하지 복구 주 8에서 봉합 사 제거 후. 따라서, 일시적인 IOP 스파이크의 제한 불구 하 고, 눈의 고혈압의 circumlimbal 봉합 모델은 현재 사용할 수 있는 작은 동물 녹 내장 모델에 대 한 유용한 추가.
앞서 언급 한 증거가이 모델의 유용성을 지원 하지만 모든 노력 과도 IOP 스파이크를 최소화 하 여야 한다. 다음 모델 유도 지원 수 있습니다. 첫째, 발생 하는 가장 일반적인 문제는 IOP 정상으로 봉합 신청 후 몇 일 반환할 수 있습니다. 이 압력 정규화의 빌미는 봉합 사 매듭 점차적으로 시간이 지남에 풀리고. 문제를 해결 하려면 첫 번째 (슬립) 매듭은 두 번째 매듭을 묶는 전에 단단히 고정 확인 합니다. 이것은 달성 될 수 있다 매듭 묶인 지속적으로 두 번째까지 슬립 매듭 ( 그림 1A화살표)의 한쪽 끝에 긴장을 유지 하 여. 두 번째 가장 일반적인 문제는 봉합 후 처음 몇 시간에서 발생할 수 있는 앞쪽에 챔버 출혈. 우리의 경험에서는, 이것은 지나치게 높은 IOP 스파이크 (보통 ≥ 80 mmHg 쥐 및 쥐에) 또는 눈의 천공과 일반적으로 관련 된 직조 봉합. 절차의 다른 합병증 봉합 지연 또는 결 막의 찢 긴 기간에 짧은 기간, 및 봉합의 손실에서 백 내장 (일반적으로 되돌릴 수)를 포함 합니다. 우리는 하지 쥐 또는 쥐의 어떤 일대에 눈 표면 감염의 개발을 지적 했다. 현미경 수술에 초보자, 연습 마스터 circumlimbal 봉합 응용 프로그램에 필요 하다. 우리 쥐 (40 중 81 쥐)16의 우리의 첫 번째 일대에 50%의 초기 성공률을 보고 있다. 우리의 경험에서는,이 연습 70-80% 향상 시킵니다. 60 쥐의 후속 일대에 우리는 앞쪽에 챔버 출혈 (13%)와 30%의 고장율에 대 한 회계 봉합 손실 (17%), 70%의 총 성공 속도 발견. 20 쥐의 일대에 우리는 (10%), 앞쪽에 챔버 출혈으로 인해 제외 되 고만 2 쥐와 쥐, 보다 높은 성공률 (90%)를 발견 하 고 아무 동물 봉합 손실로 인해 제외 됐다. 수술 하는 동안 구멍 뚫 기는 쥐와 쥐 모델 (~ 1%)에 있는 드문 발생.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
저자는 공개 없다.
Acknowledgments
이 작품은 국가 건강 및 의료 연구 위원회의 오스트레일리아 프로젝트 그랜트 (1046203), 호주 연구 협의회 미래 친교 (FT130100338)에 의해 자금을.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| normal saline | Baxter International Inc | AHB1323 | Maintain corneal hydration during surgery |
| Chlorhexadine 0.5% | Orion Laboratories | 27411, 80085 | Disinfection of surgical instrument |
| Isoflurane 99.9% | Abbott Australasia Pty Ltd | CAS 26675-46-7 | Proprietory Name: Isoflo(TM) Inhalation anaaesthetic. Pharmaceutical-grade inhalation anesthetic mixed with oxygen gas for suture procedure |
| ocular lubricant | Alcon Laboratories | 1618611 | Proprietory Name: Genteal, ocular lubricant to keep the other eye moist |
| Needle holder (microsurgery) | World Precision Instruments | 555419NT | To hold needle during ocular surgery |
| Proxymetacaine 0.5% | Alcon Laboratories | CAS 5875-06-9 | Topical ocular analgesia |
| Scissors (microsurgery) | World Precision Instruments | 501232 | To cut excessive suture stump during ligation |
| Surgical drape | Vital Medical Supplies | GM29-612EE | Ensure sterile enviornment during surgery |
| Suture needle for rats (microsurgery) | Ninbo medical needles | 151109 | 8-0 nylon suture attached with round needle, cutting edge 3/8, dual-needle, suture length 30cm |
| Suture needle for mice (microsurgery) | Ninbo medical needles | 160905 | 10-0 nylon suture attached with round needle, cutting edge 3/8, dual-needle, suture length 30cm |
| Tweezers (microsurgery) | World Precision Instruments | 500342 | Manipulate tissues during ocular surgery |
| rebound tonometer | TONOLAB, iCare, Helsinki, Finland | TV02 | for intraocular pressure monitoring |
References
- Morrison, J. C., et al. A rat model of chronic pressure-induced optic nerve damage. Experimental Eye Research. 64 (1), 85-96 (1997).
- Feng, L., Chen, H., Suyeoka, G., Liu, X. A laser-induced mouse model of chronic ocular hypertension to characterize visual defects. Journal of Visualized Experiments. (78), (2013).
- Chiu, K., Chang, R., So, K. F. Laser-induced chronic ocular hypertension model on SD rats. Journal of Visualized Experiments. (10), 549 (2007).
- Quigley, H. A., Addicks, E. M. Chronic experimental glaucoma in primates. I. Production of elevated intraocular pressure by anterior chamber injection of autologous ghost red blood cells. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 19 (2), 126-136 (1980).
- Bunker, S., et al. Experimental glaucoma induced by ocular injection of magnetic microspheres. Journal of Visualized Experiments. (96), (2015).
- Weber, A. J., Zelenak, D. Experimental glaucoma in the primate induced by latex microspheres. Journal of Neuroscience Methods. 111 (1), 39-48 (2001).
- Moreno, M. C., et al. A new experimental model of glaucoma in rats through intracameral injections of hyaluronic acid. Experimental Eye Research. 81 (1), 71-80 (2005).
- Hoyng, P. F., Verbey, N., Thorig, L., van Haeringen, N. J. Topical prostaglandins inhibit trauma-induced inflammation in the rabbit eye. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 27 (8), 1217-1225 (1986).
- Kezic, J. M., Chrysostomou, V., Trounce, I. A., McMenamin, P. G., Crowston, J. G. Effect of anterior chamber cannulation and acute IOP elevation on retinal macrophages in the adult mouse. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 54 (4), 3028-3036 (2013).
- Waisbourd, M., et al. Reversible structural and functional changes after intraocular pressure reduction in patients with glaucoma. Graefe's Archive for Clinical and Experimental Ophthalmology. 254 (6), 1159-1166 (2016).
- Foulsham, W. S., Fu, L., Tatham, A. J. Visual improvement following glaucoma surgery: a case report. BMC Ophthalmology. 14, 162 (2014).
- Anderson, A. J., Stainer, M. J. A control experiment for studies that show improved visual sensitivity with intraocular pressure lowering in glaucoma. Ophthalmology. 121 (10), 2028-2032 (2014).
- Ventura, L. M., Feuer, W. J., Porciatti, V. Progressive loss of retinal ganglion cell function is hindered with IOP-lowering treatment in early glaucoma. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 53 (2), 659-663 (2012).
- Zhao, D., et al. ARVO abstract number 3696 - B0043. annual meeting of Association for Research in Vision and Ophthalmology, Honolulu, Hawaii, USA. , (2018).
- Liu, H. H., et al. Chronic ocular hypertension induced by circumlimbal suture in rats. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 56 (5), 2811-2820 (2015).
- Zhao, D., et al. Characterization of the Circumlimbal Suture Model of Chronic IOP Elevation in Mice and Assessment of Changes in Gene Expression of Stretch Sensitive Channels. Frontiers in Neuroscience. 11, 41 (2017).
- Nguyen, C. T., et al. Simultaneous Recording of Electroretinography and Visual Evoked Potentials in Anesthetized Rats. Journal of Visualized Experiments. (113), (2016).
- Van Koeverden, A. K., He, Z., Nguyen, C. T., Vingrys, A. J., Bui, B. V. Systemic hypertension is not protective against chronic IOP elevation in a rodent model. Scientific Reports. 8 (1), 7107 (2018).
- Rodriguez, A. R., de Sevilla Muller, L. P., Brecha, N. C. The RNA binding protein RBPMS is a selective marker of ganglion cells in the mammalian retina. Journal of Comparative Neurology. 522 (6), 1411-1443 (2014).
- Aihara, M., Lindsey, J. D., Weinreb, R. N. Twenty-four-hour pattern of mouse intraocular pressure. Exp Eye Research. 77 (6), 681-686 (2003).
- Jia, L., Cepurna, W. O., Johnson, E. C., Morrison, J. C. Patterns of intraocular pressure elevation after aqueous humor outflow obstruction in rats. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 41 (6), 1380-1385 (2000).
- Nadal-Nicolas, F. M., Jimenez-Lopez, M., Sobrado-Calvo, P., Nieto-Lopez, L., Canovas-Martinez, I., Salinas-Navarro, M., Vidal-Sanz, M., Agudo, M. Brn3a as a marker of retinal ganglion cells: qualitative and quantitative time course studies in naive and optic nerve-injured retinas. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 50 (8), 3860-3868 (2009).
- Liu, H. H., Flanagan, J. G. A Mouse Model of Chronic Ocular Hypertension Induced by Circumlimbal Suture. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 58 (1), 353-361 (2017).
- Liu, H. H., He, Z., Nguyen, C. T., Vingrys, A. J., Bui, B. V. Reversal of functional loss in a rat model of chronic intraocular pressure elevation. Ophthalmic & Physiological Optics. 37 (1), 71-81 (2017).
- Liu, H. H., Zhang, L., Shi, M., Chen, L., Flanagan, J. G. Comparison of laser and circumlimbal suture induced elevation of intraocular pressure in albino CD-1 mice. PLoS One. 12 (11), 0189094 (2017).
- Shen, H. H., et al. Intraocular Pressure Induced Retinal Changes Identified Using Synchrotron Infrared Microscopy. PLoS One. 11 (10), 0164035 (2016).
