Summary
نحن وضع البروتوكولات وتصميم جهاز مخصص لتمكين تضمين عينات مقياس ملليمتر. نحن نقدم نماذج إعداد الإجراءات مع تأكيد على تضمينها في راتنج اﻷكريليك وبوليميد الأنابيب تحقيق التثبيت جامدة والتخزين طويل الأجل للعينات لاستجواب مورفولوجيا العمارة وخلايا الأنسجة بالدقيقة-قيراط
Abstract
لما يزيد على مائة سنة، كانت الدراسة النسيجي للأنسجة المعيار الذهبي للتشخيص الطبي لعلم الأنسجة يسمح بجميع أنواع الخلايا في كل الأنسجة تحديد ووصف. لدينا مختبر يعمل بنشاط لجعل التقدم التكنولوجي في الأشعة السينية الدقيقة المحسوبة التصوير المقطعي (الصغرى-CT) التي سوف تجلب قوة الأنسجة التشخيصية لدراسة حجم الأنسجة كاملة في القرار الخلوية (أي.، الأشعة سينية طريقة هيستوتوموجرافي). وتحقيقا لهذه الغاية، حققنا تحسينات المستهدفة لإعداد نموذج خط الأنابيب. التحسين رئيسي واحد، وتركيز العمل الحالي، أسلوب مباشر لتضمين جامدة من عينات مقياس الملليمتر الثابتة والملون. العديد من الأساليب المنشورة لتجميد العينة وستتحقق التصوير بالأشعة المقطعية الصغرى تعتمد على وضع العينات في شمع البارافين أو [اغروس] أو السوائل مثل الكحول. ويمتد نهجنا هذا العمل مع الإجراءات المخصصة، وتصميم جهاز للطباعة ثلاثية الأبعاد لتضمين العينات في راتنج اﻷكريليك مباشرة إلى بوليميد الأنابيب، شفافة نسبيا للأشعة السينية. هنا، يتم وصف الإجراءات إعداد نموذج للعينات المأخوذة من 0.5 إلى 10 ملم في القطر، والتي ستكون مناسبة ليرقات الزرد كله والأحداث، أو غيرها من الحيوانات وعينات الأنسجة من أبعاد مماثلة. كإثبات للمفهوم، ونحن قد مضمن العينات من دانيوو المورفولوجيةو براغيث الماء، وجنينا ماوس؛ تظهر الصور التمثيلية من مسح ثلاثي الأبعاد لثلاثة من هذه العينات. الأهم من ذلك، لدينا منهجية تؤدي إلى فوائد متعددة بما في ذلك تجميد جامدة وطويلة الأجل الحفاظ على الموارد التي أنشأها مشقة والقدرة على إعادة استجواب عينات.
Introduction
تعمل هي الصفات يمكن ملاحظتها للكائن الحي التي تمثل نتائج التفاعلات فريدة من نوعها بين خلفيتها الوراثية والبيئة. يمكن أن تتضمن هذه الخصائص الخصائص السلوكية والبيوكيميائية والمورفولوجية، التنموية، أو الفسيولوجية. الأهم من ذلك، يمكن أن توفر الاختلافات بين الكائنات البرية من نوع وطفرات وراثية في الصفات الرئيسية ثاقبة آليات ووظائف المورثات المتضررة. فيما يتعلق بالتشكل، التشريح المرضى هو معيار الذهب لتقييم تعمل على المستوى الخلوي ولكن يعاني من القطع الميكانيكية ولا يسمح بالتحليل الحجمي الكمية الدقيقة1. المختبر الدافع للتغلب على الحواجز التي تعترض تطبيق القدرة التشخيصية لعلم الأنسجة على وحدات تخزين النسيج الكامل في القرار submicron.
دراسة استقصائية للتكنولوجيات المتاحة تشير إلى أن التصوير بواسطة الأشعة السينية الصغرى-حسبت التصوير المقطعي (الصغرى-CT) قد تقدم مثالية القدرات اللازمة ملليمتر على نطاق الجامعة والحيوان ثلاثي الأبعاد (3D) علم الأنسجة. CT الجزئي يمكن التصور غير مدمرة، والخواص، وثلاثية الأبعاد، والقدرة على إجراء تحليل كمي للأنسجة العمارة1،2. في السنوات الأخيرة، اكتسب الجر تزايد تصوير ثلاثي الأبعاد من الزرد أونستينيد والملطخة بالمعادن بالأشعة المقطعية الصغرى وقد استخدمت للتحليل الحجمي لانسجة عدة، بما في ذلك العضلات والأسنان والعظام والأنسجة الدهنية3،4 ،،من56،،من78،9،10. نموذج الكائنات الحية وعينات الأنسجة الأخرى أيضا قابلة للتصوير بالأشعة المقطعية الصغرى. على سبيل المثال، استحدث خط أنابيب للتحديد الكمي للتشريح المتوسطة المدى كثيفة من العقول الماوس تصويرها عبر السنكروتروني الصغرى-ط م11. وبالمثل، قد ثبت بروتوكولا المصبوغة على أساس ويوزين تكون مناسبة لتصوير مايكرو-CT الأنسجة اللينة من أجهزة الماوس كله12. تحليل شكلي لفقرات L3 البشرية أونستينيد والتصور من الرئتين البشرية الملطخة بالفضة باستخدام الأشعة المقطعية الصغرى قد أثبتت جدوى هذه التكنولوجيا للإنسان عينات13،14.
بغية تفعيل الوعد الكبير للصغير-CT لكامل phenotyping المورفولوجية للحيوانات الصغيرة سليمة وعينات الأنسجة، حاجة عددا من العقبات التي يتعين التغلب عليها فيما يتعلق بالإنتاجية، حقل من عرض الخلية شاملة تلطيخ،، القرار والحفاظ على المدى الطويل. في حين أن كل جانب من هذه الجوانب من الأهمية بمكان، محور المخطوطة الحالية هي الأمثل لإجراءات الدمج، مع ملاحظات إضافية على التثبيت بعينه وتلطيخ. تلوين المعادن الثقيلة مفيد لأنه منخفض للتناقض المتأصل بين مختلف الأنسجة الرخوة في الصور المقطعية الصغرى. البقع فاعلية المعادن المختلفة، مثل أكسيد الازميوم واليود، حمض فوسفوتونجستيك (منطقة التجارة التفضيلية)، جالوسيانين-تشرومالوم، وقد تم تعزيز التباين للتصوير بالأشعة المقطعية الصغرى درس15،،من1617. خلات اليورانيل قد استخدمت كعامل متناقضة لتصوير الأشعة المقطعية الصغرى18،العظام والغضاريف19. منطقة التجارة التفضيلية المستخدمة في البروتوكول لدينا يؤدي إلى تلطيخ يتفق تقريبا جميع الأنسجة والخلايا في عينات الزرد كله، مما أسفر عن الصور التي يحتمل أن تكون متوافقة مع الدراسات الشبيهة بعلم الأنسجة من خلال مجلدات كاملة من الأنسجة.
أثناء الحصول على الصور المقطعية الصغرى، كما يتم تدوير العينة بجزء صغير من درجة إسقاطاً ثنائي الأبعاد (2D) وتتكرر حتى اكتمال النموذج دوران 180 درجة أو 360 درجة، توليد سلسلة الآلاف من إسقاطات 2D يستخدم إعادة البناء في 3D حجم20. في هذه العملية، سوف يسبب أي اضطراب للعينة الإسقاطات 2D المقابلة خارج المحاذاة، أسفر عن أحجام ثلاثية الأبعاد أعيد بناؤها ضعيف. تجميد العينة طريقة لتصحيح هذه المشكلة، وتشمل بعض الاستراتيجيات الحالية غمر العينة بالكحول أو تضمينها في [اغروس] في أنابيب البولي بروبلين أو ميكروبيبيتي نصائح3،،من515، 16 , 21 , 22-أساليب الغمر السائلة ليست مثالية لأنه يمكن أن تحدث حركة عينة أثناء الحصول على الصور بين أجهزة التصوير، أسفر عن إعادة البناء تحولت من وحدات التخزين 3D23. علاوة على ذلك، فإنه من المعروف جيدا أن الاستقرار المادي لعينات الأنسجة السائلة المخزنة الفقراء في جداول زمنية لشهور وسنوات، نتيجة عدم الاستقرار الكيميائي وكشط السطحية المرتبطة بحركة لنقاط الاتصال بين عينة و (جدار الحاوية الملاحظات الشخصية مع عينات الأنسجة الحيوانية والبشرية الثابتة).
لتقليل احتمالات حركة عينة أثناء التصوير، يمكن تضمين عينات في [اغروس]24،،من2526، ولكن هذه الممارسة ترتبط بمخاطر وصمة عار نشرها في [اغروس] مما يقلل من الصورة على النقيض من26. وعلاوة على ذلك، الاستعدادات السائل أو [اغروس] عرضه للأضرار المادية وتتحلل بمرور الوقت، يجعلها غير صالحة للتخزين طويل الأجل في العينة. نحن مسبب أن أسلوب التثبيت عينة يحتمل أن تكون ناجحة وواضحة يمكن أن تكون مقتبسة من استخدامه لعينات المجهر الإلكتروني. يشيع استخدام الراتنجات مبلمرة مثل 812 أبون (توقف والاستعاضة عنها بتضمين 812) لتوفير صلابة المطلوبة لإنشاء أقسام سامسونج الميكروسكوب الإلكتروني27،28. وفي الواقع، أظهرت عدة دراسات مقارنة بين التصوير بالأشعة السينية والميكروسكوب الإلكتروني أن العينات جزءا لا يتجزأ من الراتنج يمكن تصويرها بالأشعة السينية مجهرية29،30. ومع ذلك، بعض الممارسات القياسية للمجهر الإلكتروني لا تترجم مباشرة إلى التصوير بالأشعة المقطعية الصغرى. على سبيل المثال، التربيعية الصغرى-CT تصوير العينات مع الراتنج حواف كتل الراتنج النموذجية وعينات قطع من تلك الكتل يترافق مع الحيود حافة القطع الأثرية التي يمكن أن تتداخل مع التصوير. تنعيم الحواف الراتنج، بينما ممكن، شاقة وتستغرق وقتاً طويلاً.
بينما يعمل مجموعة متنوعة من البلاستيك الراتنج التضمين في المجهر الإلكتروني، الخلفية العالية المرتبطة بصعوبة راتنجات مثل تضمين 812 أدت بنا إلى اختبار الآخرين. لقد اخترنا الأبيض LR سبب لها اللزوجة منخفضة، وانكماش منخفضة، والاتجاه المنخفض على شكل فقاعات أثناء البلمرة، والخلفية أقل. لإنشاء نماذج خالية من الحافة، وتقليل كمية الراتنج المحيطة بالعينة، قمنا بتطوير البروتوكولات رسم العينات في الراتنج السائل في الأنابيب بوليميد قبل البلمرة. واختير بوليميد عالية الثبات الحراري وارتفاع نفاذية الأشعة السينية حيث أن إزالة الأنابيب ليست ضرورية للتصوير. أخيرا، لقد قمنا بتصميم محول مخصص ميكروبيبيتي لدينا عينة تضمين تقنية بغية عقد الأنابيب موثوق بها ومنع تلوث ميكروبيبيتيس. المحول يمكن طباعة من ملف صورة CAD 3D. أخذت معا، هدف أساليب إعداد العينة المعروضة هنا لجعل التضمين من عينات صغيرة أكثر وضوحاً، وتحقيق تحسين تلطيخ التباين وتجميد جامدة والتخزين طويل الأجل لعينات سليمة على نطاق ملليمتر.
Protocol
وافق جميع الإجراءات على الحيوانات الحية "رعاية الحيوان المؤسسية" واستخدام اللجنة (إياكوك) في جامعة ولاية بنسلفانيا.
1-اليوم الأول: التثبيت
- لتحسين التثبيت وتخفيض حجم محتويات القناة الهضمية، تجويع الأسماك الصغيرة لمالا يقل عن 24 ح عينة 10 مم، أو لفترة أطول لعينات أكبر (مثلاً.، ح 72 عن عينة 14 مم).
- البرد قبل 10% فورمالين مخزنة المحايدة (NBF) و 2 × تريكايني-S (MS-222، 400 مغ/لتر) على الجليد إلى 4 درجات مئوية.
- ضعف الأسماك المياه وحدة التخزين المبردة 2 × مرض التصلب العصبي المتعدد-222 للقتل الرحيم السريع وإنسانية.
- انتظر 30 ثانية (اليرقات) إلى 60 توقف s (الأحداث) بعد الأسماك يتحرك.
- تزج الأسماك المثلجة 10% NBF لمدة 10 دقائق.
- إصلاح الأسماك المثلجة حل NBF 10% بين عشية وضحاها في حاويات مغلوطاً في درجة حرارة الغرفة.
ملاحظة: مطلوبة حاويات مغلوطاً للتقليل من الانحناء للعينة. حجم مثبت والحلول لجميع الخطوات اللاحقة ينبغي أن يكون على الأقل 20 مرة حجم عينة ما لم يحدد خلاف ذلك. بالنسبة حجم الحل الموصى به الزرد اليرقات 1-5، 1 مل على الأقل. عدم كفاية نتائج مثبت في التثبيت الفقراء، وفائضا في حجم الكاشف لا يؤثر سلبا نتيجة الإجراء المبين. لإكمال التثبيت للأسماك الأكبر، شق بطن بدءاً قليلاً عرفت المسام الشرج. استخدام الاختراق الحد الأدنى من مقص أو سكين وتطبيق قوة لطيف بعيداً عن الأسماك بينما خفض إلى أدنى حد من الأضرار التي لحقت الأجهزة الداخلية. وقد تم تثبيت بروتوكولات ووصف آخرون31،،من3233.
2-يوم 2: الجفاف وتلطيخ
- شطف العينات الثابتة 3 مرات في 1 × الفوسفات مخزنة المالحة (PBS) الأس الهيدروجيني 7.4 لمدة 10 دقائق.
- غمر العينات في 35% إيثيل الكحول (EtOH) لمدة 20 دقيقة في درجة حرارة الغرفة مع الانفعالات لطيف.
ملاحظة: جميع الخطوات الانفعالات لطيف، استخدام شاكر منضدية وتعيين لتأثير خلط مع تجنب بعناية الاهتزاز وفرك عينة ضد الأسطح الحاوية. - غمر العينات في 50% EtOH لمدة 20 دقيقة في درجة حرارة الغرفة مع الانفعالات لطيف.
- حل مسحوق (منطقة التجارة التفضيلية) حمض فوسفوتونجستيك في الماء لتحضير حلاً أسهم 1% w/v.
- تمييع الحل الأسهم التفضيلية 1% 3:7 في 100% EtOH للحصول على حل المصبوغة منطقة التجارة التفضيلية 0.3 في المائة.
- وصمة عار العينات بين عشية وضحاها في حل التجارة التفضيلية 0.3% عند درجة حرارة الغرفة مع الانفعالات لطيف.
3-اليوم الثالث: تسلل
- إعداد الخليط 1:1 v/v 100 ٪ راتنج اﻷكريليك EtOH والأبيض LR وتوضع جانبا.
- شطف 3 مرات في 70% EtOH لمدة 10 دقائق.
- غمر العينات في 90% EtOH مدة 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة مع الانفعالات لطيف.
- غمر العينات في 95% EtOH مدة 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة مع الانفعالات لطيف.
- غمر العينات مرتين في 100% EtOH مدة 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة مع الانفعالات لطيف.
- غمر العينات في 1:1 EtOH والأبيض LR راتنج اﻷكريليك المخلوط بين عشية وضحاها في درجة حرارة الغرفة مع الانفعالات لطيف.
4-اليوم الرابع: التضمين
- غمر العينات في 100 ٪ الأبيض LR الراتنج ح 2 في درجة حرارة الغرفة مع الانفعالات لطيف.
- استبدال الراتنج في الخطوة 4، 1 جديدة 100% LR الأبيض راتنج واحتضانها ح 1 في درجة حرارة الغرفة مع الانفعالات لطيف.
- تجميع جهاز التضمين (الشكل 1).
- قطع أنابيب بوليميد القطر المناسب والطول.
ملاحظة: ينصح الأنبوب مع قطر داخلي الذي أكبر من قطر العينة 0.1 مم على الأقل. لعينات نموذجية، يتم استخدام طول قياسي من 30 ملم أنابيب لكل عينة. عند الرغبة، يمكن استيعاب ممدود العينات باستخدام أنابيب أطول.- إرفاق ميكروبيبيتي P1000 إلى نهاية نطاق واسع من المحول التضمين وإدراج الأنابيب بوليميد إلى نهاية ضيق (الشكل 1). إذا لم يتوفر محول التضمين، انتقل إلى الخطوة 4.3.3. وبخلاف ذلك، الاستمرار في "الخطوة 4، 4".
- مقطع قبالة نهاية تلميح ميكروبيبيتي مباشرة عبر هذا الأنبوب بوليميد تناسب شكل مريح. قطع في 44 مم من نهاية نطاق واسع من طرف ميكروبيبيتي الأصفر ميليلتر 200 ل 0.0403 "أنابيب ومم 59 من أسفل تلميح 1 مل الأزرق ل 0.105" أنابيب. تقليم حسب الحاجة.
- إرفاق نصيحة قص ميكروبيبيتي ميكروبيبيتي.
- نقل العينات إلى سفينة تزن صغيرة أو حوض الحل على شكل V وتغرق تماما هذه العينات في 100 ٪ راتنج الأبيض ل. ر.
- مع جهاز التضمين من "الخطوة 4، 3"، هدف الأنبوب في نهاية نطاق واسع من العينة الثابتة (أو نحو الرأس في حالة العينات الحيوانية) و "الماصة؛" العينة ببطء في الأنبوب. ضع العينة في منتصف الأنبوب ويكفل شغل الأنبوب أعلاه وأدناه العينة مع الراتنج.
- "الماصة؛" العينة في الأنابيب مثل أن تكون العينة في الاتجاه الطبيعي، وإلى الأمام.
ملاحظة: بيبيتينج بطيئة يتجنب فقاعات الهواء وعينه الأضرار الناجمة عن التآكل ضد حافة الأنابيب. يمكن أن تتلف حركة إلى الخلف داخل الأنبوب بسهولة الحدود القصوى (أطرافه، وأجنحة، وزعانف، إلخ.). من المستحسن السماح لبعض تجاوز الراتنج في جهاز التضمين، وذلك في وقت لاحق، الهواء لا يدخل الأنبوب أثناء الإزالة.
- "الماصة؛" العينة في الأنابيب مثل أن تكون العينة في الاتجاه الطبيعي، وإلى الأمام.
- فورا ختم نهاية مفتوحة مع الطين النمذجة لينة القائم على النفط.
- تسطيح الطين في ورقة 1 مم سميكة.
- تثبيت الأنبوب بين الفهرس والأصابع الوسطى.
- اضغط ببطء كلاي ضد نهاية الأنبوب مع الإبهام.
- إزالة الطين الزائدة.
- إزالة جهاز التضمين، من ميكروبيبيتي.
- سحب الأنبوب بالتناوب لطيف وختم الطرف الآخر بالطين.
- عقد إصبع ضد نهاية مغلقة لمنع الطرد الطين.
- ادفع تفض نهاية الأنبوب ببطء في الطين.
- ضع الأنبوب أفقياً وبلمره الراتنج عن 24 ساعة عند 65 درجة مئوية.
ملاحظة: يتجنب الموضع الأفقي في حركة عينة خلال البلمرة. إذا كان محاصراً كمية صغيرة من الهواء في "الخطوة 4، 8"، نهاية بفقاعة هواء قد أن تكون مرتفعة قليلاً لمنع حركة فقاعة الهواء تجاه العينة. الأهم من ذلك، قد يسبب الكثير من الارتفاع خلال البلمرة العينة تقع نهاية منخفضة بسبب خطورة. ويرد عينة مضمنة بشكل صحيح بالمقارنة مع فقاعة هواء، التي ينبغي تجنبها لأن الانكسار من واجهات الهواء/الراتنج يمكن أن تتحلل جودة الصورة (الشكل 2).
5-اليوم الخامس: جمع
- جمع العينات للحصول على الصور في نهاية يوم 5.
ملاحظة: إزالة أنابيب بوليميد ممكن لكنه ليس ضروريا للتصوير. وأجرى المستندة إلى السنكروتروني تصوير الأشعة المقطعية الصغرى للعينة الزرد في بيمليني 2-BM في متقدمة فوتون المصدر (الجزائرية) في "مختبر أرغون الوطني" (Lemont، إلينوي، الولايات المتحدة الأمريكية). الزرد الملطخة بمنطقة التجارة التفضيلية، تم تحديد مجموعة الطاقة مثلى بالأشعة سينية من 5-30 كيلو إلكترون فولط، وطاقة الأشعة سينية من 13.8 كيلوفولط كان يستخدم للتصوير. وتم الحصول على إسقاطات 1501 في 13.8 كيلوفولط ما يزيد على 180 درجة (1 الإسقاط كل درجات 0.12) مع كاميرا 2048 قبل 2048 بكسل. بالإضافة إلى ذلك، اقتنى أيضا صورتين مسطحة-حقل (كسب) (واحد في البداية) وواحدة في النهاية لاقتناء وواحد الظلام--حقل الصورة. أجريت تصويبات مسطحة-والظلام-الحقل وخاتم قطعة أثرية الحد والتعمير الصورة باستخدام الفتح المصدر توموبي أدوات34. تم تصويرها عينات براغيث الماء و المورفولوجية الملطخة بمنطقة التجارة التفضيلية في12،مجهر الأشعة السينية35. الإعدادات الخاصة بالأشعة المقطعية الصغرى التي تعتمد على الكائن ونوعية وصمة عار. على سبيل المثال، تم مسحها ضوئياً العينة المورفولوجية في 40 كفب، 74 ماجستير، و 15 ثانية بدقة فوكسل 3.10 × 3.10 × 3، 10 ميكرون3.
Representative Results
ووصف البروتوكول أعلاه تفاصيل إجراء إعداد نموذج لليرقات الزرد كله والأحداث للتصوير بالأشعة المقطعية الصغرى. جدير بالذكر أن هذه الطريقة سهولة تكييف أنواع العينات الأخرى (على سبيل المثال-، المورفولوجية، و براغيث الماء، و نبات، وأجهزة الماوس). مرات حضانة في مختلف الخطوات التي تكون مناسبة ليرقات الزرد وعينات من حجم مماثل؛ وقد تتطلب عينات أكبر حضانة أطول. مساعدة مع العينة تضمين الخطوات، قمنا بتصميم محول التي تعلق على ميكروبيبيتي 1 مل، ويمكن أن تكون مخصصة لأحجام مختلفة من بوليميد الأنابيب (الشكل 1). وكان هذا محول مخصص 3D طباعة من ملف CAD المقترنة مع هذه المخطوطة ومتاحة للتحميل من http://publications.chenglab.com/LinEtAlJOVE/. نظراً لجميع القراء قد لا يكون الوصول إلى طابعة ثلاثية الأبعاد، هو وصف الجمعية جهاز التضمين محلية الصنع باستخدام النصائح ميكروبيبيتي في البروتوكول (الخطوة 4، 3). يرقة الزرد مضمن بنجاح يظهر مقارنة بعينه مع فقاعة هواء (الشكل 2)، التي سوف يرجح أن يقلل من جودة الصورة. لإظهار براعة الإجراء التضمين، نعرض العينات من مختلف نموذج الكائنات (أي.، دانيوو المورفولوجيةو براغيث الماءوالجنين الماوس) التي مرت (خط أنابيب إعداد عينة الشكل 3). تظهر مجلدات 3D أعيد بناؤها من العينات دانيوو براغيث الماء، و المورفولوجية كله تصوير بالأشعة المقطعية الصغرى (الشكل 4). الأهم من ذلك، كما يتبين من العينة دانيو ، هذه العينات يمكن تخزينها لفترة ممتدة من الزمن وإعادة استخدامها لجلسات التصوير متعددة (الشكل 5).
رقم 1. تضمين الجهاز. (A (محول صمم لتسهيل الدمج باستخدام أدوات مختبرية مشتركة. (ب) توضيح مستعرضة للمحول. (ج) تضمين الجهاز بعد إدخال الأنبوب بوليميد عند النقطة (أ) محول وإرفاق ميكروبيبيتي في محول النقطة (ج). محول الجزء (ب) دائرة تجاوز سعة المصممة لاستيعاب الراتنج الزائدة وحماية ميكروبيبيتي من التلوث. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
رقم 2. العينات بنجاح المضمنة خالية من فقاعات الهواء- (A) جزءا لا يتجزأ من 3 أيام بعد إخصاب (إدارة الشرطة الاتحادية) الزرد يرقات دون فقاعة هواء. (ب) الزرد جزءا لا يتجزأ من إدارة الشرطة الاتحادية 3 مع فقاعة هواء. الهواء محاصرين أثناء عملية التضمين يمكن التحرك نحو العينة إذا لم يتم وضع العينة خلال البلمرة أفقياً. تغيير حجم أشرطة = 1 مم. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
الشكل 3. يمكن تضمين مجموعة متنوعة واسعة من العينات مع بروتوكول لدينا. (أ) 7 إدارة الشرطة الاتحادية الزرد اليرقة. (ب) الكبار المورفولوجية. (ج) الكبار براغيث الماء. (د) الماوس الجنين. ويتم إيواء عينات أكبر مثل الجنين الماوس بعدد قليل من التعديلات على البروتوكول. بإيجاز، مليئة الراتنج إلى 1/3 الطول الأنابيب بوليميد وبلمره قبل الدمج. كان وضع نموذج ثابت والملون أعلى الراتنج مبلمرة مسبقاً. الأنابيب ثم مليئة راتنج مبلمرة الأمم المتحدة تليها بلمرة ثانية. تمت إزالة الأنبوب بوليميد قبل التصوير للسماح التصور أفضل من العينة في هذا الشكل. إزالة الأنابيب ليست ضرورية للحصول على صورة ناجحة بأشرطة الحجم الصغير-قيراط: الصور العينة، 5 مم؛ توسيع insets، 1 مم. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
الشكل 4. اﻷداءات ثلاثية الأبعاد للعينات جزءا لا يتجزأ. (أ) أعيد بناء 3 يرقة الزرد إدارة الشرطة الاتحادية في 0.743 × 0.743 × 0.743 ميكرومتر3 فوكسل القرار. (ب) إعادة بنائها الكبار براغيث الماء (3 × 3 × 3 ميكرومتر3 فوكسل القرار). (ج) إعادة بنائها الكبار المورفولوجية (3.1 × 3.1 × 3.1 ميكرومتر3 فوكسل القرار). يمكن إنشاء المقاطع العرضية الرقمية في أي زاوية كما هو موضح في العمود الأيسر. تظهر اﻷداءات السطحية على اليمين، تقديمها باستخدام البرمجيات التجارية. تضمين الراتنج يمكن رؤية في جميع عمليات التفحص خارج العينة (لاحظ *)، ولكن لا تتداخل مع العينة نفسها. وكان المصور اليرقة الزرد في "مختبر أرغون الوطني" في "المصدر فوتون المتقدم" الذي أساس السنكروتروني. العينات براغيث الماء أو المورفولوجية تم تصويرها مع مجهر الأشعة السينية تجارية. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
الرقم 5. يمكن أن تكون العينات جزءا لا يتجزأ مع لدينا بروتوكول إعادة المصورة مع مايكرو-قيراط وكان تصويرها اليرقة الزرد 5 إدارة الشرطة الاتحادية نفسها في 2011 (A) و (ب) 2013، قدم إسقاطات متوسط كثافة رأي السهمي. صورة مقارنة بين الأشعة بعد التخزين يبين الحفاظ على الخصائص التشريحية. (ج) عن قرب للعضلات من مسح كلا يرد، مع خطوط مجزأة تشير إلى المناطق المقابلة المستخدمة في توليد الشخصية كثافة (د). إظهار كثافة تطبيع لهذه المتوسطات المقابلة على غرار كل مكانياً مطابقة قمم المحلية في كل فحص. (ﻫ) متوسط قيم الكثافة لمناطق مختارة في ألف وب المنتمين إلى الخلفية (Bg، الأرجواني)، نويات الخلايا العصبية (ن) الأخضر، مقسوماً على متوسط للخلفية (أبيض) المسألة الأبيض (W، الأزرق)، والعضلات (M، البرتقالي) واستخدامها لتوليد إشارة إلى الضوضاء نسب (دائرة الاستخبارات الوطنية)، الذي يقابل كذلك بين المسح. تغيير حجم أشرطة = 100 ميكرومتر. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
Discussion
في هذه المخطوطة، نقدم بروتوكول مفصل للتثبيت جامدة ثابتة والملون ملليمتر-الحجم (0.5 إلى 2.5 مم) عينات للتصوير بالأشعة المقطعية الصغرى. ونظرا للتقدم السريع في تكنولوجيا الأشعة المقطعية الصغرى فيما يتعلق بالقرار وسرعة، وسيلة للمحافظة على العينة الدائمة مع قدرات التصوير إعادة مرغوب فيه للغاية. تقليديا، تستخدم راتنج التضمين كثيفة عادة في المجهر الإلكتروني لتوفير الدعم الهيكلي لقص المقاطع سامسونج، والتقليل إلى أدنى حد من الأضرار التي لحقت بالعينة. لدينا طريقة تكييف استخدامها لتجميد جامدة أثناء التصوير غير المدمرة. للتقليل من التحف التصوير من وجود الراتنج الزائدة، قمنا بتنفيذ استخدام أنابيب شفافة بوليميد الأشعة السينية لإنشاء نماذج جولة دون حواف، وتقييد حجم راتنج حول العينة.
نتائج مثلى لتضمين الإجراء مرهون بتنفيذ دقيق لعدة خطوات بالغة الأهمية والاهتمام بسلامة العينة طوال فترة الإجراءات. وفي الواقع، سيؤدي إلى إتلاف العينة في صورة نهائية الشبهة بغض النظر عن نجاح تنفيذ التصوير. منذ تقشعر لها اﻷبدان يسهم في تقليص استجابات الألم، والأنسجة غير المثبتة يحط أكثر سرعة في ارتفاع درجات الحرارة، ونحن استخدام الكواشف مبردة مسبقاً. عينات كبيرة قد تحتاج إلى قطع للسماح بإدخال مثبت في داخل العينة حيث أن الأعضاء الداخلية مثل الكبد والبنكرياس والأمعاء هي ثابتة تماما. الأنسجة غير المثبتة تتدهور وتفقد السلامة الهيكلية، وتدمير الهيكل البيولوجي. خطوة رئيسية أخرى للحفاظ على العينة في المحاذاة الطبيعية به. ولذلك، أننا ندعو لاستخدام الحاويات مغلوطاً، التي نستخدمها طوال الإجراءات وهي أهمية خاصة أثناء التثبيت. التثبيت في بولي بروبلين أنابيب أو الأنابيب المخروطية التي عادة ما يكون من أسفل على شكل V ينبغي تجنبها لأنها يمكن أن تسبب عينات ممدود لثني، مما يشوه مورفولوجيا الطبيعية للعينة. وبالإضافة إلى ذلك، التقليل من استخدام الراتنج، القطر الداخلي للأنبوب بوليميد فقط أكبر قليلاً من عرض العينة. الانحناء للعينة يمكن أن يؤدي أيضا إلى تلف العينة لأنه يدخل الأنبوب. من المستحسن أيضا لنقل العينة إلى الأنبوب في طريقة إلى الأمام طبيعية لتجنب الحدود القصوى المدمرة. الجفاف المناسب خطوة حاسمة أخرى. ويتحقق ذلك بزيادات صغيرة لزيادة تركيزات EtOH ببطء استبدال المياه مع EtOH، الذي أكثر الامتزاج مع الراتنج. زيادات كبيرة في تركيز EtOH مقترنة بانكماش الأنسجة ويمكن تخفيفها بزيادات إضافية الحضانة EtOH جعل الانتقال أكثر تدرجا. وأخيراً، لتقليل حركة عينة أو جيوب هوائية، إذا كان هناك أي، توضع العينات أفقياً أثناء بلمرة الراتنج (نهاية يوم 4). جيوب هوائية أو تسرب إلى جانب العينة يسبب التحف الضوئية مع التصوير بالأشعة السينية المرتبطة بحافة الحيود، تقليل جودة الصورة.
وفيما يتعلق بالتعديلات المحتملة على البروتوكول، والأخرى تضمين الراتنجات والمعادن البقع يمكن استخدامها بدلاً من اﻷكريليك الأبيض LR ومنطقة التجارة التفضيلية، على التوالي. Embed812، راتنج الإيبوكسي استخداماً في المجهر الإلكتروني، عالية اللزوجة، وأكثر صعوبة لنقل، وقد يسبب تشويها للعينات، ويرتبط مع الخلفية أعلى من اﻷكريليك أو غليكول الميثاكريليت الراتنج. بينما JB4، زائد ميثاكريلات غليكول، هو أقل لزوجة من EMbed812 والخلفية السفلي، كثيرا ما تظهر تشكيل جيوب هوائية عشوائية محيط العينة. وكما ذكر، جيوب الهواء يقلل من جودة الصورة وهي مشكلة خاصة للعينات الثمينة. تجدر الإشارة إلى أن تيتشنوفيت 7100، آخر سكري ميثاكريلات، يتداخل مع تلطيخ منطقة التجارة التفضيلية، نتج عنه ضعف التباين في الصورة النهائية. نسبيا، اﻷكريليك الأبيض LR اللزوجة مثل المياه، خلفية منخفضة، ولا تتداخل مع تلطيخ منطقة التجارة التفضيلية. في أيدينا، معدل النجاح للتضمين في الأبيض LR دون فقاعات الضرر أو الهواء عينة أكبر من 95%. لهذه الأسباب، فإننا ننادي استخدامها الراتنج التضمين للأنسجة الدقيقة-قيراط فيما يتعلق بالبقع, البقع النتيجة للمعادن المختلفة مثل أكسيد الاوزميوم، اليود، ومنطقة التجارة التفضيلية في التصوير بالأشعة المقطعية الصغرى وقد تم مقارنة ونوقشت في مكان آخر15،،من1617 وهو خارج نطاق هذا مخطوطة.
حجم العينة يشكل قيداً رئيسيا على البروتوكول الحالي لدينا. أن نوظف شفط لنقل العينات إلى الأنبوب، القدرة على رؤية العينة أمر بالغ الأهمية للتوجه والتأكد من أنها في الواقع في الأنبوب. نتيجة لذلك عينات ملليمتر الفرعية مثل تارديجرادي (أي.، يتحمل المياه) صعبة للغاية لتضمين لأنها تتطلب الاستخدام مجهر لتصور. حالما يتم تطبيق شفط، تضيع بسهولة من المستوى البؤري عينات مجهرية وتصبح صعبة لإعادة اكتشاف، مما يجعل من الصعب تحديد إذا مروا بعيدة جداً عن طريق المرفق نهاية الأنبوب. يمكن تضمين عينات أكبر، مثل الماوس الأجنة، (3-10 مم) مع تعديلات طفيفة في تضمين البروتوكول (الشكل 4). على وجه الخصوص، تم ملء الأنبوب بوليميد إلى 1/3 مع الراتنج السائل، الذي كان بلمرة قبل التضمين. كان وضع العينة ثابتة والملون أعلى الراتنج مبلمرة مسبقاً. الأنابيب كان ثم تماما مليئة راتنج مبلمرة الأمم المتحدة وتليها بلمرة ثانية.
أن أهمية لدينا بروتوكول التضمين المتشعبة. جامد المعطل تداولها العينات الحيوانية أو الأنسجة كلها مرغوب فيه لأسباب من بينها: (1) إنشاء مستودعات طويلة الأجل للعينات التي يصعب على توليد أو إعداد؛ (2) إعادة اكتساب البيانات؛ (3) تمكين استخدام التصوير المسلسل طرائق التصوير متعددة؛ و (4) توفير المعايير لمعايرة وتطوير التكنولوجيا. عينات أعد باجرائنا التضمين هي المغطى في الراتنج الصلبة التي مرونة ضد الأضرار ويمكن ذلك بسهولة تخزينها وربما إلى أجل غير مسمى. التخزين طويل الأجل مفيد بشكل خاص لعينات نادرة أو مشقة ولدت مثل تلك المرتبطة بالمشاريع فنوم. علاوة على ذلك، في حالة ما إذا فقدت البيانات الرقمية يمكن إنشاء البيانات من العينة الأصلية. القدرة على إعادة التصوير على مدى فترة طويلة من الزمن يحتمل أن يسمح نفس العينة استجواب مع أكثر تقدما بالتصوير الطرائق في المستقبل. نظراً للعينات استقرارا ماديا بين حالات التصوير، يتم الحصول على الصور من نفس العينة في نفس الاتجاه، تسهيل التسجيل بين مجموعات البيانات الأقدم والأحدث. على سبيل المثال، صورة ذات دقة منخفضة قد تسمح فقط تجزئة أنسجة في يرقة الزرد. اليرقة نفسها يمكن في وقت لاحق إعادة تصويرها في دقة أعلى حيث أن أكثر تفصيلاً التحليلات الحسابية في القرار الخلوية. تقترح هذه الإمكانية لإجراء مقارنة مباشرة بين المسجلين بمسح العينات جزءا لا يتجزأ من راتنج كاحتمال قياسية لتطوير التكنولوجيا الدقيقة-قيراط ويمكن تقييم آثار أي تغيير في أسلوب التصوير بالتصوير من نفس العينة حيث أنه يتم التحكم في كل المتغيرات في الخطوة إعداد عينة. أخيرا، يمكن استخدام عينة قياسية جزءا لا يتجزأ من راتنج لمعايرة أداة لاختبار اتساق تصوير.
أعمالنا السابقة دراسة الأنسجة السمكية متحولة والمريضة أظهرت أن القرار الخلوية يسمح بالكشف عن تشوهات خفية في هيكل الأنسجة التي يتم التغاضي عنها في الفحص الإجمالي باستخدام مجهر تشريح36، أو طاقة المنخفضة مجهر ستيريو. ونود توسيع تحليلاتنا عالية الاستبانة للعينات البشرية. الزرد اليرقات، التي تشكل الموضوع الأساسي لعملنا الإنمائي، تشبه إبرة البشرية خزعات في هشاشة وعدم تجانس النسيج الخلوي وبين الخلايا، وحجم (1-3 مم)، وشكل ممدود. استناداً إلى خبرتنا الواسعة مع الزرد، وغيرها من الأعمال التي تبين أن الصغرى-CT بنجاح الملون وتفحص الأنسجة البشرية، ولو على أدنى القرار37، نتوقع نهجنا تحقيق قيمة مضافة لتصوير وتحليل عينة الإبرة. وقد قدرنا أن الجمعية العامة لمجموعة أدوات كافية لإعداد واحدة من عينات تصل إلى 20 من نفس الشرط أن يحتمل أن تكون أقل من 30 دولاراً. العينات التي أعدها لدينا أسلوب التضمين تقاوم الأضرار المادية وبالتالي من السهل للنقل. بانخفاض التكلفة وسهولة النقل توحي بإمكانية جمع العينات من عبر العالم، ولا سيما في المناطق التي لا يسهل تصوير القرار الخلوية مع الأشعة المقطعية الصغرى. رؤيتنا هي لملفات رقمية عالية الدقة لابره الخزعات (تتراوح من 0.1 إلى عدة تيرابايت) لتمكين إنشاء أطلس رقمي للأنسجة البشرية، وفي الوقت نفسه السماح للباحثين لصقل وتعزيز خطوط الأنابيب التحليل الحالي الترجمة والوصف الكمي لهندسة الخلايا والأنسجة والأنسجة تم مسحها ضوئياً في سياق كامل 3D.
Disclosures
أن تعلن كل من المؤلفين أن هناك أي تعارض في المصالح.
Acknowledgments
المؤلف يود أن يشكر مايرز رولاند يرجى توفير بروتوكولات تيم الأصلي. وبالإضافة إلى ذلك، نود أن نشكر الدكتور جون كولبورني لتقديم العينة براغيث الماء ، والدكتور يوسف جيريراجان لتقديم العينة المورفولوجية ، والدكتور فادية كمال لتزويد الجنين الماوس. المحققون الاعتراف بدعم تمويلي من المعاهد الوطنية للصحة (1R24OD18559-01-A2، PI: KCC)، "المختبرات جيتلين جيك" "بحوث السرطان"، ومن تمويل الجائزة التجريبية من معاهد هوك الأمير سلطان لعلوم الحياة، ومعهد سيبيرسسينسي.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 10X Neutral buffered formalin | Fisher Scientific | SF100-4 | |
| Phosphotunstic Acid | VWR | MK282402 | |
| Tricaine-S (MS-222) | Western Chemical | MS-222 | |
| LR White | Electron Microscopy Sciences | 14380 | |
| Polyimide tubing (ID 0.04") | Nordson Medical | 141-0065 | The exact polyimide tubings described in the manuscript are no longer available. A close match is provided here. Tubing with custom diameter can be manufactured upon request. |
| Ethyl Alcohol 200 Proof | Pharmco-Aaper | 111000200 | |
| Oil-based soft modeling clay | Sculpey | S302 001 | |
| Micropipette P200 | Gilson | F123601 | |
| Micropipette P1000 | Gilson | F123502 | |
| Glass vials | VWR | 66015-042 | |
| V-shaped basin | VWR | 89094-676 | |
| Weigh boats | VWR | 10803-148 | |
| 200 μL yellow micropipette tip | Fisher Scientific | 02-707-500 | |
| 1 mL blue micropipette tip | Fisher Scientific | 02-681-163 | |
| Tabletop shaker | Thermolyne | M71735 | |
| Camera | Photometrics | CoolSNAP HQ2 CCD | |
| X-ray microscope | Zeiss | Xradia 520 Versa |
References
- Cheng, K. C., Katz, S. R., Lin, A. Y., Xin, X., Ding, Y. Whole-organism cellular pathology: a systems approach to phenomics. Advances in Genetics. 95, 89-115 (2016).
- Cheng, K. C., Xin, X., Clark, D., La Riviere, P. Whole-animal imaging, gene function, and the zebrafish phenome project. Current Opinion in Genetics & Development. 21 (5), 620-629 (2011).
- Vågberg, W., Larsson, D. H., Li, M., Arner, A., Hertz, H. M. X-ray phase-contrast tomography for high-spatial-resolution zebrafish muscle imaging. Scientific Reports. 5, 16625 (2015).
- Bruneel, B., et al. Imaging the zebrafish dentition: from traditional approaches to emerging technologies. Zebrafish. 12 (1), 1-10 (2015).
- Charles, J. F., et al. Utility of quantitative micro-computed tomographic analysis in zebrafish to define gene function during skeletogenesis. Bone. 101, 162-171 (2017).
- Silvent, J., et al. Zebrafish skeleton development: High resolution micro-CT and FIB-SEM block surface serial imaging for phenotype identification. PLoS One. 12 (12), e0177731 (2017).
- Hur, M., et al. MicroCT-based phenomics in the zebrafish skeleton reveals virtues of deep phenotyping in a distributed organ system. eLife. 6, e26014 (2017).
- J, S. Whole-body imaging of a hypercholesterolemic female zebrafish by using synchrotron X-ray micro-CT. Zebrafish. 12 (1), 11-20 (2015).
- Hasamura, T., et al. Green tea extract suppresses adiposity and affects the expression of lipid metabolism genes in diet-induced obese zebrafish. Nutrition and Metabolism. 9 (1), 73 (2012).
- Meguro, S., Hasumura, T., Hase, T. Body fat accumulation in zebrafish is induced by a diet rich in fat and reduced by supplementation with green tea extract. PLoS One. 10 (3), e0120142 (2015).
- Dyer, E. L., et al. Quantifying mesoscale neuroanatomy using X-ray microtomography. eNeuro. 4 (5), (2017).
- Busse, M., et al. Three-dimensional virtual histology enabled through cytoplasm-specific X-ray stain for microscopic and nanoscopic computed tomography. Proc Natl Acad Sci U.S.A. 115 (10), 2293-2298 (2018).
- Perilli, E., Parkinson, I. H., Reynolds, K. J. Micro-CT examination of human bone: from biopsies towards the entire organ. Ann Inst Super Sanita. 48 (1), 75-82 (2012).
- Watz, H., Breithecker, A., Rau, W. S., Kriete, A. Micro-CT of the human lung: imaging of alveoli and virtual endoscopy of an alveolar duct in a normal lung and in a lung with centrilobular emphysema - initial observations. Radiology. 236 (3), 1053-1058 (2005).
- Metscher, B. D. MicroCT for developmental biology: A versatile tool for high-contrast 3D imaging at histological resolutions. Developmental Dynamics. 238 (3), 632-640 (2009).
- Metscher, B. D. MicroCT for comparative morphology: simple staining methods allow high-contrast 3D imaging of diverse non-mineralized animal tissues. BMC Physiology. 9, 11 (2009).
- Pauwels, E., Van Loo, D., Cornillie, P., Brabant, L., Van Hoorebeke, L. An exploratory study of contrast agents for soft tissue visualization by means of high resolution X-ray computed tomography imaging. Journal of Microscopy. 250 (1), 21-31 (2013).
- Kün-Darbois, J. D., Manero, F., Rony, L., Chappard, D. Contrast enhancement with uranyl acetate allows quantitative analysis of the articular cartilage by microCT: Application to mandibular condyles in the BTX rat model of disuse. Micro. 97, 35-40 (2017).
- Tang, S. Y., Vashishth, D. A non-invasive in vitro technique for the three-dimensional quantification of microdamage in trabecular. Bone. 40 (5), 1259-1264 (2007).
- Elliott, J. C., Dover, S. D. X-ray microtomography. Journal of Microscopy. 126 (Pt 2), 211-213 (1982).
- Johnson, J. T., et al. Virtual histology of transgenic mouse embryos for high-throughput phenotyping). PLoS Genetics. 2 (4), e61 (2006).
- Larsson, D. H., Vågberg, W., Yaroshenko, A., Yildirim, A. Ö, Hertz, H. M. High-resolution short-exposure small-animal laboratory x-ray phase-contrast tomography. Scientific Reports. 6, 39074 (2016).
- Pleissis, A., Broeckhoven, C., Guelpa, A., Roux, S. G. Laboratory x-ray micro-computed tomography: a user guideline for biological samples. GigaScience. 5, 1011 (2017).
- Wong, M. D., Spring, S., Henkelman, R. M. Structural stabilization of tissue for embryo phenotyping using micro-CT with iodine staining. PLoS One. 8 (12), e84321 (2013).
- Wong, M. D., Maezawa, Y., Lerch, L. P., Henkelman, R. M. Automated pipeline for anatomical phenotyping of mouse embryos using micro-CT. Development. 141 (12), 2533-2541 (2014).
- Hsu, C. W., et al. Three-dimensional microCT imaging of mouse development from early post-implantation to early postnatal stages. Developmental Biology. 419 (2), 229-236 (2017).
- Luft, J. H. Improvements in epoxy resin embedding methods. The Journal of Biophysical and Biochemical Cytology. 9, 409-414 (1961).
- Hayat, M. A., Giaquinta, R. Rapid fixation and embedding for electron microscopy. Tissue Cell. 2 (2), 191-195 (1970).
- Handschuh, S., Baeumler, N., Schwaha, T., Ruthensteiner, B. A correlative approach for combining microCT, light and transmission electron microscopy in a single 3D scenario. Frontiers in Zoology. 10, 44 (2013).
- Bushong, E. A., et al. X-ray microscopy as an approach to increasing accuracy and efficiency of serial block-face imaging for correlated light and electron microscopy of biological specimens. Microscopy and Microanalysis. 21 (1), 231-238 (2015).
- Tsao-Wu, G. S., Weber, C. H., Budgeon, L. R., Cheng, K. C. Agarose-embedded tissue arrays for histologic and genetic analysis. Biotechniques. 25 (4), 614-618 (1998).
- Sabaliauskas, N. A., et al. High-throughput zebrafish histology. Methods. 39 (3), 246-254 (2006).
- Copper, J. E., et al. Comparative analysis of fixation and embedding techniques for optimized histological preparation of zebrafish. Comparative Biochemistry and Physiology. 208, 38-46 (2018).
- Gürsoy, D., De Carlo, F., Xiao, X., Jacobsen, C. TomoPy: a framework for the analysis of synchrotron tomographic data. J Synchrotron Radiat. 21 (Pt 5), 1188-1193 (2014).
- Merkle, A. P., Gelb, J. The ascent of 3D X-ray microscopy in the laboratory. Microscopy Today. 21 (2), 10-15 (2013).
- Thomas, G. K. A molecular and systems biology analysis of pleiotropic vertebrate phenotypes (Doctoral dissertation). , Retrieved from the Penn State Electronic Theses and Dissertations Database (2009).
- Walton, L. A., et al. Morphological characterisation of unstained and intact tissue micro-architecture by X-ray computed micro- and nano- tomography. Scientific Reports. 5, 10074 (2015).
