Summary
ويصف هذا البروتوكول تصنيع أجهزة موائع جزيئية من MY133-V2000 للقضاء على القطع الأثرية التي غالباً ما تنشأ في ميكروتشانيلس بسبب الانكسار mismatching بين هياكل microchannel ومحلول مائي. يستخدم هذا البروتوكول حامل اكريليك لضغط الجهاز مغلفة، تحسين الالتصاق كيميائيا وميكانيكيا على حد سواء.
Abstract
باستخدام أجهزة موائع جزيئية برز كأداة حاسمة للتطبيقات الطبية الحيوية. عندما يتم دمجها مع تقنيات الفحص المجهري الحديثة، يمكن تنفيذ هذه الأجهزة كجزء من منصة قوية قادرة على إجراء قياسات مكملة متزامنة. أن التحدي الأساسي الذي تم إنشاؤها بواسطة المزيج من هذه الأساليب اثنين هو عدم التطابق في الانكسار بين المواد المستخدمة تقليديا لجعل أجهزة موائع جزيئية والمحاليل التي عادة ما تستخدم في الطب الحيوي. يمكن إنشاء عدم التطابق هذا التحف الضوئية قرب حواف القناة أو الجهاز. حل واحد هو الحد من الانكسار للمواد المستخدمة لاختلاق الجهاز باستخدام بوليمر مفلورة مثل MY133-V2000 الانكسار الذي مماثل للمياه (n = 1.33). هنا، هو أثبت بناء جهاز موائع جزيئية مصنوعة من MY133-V2000 باستخدام تقنيات الطباعة الحجرية الناعمة، استخدام البلازما2 س بالاقتران مع حائز اكريليك زيادة الالتصاق بين الجهاز MY133-V2000 ملفقة الركيزة بولي دايمثيل سيلوكسان (PDMS). ثم يتم اختبار الجهاز بحضانة أنها مليئة بخلية ثقافة وسائل الإعلام ح 24 لإثبات قدرة الجهاز على الحفاظ على ظروف ثقافة الخلية أثناء تجربة التصوير نموذجية. أخيرا، يستخدم لقياس توزيع كتلة داخل الخلايا الحية ملتصقة في microchannel المرحلة كمية مجهرية (كناية). بهذه الطريقة، وزيادة الدقة، مكنت بتلفيق الجهاز من بوليمر انخفاض مؤشر إنكسار مثل MY133-V2000 بدلاً من مواد الطباعة الحجرية الناعمة التقليدية مثل PDMS، يتجلى. وعموما، هذا النهج لاختلاق أجهزة موائع جزيئية يمكن سهولة إدماج مهام سير عمل الطباعة الحجرية الناعمة القائمة بغية الحد من الآثار البصرية وزيادة دقة القياس.
Introduction
وقد مكن تطوير تكنولوجيا موائع جزيئية طائفة واسعة من التقنيات الطبية الجديدة هذا النفوذ في الفيزياء فريدة من نوعها لتدفقات مجهرية الحجم1،2. وهذا يشمل تقنيات التشخيص التي بنيت على منصات موائع جزيئية أن قياس المؤشرات الحيوية ذات الصلة سريرياً، بما في ذلك الخلية صلابة3وعلامات سطح4النمو5. عن طريق التلاعب في الخلايا المفردة، يمكن أيضا استخدام أجهزة موائع جزيئية لقياس التباين العلامات البيولوجية، على سبيل المثال كمؤشر للورم الخبيث6. القدرة على الجمع بين التطبيقات موائع جزيئية مع الفحص المجهري زاد فائدة هذه المنصات بالسماح للأجهزة التي تقيس المؤشرات الحيوية متعددة في وقت واحد7.
كناية هو أسلوب الفحص المجهري أن التدابير في مرحلة التحول حيث يمر الضوء ويتفاعل مع هذه المسألة داخل عينات شفافة. ويمكن حساب كتلة الخلايا المفردة من قياسات كناية، باستخدام العلاقة المعروفة بين الانكسار و8،كثافة الكتلة الحيوية9. الأعمال السابقة أظهرت أن كناية قادرة على قياس البارامترات ذات الصلة سريرياً مثل الخلية النمو10،11 وخلية الخصائص الميكانيكية عن طريق اضطراب قوة12. عندما يتم دمجها مع ميكروفلويديكس، يمكن استخدام كناية يحتمل أن تكون قياس سلوك الخلية في بيئة شديدة تسيطر عليها في المختبر. واحدة من التحديات الرئيسية التي تواجه الجمع كناية ميكروفلويديكس هو الانكسار عالية لمعظم البوليمرات المستخدمة لبناء قنوات موائع جزيئية عن طريق الطباعة الحجرية الناعمة13.
تحديا هاما يواجه مجموعة ميكروفلويديكس مع تقنيات مختلفة للفحص المجهري هو عدم التطابق بين الانكسار للمواد الجهاز بالنسبة للانكسار الماء14،15. أسلوب واحد لمعالجة هذه المسألة من خلال استخدام بوليمر إنكسار منخفضة مثل سيتوب16 أو MY133-V200013. هذا الأخير مفلورة الأشعة فوق البنفسجية (الأشعة فوق البنفسجية)-بوليمر acrylate الشفاء له إنكسار مماثلة للمياه (n = 1.33) ومتوافق مع تقنيات الطباعة الحجرية الناعمة، مما يسمح لاندماج سلس في موائع جزيئية أنشئت العديد من مهام سير العمل في تصنيع الجهاز. هذا يجعل MY133 V2000 ليس فقط مناسبة لتصنيع جهاز موائع جزيئية، ولكن أيضا يسمح لها بسهولة الجمع كناية وغيرها من النهج مجهرية، قياس سلوك الخلية في المستعمرة وحجم خلية واحدة على حد سواء. MY133-V2000 يزيل التحف نظراً لمرحلة إزالة التغليف بإنتاج القليل، أن وجد، مرحلة التحول يمر الضوء من خلال واجهة MY133 المياه.
على الرغم من أن القضاء على عدم التكافؤ في الانكسار، هو أحد التحديات الكبرى المرتبطة بالأجهزة المصنعة من بوليمرات المفلورة، مثل MY133-V2000، على انضمام منخفضة إلى مواد أخرى مثل الزجاج أو PDMS. يوضح هذا العمل تصنيع جهاز موائع جزيئية MY133-V2000 باستخدام الطباعة الحجرية الناعمة. ويضمن الركازة جنبا إلى جنب مع حامل اكريليك ملفقة مخصص استخدام البلازما2 س لعلاج سطح القناة و PDMS أن الجهاز تتمسك بالركيزة، إنشاء قناة مختومة. هذا الجهاز مناسب لزراعة الخلايا وكناية لقياس كتلة الخلايا في القناة، والتي لها تطبيقات هامة لقياس نمو الخلايا الحية والنقل داخل الخلية لخلية الكتلة الحيوية، وكلاهما له أهمية سريرية في التشخيص اكتشاف الأدوية والعقاقير.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1-تلفيق السلبية بولي دايمثيل سيلوكسان
-
إعداد بولي دايمثيل سيلوكسان
- قياس 18 جرام من PDMS سيليكون الاستومر و 1.8 غرام من الكاشف علاج. صب الكاشف علاج في قارب قياس المتضمن في الاستومر.
- مزيج الاستومر والكاشف علاج بشدة لمدة 1 دقيقة ووضع الخليط في فراغ غرفة لمدة 30 دقيقة.
- إزالة PDMS من الفراغ، صب غ 15 على النفي قاطع ملفات تعريف ارتباط باستخدام (نصف قطرها = 3.8 سم) الحفاظ PDMS من يلوذ بالفرار إلى الجانب، وتغطي الخليط PDMS المتبقية.
- وضع القالب يحتوي على PDMS في فراغ الغرفة لمدة 10 دقائق.
- إزالة القالب الذي يحتوي على PDMS من فراغ الغرفة، ووضعه على صفيحة تعيين إلى 150 درجة مئوية لمدة 60 دقيقة علاج، وتغطية ذلك مع رقائق الألومنيوم.
- PDMS المتبقية على زجاج مقلوب طبق بتري (10 سم)، من أجل استخدام قطع الكعكة آخر كالعفن، لخلق لوحة من PDMS. وضع هذا في فراغ الغرفة حتى السلبية PDMS هو شُفي تماما.
- نقل طبق بيتري مع PDMS من الفراغ إلى صفيحة مسخن لعلاج عند 150 درجة مئوية لمدة 60 دقيقة.
-
المعالجة السطحية بالبلازما من بولي دايمثيل سيلوكسان
- إدراج شفرة حلاقة حادة تحت في PDMS وقطع الكعكة إزالة بعناية PDMS من السلبية.
- استخدام سكين حادة هواية لقطع السلبية من أكبر قطعة من PDMS؛ أنه ينبغي خفض مع يكفي المنطقة العازلة لإرفاق قطعة أخرى من PDMS وعلى رأس ذلك دون عرقلة السلبية.
- إدراج شفرة حلاقة حادة تحت PDMS شُفي مع السلبية لإزالة بعناية PDMS من طبق بيتري.
- استخدام قطع سكين هواية لقطع قطعة من PDMS من لوحة المفاتيح التي هي بنفس حجم القطعة للسلبية. بعد ذلك، قص مستطيل من قطعة جديدة من PDMS مع مساحة كافية لاحتواء أنه حول microchannel عند وضعه على قمة السلبية.
- وضع كل قطعة من PDMS (السلبية والمستطيل) على الركازة مسطحة (مثل شريحة مصنوعة من الزجاج أو الكوارتز، البوليستيرين، أو مواد أخرى) وإدراجها في بلازما تردد الراديو (RF) النظيف. أغلق الباب وختم الدائرة بإجلاء جوية استخدام مضخة فراغ. حقن الهواء يصل إلى ضغط من 400 متور باستخدام وحدة تحكم رقمية ضغط فراغ.
ملاحظة: إذا لم يتم استخدامه الركازة المستخدمة لتنظيف البلازما في البلازما أنظف، وضعه في البلازما أنظف بنفسها عن 60 ثانية قبل لعلاج السلبية، للحيلولة دون التمسك بالركيزة الطبقة الأساس اﻷكريليك. - تشغيل الإعداد الترددات العالية، وبلازما وردي جوية يجب أن يظهر في نافذة عرض. بلازما-علاج قطعتين من PDMS لمدة 30 ثانية، ثم إيقاف تشغيل الإعداد الترددات اللاسلكية. تسمح للهواء بطء إدخال الدائرة من أجل منع تدفق هواء مضطرب من الإخلال بمحتويات الدائرة.
- إزالة PDMS من البلازما أنظف ووضعه على benchtop. ثم، بعناية عكس المستطيل PDMS على السلبية واضغط عليه بزوج من الملقط. وليكن على الراحة لمدة 10 دقيقة للسماح لقطعتين من PDMS على التمسك ببعضها البعض.
-
فلوروسيلاني المعالجة السطحية من بولي دايمثيل سيلوكسان السلبية
- استخدام قطارة لوضع 2 قطرات من ثلاثي الكلور (ح 1، ح 1، ح 2، ح 2-perfluoro-أوكتيل) silane (بفوتس) في صغيرة تزن القارب وأدخله في فراغ غرفة زجاجية.
- عكس PDMS على قطعة من رقائق الألومنيوم (حيث أن تواجه بالنفي microchannel إلى الأعلى) ووضعه في قاعة الزجاج فراغ. ثم إخلاء غرفة 24 ساعة بشكل مستمر.
2-تلفيق MY133 Microchannel
-
تشكيل هيكل microchannel MY133-V2000
- ملء PDMS السلبية مع 400 ميليلتر من MY133-V2000.
ملاحظة: السلبية يجب أن يكون قليلاً مملوء. - ضع PDMS V2000 مملوءة MY133 السلبية في فراغ غرفة ح 2 لإزالة أي فقاعات.
- إزالة MY133-V2000 من الفراغ واضغط ببطء على شريحة زجاجية ضد أعلى السلبية ممتلئة قليلاً لإنشاء سطح مستو من MY133-V2000 ومنع الأوكسجين من تثبيط في البلمرة.
ملاحظة: PDMS، على سطح القناة، سوف جزئيا تمنع البلمرة، تمكين الترابط في مراحل لاحقة. وقد الشريحة الزجاجية شفافية الأشعة فوق البنفسجية انخفاض طفيف (35 في المائة) بالمقارنة مع الكوارتز، مما يساعد على منع أي اصفرار الجهاز شُفي. - إدراج MY133 V2000 في فرن 400 W الأشعة فوق البنفسجية وتعيين الأشعة فوق البنفسجية إلى 50% حدة الأقصى ل 300 s لعلاج microchannel MY133 V2000.
ملاحظة: هو الطول الموجي ذروة المستخدمة لعلاج الجهاز حوالي 375 نيوتن متر مع عرض النطاق الترددي لحوالي 25 نانومتر. واستخدمت حوالي 4,500 مللي جول/سم2 من السلطة لعلاج microchannel، الذي أكثر قليلاً من ضعف الحد الأدنى علاج الطاقة الذي أوصت به الشركة المصنعة.
- ملء PDMS السلبية مع 400 ميليلتر من MY133-V2000.
-
بناء على حامل اﻷكريليك
- رسم طبقة الأساس اﻷكريليك استخدام برامج رسم النواقل. تأكد من أن الطبقة الأساس مستطيل الذي 1.5 مم، 75 مم منذ وقت طويل، وعلى نطاق واسع، مع مستطيل تركزت التدابير 25 مم × 11 مم 25 مم.
- رسم طبقة منتصف اﻷكريليك استخدام ناقل الرسم البرمجيات. تأكد من الطبقة منتصف مستطيل (1.5 مم، 75 مم طويلة، و 25 مم) مع مربع متوسط (5 مم × 5 مم) واثنين من الدوائر (وكلاهما يبلغ قطرها 3 مم) مفصولة 15 ملم.
- رسم الطبقة العليا اﻷكريليك استخدام ناقل الرسم البرمجيات. تأكد من أن الطبقة العليا هو مستطيل (3 مم، 30 مم طويلة، و 25 مم) مع مربع متوسط (5 مم × 5 مم) واثنين من الدوائر (وكلاهما يبلغ قطرها 3 مم) مفصولة 15 ملم.
- قطع الجهاز التصاميم التي تم إنشاؤها في برامج مكافحة ناقلات الرسم مع قطع ليزر. استخدام إعدادات عينة من سرعة الطاقة و 30% 100%. قم بتشغيل برنامج مرتين لضمان قطع اﻷكريليك.
- اضغط الثقوب في الطبقة العليا اﻷكريليك باستخدام أداة التنصت 0.80 مم M5 حجم.
- مسح القطع اﻷكريليك مع الأسيتون لإزالة أي علامات متبقية أو حروق.
-
الرابطة من MY133-V2000 في حامل اﻷكريليك
- إرفاق قاعدة طبقة من اﻷكريليك الركيزة الزجاج باستخدام لاصقة مثل الغراء سوبر cyanoacrylate. ضع نقطتين صغيرة على حواف اﻷكريليك وثم استخدم أداة المتاح لموزعه بالتساوي الغراء. ضع الركيزة الزجاج على اﻷكريليك والسماح للغراء استخدام وزن الزجاج إلى أنه عقد في مكان جاف.
- معطف الزجاج مكشوفة مع 100 ميليلتر من PDMS استخدام ماصة تشريد إيجابية؛ ثم إدراج الطبقة الأساس المغطى تدور فراغ وتعيينها إلى 1500 دورة في الدقيقة لمدة 2 دقيقة بالتساوي معطف الزجاج مع فيلم PDMS حوالي 10-ميكرومتر سميكة.
- إزالة الطبقة الأساس من المغطى تدور ومسح بعيداً بعناية أي PDMS الزائدة التي المغلفة اﻷكريليك مع منشفة الأسيتون والورق. احرص على عدم تعكير PDMS أونكوريد.
- خبز الطبقة الأساس مع PDMS في فرن عند 65 درجة مئوية ح 2 لعلاج في PDMS.
- "الماصة؛" 1 مل PDMS إلى شريحة زجاج، وثم استخدم شريحة زجاجية أخرى إلى موزعة بالتساوي PDMS حتى يبدأ بطين من الجانبين. علاج هذا على لوحة الساخن عند 150 درجة مئوية لمدة 10 دقائق.
- قطع PDMS شُفي إلى مستطيل مع نفس الأبعاد كما الجهاز MY133 V2000، وثم باستخدام طبقة اﻷكريليك منتصف كالعفن، لكمه ثقوب للخزان وقطع ساحة عرض نافذة في PDMS جعل طوقا PDMS.
- ضع MY133-V2000 والجانب قناة تصل، على نفسه أو الركازة شقة مماثلة كما تستخدم لعلاج البلازما PDMS في خطوة 1.2.5. ضع الطبقة الأساس اﻷكريليك المحتوية على الركازة PDMS شُفي جنبا إلى جنب مع قناة MY133-V2000 في البلازما2 س النظيف. تعيين الضغط فراغ إلى 200 متورر والترددات اللاسلكية المستوى المرتفع وعلاج سطح الركازة القناة والزجاج لمدة 30 ثانية.
- استخدام الملقط، فورا مكان القناة MY133-V2000 الجانبية إلى أسفل في انقطاع مستطيلة من اﻷكريليك طبقة الأساس مثل MY133-V2000 PDMS في جهات الاتصال.
- وضع طوقا PDMS على رأس الجهاز MY133-V2000، يصطفون الثقوب في طوقا مع الخزانات في الجهاز.
- مكان الجهاز لم تنته على منصة مرتفعة أعلاه على مقاعد البدلاء لتوفير سطح لقط للجمعية الجهاز.
- استخراج 3 مل من اﻷكريليك الأسمنت استخدام المحاقن. توزيع ما يكفي الأسمنت اﻷكريليك فوق طبقة الأساس لتوفير طبقة رقيقة. جعل معطف حتى قدر الإمكان ولا تسمح تسرب المواد إلى القناة.
- ضع طبقة منتصف قطعة اﻷكريليك على رأس اﻷكريليك طبقة الأساس. تأكد من أن الثقوب خط مع خزانات قناة MY133-V2000.
- استخدام المشابك الصغيرة 3 عقد الطبقة الأساس وأواسط طبقة معا كمحكم ممكن لمدة 2 دقيقة بينما الأسمنت اﻷكريليك يصلب، السندات على قطعة اﻷكريليك معا. ضمان أن الخزانات عدم إعاقة أثناء هذه الخطوة منع الهواء من الوقوع تحت الجهاز MY133-V2000.
- إزالة الضغط من الجهاز والأسمنت اﻷكريليك على طبقة منتصف في أماكن الاتصال المتوقعة مع الطبقة العليا من اﻷكريليك.
- وضع الطبقة العليا من اﻷكريليك على قطعة منتصف طبقة من اﻷكريليك، ضمان أن الثقوب تتماشى مع الخزانات، والسماح لها بقية على مقاعد البدلاء لمدة 2 دقيقة في حين يجف الأسمنت اﻷكريليك.
3-اختبار واستخدام الجهاز MY133-V2000
-
تسرب اختبار
- اختبار الجهاز MY133-V2000 بإضافة 10 ميليلتر من صبغة الطعام أو المياه إلى واحدة من ثقوب الخزان لاختبار للالتصاق وتدفق.
- إدراج أنبوب (يبلغ قطرها 1/8 في خارجي) في الخزان وتوصيل الطرف الآخر إلى فخ فراغ. تحويل فراغ إلى سحب الصبغة أو المياه عبر القنوات إلى التأكد من أن يتم إنشاء جهاز ناجحة.
- الاختيار تحت مجهر للتحقق من وجود أي تسرب في القناة أو الخزان وملء الخزان مع الإيثانول، وتسمح الإيثانول للجلوس في درجة حرارة الغرفة لمدة 10 دقائق. وبعد ذلك، سحب الإيثانول من خلال استخدام الفراغ، لتنظيف صبغ أو المياه من القناة.
- رش القناة مع الإيثانول ووضعه في طبق البوليستيرين عقيمة. التفاف محكم مع بارافيلم وتخزينها في بيئة معقمة حتى المطلوبة.
ملاحظة: عند هذه النقطة، الجهاز يجب أن تعالج أسيبتيكالي منعا للتلوث. عندما تكون جاهزاً لاستخدام الجهاز، ينبغي تعقيم خارج الحاوية باستخدام الإيثانول وإحضارها إلى السلامة الأحيائية مجلس الوزراء قبل فتح الحاوية.
-
تصفيح MCF7 الخلايا في الجهاز MY133-V2000
- تنمو خلايا MCF7 على أطباق بيتري 10 سم في وسائل الإعلام كاملة تتألف من المتوسطة دولبيكو في الأساسية الحد الأدنى (دميم)، وتستكمل مع 10% مصل بقرى الجنين والبنسلين والستربتوميسين، الجلوتامين والأحماض الأمينية غير الأساسية، في حاضنة ثقافة خلية أن يحافظ على جو رطبة التي تحتوي على أول أكسيد الكربون 5%2 و % 20 س2 عند درجة حرارة 37 درجة مئوية. تنمو الخلايا إلى ما يقرب من 80% التقاء قبل البذر لهم في microchannel.
- أولاً، رذاذ الطبق البوليسترين يتضمن microchannel مع الإيثانول 70%. ثم جعله في مجلس الوزراء قبل إزالة بارافيلم حماية القناة من البيئة المحيطة المختبر السلامة الأحيائية.
- شل فيبرونيكتين المستمدة من البلازما البشرية على سطح microchannel باذابته في الفوسفات مخزنة المالحة دولبيكو (دببس) إلى 10 ميكروغرام/مل. ثم ضخ 20 ميليلتر لهذا الحل في القناة واحتضان أنه في 20 درجة مئوية لمدة 45 دقيقة.
- أغسل الحل فيبرونيكتين الخروج من القناة بالحقن ميليلتر 20 خلية ثقافة وسائل الإعلام في القناة، ويسمح لها باحتضان في 20 درجة مئوية لمدة 10 دقائق.
- تغسل الخلايا مع 10 مل دببس، وتريبسينيزي الخلايا بإضافة 1 مل التربسين 1 x. احتضان الخلايا في 37 درجة مئوية للحد الأدنى 7 تحييد التربسين مع مل 9 وسائط كاملة.
- حقن 20 ميليلتر من الخلايا في القناة واحتضانها لهم في 37 درجة مئوية لمدة 45-120 دقيقة للسماح للمرفق إلى الركازة قبل التصوير.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
ويصف هذا البروتوكول تلفيق MY133-V2000، بوليمر مفلورة مع إنكسار منخفض مطابقة للمياه. من سمات رئيسية لهذا البروتوكول هو كيفية التغلب على عدم التصاق التي من سمات البوليمرات المفلورة باستخدام البلازما الأوكسجين واختلاق الجهاز داخل حائز اكريليك تزويد قوة إضافية الميكانيكية اللازمة لإغلاق القناة ضد الركازة PDMS (الشكل 1). الانكسار المنخفض للجهاز النهائي يظهر بوضوح في نطاق عيانية (الشكل 2). حواف قناة المصنوعة من هذه المواد يتم رؤيتها بوضوح في الهواء (الشكل 2ألف) ولكن يصبح من الصعب تمييز عندما مغمورة بالمياه (الشكل 2ب) نظراً لتطابق وثيق في الانكسار. وهذا يوفر فحص سريع للخصائص البصرية للمواد بعد التصنيع. ويبين الشكل 2ج، حيث يمكن رؤية microchannel MY133-V2000 مغلفة بالاكريليك الذي يوفر القوة الميكانيكية إضافية المطلوبة لختم microchannel جهاز أنجزت بنجاح. جهاز ناجحة ينبغي إظهار التصاق جيدة (خالية من فقاعات الهواء) بين الجهاز والركيزة. وجود فقاعة هواء في مركز قناة الجهاز تشير إلى أن الهواء لم يسمح للهروب من خلال الترابط، على الأرجح بسبب انسداد من الخزانات عند الأسمنت اﻷكريليك مجموعات. كما يبين هذا الجهاز طبقات اﻷكريليك/الزجاج التقيد بها جيدا مع الركوع الحد الأدنى من الركازة الزجاج. يمكن معالجة المشاكل في هذا المجال أما نشر لاصقة بين طبقات اﻷكريليك والزجاج بشكل متساو أو بتقليل سمك الجهاز موائع جزيئية لمنع الإجهاد على الحامل. وأخيراً، الخزانات في جميع الأفرقة الثلاثة تظهر حواف واضحة، مع لا فجوات الهواء عند الحواف. هذا هو آخر منطقة المشكلة المحتملة لالتصاق الجهاز-الركيزة التي يتم حلها باستخدام قالب الجهاز مع منافذ التروية في بني.
على المستوى المجهري، يتم إدخال التحف قليلة، أن وجدت، بسبب إزالة التغليف مرحلة ما يناسبها من الانكسار في microchannel ووسائل الإعلام ثقافة الخلية. وهذا يدل على أن كتلة الخلايا يمكن قياسها كمياً تحديداً حتى محيط جدران القناة (الشكل 3). مجتمعة، هذه النتائج تظهر، على نطاق عيانية وعلى نطاق مجهرية، مزايا استخدام بوليمر مفلورة لمطابقة مؤشرات الانكسار بين مواد تصنيع microchannel إلى الخلية مائي ثقافة وسائل الإعلام.
الشكل 1 : سير عمل الطباعة الحجرية الناعمة MY133-V2000. (أ) بعد ملء القالب مع MY133-V2000، يتم ضغط غضروف استخدام شريحة زجاجية لإنشاء شقة السطحية وعلاجه في فرن الأشعة فوق البنفسجية. علما أن ارتفاع سلبية الخزانات يماثل ارتفاع القالب لإنشاء الخزانات العميقة 3 مم في القطر. (ب) بعد قطع اﻷكريليك، التصاق الطبقة السفلي اﻷكريليك ساترة زجاجية قبل طلاء تدور مع PDMS. أعلى طبقتين اﻷكريليك هي مغلفة معا باستخدام الأسمنت اﻷكريليك. (ج) MY133-V2000 شُفي الجهاز (قناة الجانب الأعلى) ساترة السطح-تعامل واستخدام البلازما2 س. (د) وأخيراً، يتم تجميع الجهاز بالالتزام الجانبين المعالجة السطحية للجهاز وساترة معا. طوقا PDMS ثم يوضع على رأس الجهاز MY133-V2000 ومرفقه اﻷكريليك استخدام الأسمنت اﻷكريليك، مع الثقوب طوقا PDMS ومنتصف الطبقة من اﻷكريليك يصطفون مع الخزانات. الجهاز تجميعها ثم فرضت باليد لمدة 2 دقيقة حتى يجف الأسمنت اﻷكريليك. (ﻫ) عرض للجهاز يوضح كيف يتم تجميع الجهاز. (و) الرسم يظهر المقطع العرضي عن طريق microchannel الجهاز الانتهاء. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
الشكل 2 : صور للانتهاء من الأجهزة MY133-V2000. (أ) حواف الجهاز MY133-V2000 مرئية مميزة في الهواء. (ب) عند المغمورة بالمياه، تختفي حواف نفس الجهاز MY133-V2000 بسبب تطابق وثيق في الانكسار. (ج) هذه الصورة يظهر جهاز انتهاء مع حائز اكريليك. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
الشكل 3 : يمكن قياس كتلة الخلية تحديداً قرب هياكل microchannel. إظهار قياسات الكتلة الخلية من الخلايا MCF7 طازجة المبذورة في microchannel MY133 V2000 لا القطع الأثرية بسبب التفاف المرحلة قرب (أ و ب) الجدار أو (ج) مركز القناة. يتم تجنب هذه التحف في قناة MY133-V2000 بسبب الانكسار عن كثب مطابقة المواد القناة ووسائل الإعلام ثقافة الخلية. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
يمكن استخدامها كبديل لمواد تصنيع الطباعة الحجرية الناعمة التقليدية مثل PDMS MY133 V2000. العمل السابقة قد أظهرت أن المواد مع مؤشر إنكسار عالية، مثل PDMS، عرض القطع الأثرية الهامة قرب جدران القناة بسبب مؤشرات الانكسار mismatching بين مواد تصنيع ومحلول مائي داخل القناة 13-MY133-V2000 يتيح مطابقة الانكسار الجهاز موائع جزيئية للمحاليل التي يشيع استخدامها في التطبيقات الطبية الحيوية. وهذا يقلل التحف التصوير عند الجمع بين ميكروفلويديكس وتقنيات الفحص المجهري متقدمة، توفير ميزة واضحة على موائع جزيئية التقليدية مواد التصنيع. أمكن تخفيض قطعة أثرية في قنوات موائع جزيئية بهذه الأسفار يتيح النظام والمرحلة كمية مجهرية (الشكل 3) إشارات أكثر تحديداً كمياً وحتى بالقرب من microchannel هياكل13.
بوليمر مفلورة، المعارض MY133-V2000 عادة التصاق منخفضة بين هيكل القناة وغيرها من المواد، ومن ثم إدخال قيداً كبيرا بالمقارنة مع مواد التصنيع التقليدية. للتغلب على هذا التحدي، تستخدم المعالجة السطحية كلا الكيميائية (س2 بلازما) بالإضافة إلى ضغط الميكانيكية التي تم إنشاؤها بواسطة الضغط على الجهاز وطوقا PDMS بين الركيزة وقطعة من اﻷكريليك. معامل مرونة أقل من PDMS (بالمقارنة مع MY133-V2000) ضروري لنقل القوة الميكانيكية من اﻷكريليك الجهاز MY133-V2000، لأنها تشوه ما يكفي تكون مضغوطة، مما يسمح لها بعقد في microchannel في المكان في حين في نفس الوقت إبقائها مختومة ضد الركازة.
يمكن واجهت نقطتان هامتان للفشل عند تلفيق ميكروتشانيلس باستخدام هذا الأسلوب، وينبغي أن يكون لاحظت عندما استكشاف الأخطاء وإصلاحها. هذه هي تسرب من الخزان بسبب الخبث الزائدة والتسرب من مركز القناة فيها القوة من الضغط الميكانيكي على الأقل. منعت حتى كمية صغيرة من الخبث من اللكم الثقوب للخزانات الخزان من الانضمام إلى الركيزة بشكل صحيح. لمنع تسرب من الخزان، السلبية microchannel يحتوي على أعمدة صغيرة، 3 مم في القطر، والتي تتشابه في الارتفاع كالعفن، حتى أنه يمكن أن يلقي الخزانات كجزء من microchannel دون الحاجة إلى استخدام أداة لكمه ثقوب للخزانات. اللكم الثقوب للخزانات بعد علاج ينشئ الخبث التي يجب أن تكون جرفت دون إلحاق الضرر بالقناة (الشكل 1أ). وهذا يصعب تحقيقه في الواقع العملي. لمنع تسرب من مركز القناة، المهم لا لتغطية الخزانات خلال الجمعية بغية السماح للهواء للهروب من أسفل الجهاز. إذا كان يتم عرقلة الخزانات عند الالتصاق الجهاز معا، الهواء تحت الجهاز غير قادر على الهرب، إنشاء حيز للسائل يتسرب خارج القناة.
ولذلك، يقدم هذا البروتوكول، طريقة لتحسين الالتصاق عن طريق المعالجة السطحية وتركيب الجهاز في حائز اكريليك، التخفيف من الآثار السلبية الفلورة على خصائص البوليمر لاصقة. الأجهزة التي كانت مملوءة بسائل والمحتضنة لمدة تصل إلى 24 ساعة، مما يدل على أن الجهاز لا يزال وظيفية لمدة تجربة التصوير نموذجية. MY133-V2000، كمادة تصنيع جهاز موائع جزيئية، يمكن أن تكون جنبا إلى جنب مع كناية لقياس الكتلة الحيوية في الخلية. سابقا، قد تبين كناية لقياس نمو الخلايا الحية بدقة أكبر من النهج التقليدية17. استخدام كناية، يمكن قياس استجابة المخدرات خلية يعيش مع القرار خلية واحدة11،،من1819. عندما يتم دمجها مع MY133-V2000، يمكن مثقف خلايا في قناة على الأقل 1 د، تمكين معدل نمو الخلايا لتحديد دقة. الجمع بين مزايا ميكروفلويديكس وكناية يسمح لقياس النمو والعيش المخدرات استجابات الخلايا تحت ظروف خاضعة للرقابة.
التطبيقات المستقبلية لهذه التقنية تشمل إدماج موائع جزيئية أكثر تقدما وتجارب كمية مجهرية. مرونة MY133 V200013 متوافق مع تقنيات متقدمة موائع جزيئية مثل حديد التسليح، كذلك تمكين تلفيق هندستها المعقدة وتصاميم تجريبية. وتبين النتائج المعروضة هنا استخدام هذه المواد لإجراء القياسات الكمية باستخدام كناية. وينبغي أيضا متوافقة مع تقنيات الفحص المجهري الكمية الأخرى، مثل فرستير الرنين الطاقة نقل أو الأسفار مجهرية عمر MY133-V2000. كما يسمح هذا النهج للجهاز لتركيبها على ومختومة ضد الركازة PDMS، تمكين تصاميم تجريبية متقدمة مثل تغليف fluorophores في الركازة. عموما، MY133-V2000 يقلل من القطع الأثرية عند إجراء القياسات الكمية في المحاليل في ميكروتشانيلس، يجعلها مادة مثالية لتلفيق القنوات موائع جزيئية لإجراء قياسات عالية الدقة الطبية الحيوية.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
الكتاب ليس لها علاقة بالكشف عن.
Acknowledgments
وأيد هذا العمل جامعة يوتا مكتب نائب الرئيس للبحوث، وكذلك الأموال بالتزامن مع منح CA042014 P30 منح معهد السرطان هنتسمان والبرنامج CRR هنتسمان معهد السرطان.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| MY133-V2000 | MY Polymers | MY133-V2000 | |
| Sylgard 184 | Ellsworth Adhesives | 184 SIL ELAST KIT 0.5KG | |
| Fisher Premium microscope slides | Fisher Scientific | 12-544-4 | |
| .118"(3.0mm) x 12" x 12" Acrylic Sheet | United States Plastic Corp | 44290 | |
| .060"(1.5mm) x 12" x 12" Acrylic Sheet | United States Plastic Corp | 44200 | |
| SCIGRIP 3 Very Fast Set Acrylic Cement | United States Plastic Corp | 45735 | |
| Standard Aluminum Foil (.6 mm thick) | VWR | 89107-726 | |
| Kim Wipes | Fisher Scientific | 06-666 | |
| Insta-Cure+ Super Glue | Bob Smith Industries | BSI-109 | |
| 1/8" PVC tubing | McMaster Carr | 5231K55 | |
| McCormick Food Coloring | Target | 13353207 | |
| X-Acto #1 Precision Knife | X-Acto | X3201 | |
| X-Acto #18 Heavyweight wood chiseling blade | X-Acto | X218 | |
| VWR Razor Blades | VWR | 55411-055 | |
| Surface Treated Cell Culture Dishes | Fisher Scientific | FBO12922 | |
| Fibronectin Human Plasma | Sigma-Aldritch | F0895-1MG | |
| Trypsin-EDTA 10x | Fisher Scientific | 15-400-054 | |
| Corning Dulbecco's Phosphate Buffered Saline | Fisher Scientific | MT21030CM | |
| Gibco Penicillin-Streptomycin | Fisher Scientific | 15-140-148 | |
| HyClone Nonessential Amino Acids 100x | Fisher Scientific | SH3023801 | |
| Fetal Bovine Serum | Omega Scientific | FB-12 | |
| Corning DMEM with L-glutamine and glucose | Fisher Scientific | MT10013CV | |
| Trichloro(1H,1H,2H,2H-perfluorooctyl)silane | Sigma-Aldritch | 448931 | Reacts violently with water |
| Ethanol, 200 proof Decon Labs | Fisher Scientific | 04-355-223 | |
| Acetone | Fisher Scientific | A18P-4 | |
| Bel-Art 42025 Plastic Dessicator | Cole-Parmer | EW-06514-30 | |
| Epilog Fusion Laser Cutter, 120 W | Epilog Laser | Epilog Fusion M2 32 Laser | |
| Isotemp Stirring Hotplate | Fisher Scientific | SP88850200 | |
| Ateco 14111 1.5 inch stainless steel cutter | Ateco | 14111 | |
| Pyrex Glass Cell Culture Dish | Fisher Scientific | 08-747B | |
| Radio Frequency Plasma Cleaner | Harrick Plasma | PDC-32G | Used with Oxygen gas |
| Black Hole Laboratories Digivac | Black Hole Laboratories | Model 215 | |
| Intelli-Ray Ultraviolet Oven | Uvitron | UVO338 | |
| Compact Spin Coater | MTI Corporation | VTC-100A | |
| Fisher Brand Isotemp Oven | Fisher Scientific | 15-103-0510 | Forced Air Convection |
| Gilson Positive Displacement Pipette P1000 | Fisher Scientific | FD10006G | |
| HeraCell VIOS 160i | Fisher Scientific | 13 998 212PM |
References
- Zare, R. N., Kim, S. Microfluidic platforms for single-cell analysis. Annual Review Biomedical Engineering. 12, 187-201 (2010).
- Neuzi, P., Giselbrecht, S., Lange, K., Huang, T. J., Manz, A. Revisiting lab-on-a-chip technology for drug discovery. Nature Reviews Drug Discovery. 11 (8), 620-632 (2012).
- Xu, W., et al. Cell stiffness is a biomarker of the metastatic potential of ovarian cancer cells. PLoS ONE. 7 (10), 46609 (2012).
- Karakas, H. E., et al. A microfluidic chip for screening individual cancer cells via eavesdropping on autophagy-inducing crosstalk in the stroma niche. Scientific Reports. 7 (1), 2050 (2017).
- DeBerardinis, R. J., Lum, J. J., Hatzivassiliou, G., Thompson, C. B. The biology of cancer: metabolic reprogramming fuels cell growth and proliferation. Cell Metabolism. 7 (1), 11-20 (2008).
- Yin, H., Marshall, D. Microfluidics for single cell analysis. Current Opinion in Biotechnology. 23 (1), 110-119 (2012).
- Kemper, B., et al. Monitoring of laser micromanipulated optically trapped cells by digital holographic microscopy. Journal of Biophotonics. 3 (7), 425-431 (2010).
- Barer, R. Interference micorscopy and mass determination. Nature. 169 (4296), 366-367 (1952).
- Zangle, T. A., Teitell, M. A. Live-cell mass profiling: an emerging approach in quantitative biophysics. Nature Methods. 11 (12), 1221-1228 (2014).
- Chun, J., et al. Rapidly quantifying drug sensitivity of dispersed and clumped breast cancer cells by mass profiling. Analyst. 137 (23), 5495-5498 (2012).
- Reed, J., et al. Live cell interferometry reveals cellular dynamism during force propagation. Acs Nano. 2 (5), 841-846 (2011).
- Eldridge, W. J., Steelman, Z. A., Loomis, B., Wax, A. Optical Phase Measurements of Disorder Strength Link Microstructure to Cell Stiffness. Biophysical Journal. 112 (4), 692-702 (2017).
- Kim, D. N. H., Kim, K. T., Kim, C., Teitell, M. A., Zangle, T. A. Soft lithography fabrication of index-matched microfluidic devices for reducing artifacts in fluorescence and quantitative phase imaging. Microfluidics and Nanofluidics. 22 (1), 11 (2018).
- Byron, M. L., Variano, E. A. Refractive-index-matched hydrogel materials for measuring flow-structure interactions. Experiments in Fluids. 54 (2), 6 (2013).
- Ogawa, T., Hanada, Y. Microfabrication of the UV transparent polymer CYTOP using a conventional pulsed green laser. Applied Physics a-Materials Science & Processing. 122 (3), 6 (2016).
- Hanada, Y., Ogawa, T., Koike, K., Sugioka, K. Making the invisible visible: a microfluidic chip using a low refractive index polymer. Lab on a Chip. 16 (13), 2481-2486 (2016).
- Zangle, T. A., Burnes, D., Mathis, C., Witte, O. N., Teitell, M. A. Quantifying biomass changes of single CD8+ T cells during antigen specific cytotoxicity. PLoS One. 8 (7), 68916 (2013).
- Huang, D., et al. High Speed Live Cell Interferometry: A New Method for Rapidly Quantifying Tumor Drug Resistance and Heterogeneity. Analytical Chemistry. 90 (5), 3299-3306 (2018).
- Mir, M., Bergamaschi, A., Katzenellenbogen, B. S., Popescu, G. Highly sensitive quantitative imaging for monitoring single cancer cell growth kinetics and drug response. PLoS ONE. 9 (2), 89000 (2014).
