Summary
Vi utvecklat protokoll och designat en egen apparatur att aktivera inbäddning av millimeter-skala exemplar. Vi presenterar prov förberedelse förfaranden med betoning på inbäddning i akrylharts och polyimid slangar för att uppnå styv immobilisering och långvarig lagring av prover för förhör av vävnad arkitektur och cell morfologi av mikro-CT.
Abstract
För över hundra år, har histologiska studier av vävnader varit guldmyntfoten för medicinsk diagnos eftersom histologi tillåter alla celltyper i varje vävnad skall identifieras och karakteriseras. Vårt laboratorium arbetar aktivt för att göra tekniska framsteg i röntgen mikro-datortomografi (mikro-CT) som kommer att föra diagnostiska kraften i histologi till studien av full vävnad volymer på cellulära upplösning (dvs., en röntgenbild Histo-tomography modalitet). Mot detta syfte har vi gjort riktade förbättringar till prov förberedelse rörledningen. En nyckel optimering och fokus i detta arbete, är en enkel metod för styv inbäddning av fasta och färgade millimeter-skala prover. Många av de publicerade metoderna för provet immobilisering och korrelat mikro-CT imaging förlitar sig på att placera proverna i paraffin vax, agaros eller vätskor såsom alkohol. Vår strategi sträcker sig detta arbete med anpassade förfaranden och utformningen av en 3-dimensionell utskrivbara apparater till bädda in proverna i en akrylharts direkt i polyimid slangar, som är relativt transparent för röntgen. Häri, beskrivs prov förberedelse förfaranden för proverna från 0,5 till 10 mm i diameter, som skulle vara lämpliga för hela zebrafiskar larver och yngel, eller andra djur och vävnadsprover på liknande dimensioner. Som bevis på koncept, har vi inbäddade exemplaren från Danio, Drosophila, Daphniaoch en mus embryo; representativa bilder från 3-dimensionell genomsökningar för tre av dessa prover redovisas. Ännu viktigare, leder vår metod till flera fördelar inklusive styv immobilisering, långtidslagring av mödosamt skapade resurser och möjligheten att åter förhöra prover.
Introduction
Fenotyper är observerbara egenskaper av en organism som representerar konsekvenserna av unika interaktioner mellan dess genetiska bakgrund och miljö. Dessa egenskaper kan inkludera beteendemässiga, biokemisk, morfologisk, utvecklingsmässiga eller fysiologiska egenskaper. Ännu viktigare, kan skillnader i egenskaper mellan vildtyps-organismer och genetiska mutanter ge viktiga insikt mekanismer och funktioner av drabbade gener. Vad gäller morfologi, histopatologi är den gyllene standarden för att bedöma fenotyper på cellnivå men lider mekaniska artefakter och tillåter inte exakt kvantitativ volymetrisk analys1. Vårt laboratorium är motiverade att övervinna hinder för tillämpningen av diagnostiska kraften i histologi på full vävnad volymer submicron upplösning.
En undersökning av tillgänglig teknik föreslår att avbildning av röntgen mikro-beräknade datortomografi (mikro-CT) kan ge perfekt kapacitet som krävs för millimeter-skala hela-djur 3-dimensionell (3D) histologi. Micro-CT kan icke-förstörande, isotropa, 3D visualisering och förmågan att genomföra kvantitativ analys av vävnad arkitektur1,2. Under de senaste åren 3D imaging av ofärgade och metall-färgas zebrafiskar av mikro-CT har fått ökande dragkraft och har använts för volymetrisk analys av flera vävnader, inklusive muskler, tänder, ben och fettvävnad3,4 ,5,6,7,8,9,10. Andra modellorganismer och vävnadsprover är också mottagliga för mikro-CT imaging. Exempelvis har en pipeline införts för att kvantifiera tät tem neuroanatomi av mus hjärnor avbildade via synkrotron mikro-CT11. Likaså har en eosin-baserat färgning protokoll visat sig vara lämplig för mjuk vävnad mikro-CT-avbildning av hela musen organ12. Morfometriska analys av ofärgade mänskliga L3 Kotor och visualisering av silver-färgade människors lungor med mikro-CT har visat nyttan av denna teknik för mänskliga prover13,14.
För att aktualisera den mycket lovande för mikro-CT för komplett morfologiska fenotypning av intakt smådjur och vävnadsprover, ett antal hinder som måste övervinnas i förhållande till genomströmning, upplösning, field-of-view, omfattande cell färgning, och långsiktigt bevarande. Medan var och en av dessa aspekter är kritiskt viktigt, är fokus i det nuvarande manuskriptet optimering av inbäddning rutiner, med ytterligare anteckningar på prov fixering och färgning. Heavy metal färgning är användbar eftersom den inneboende kontrasten mellan olika mjukdelar i mikro-CT-bilder är låg. Styrkan hos olika metall fläckar, såsom osmium vanligtvis, jod, phosphotungstic syra (PTA) och gallocyanin-chromalum, för att förbättra kontrast för mikro-CT imaging har varit studerade15,16,17. Uranyl acetat har också använts som en kontrasterande agent för mikro-CT-avbildning av ben och brosk18,19. PTA som används i våra protokoll leder till konsekvent färgning av nästan alla vävnader och celler i hela zebrafiskar exemplar, vilket ger bilder som är potentiellt kompatibla med histologi-liknande studier genom hela volymer av vävnad.
Under mikro-CT bild förvärv, en 2-dimensionell (2D) projektion tas som provet är roterade av en bråkdel av en grad och upprepas tills provet har slutfört en 180° eller 360° rotation, generera en serie av tusentals 2D prognoser används för den rekonstruktion av 3D-volym20. I denna process orsakar någon störning av preparatet motsvarande 2D prognoserna att vara ur läge, vilket resulterar i dåligt rekonstruerade 3D volymer. Prov immobilisering är ett sätt att rätta till problemet och några aktuella strategier innebär dränka provet i alkohol eller inbäddning i agaros i polypropylene rören eller mikropipett tips3,5,15, 16 , 21 , 22. flytande nedsänkning metoder är inte idealiska eftersom provet rörelse under bild förvärv kan uppstå mellan imaging uppsättningar, vilket resulterar i skiftade rekonstruktioner av 3D volymer23. Vidare är det väl känt att fysisk stabilitet av vätska-lagrade vävnadsprover är fattig på tidsskalor av månader till år, på grund av kemisk instabilitet och ytan nötning förknippas med rörelse av kontaktpunkter mellan prov och kärlet vägg ( personliga observationer med fasta djur- och vävnadsprover).
För att minska risken för provet rörelse under imaging, prover kan bäddas i agaros24,25,26, men denna praxis är associerade med risken att fläcken sprida in agaros vilket minskar bilden kontrast26. Dessutom vätska eller agaros preparat är benägna att fysiska skador och försämras med tiden, vilket gör dem olämpliga för långsiktig förvaring av provet. Vi resonerade att en potentiellt framgångsrika och okomplicerat prov immobilisering metod kunde anpassas från det som används för elektronmikroskopi exemplar. Polymeriserat hartser såsom EPON 812 (slopas och ersätts med bädda in 812) används ofta för att ge den hårdhet som krävs för att generera ultrathin sektioner för elektronmikroskopi27,28. Faktiskt, flera jämförande studier mellan röntgenfotografering och elektronmikroskopi har visat att de prover som inbäddade i harts kan avbildas med röntgen mikroskopi29,30. Några av standard praxis för elektronmikroskopi översätter dock inte direkt till mikro-CT imaging. Till exempel mikro-CT-avbildning av prover med fyrkant harts kanter av typiska harts block och prov klipp från dessa block är associerad med kant diffraction artefakter som kan störa imaging. Smoothing harts kanter, samtidigt som möjligt, är mödosam och tidskrävande.
Medan en mängd plast inbäddning hartser är anställda i elektronmikroskopi, ledde hög bakgrunden är associerad med hårdare hartser såsom bädda in 812 oss att testa andra. Vi valde LR vit på grund av dess låga viskositet, låg krympning, låg tendens att bilda bubblor under polymerisation och lägre bakgrund. Att skapa edge-gratis prover, och att minimera mängden harts som omger provet, utvecklat vi protokollen för att rita exemplar i flytande harts till polyimid slangar före polymerisation. Polyimid valdes för dess hög termisk stabilitet och hög röntgen transmittans så att borttagningen av slangen inte är nödvändigt för avbildning. Slutligen har vi utformat en anpassad mikropipett adapter för vårt urval bädda in tekniken för att tillförlitligt håll slangen och förhindra kontaminering av Mikropipetter. Adaptern kan vara 3D tryckt från en CAD fil. Sammantaget är målet med de prov förberedelse metoder som presenteras här att göra inbäddning av små prover mer rättframt, uppnå förbättrad färgning kontrast, styv immobilisering och långsiktig lagring av intakt millimeter-skala exemplar.
Protocol
Alla förfaranden på levande djur godkändes av institutionella djur vård och användning kommittén (IACUC) vid Pennsylvania State University.
1. dag 1: fixering
- För att förbättra fixeringen och minska volymen av gut innehållet, svälta juvenil fisk för minst 24 h för ett 10 mm exemplar, eller längre för större exemplar (t.ex., 72 h för ett 14 mm exemplar).
- Pre chill 10% Neutral buffrad Formalin (NBF) och 2 x Tricaine-S (MS-222, 400 mg/L) på is till 4 ° C.
- Dubbla fisken vattenvolym med kylda 2 x MS-222 för snabba och humana dödshjälp.
- Vänta 30 s (larver) till 60 s (ungdomar) efter fisken stannar.
- Doppa fisken i kylt 10% NBF i 10 min.
- Fixa fisken i kylt 10% NBF lösning över natten i flatbottnade behållare i rumstemperatur.
Obs: Flatbottnad behållare krävs för att minimera böjning av preparatet. Volymen av fixativ och lösningar av alla efterföljande steg bör vara minst 20 gånger provvolymen såvida inte annat anges. För 1-5 larver zebrafiskar är den rekommenderade lösning volymen minst 1 mL. Otillräcklig fixativ resulterar i dålig fixering och ett överskott av reagens volym påverkar inte negativt resultatet av det beskrivna förfarandet. För fullständig fixering av större fiskar, slits buken börjar något anterior anal pore. Använda minimal genomträngning av sax eller kniv och tillämpa mild kraft från fisken medan skära för att minimera skador på inre organ. Fixering protokoll har varit beskrivs av andra31,32,33.
2. dag 2: Uttorkning & färgning
- Skölj fasta exemplar 3 gånger i 1 x fosfatbuffrad koksaltlösning (PBS) pH 7,4 i 10 min.
- Dränka proverna i 35% etanol (EtOH) under 20 minuter vid rumstemperatur med försiktig skakning.
Obs: För alla försiktig skakning steg, använda en bordsskiva shaker och ange för en blandning effekt samtidigt noga undvika stöta och gnugga av provet mot behållare ytorna. - Dränka proverna i 50% EtOH under 20 minuter vid rumstemperatur med försiktig skakning.
- Lös phosphotungstic syra (PTA) pulver i vatten för att förbereda en 1% w/v stamlösning.
- Späd 1% PTA stamlösning 3:7 i 100% EtOH att erhålla en 0,3% PTA färglösningen.
- Fläcken proverna övernattning i 0,3% PTA lösningen vid rumstemperatur med försiktig skakning.
3. dag 3: Infiltration
- Förbereda 1:1 v/v blandning av 100% EtOH och LR vit akrylharts och ställ åt sidan.
- Skölj 3 gånger i 70% EtOH i 10 min.
- Dränka proverna i 90% EtOH i 30 min i rumstemperatur med försiktig skakning.
- Dränka proverna i 95% EtOH i 30 min i rumstemperatur med försiktig skakning.
- Dränka proverna två gånger i 100% EtOH i 30 min i rumstemperatur med försiktig skakning.
- Dränka proverna i 1:1 EtOH och LR vit akrylharts blandningen över natten i rumstemperatur med försiktig skakning.
4. dag 4: bädda in
- Dränka proverna i 100% LR vit resin för 2 h vid rumstemperatur med försiktig skakning.
- Ersätta kådan i steg 4.1 med fräsch 100% LR vit harts och inkubera i 1 timme vid rumstemperatur med försiktig skakning.
- Montera inbäddning apparaten (figur 1).
- Skär polyimid slangar av lämplig diameter och längd.
Obs: Slangen med en inre diameter som är minst 0,1 mm större än diametern av preparatet rekommenderas. För typiska exemplar används en standard längd 30 mm av slang för varje prov. När önskad, avlånga exemplar kan rymmas med längre slangar.- Bifoga en P1000 mikropipett i den breda änden av inbäddning adaptern och sätt polyimid slangen till den smala änden (figur 1 c). Om inbäddning adaptern inte finns, gå till steg 4.3.3. Annars fortsätter du till steg 4,4.
- Klipp bort i slutet av en mikropipett spets rakt över så att polyimid slangen sitter tätt. Skära på 44 mm från den breda änden av ett 200 µL gul mikropipett tips för den 0.0403 ”slangar och 59 mm från botten av 1 mL blå spets för den 0,105” slangar. Trimma efter behov.
- Fäst den skurna mikropipett spetsen en mikropipett.
- Överföra proverna till en liten väger båten eller V-formad lösning bassäng och helt dränka proverna i 100% LR vit harts.
- Med inbäddning apparaten från steg 4,3, sikta slangen vid den breda änden av fast provet (eller mot huvudet när det gäller animaliska exemplar) och Pipettera preparatet långsamt i slangen. Placera provet i mitten av slangen och se till att slangen ovanför och nedanför preparatet fylls med kåda.
- Pipettera provet i slangen så att provet är i naturlig, framåt riktning.
Obs: Långsam pipettering undviker luftbubblor och preparatet skada orsakad av nötning mot slangen kant. Bakåt rörelse in slangen kan lätt skada extremiteter (armar och ben, vingar, fenor, etc.). Det rekommenderas att tillåta vissa harts overflow i inbäddning apparaten så att senare luft inte kommer in slangen under borttagning.
- Pipettera provet i slangen så att provet är i naturlig, framåt riktning.
- Omedelbart försegla den öppna änden med oljebaserade mjuk modellering lera.
- Platta leran till en 1 mm tjock-ark.
- Stabilisera slangen mellan pek- och långfingret.
- Tryck långsamt på lera mot slutet av slangen med tummen.
- Ta bort överflödig lera.
- Ta bort inbäddning apparaten från mikropipett.
- Dra ut slangen genom varsam rotering och försegla den andra ändan med leran.
- Håll ett finger mot förseglade slutet att förhindra utslungning av lera.
- Tryck långsamt oförseglade slutet av slangen in i leran.
- Placera slangen horisontellt och polymerisera kådan för 24 h vid 65 ° C.
Obs: Horisontell placering undviker prov rörelsen under polymerisationen. Om en liten mängd luft var instängd i steg 4,8, kan avsluta med luftbubblan vara förhöjda något för att förhindra luftrörelser bubbla mot preparatet. Allt orsaka för mycket höjd under polymeriseringen provexemplaret falla mot låg slutet på grund av tyngdkraften. Ett ordentligt inbäddade prov visas jämfört med en med en luftbubbla, som bör undvikas eftersom refraktionen från luft/kåda gränssnitt kan försämra bildkvaliteten (figur 2).
5. dag 5: samling
- Samla in proverna för bild förvärvandet i slutet av dag 5.
Obs: Avlägsnande av polyimid slangar är möjligt men inte nödvändigt för avbildning. Synkrotron-baserade micro-CT tänkbar för zebrafiskar provet utfördes på Beamline 2-BM på Advanced Photon Source (APS) i Argonne National Laboratory (Lemont, IL, USA). För PTA-färgade zebrafiskar, en optimal X-ray energi utbud av 5-30 keV fastställdes, och en X-ray energi på 13,8 keV användes för bildbehandling. 1501 prognoser erhölls på 13,8 keV över 180 grader (1 projektion varje 0,12 grader) med en 2048-av-2048 pixel kamera. Dessutom förvärvades också två platt-fältet (vinst) bilder (en i början) och en i slutet av förvärvet och en mörk-fältet bild. Platt- och mörker-fältet korrigeringar, ring artefakt reducering och bild återuppbyggnad skedde med hjälp av open source TomoPy toolkit34. PTA-färgade Daphnia och Drosophila prover var avbildad på en röntgen Mikroskop12,35. Specifika mikro-CT inställningar är beroende på objektet och kvaliteten på fläcken. Till exempel Drosophila preparatet skannades på 40 kVp, 74 mA och 15 s med en voxel upplösning på 3.10 × 3.10 × 3.10 µm3.
Representative Results
Protokollet beskrivs ovan Detaljer prov förberedelse förfarandet för hela zebrafiskar larver och yngel för mikro-CT bilddiagnostik. Särskilt, denna metod är lätt anpassas till andra prover typer (t.ex., Drosophila, Daphnia, Arabidopsis, mus organ). Inkubationstider i olika steg är lämpliga för zebrafiskar larver och prover av liknande storlek. större prover kan kräva längre inkubation. För att bistå med provet inbäddning steg, utformade vi en adapter som fäster till en 1 mL mikropipett, och kan anpassas för olika storlekar av polyimid slangar (figur 1). Denna anpassad adapter var 3D tryckt från en CAD-fil som är associerade med detta manuskript och tillgängliga för nedladdning från http://publications.chenglab.com/LinEtAlJOVE/. Eftersom alla läsare inte kan ha tillgång till en 3D-skrivare, beskrivs montering av en hemmagjord inbäddning apparater använder mikropipett tips i protokollet (steg 4.3). Ett framgångsrikt inbäddade zebrafiskar larv visas jämfört med en förlaga med en luftbubbla (figur 2), som sannolikt kommer att försämra bildkvaliteten. För att visa mångsidigheten hos förfarandet för inbäddning, vi visar exemplaren från olika modellorganismer (dvs., Danio, Drosophila, Daphnia, mus embryo) som har gått igenom den prov förberedelse pipeline ( (Se figur 3). Rekonstruerade 3D volymer av hela Danio, Daphniaoch Drosophila exemplar fotograferad av mikro-CT visas (figur 4). Ännu viktigare, vilket framgår av Danio provet, kan dessa prover lagras under en längre tid och återanvändas för flera imaging sessioner (figur 5).
Figur 1. Bädda in apparatur. (A) en adapter var utformade för att underlätta för inbäddning använder gemensamma laboratoriet verktyg. (B) en tvärsnitts illustration av adaptern. (C) inbäddning apparater efter införandet av polyimid slangen på adapter led a och fästa mikropipett på adapter punkt (c). Adapter-segmentet (b) är en overflow kammare utformad för att rymma överskott harts och skydda mikropipett från föroreningar. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2. Framgångsrikt inbäddade exemplar saknar luftbubblor. (A) en inbäddad 3 dygn efter befruktning (dpf) larval zebrafiskar utan luftbubbla. (B) en inbäddad 3 dpf zebrafiskar med en luftbubbla. Luft instängd under processen inbäddning kan flytta mot preparatet om provet inte är placerad horisontellt under polymerisationen. Skala barer = 1 mm. vänligen klicka här för att visa en större version av denna siffra.
Figur 3. En mängd olika exemplar kan bäddas med våra protokoll. (A) 7 dpf zebrafiskar larv. (B) vuxna Drosophila. (C) vuxen Daphnia. (D) mus embryo. Större prover såsom mus embryot hysas av några ändringar av protokollet. Kort, polyimid slangen fylldes till 1/3 av dess längd med harts och polymeriseras före inbäddning. Fasta och färgas provet placerades ovanpå före polymeriserat kådan. Slangen var då fylld med un-polymeriserat harts följt av en andra polymerisation. Polyimid slangen togs bort före fotografering att tillåta bättre visualisering av provet i denna siffra. Avlägsnande av slangen inte är nödvändig för framgångsrik bild förvärvandet av mikro-CT. skala barer: prov bilder, 5 mm; förstorad inläggningar, 1 mm. vänligen klicka här för att visa en större version av denna siffra.
Figur 4. 3-dimensionell renderingar av inbäddade exemplar. (A) rekonstruerade 3 dpf zebrafiskar larv på 0,743 × 0.743 × 0.743 µm3 voxel upplösning. (B) rekonstruerade vuxen Daphnia (3 × 3 × 3 µm3 voxel upplösning). (C) rekonstruerade vuxen Drosophila (3,1 × 3,1 × 3,1 µm3 voxel upplösning). Digitala tvärsnitt kan genereras i valfri vinkel som visas i den vänstra kolumnen. Yta renderingar visas till höger, återges med kommersiell programvara. Inbäddning harts kan ses i alla genomsökningar utanför provet (noteras av *), men stör inte provet själv. Zebrafiskar larven fotograferades vid Argonne National Laboratory vid Advanced Photon källan som är synkrotron-baserade. Daphnia eller Drosophila exemplaren var avbildade med kommersiella röntgen Mikroskop. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 5. Prover som inbäddade med våra protokoll kan vara åter avbildad med mikro-CT. Samma 5 dpf zebrafiskar larven fotograferades i (A) 2011 och (B) 2013, presenteras som genomsnittliga intensitet projektioner av vyn sagittal. Bild jämförelse mellan skanningar efter lagring visar bevarandet av anatomiska funktioner. C en närbild av muskler från både skanningar presenteras, med segmenterade linjer som anger motsvarande regioner används för (D) intensitet profil generation. Intensitet profiler normaliserade till deras motsvarande medelvärden längs båda linjerna visar rumsligt matchande lokala toppar i både skanningar. (E) Genomsnittlig intensitetsvärdena för utvalda regioner i A och B tillhör bakgrund (Bg, lila), neuronala atomkärnor (N, grön), vit substans (W, blå), och muskeln (M, orange) var delat med ett genomsnitt för bakgrunden (vit) och används för att generera signal-brus- nyckeltal (SNR), vilket motsvarar väl mellan skanningar. Skala barer = 100 µm. vänligen klicka här för att visa en större version av denna siffra.
Discussion
I detta manuskript presenterar vi ett detaljerat protokoll för styv immobilisering av fasta och färgade millimeter-skala (0,5 till 2,5 mm diameter) exemplar för mikro-CT bilddiagnostik. Med tanke på den snabba utvecklingen av mikro-CT teknik när det gäller upplösning och hastighet, är en metod för permanent prov bevarande med nytt imaging funktioner mycket önskvärt. Traditionellt används ofta tät inbäddning harts i elektronmikroskopi för att ge strukturellt stöd för att minska ultrathin sektioner och minimera skadorna på preparatet. Vår metod anpassad dess användning för styv immobilisering under icke-förstörande bildbehandling. För att minimera de imaging artefakterna från förekomsten av överskjutande harts, har vi genomfört användningen av röntgen transparent polyimid slangar att skapa runda prover utan kanter, och att begränsa mängden harts runt provet.
Optimala resultatet av inbäddning förfarandet villkoras försiktig körning av flera kritiska moment och uppmärksamhet till provet integritet under hela förfarandet. Faktiskt kommer att skadar preparatet resultera i en komprometterad slutliga bilden oavsett framgången för utförandet av imaging. Eftersom kylning bidrar till en minskning av smärta svaren och ofixerad vävnad bryts ned snabbare vid högre temperaturer, använder vi pre kylda reagenser. Stora exemplar kan behöva sänkas för att tillåta införsel av fixativ till insidan av preparatet så att inre organ såsom lever, bukspottkörtel och tarm är helt fasta. Ofixerade vävnader försämras och förlorar strukturell integritet, förstöra biologisk struktur. Ett annat viktigt steg är att upprätthålla förlagan i sin naturliga anpassning. Därför förespråkar vi för användning av flatbottnad behållare, som vi använder under hela förfarandet och är särskilt viktigt under fixering. Fixering i polypropylen rör eller koniska rör som vanligtvis har en V-formad botten bör undvikas eftersom de kan orsaka långsträckt prover att böja, vilket snedvrider den naturliga morfologin av preparatet. Dessutom, för att minimera användningen av harts, är den inre diametern av polyimid slangen bara något större än bredden på preparatet. Böjning av preparatet kan också resultera i skador till preparatet som det går in slangen. Det rekommenderas också att överföra preparatet i slangen i en naturlig framåt sätt att undvika skadliga extremiteter. Ordentlig uttorkning är ett annat viktigt steg. Detta görs med små steg av ökande EtOH koncentrationer att långsamt byta vatten med EtOH, vilket är mer blandbart med harts. Stora ökningar i EtOH koncentration är associerade med vävnad krympning och kan förbättras genom ytterligare steg om EtOH inkubation att göra övergången mer gradvis. Slutligen, för att minimera rörelsen av preparatet eller luftfickor, om det finns några, proverna placeras horisontellt under harts polymerisation (slutet av dag 4). Luftfickor eller tätningsmedel bredvid preparatet orsakar optiska artefakter med röntgenfotografering associerade med kant diffraction, minska bildkvaliteten.
När det gäller eventuella ändringar av protokollet, andra inbäddning hartser och metall fläckar kan användas i stället för LR vit akryl och PTA, respektive. Embed812, ett epoxiharts som vanligen används i elektronmikroskopi, är mycket trögflytande, svårare att överföra, kan orsaka snedvridning av exemplaren och associeras med högre bakgrund än akryl eller glykol metakrylatresiner. Medan JB4 Plus, en glykol form, är mindre trögflytande än EMbed812 och har lägre bakgrund, slumpmässiga bildandet av luftfickor ofta visas i närheten av preparatet. Som nämnts, luftfickor försämra bildkvaliteten och är särskilt problematiska för dyrbara prover. Det är värt att notera att Technovit 7100, en annan glykol form, stör PTA färgning, vilket resulterar i dålig kontrast i den slutliga bilden. Jämförelsevis, LR vit akryl har vatten-liknande viskositet, låg bakgrund, och stör inte PTA färgning. I våra händer är framgången för inbäddning i LR vitt utan provet skador eller luftbubblor större än 95%. Av dessa skäl har förespråkar vi dess användning som inbäddning kådan för vävnad mikro-CT. När det gäller fläckar, resultatet av olika metall fläckar såsom osmium vanligtvis, jod, och PTA i mikro-CT imaging har varit jämförs och diskuteras på annat håll15,16,17 och ligger utanför tillämpningsområdet för denna Manuskriptet.
Urvalets storlek är en stor begränsning till vår nuvarande protokoll. Eftersom vi anställer sug att överföra exemplar i slangen, är förmågan att se preparatet kritiska för orientering och säkerställa att det verkligen är i slangen. Som ett resultat, sub millimeter prover såsom trögkrypare (dvs., vatten björnar) är extremt svåra att bädda in eftersom de kräver användning ett mikroskop för att visualiseras. När sug är tillämpas, mikroskopiska exemplar försvinner enkelt från fokalplanet och bli utmanande att återupptäcka, vilket gör det svårt att avgöra om de gått för långt genom bifogade slutet av slangen. Större prover, såsom musembryon, (3-10 mm) kan bäddas med smärre ändringar av inbäddning protokoll (figur 4 d). I synnerhet var polyimid slangen fylld till 1/3 med flytande harts, som var polymeriseras före inbäddning. Fasta och färgas provet placerades ovanpå före polymeriserat kådan. Slangen var sedan helt fylld med un-polymeriserat harts och följt av en andra polymerisation.
Betydelsen av vårt inbäddning protokoll är mångfacetterad. Stelt immobiliserade hela djuret eller vävnad prover är önskvärda av anledningar: (1) att skapa långsiktiga förråd av prover som är svåra att generera eller förbereda; (2) nytt förvärv av data; (3) Aktivera följetong imaging använder flera avbildningsmetoder; (4) att ge normer för kalibrering och teknisk utveckling. Prover som tillagas med vårt förfarande för inbäddning är inneslutna i fast harts som är motståndskraftig mot skador och därför lätt kan lagras kanske på obestämd tid. Långsiktig lagring är särskilt användbar för sällsynta eller mödosamt genererade prover såsom de som förknippas med företeelser projekt. Ytterligare, i händelse av att de digitala data går förlorade, data kan genereras från det ursprungliga provet. Kapaciteten hos ny avbildning under en lång tidsperiod potentiellt tillåter samma prov att förhöras med mer avancerade imaging modaliteter i framtiden. Eftersom proverna är fysiskt stabil mellan imaging instanser, förvärvas bilder från samma prov i samma riktning, underlätta registrering mellan tidigare och senare datamängder. Exempelvis kan en lågupplöst bild Tillåt endast segmentering av vävnader i en zebrafiskar larv. Samma larven kan senare avbildas åter på högre upplösning så att mer detaljerad computational analyser på cellulära upplösning. Denna förmåga för direkt jämförelse mellan registrerade skanningar föreslår harts-embedded prover som en potential som är standard för teknikutveckling av mikro-CT. Effekterna av eventuella ändringar av metoden imaging kan bedömas av imaging av samma prov så att alla variabler i prov förberedelse steg kontrolleras. Slutligen, ett harts-embedded standardprov kan användas för instrumentkalibrering för att testa för konsekvens för bildframställning.
Vårt tidigare arbete att undersöka muterade och sjuka fiskar histologi visade att cellulära upplösning tillåter upptäckt av subtila avvikelser i vävnad struktur som förbises i brutto undersökning med den dissekera Mikroskop36eller en lågenergi- stereo Mikroskop. Vi vill utöka våra högupplösta analyser till mänskliga prover. Zebrafiskar larver, som utgör den primära frågan om vårt utvecklingsarbete, liknar mänskliga nål biopsier i sin bräcklighet, cellulära och intercellulära vävnad heterogenitet, storlek (1-3 mm diameter) och avlånga. Baserat på vår omfattande erfarenhet med zebrafiskar och annat arbete som visar att mikro-CT framgång målat och skannas mänsklig vävnad, om än i lägre upplösning37, vi förväntar oss att våra metoder för att tillföra mervärde till bildhantering och analys av nålen biopsier. Vi har uppskattat att monteringen av ett kit som är tillräcklig för en beredning av upp till 20 prover av samma skick vara potentiellt mindre än 30 USD. De prover som utarbetats av vår inbäddning metod är resistenta mot fysiska skador och därför lätt att transportera. Den låg kostnad och enkel transport föreslår möjligheten att insamling av prover från hela världen, särskilt områden som cellulära resolution imaging med mikro-CT inte är lättillgänglig. Vår vision är att högupplösta digitala filer av nålen biopsier (allt från 0,1 till flera terabyte) att möjliggöra skapandet av en digital atlas av mänskliga vävnader, och samtidigt ge forskarna att förfina och förbättra nuvarande analys rörledningar för lokalisering och kvantitativa karakterisering av cellulär och vävnad arkitekturen inom 3D vävnader skannas.
Disclosures
Alla författarna förklarar att det inte finns några intressekonflikter.
Acknowledgments
Författarna vill tacka Roland Myers för vänligt att ge de ursprungliga TEM-protokoll. Dessutom vill vi tacka Dr John Colbourne för att tillhandahålla Daphnia preparatet, Dr Santhosh Girirajan för att tillhandahålla Drosophila preparatet och Dr Fadia Kamal för att tillhandahålla mus embryot. Utredarna bekräftar finansieringsstöd från NIH (1R24OD18559-01-A2, PI: KCC), Jake Gittlen laboratorier för cancerforskning och från pilot award finansiering från PSU Huck instituten av biovetenskap och Institutet för CyberScience.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 10X Neutral buffered formalin | Fisher Scientific | SF100-4 | |
| Phosphotunstic Acid | VWR | MK282402 | |
| Tricaine-S (MS-222) | Western Chemical | MS-222 | |
| LR White | Electron Microscopy Sciences | 14380 | |
| Polyimide tubing (ID 0.04") | Nordson Medical | 141-0065 | The exact polyimide tubings described in the manuscript are no longer available. A close match is provided here. Tubing with custom diameter can be manufactured upon request. |
| Ethyl Alcohol 200 Proof | Pharmco-Aaper | 111000200 | |
| Oil-based soft modeling clay | Sculpey | S302 001 | |
| Micropipette P200 | Gilson | F123601 | |
| Micropipette P1000 | Gilson | F123502 | |
| Glass vials | VWR | 66015-042 | |
| V-shaped basin | VWR | 89094-676 | |
| Weigh boats | VWR | 10803-148 | |
| 200 μL yellow micropipette tip | Fisher Scientific | 02-707-500 | |
| 1 mL blue micropipette tip | Fisher Scientific | 02-681-163 | |
| Tabletop shaker | Thermolyne | M71735 | |
| Camera | Photometrics | CoolSNAP HQ2 CCD | |
| X-ray microscope | Zeiss | Xradia 520 Versa |
References
- Cheng, K. C., Katz, S. R., Lin, A. Y., Xin, X., Ding, Y. Whole-organism cellular pathology: a systems approach to phenomics. Advances in Genetics. 95, 89-115 (2016).
- Cheng, K. C., Xin, X., Clark, D., La Riviere, P. Whole-animal imaging, gene function, and the zebrafish phenome project. Current Opinion in Genetics & Development. 21 (5), 620-629 (2011).
- Vågberg, W., Larsson, D. H., Li, M., Arner, A., Hertz, H. M. X-ray phase-contrast tomography for high-spatial-resolution zebrafish muscle imaging. Scientific Reports. 5, 16625 (2015).
- Bruneel, B., et al. Imaging the zebrafish dentition: from traditional approaches to emerging technologies. Zebrafish. 12 (1), 1-10 (2015).
- Charles, J. F., et al. Utility of quantitative micro-computed tomographic analysis in zebrafish to define gene function during skeletogenesis. Bone. 101, 162-171 (2017).
- Silvent, J., et al. Zebrafish skeleton development: High resolution micro-CT and FIB-SEM block surface serial imaging for phenotype identification. PLoS One. 12 (12), e0177731 (2017).
- Hur, M., et al. MicroCT-based phenomics in the zebrafish skeleton reveals virtues of deep phenotyping in a distributed organ system. eLife. 6, e26014 (2017).
- J, S. Whole-body imaging of a hypercholesterolemic female zebrafish by using synchrotron X-ray micro-CT. Zebrafish. 12 (1), 11-20 (2015).
- Hasamura, T., et al. Green tea extract suppresses adiposity and affects the expression of lipid metabolism genes in diet-induced obese zebrafish. Nutrition and Metabolism. 9 (1), 73 (2012).
- Meguro, S., Hasumura, T., Hase, T. Body fat accumulation in zebrafish is induced by a diet rich in fat and reduced by supplementation with green tea extract. PLoS One. 10 (3), e0120142 (2015).
- Dyer, E. L., et al. Quantifying mesoscale neuroanatomy using X-ray microtomography. eNeuro. 4 (5), (2017).
- Busse, M., et al. Three-dimensional virtual histology enabled through cytoplasm-specific X-ray stain for microscopic and nanoscopic computed tomography. Proc Natl Acad Sci U.S.A. 115 (10), 2293-2298 (2018).
- Perilli, E., Parkinson, I. H., Reynolds, K. J. Micro-CT examination of human bone: from biopsies towards the entire organ. Ann Inst Super Sanita. 48 (1), 75-82 (2012).
- Watz, H., Breithecker, A., Rau, W. S., Kriete, A. Micro-CT of the human lung: imaging of alveoli and virtual endoscopy of an alveolar duct in a normal lung and in a lung with centrilobular emphysema - initial observations. Radiology. 236 (3), 1053-1058 (2005).
- Metscher, B. D. MicroCT for developmental biology: A versatile tool for high-contrast 3D imaging at histological resolutions. Developmental Dynamics. 238 (3), 632-640 (2009).
- Metscher, B. D. MicroCT for comparative morphology: simple staining methods allow high-contrast 3D imaging of diverse non-mineralized animal tissues. BMC Physiology. 9, 11 (2009).
- Pauwels, E., Van Loo, D., Cornillie, P., Brabant, L., Van Hoorebeke, L. An exploratory study of contrast agents for soft tissue visualization by means of high resolution X-ray computed tomography imaging. Journal of Microscopy. 250 (1), 21-31 (2013).
- Kün-Darbois, J. D., Manero, F., Rony, L., Chappard, D. Contrast enhancement with uranyl acetate allows quantitative analysis of the articular cartilage by microCT: Application to mandibular condyles in the BTX rat model of disuse. Micro. 97, 35-40 (2017).
- Tang, S. Y., Vashishth, D. A non-invasive in vitro technique for the three-dimensional quantification of microdamage in trabecular. Bone. 40 (5), 1259-1264 (2007).
- Elliott, J. C., Dover, S. D. X-ray microtomography. Journal of Microscopy. 126 (Pt 2), 211-213 (1982).
- Johnson, J. T., et al. Virtual histology of transgenic mouse embryos for high-throughput phenotyping). PLoS Genetics. 2 (4), e61 (2006).
- Larsson, D. H., Vågberg, W., Yaroshenko, A., Yildirim, A. Ö, Hertz, H. M. High-resolution short-exposure small-animal laboratory x-ray phase-contrast tomography. Scientific Reports. 6, 39074 (2016).
- Pleissis, A., Broeckhoven, C., Guelpa, A., Roux, S. G. Laboratory x-ray micro-computed tomography: a user guideline for biological samples. GigaScience. 5, 1011 (2017).
- Wong, M. D., Spring, S., Henkelman, R. M. Structural stabilization of tissue for embryo phenotyping using micro-CT with iodine staining. PLoS One. 8 (12), e84321 (2013).
- Wong, M. D., Maezawa, Y., Lerch, L. P., Henkelman, R. M. Automated pipeline for anatomical phenotyping of mouse embryos using micro-CT. Development. 141 (12), 2533-2541 (2014).
- Hsu, C. W., et al. Three-dimensional microCT imaging of mouse development from early post-implantation to early postnatal stages. Developmental Biology. 419 (2), 229-236 (2017).
- Luft, J. H. Improvements in epoxy resin embedding methods. The Journal of Biophysical and Biochemical Cytology. 9, 409-414 (1961).
- Hayat, M. A., Giaquinta, R. Rapid fixation and embedding for electron microscopy. Tissue Cell. 2 (2), 191-195 (1970).
- Handschuh, S., Baeumler, N., Schwaha, T., Ruthensteiner, B. A correlative approach for combining microCT, light and transmission electron microscopy in a single 3D scenario. Frontiers in Zoology. 10, 44 (2013).
- Bushong, E. A., et al. X-ray microscopy as an approach to increasing accuracy and efficiency of serial block-face imaging for correlated light and electron microscopy of biological specimens. Microscopy and Microanalysis. 21 (1), 231-238 (2015).
- Tsao-Wu, G. S., Weber, C. H., Budgeon, L. R., Cheng, K. C. Agarose-embedded tissue arrays for histologic and genetic analysis. Biotechniques. 25 (4), 614-618 (1998).
- Sabaliauskas, N. A., et al. High-throughput zebrafish histology. Methods. 39 (3), 246-254 (2006).
- Copper, J. E., et al. Comparative analysis of fixation and embedding techniques for optimized histological preparation of zebrafish. Comparative Biochemistry and Physiology. 208, 38-46 (2018).
- Gürsoy, D., De Carlo, F., Xiao, X., Jacobsen, C. TomoPy: a framework for the analysis of synchrotron tomographic data. J Synchrotron Radiat. 21 (Pt 5), 1188-1193 (2014).
- Merkle, A. P., Gelb, J. The ascent of 3D X-ray microscopy in the laboratory. Microscopy Today. 21 (2), 10-15 (2013).
- Thomas, G. K. A molecular and systems biology analysis of pleiotropic vertebrate phenotypes (Doctoral dissertation). , Retrieved from the Penn State Electronic Theses and Dissertations Database (2009).
- Walton, L. A., et al. Morphological characterisation of unstained and intact tissue micro-architecture by X-ray computed micro- and nano- tomography. Scientific Reports. 5, 10074 (2015).
