Summary
Abbiamo sviluppato protocolli e progettato un apparecchio personalizzato per abilitare l'incorporamento degli esemplari di scala del millimetro. Vi presentiamo le procedure di preparazione del campione con un'enfasi sull'integrazione in resina acrilica e polyimide tubazione per raggiungere immobilizzazione rigida e archiviazione a lungo termine degli esemplari per l'interrogatorio di morfologia delle cellule e l'architettura del tessuto dal micro-CT.
Abstract
Per oltre un centinaio di anni, l'esame istologico dei tessuti è stato il gold standard per la diagnosi medica perché l'istologia permette tutti i tipi di cellule in ogni tessuto per essere identificato e caratterizzato. Il nostro laboratorio sta lavorando attivamente per fare progressi tecnologici in raggi x micro-tomografia computerizzata (micro-CT) che porterà il potere diagnostico dell'istologia per lo studio dei volumi di tessuto completo al cellulare ad alta risoluzione (cioè., raggi x Modalità di Histo-Tomography). A questo scopo abbiamo apportato miglioramenti mirati alla pipeline di preparazione del campione. Una chiave di ottimizzazioni e l'obiettivo del presente lavoro, è un metodo semplice per l'incorporamento rigida di campioni di scala millimetrata fisso e macchiato. Molti dei metodi pubblicati per esempio immobilizzazione e formazione immagine correlativa di micro-CT si basano sul posizionamento dei campioni in paraffina, agarosio o liquidi come alcool. Il nostro approccio si estende questo lavoro con procedure personalizzate e il design di un apparato stampabile 3-dimensionale per incorporare i campioni in una resina acrilica direttamente in polyimide tubazione, che è relativamente trasparente ai raggi x. Sono descritte le procedure di preparazione del campione per i campioni da 0,5 a 10 mm di diametro, che sarebbe adatto per larve di zebrafish intero e novellame o altri animali e campioni di tessuto di dimensioni simili. Come prova di concetto, noi abbiamo incorporato i campioni da Danio, Drosophila, Daphniae un embrione di topo; immagini rappresentative da scansioni 3-dimensionale per tre di questi campioni sono mostrati. D'importanza, la nostra metodologia conduce a molteplici vantaggi, tra cui immobilizzazione rigida, conservazione a lungo termine delle risorse faticosamente creato e la capacità di interrogare nuovamente campioni.
Introduction
Fenotipi sono tratti osservabili di un organismo che rappresentano le conseguenze delle interazioni uniche tra il suo patrimonio genetico e l'ambiente. Queste caratteristiche possono includere proprietà comportamentali, biochimici, morfologici, inerente allo sviluppo, o fisiologiche. Cosa importante, differenze nei tratti tra organismi wild type e mutanti genetici possono fornire informazioni chiave sui meccanismi e le funzioni dei geni interessati. Per quanto riguarda la morfologia, l'istopatologia è il gold standard per la valutazione di fenotipi a livello cellulare ma soffre di manufatti meccanici e non permette accurate analisi volumetrica quantitativa1. Il nostro laboratorio è motivato a superare le barriere per l'applicazione del potere diagnostico dell'istologia a volumi di tessuto completo a risoluzione di submicron.
Un sondaggio di tecnologie disponibili suggerisce che la formazione immagine ai raggi x micro-computato tomografia (micro-CT) può fornire funzionalità ideale necessaria per l'istologia scala millimetrata intero-animale 3-dimensionale (3D). Micro-CT consente la visualizzazione non distruttiva, isotropo, 3D e la capacità di condurre analisi quantitativa del tessuto architettura1,2. Negli ultimi anni, immagini 3D di zebrafish non macchiate e metallo-macchiato dal micro-CT ha guadagnato la trazione crescente ed sono stata utilizzata per analisi volumetrica dei diversi tessuti, compreso il muscolo, denti, ossa e tessuti adiposi3,4 ,5,6,7,8,9,10. Altri organismi modello e campioni di tessuto sono inoltre favorevoli a micro-CT imaging. Per esempio, una pipeline è stato introdotto per quantificare la neuroanatomia mesoscala denso di cervelli di topo imaged via sincrotrone micro-CT11. Allo stesso modo, un protocollo di colorazione eosina-basato ha dimostrato di essere adatto per tessuti molli micro-imaging TC di mouse interi organi12. L'analisi morfometrica delle vertebre di L3 umane non macchiate e la visualizzazione dei polmoni umani argento-macchiate usando micro-CT hanno dimostrato l'utilità di questa tecnologia per umani campioni13,14.
Al fine di attualizzare la grande promessa del micro-CT per fenotipizzazione morfologica completa di piccoli animali intatti e gli esemplari del tessuto, una serie di ostacoli deve essere superati in relazione alla velocità di trasmissione, risoluzione, campo di vista, cella completa colorazione, e conservazione a lungo termine. Mentre ciascuno di questi aspetti è di fondamentale importanza, il focus del presente manoscritto è l'ottimizzazione delle procedure di incasso, con note aggiuntive sull'esempio fissazione e colorazione. Macchiatura di metalli pesanti è utile perché il contrasto inerente tra diversi tessuti molli nelle immagini di micro-CT è basso. La potenza di metallo varie macchie, come il tetrossido di osmio, iodio, acido fosfotungstico (PTA) e gallocyanin-chromalum, per migliorare il contrasto per imaging di micro-CT è stato studiato15,16,17. Acetato di uranile è stato utilizzato anche come agente di contrasto per imaging micro-CT dell'osso e della cartilagine18,19. PTA come usato nel nostro protocollo porta a colorazione coerente di quasi tutti i tessuti e le cellule negli esemplari di zebrafish intero, producendo immagini che sono potenzialmente compatibili con istologia-come studi attraverso volumi completi del tessuto.
Durante l'acquisizione di immagini di micro-CT, proiezione 2-dimensionale (2D) è presa come campione viene ruotato per una frazione di grado e ripetuta fino a che il campione ha completato una rotazione di 180° o 360°, generando una serie di migliaia di proiezioni 2D utilizzate per la ricostruzione del volume 3D20. In questo processo, qualsiasi perturbazione dell'esemplare causerà le proiezioni 2D corrispondente essere fuori allineamento, con conseguente mal ricostruiti volumi 3D. Immobilizzazione del campione è un modo per correggere questo problema e alcune strategie attuali implicano immergendo il campione in alcool o incorporamento in agarosio in provette di polipropilene o micropipetta suggerimenti3,5,15, 16 , 21 , 22. metodi di immersione in liquidi non sono l'ideale perché il movimento del campione durante l'acquisizione delle immagini può verificarsi tra insiemi di imaging, con conseguente spostati ricostruzioni di volumi 3D23. Inoltre, è ben noto che la stabilità fisica dei campioni di tessuto liquido-conservato è povera di scale di tempo di mesi o anni, a seguito di instabilità chimica e all'abrasione superficiale associata con il movimento dei punti di contatto tra il campione e il contenitore parete ( osservazioni personali con campioni di tessuto animale e umano fisso).
Per ridurre il potenziale per il movimento del campione durante la formazione immagine, i campioni possono essere incorporati in agarosio24,25,26, ma questa pratica è associata con il rischio della macchia diffondente in agarosio riducendo così immagine 26il contrasto. Inoltre, preparazioni di liquido o agarosio sono inclini a danni fisici e degradano nel tempo, che li rende inutilizzabili per la conservazione a lungo termine di campione. Abbiamo ragionato che un metodo di immobilizzazione di esempio semplice e potenzialmente di successo potrebbe essere adattato da quello utilizzato per i campioni di microscopia elettronica. Resine polimerizzate come EPON 812 (interrotto e sostituito da incorporare 812) sono comunemente usate per fornire la durezza necessaria per generare sezioni ultrasottili per microscopia elettronica27,28. Infatti, parecchi studi comparativi tra imaging a raggi x e microscopia elettronica hanno dimostrato che i campioni incorporati in resina possono essere ripreso da raggi x microscopia29,30. Tuttavia, alcune delle pratiche standard di microscopia elettronica non si traducono direttamente a micro-CT imaging. Ad esempio, micro-CT imaging di campioni con quadrati resina bordi dei blocchi in resina tipica e campioni tagliati da quei blocchi è associato con artefatti di diffrazione di bordo che possono interferire con la formazione immagine. Lisciando i bordi di resina, quando possibile, è laboriosa e richiede tempo.
Mentre una varietà di resine plastiche incorporamento sono impiegati in microscopia elettronica, l'alta priorità bassa associata con resine più difficile come incorporare 812 ci ha portato a testare gli altri. Abbiamo scelto LR White grazie alla sua bassa viscosità, basso ritiro, bassa tendenza a formare delle bolle durante la polimerizzazione e priorità bassa più bassa. Per creare campioni di bordo libero e per ridurre al minimo la quantità di resina che circondano il campione, abbiamo sviluppato i protocolli per disegnare gli esemplari in resina liquida in tubazione di polyimide prima della polimerizzazione. Polyimide è stato scelto per la sua elevata stabilità termica e alta trasmissione di raggi x in modo che la rimozione del tubo non è necessaria per l'imaging. Infine, abbiamo progettato un adattatore personalizzato micropipetta per il nostro campione incorporamento tecnica al fine di tenere il tubo e impedire la contaminazione di Micropipette in modo affidabile. L'adattatore può essere stampato da un file di immagine di CAD 3D. Presi insieme, l'obiettivo dei metodi di preparazione del campione qui presentato è di rendere l'incorporamento di piccoli campioni più semplici, realizzare enhanced colorazione di contrasto, immobilizzazione rigida e archiviazione a lungo termine degli esemplari scala millimetrata intatto.
Protocol
Tutte le procedure per gli animali vivi sono state approvate dal istituzionale Animal Care e uso Committee (IACUC) presso la Pennsylvania State University.
1. giorno 1: fissazione
- Per migliorare la fissazione e ridurre il volume del contenuto intestinale, morire di fame il novellame per almeno 24 h per un esemplare di 10 mm, o più per gli esemplari più grandi (ad es., 72 h per un esemplare di 14 mm).
- Pre-raffreddare 10% formalina tamponata neutra (NBF) e 2 x tricaina-S (MS-222, 400 mg/L) sul ghiaccio a 4 ° C.
- Doppia il pesce acqua volume con refrigerati 2 x MS-222 per eutanasia rapida e umano.
- Attendere per 30 s (larve) per 60 s (novellame) dopo il pesce smette di muoversi.
- Immergere il pesce in refrigerata 10% NBF per 10 min.
- Difficoltà il pesce in soluzione NBF 10% refrigerato durante la notte in recipienti a fondo piatto a temperatura ambiente.
Nota: Recipienti a fondo piatto sono necessari per ridurre al minimo la flessione dell'esemplare. Il volume di fissativo e soluzioni di tutti i passaggi successivi dovrebbero essere almeno 20 volte il volume di campione, se non diversamente specificato. Per 1-5 di zebrafish larvale, il volume di soluzione consigliata è di almeno 1 mL. Risultati insufficienti fissativi nella fissazione del povera e un eccesso di volume di reagente non influisce negativamente l'esito della procedura descritta. Per il fissaggio completo di pesci più grandi, spacchi la pancia a partire leggermente anteriore il poro anale. Utilizzare penetrazione minima di forbici o un coltello e applicare forza gentile lontano dal pesce durante il taglio per ridurre al minimo i danni agli organi interni. Protocolli di fissazione sono stati descritti da altri31,32,33.
2. giorno 2: Disidratazione e colorazione
- Lavare 3 volte campioni fissati in 1x tamponato fosfato salino (PBS) pH 7.4 per 10 min.
- Immergere i campioni in alcool etilico al 35% (EtOH) per 20 min a temperatura ambiente con agitazione delicata.
Nota: Per tutte le fasi di movimentazione delicata, utilizzare un agitatore da tavolo e impostare per un effetto di miscelazione, con cura evitando urti e sfregamenti del campione contro le superfici del contenitore. - Immergere i campioni in 50% EtOH per 20 min a temperatura ambiente con agitazione delicata.
- Sciogliere di polvere di acido fosfotungstico (PTA) in acqua per preparare una soluzione stock di 1% w/v.
- Diluire la soluzione madre di PTA 1% 3:7 in 100% EtOH per ottenere una soluzione colorante del PTA di 0,3%.
- Macchiare i campioni durante la notte nella soluzione PTA 0,3% a temperatura ambiente con agitazione delicata.
3. giorno 3: infiltrazione
- Preparare la miscela 1:1 v/v di EtOH e LR bianco resina acrilica al 100% e mettere da parte.
- Risciacquo 3 volte in 70% EtOH per 10 min.
- Immergere i campioni nel 90% EtOH per 30 min a temperatura ambiente con agitazione delicata.
- Immergere i campioni nel 95% EtOH per 30 min a temperatura ambiente con agitazione delicata.
- Immergere i campioni due volte in 100% EtOH per 30 min a temperatura ambiente con agitazione delicata.
- Immergere i campioni in miscela 1:1 EtOH e LR bianco acrilico resina durante la notte a temperatura ambiente con agitazione delicata.
4. giorno 4: incorporamento
- Immergere i campioni in 100% LR White resina per 2 h a temperatura ambiente con agitazione delicata.
- Sostituire la resina nel passaggio 4.1 con fresco 100% LR bianco resina e incubare per 1 h a temperatura ambiente con agitazione delicata.
- Montare l'apparecchiatura incorporamento (Figura 1).
- Tagliare la tubazione di polyimide di opportuno diametro e lunghezza.
Nota: È consigliabile il tubo con un diametro interno di almeno 0,1 mm più grande del diametro del provino. Per esemplari tipici, una lunghezza standard di 30 mm di tubo è utilizzata per ogni campione. Quando lo si desidera, allungati esemplari possono essere ospitati utilizzando tubi più lunghi.- Montare una micropipetta P1000 per la parte più larga della scheda di incorporamento e inserire la tubazione di polyimide all'estremità stretta (Figura 1). Se la scheda di incorporamento non è disponibile, passare al punto 4.3.3. In caso contrario, continuare a punto 4.4.
- Clip fuori alla fine di una punta della micropipetta dritto attraverso tale che la tubazione di polyimide si adatta perfettamente. Tagliare a 44 mm dall'estremità larga di una punta di giallo micropipetta 200 µ l per il 0,0403" tubi e 59 mm dal fondo della punta di 1 mL blu per 0,105" della tubazione. Tagliare secondo le necessità.
- Fissare la punta di taglio micropipetta per una micropipetta.
- Trasferire i campioni a pesare piccola barca o bacino a forma di V di soluzione e immergere completamente i campioni in 100% resina bianca di LR.
- Con l'apparato incorporamento da passo 4.3, mirare il tubo alla fine di larghezza del campione fisso (o verso la testa nel caso di esemplari di animali) e pipettare lentamente il campione nel tubo. Collocare l'esempio nel mezzo il tubo e assicurare che il tubo sopra e sotto l'esemplare è riempito di resina.
- Dispensare il campione nel tubo tale che il campione si sta muovendo nella direzione naturale, avanti.
Nota: Il pipettaggio lento evita bolle d'aria ed esemplare danno causato dallo sfregamento contro il bordo della tubazione. Movimento all'indietro nel tubo possa facilmente danneggiare le estremità (arti, Ali, pinne, ecc.). Si consiglia di consentire alcune overflow di resina nell'apparato incorporamento in modo che, più tardi, aria non entra il tubo durante la rimozione.
- Dispensare il campione nel tubo tale che il campione si sta muovendo nella direzione naturale, avanti.
- Immediatamente sigillare l'estremità aperta con argilla di modellistica morbido a base di olio.
- Appiattire l'argilla in un foglio di spessore mm 1.
- Stabilizzare il tubo tra l'indice e le barrette centrali.
- Premere lentamente l'argilla contro l'estremità del tubo con il pollice.
- Rimuovere l'eccesso di argilla.
- Rimuovere l'apparecchio incorporamento dalla micropipetta.
- Estrarre il tubo di rotazione delicata e sigillare l'altra estremità con l'argilla.
- Tenere premuto un dito contro l'estremità sigillata per evitare l'espulsione dell'argilla.
- Spingere lentamente l'estremità del tubo non sealed in argilla.
- Posizionare il tubo orizzontalmente e polimerizzare la resina per 24 h a 65 ° C.
Nota: Il posizionamento orizzontale evita il movimento del campione durante la polimerizzazione. Se una piccola quantità di aria è stata intrappolata in passo 4.8, alla fine con la bolla d'aria può essere elevata leggermente per impedire il movimento di bolla di aria verso l'esemplare. Soprattutto, troppa elevazione durante la polimerizzazione può causare l'esemplare a cadere verso il bassa fine a causa della gravità. Un campione correttamente incorporato è dimostrato rispetto ad uno con una bolla d'aria, che dovrebbe essere evitata perché la rifrazione da interfacce aria/resina può degradare la qualità dell'immagine (Figura 2).
5. giorno 5: raccolta
- Raccogliere i campioni per acquisizione di immagini alla fine del giorno 5.
Nota: La rimozione della tubazione di polyimide è possibile ma non necessaria per l'imaging. Basato su sincrotrone micro-CT imaging per l'esempio di zebrafish è stata eseguita alle Beamline 2-BM presso Advanced Photon fonte (APS) in Argonne National Laboratory (Lemont, IL, USA). Per PTA-macchiato zebrafish, è stata determinata una gamma ottimale di energia dei raggi x di 5-30 keV, e un'energia di raggi x di 13,8 keV è stato usato per formazione immagine. 1501 proiezioni sono state ottenute a 13,8 keV oltre 180 gradi (1 proiezione ogni 0,12 gradi) con una fotocamera 2048-di-2048 pixel. Inoltre, due immagini di piatto-campo (guadagno) (uno all'inizio) e uno alla fine dell'acquisizione ed una campo scuro inoltre sono state acquisite. Le correzioni di piatto-campo e campo scuro, anello artefatto riduzione e ricostruzione dell'immagine sono state fatte utilizzando l'open source TomoPy toolkit34. PTA-macchiato Daphnia e Drosophila campioni erano imaged su un microscopio a raggi x12,35. Impostazioni specifiche di micro-CT sono dipendente l'oggetto e la qualità della macchia. Ad esempio, l'esemplare di Drosophila è stato digitalizzato presso 40 kVp, 74 mA e 15 s ad una risoluzione di voxel di 3.10 × 3.10 × 3.10 µm3.
Representative Results
Il protocollo descritto sopra dettagli la procedura di preparazione del campione per le larve di zebrafish intero e novellame per micro-CT imaging. In particolare, questo metodo è prontamente adattato ad altri tipi di campioni (ad es., Drosophila, Daphnia, Arabidopsis, organi del topo). Tempi di incubazione nei vari passaggi sono appropriati per le larve di zebrafish e campioni di dimensioni simili; i più grandi campioni potrebbero richiedere di incubazione più lungo. Per semplificare l'esempio incorporamento passi, abbiamo progettato un adattatore che si collega a una micropipetta da 1 mL e può essere personalizzato per vari formati di polyimide tubo flessibile (Figura 1). Questo adattatore personalizzato è stato stampato da un file CAD che è associato con questo manoscritto e disponibile per il download da http://publications.chenglab.com/LinEtAlJOVE/ 3D. Poiché tutti i lettori non possono avere accesso a una stampante 3D, montaggio di un apparato di incorporamento fatti in casa utilizzando una micropipetta suggerimenti è descritto nel protocollo (punto 4.3). Una larva di zebrafish incorporato con successo è dimostrata rispetto ad un esemplare con una bolla d'aria (Figura 2), che probabilmente si degrada la qualità dell'immagine. Per dimostrare la versatilità della procedura l'incorporamento, mostriamo gli esemplari da vari organismi di modello (cioè., Danio, Drosophila, Daphnia, embrione di topo) che sono passati attraverso il campione preparazione della pipeline ( Figura 3). Ricostruita volumi 3D di interi esemplari Danio, Daphniae Drosophila , ripresi da micro-CT sono visualizzati (Figura 4). D'importanza, come dimostra l'esempio di Danio , questi campioni possono essere conservati per un periodo di tempo prolungato e riutilizzati per più sessioni di formazione immagine (Figura 5).
Figura 1. L'incorporamento di apparato. (A) un adattatore è stato progettato per facilitare l'incorporamento utilizzando strumenti di laboratorio comuni. (B) un'illustrazione della sezione trasversale dell'adattatore. (C) l'incorporamento apparato dopo l'inserimento della tubazione di polyimide punto adattatore (a) e allegando la micropipetta a punto di adattatore (c). Segmento di adattatore (b) è una camera di overflow progettata per ospitare la resina in eccesso e proteggere la micropipetta da contaminazione. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 2. Incorporato con successo i campioni sono privi di bolle d'aria. (A) un incorporato 3 giorni post-fertilizzazione (dpf) di zebrafish larvale senza bolle d'aria. (B) un zebrafish incorporato 3 dpf con una bolla d'aria. L'aria intrappolata durante il processo di incorporamento possa muoversi verso l'esemplare se il campione non è messo in posizione orizzontale durante la polimerizzazione. Scala bar = 1 mm. per favore clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 3. Un'ampia varietà di campioni può essere integrata con il nostro protocollo. (A) larva di zebrafish dpf 7. (B) adulto della drosofila. (C) adulto Daphnia. (D) embrione di topo. I più grandi campioni come l'embrione di topo sono gestiti da poche modifiche al protocollo. Brevemente, la tubazione di polyimide è stata riempita per 1/3 della sua lunghezza di resina e polimerizzata prima dell'inclusione. Campione fisso e macchiato era collocato in cima la resina pre-polimerizzata. Il tubo è stato poi riempito con resina non polimerizzata, seguita da una seconda polimerizzazione. La tubazione di polyimide è stato rimosso prima della fotografia per permettere la migliore visualizzazione del campione in questa figura. La rimozione del tubo non è necessaria per l'acquisizione di immagine di successo di barre della scala micro-CT.: immagini campione, 5mm; allargata inserti, 1 mm. per favore clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 4. rendering 3-dimensionale degli esemplari incorporati. (A) ricostruito della larva di zebrafish dpf 3 × 0.743 0.743 × 0.743 µm3 voxel risoluzione. (B) ricostruito adulto Daphnia (risoluzione di 3 × 3 × 3 µm3 voxel). (C) ricostruito adulto Drosophila (risoluzione di 3.1 × 3.1 × 3.1 µm3 voxel). Sezioni trasversali digitale possono essere generate in qualsiasi angolo come mostrato nella colonna di sinistra. Rendering di superficie vengono visualizzati sulla destra, il rendering utilizzando software commerciali. L'incorporamento di resina può essere visto in tutte le scansioni fuori il campione (notato da *), ma non interferisce con il campione stesso. La larva di pesce zebra era imaged Argonne National Laboratory presso la fonte del fotone avanzate che è basato su sincrotrone. Gli esemplari di Daphnia o Drosophila erano imaged con un microscopio a raggi x delle imprese. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 5. Campioni incorporati con nostro protocollo possono essere creata una nuova immagine con micro-CT. La larva di pesce zebra 5 dpf stesso era imaged nel 2011 (A) e (B) 2013, presentato come proiezioni di intensità media della vista sagittale. Confronto delle immagini tra le scansioni dopo il deposito Mostra la conservazione delle caratteristiche anatomiche. Close-up (C) un del muscolo da entrambe le scansioni è presentato, con linee segmentate che indica regioni corrispondenti utilizzate per la generazione del profilo (D) per intensità. Profili di intensità normalizzati alla loro medie corrispondenti lungo entrambe le linee mostrano spazialmente corrispondenti picchi locali in entrambe le scansioni. (E) intensità i valori medi per regioni selezionate nella A e B appartenendo a sfondo (Bg, viola), i nuclei neuronali (N, verde), materia bianca (W, blu) e il muscolo (M, arancione) erano divisi da una media di fondo (bianco) e utilizzato per generare il segnale-rumore rapporti (SNR), che corrisponde bene tra le scansioni. Scala bar = 100 µm. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Discussion
In questo manoscritto, presentiamo un protocollo dettagliato per immobilizzazione rigida della scala millimetrata fisso e macchiato esemplari (0,5 fino a 2,5 mm di diametro) per micro-CT imaging. Dato il rapido progresso della tecnologia di micro-CT per quanto riguarda la risoluzione e la velocità, un metodo di conservazione del campione permanente con re-imaging delle funzionalità è altamente desiderabile. Tradizionalmente, la densa resina incorporamento sono comunemente usati in microscopia elettronica per fornire il supporto strutturale per tagliare sezioni ultrasottili e minimizzare i danni alla provetta. Il nostro metodo adattato suo uso per immobilizzazione rigida durante la formazione immagine non-distruttivo. Per ridurre al minimo gli artefatti imaging dalla presenza di resina in eccesso, abbiamo implementato l'utilizzo di tubazione di polyimide trasparente ai raggi x per creare campioni di turno senza bordi e di limitare il volume di resina intorno al campione.
Risultato ottimale della procedura incorporamento è condizionato all'attenta esecuzione di diversi passaggi critici e attenzione per l'integrità del campione durante tutta la procedura. Infatti, danneggiare l'esemplare si tradurrà in un'immagine finale compromessa indipendentemente dal successo di esecuzione dell'imaging. Poiché agghiacciante contribuisce a una diminuzione delle risposte di dolore e tessuto unfixed degrada più rapidamente a temperature più elevate, usiamo i reagenti pre-refrigerati. Esemplari di grandi dimensioni potrebbero essere necessario essere tagliato per permettere l'entrata di fissativo nella parte interna dell'esemplare, affinché gli organi interni come fegato, pancreas e intestino sono completamente fissi. Tessuti non fissati deteriorano e perdono l'integrità strutturale, distruggendo la struttura biologica. Un altro passo fondamentale è quello di mantenere il campione nel suo allineamento naturale. Di conseguenza, sosteniamo per l'uso di contenitori a fondo piatto, che usiamo in tutta la procedura e sono particolarmente importante durante la fissazione. Fissaggio in polipropilene tubi o tubi conici che di solito hanno un fondo a forma di V dovrebbero essere evitati perché possono causare allungati campioni di piegarsi, che distorce la naturale morfologia dell'esemplare. Inoltre, per ridurre al minimo l'uso della resina, il diametro interno della tubazione di polyimide è solo leggermente più grande rispetto alla larghezza dell'esemplare. Flessione dell'esemplare può anche provocare danni al provino, che entra il tubo. Si raccomanda inoltre di trasferire il campione nel tubo in modo naturale per evitare dannosi estremità. La disidratazione corretta è un altro passo fondamentale. Questa operazione viene eseguita con piccoli incrementi di aumento delle concentrazioni di EtOH per lentamente sostituire l'acqua con EtOH, che è più miscibile con la resina. Grandi aumenti nella concentrazione di EtOH sono associati con il restringimento del tessuto e possono essere migliorati da ulteriori incrementi di EtOH incubazione per rendere la transizione più graduale. Infine, per ridurre al minimo il movimento dell'esemplare o sacche d'aria, se presenti, i campioni vengono posti orizzontalmente durante la polimerizzazione della resina (fine del Day 4). Sacche d'aria o sigillante accanto l'esemplare causa artefatti ottici con imaging a raggi x associata con diffrazione a bordo, riducendo la qualità dell'immagine.
Per quanto riguarda eventuali modifiche al protocollo, altri che utilizza resine e metallo macchie possono essere utilizzate al posto di acrilico bianco di LR e PTA, rispettivamente. Embed812, resina epossidica, comunemente usata in microscopia elettronica, è altamente viscoso, più difficile il trasferimento, può causare la distorsione degli esemplari ed è associato con sfondo superiore rispetto a Resine metacrilato acrilico o glicole. Mentre JB4 Plus, un metacrilato di glicole, è meno viscoso di EMbed812 e ha priorità bassa più bassa, casuale formazione di sacche d'aria appaiono frequentemente in prossimità del campione. Come accennato, sacche d'aria degradare la qualità dell'immagine e sono particolarmente problematici per preziosi campioni. Vale la pena notare che Technovit 7100, un'altra in metacrilato di glicole, interferisce con la colorazione PTA conseguente scarso contrasto nell'immagine finale. Comparativamente, LR bianco acrilico ha acqua-come viscosità, basso fondo e non interferisce con la macchiatura di PTA. Nelle nostre mani, il tasso di successo di incorporamento in LR bianco senza bolle d'aria o di danni del campione è supera al 95%. Per questi motivi, sosteniamo il suo uso come la resina di incorporamento per tessuto micro-CT. Per quanto riguarda le macchie, il risultato di metallo varie macchie come il tetrossido di osmio, iodio, e PTA in micro-CT imaging è stata confrontata e discusso altrove15,16,17 e non rientra nell'ambito di questo manoscritto.
La dimensione del campione è una limitazione importante alla nostra attuale protocollo. Poiché ci avvaliamo di aspirazione per trasferire gli esemplari nel tubo, la capacità di vedere l'esemplare è fondamentale per l'orientamento e garantire che è davvero nelle tubazioni. Di conseguenza, sub-millimetrica campioni come Tardigrada (cioè., orsi di acqua) sono estremamente difficili da incorporare perché essi richiedono l'uso di un microscopio per essere visualizzati. Una volta applicata la aspirazione, preparati microscopici sono facilmente persi dal piano focale e diventano impegnativi a riscoprire, che lo rende difficile determinare se troppo lontano che passati alla fine allegata della tubazione. I più grandi campioni, come embrioni di topo, (3-10 mm) possono essere incorporati con lievi modifiche al protocollo di incorporamento (Figura 4). In particolare, la tubazione di polyimide è stata riempita con 1/3 di resina liquida, che era polimerizzata prima dell'inclusione. Il campione fisso e macchiato è stato messo in cima la resina pre-polimerizzata. Il tubo è stato poi completamente riempito di resina non polimerizzata e seguito da una seconda polimerizzazione.
Il significato del nostro protocollo di incorporamento è molteplice. Rigidamente immobilizzato intero animale o tessuto esemplari sono desiderabili per motivi tra cui: (1) creazione di repository a lungo termine di campioni che sono difficili da generare o preparare; (2) ri-acquisizione dei dati; (3) attivazione seriale imaging utilizzando più modalità di imaging; e (4) fornendo gli standard di calibrazione e sviluppo tecnologico. Campioni preparati con la nostra procedura di incasso sono racchiusi in resina solida che è resistente contro danni e pertanto possono essere facilmente memorizzati forse tempo indeterminato. Archiviazione a lungo termine è particolarmente utile per gli esemplari rari o faticosamente generati come quelli associati a progetti di fenomeno. Ulteriormente, nel caso in cui i dati digitali vengono persi, i dati possono essere generati da campione originale. La capacità di re-imaging per un lungo periodo di tempo potenzialmente permette lo stesso campione essere interrogati con più avanzate modalità di formazione immagine in futuro. Dal momento che i campioni sono fisicamente stabili tra istanze imaging, immagini sono acquisite dallo stesso esemplare nello stesso orientamento, facilitando la registrazione tra insiemi di dati precedenti e successive. Ad esempio, un'immagine a bassa risoluzione può consentire solo segmentazione dei tessuti in una larva di pesce zebra. La larva stessa più tardi può essere ri-imaged a risoluzione superiore in modo che più dettagliate analisi computazionali al cellulare ad alta risoluzione. Questa funzionalità per un confronto diretto tra le scansioni registrati suggerisce campioni resina-incastonati come un potenziale standard per lo sviluppo della tecnologia di micro-CT. Gli effetti di qualsiasi alterazione per il metodo di imaging possono essere valutati da imaging dello stesso campione in modo che tutte le variabili in fase di preparazione dei campione sono controllate. Infine, un campione standard incorporato resina utilizzabile per la calibrazione dello strumento per verificare la coerenza di imaging.
Il nostro lavoro precedente esame di istologia pesce mutante e malato ha mostrato che cellulare ad alta risoluzione permette la rilevazione di anomalie sottili nella struttura del tessuto che sono trascurati in esame lordo utilizzando il microscopio per dissezione36, o una bassa potenza microscopio stereo. Vogliamo espandere la nostra analisi ad alta risoluzione ai campioni umani. Le larve di zebrafish, che comprendono il soggetto primario del nostro lavoro di sviluppo, sono simili alle biopsie umane nella loro fragilità, eterogeneità cellulare e intercellulare del tessuto, dimensioni (1-3 mm di diametro) e forma allungata. Basato sulla nostra vasta esperienza con zebrafish e altri lavori mostrando che micro-CT con successo macchiato e scansionato il tessuto umano, anche se a bassa risoluzione37, ci aspettiamo che i nostri approcci per portare valore aggiunto per l'imaging e l'analisi delle biopsie dell'ago. Abbiamo stimato che il montaggio di un kit sufficiente per una preparazione di fino a 20 campioni della stessa condizione essere potenzialmente meno di 30 USD. I campioni preparati dal nostro metodo incorporamento sono resistente ai danni fisici e quindi facile da trasportare. Il basso costo e facilità di trasporto suggeriscono la possibilità di raccolta di campioni da tutto il mondo, in particolare le zone in cui imaging cellulare ad alta risoluzione con micro-CT non è facilmente accessibile. La nostra visione è per il file digitali ad alta risoluzione delle biopsie da agoaspirato (che vanno da 0,1 a diversi terabyte) per abilitare la creazione di un atlante digitale dei tessuti umani e allo stesso tempo consentire ai ricercatori di perfezionare e migliorare il pipeline di analisi corrente per localizzazione e caratterizzazione quantitativa dell'architettura cellulare e tessutale nel contesto 3D dei tessuti analizzati.
Disclosures
Tutti gli autori dichiarano che non esistano conflitti di interessi.
Acknowledgments
Gli autori vorrei ringraziare Roland Myers per gentilmente fornire i protocolli TEM originali. Inoltre, vorremmo ringraziare il Dr. John Colbourne per fornire il campione di Daphnia , Dr. Santhosh Girirajan per aver fornito l'esemplare di Drosophila e Dr. Fadia Kamal per fornire l'embrione di topo. I ricercatori riconoscono finanziamento da NIH (1R24OD18559-01-A2, PI: KCC), i laboratori di Gittlen di Jake per ricerca sul cancro e da pilota premio finanziamenti dal PSU Huck istituti delle scienze della vita e dell'Istituto per CyberScience.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 10X Neutral buffered formalin | Fisher Scientific | SF100-4 | |
| Phosphotunstic Acid | VWR | MK282402 | |
| Tricaine-S (MS-222) | Western Chemical | MS-222 | |
| LR White | Electron Microscopy Sciences | 14380 | |
| Polyimide tubing (ID 0.04") | Nordson Medical | 141-0065 | The exact polyimide tubings described in the manuscript are no longer available. A close match is provided here. Tubing with custom diameter can be manufactured upon request. |
| Ethyl Alcohol 200 Proof | Pharmco-Aaper | 111000200 | |
| Oil-based soft modeling clay | Sculpey | S302 001 | |
| Micropipette P200 | Gilson | F123601 | |
| Micropipette P1000 | Gilson | F123502 | |
| Glass vials | VWR | 66015-042 | |
| V-shaped basin | VWR | 89094-676 | |
| Weigh boats | VWR | 10803-148 | |
| 200 μL yellow micropipette tip | Fisher Scientific | 02-707-500 | |
| 1 mL blue micropipette tip | Fisher Scientific | 02-681-163 | |
| Tabletop shaker | Thermolyne | M71735 | |
| Camera | Photometrics | CoolSNAP HQ2 CCD | |
| X-ray microscope | Zeiss | Xradia 520 Versa |
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