Summary
פרוטוקול זה מתאר את הזיוף של התקנים microfluidic מ- MY133-V2000 כדי לסלק חפצים שעולות לעתים קרובות microchannels עקב המדדים השבירה המאולתר בין מבנים microchannel של תמיסה מימית. פרוטוקול זה משתמש של מחזיק אקרילי כדי לדחוס את המכשיר שעברו אנקפסולציה, שיפור הדבקות הן מבחינה כימית והן מבחינה מכנית.
Abstract
השימוש בהתקנים microfluidic התפתחה ככלי המעצב ביו יישומים. בשילוב עם טכניקות במיקרוסקופ מודרני, התקנים אלה ניתן ליישם כחלק פלטפורמה חזקה מסוגל לבצע מדידות משלימות בו זמנית. האתגר העיקרי נוצר על ידי השילוב של שתי טכניקות אלה הוא ההתאמה של שבירה בין החומרים אשר השתמשו בהם באופן מסורתי כדי להפוך התקנים microfluidic הפתרונות מימית המשמש בדרך כלל וההתערבות. חוסר ההתאמה הזה יכול ליצור חפצים אופטי סמוך לקצות ערוץ או התקן. פתרון אחד הוא כדי להפחית את מקדם שבירה של חומר המשמש לפברק את המכשיר באמצעות פולימר fluorinated כגון MY133-V2000 השבירה שלו דומה לזו של מים (n = 1.33). כאן, הבנייה של מכשיר microfluidic עשוי MY133-V2000 באמצעות טכניקות הדפס אבן רכה זה הפגינו, באמצעות פלזמה2 O בשיתוף עם מחזיק אקרילי כדי להגדיל את הידבקות בין המכשיר MY133-V2000 המציא את המצע polydimethylsiloxane (PDMS). המכשיר לאחר מכן נבדק על ידי המקננת אותו, מלא תא מדיה תרבות במשך 24 שעות ביממה להפגין את היכולת של המכשיר כדי לשמור על תנאים התרבות התא במהלך ניסוי הדמיה טיפוסי. לבסוף, מיקרוסקופיה שלב כמותית (אולאנזפין) משמש כדי למדוד את התפלגות מסה בתוך התאים חסיד חי microchannel. בדרך זו, דיוק מוגבר, מופעל על-ידי בדיית על המכשיר פולימר אינדקס השבירה נמוך כגון MY133-V2000 במקום בחומרים מסורתיים ליתוגרפיה רך כגון PDMS, הוא הפגין. באופן כללי, גישה זו עבור בדיית microfluidic התקנים שניתן בקלות לשלב בתהליכי עבודה קיימים ליתוגרפיה רך על מנת להפחית לכלוכים אופטי, להגביר את הדיוק מדידה.
Introduction
התפתחות הטכנולוגיה microfluidic אפשרה מגוון רחב של טכניקות חדשות ביו המנצלים את פיזיקה ייחודי של תזרימי מיקרוסקופיים בקנה מידה1,2. זה כולל את טכניקות אבחון בנוי על פלטפורמות microfluidic אשר לכמת הרלוונטית קלינית סמנים ביולוגיים, לרבות תא נוקשות3, סמני פני שטח4הצמיחה5. על-ידי מניפולציה תאים בודדים, התקנים microfluidic יכול לשמש גם כדי למדוד את סמן הטרוגניות, לדוגמה כמחוון של ממאירות6. ביכולת לשלב בין microfluidic יישומים עם מיקרוסקופ יש הגבירו את התועלת של פלטפורמות אלה על-ידי התרת התקנים המודדים סמנים ביולוגיים מרובים בו זמנית7.
אולאנזפין היא טכניקה מיקרוסקופית המודד את המופע. ההתחלתי, כאשר אור עובר דרך אינטראקציה עם החומר בתוך דגימות שקוף. ניתן לחשב את המסה של תאים בודדים מתוך מדידות אולאנזפין, באמצעות הקשר הידוע בין מקדם שבירה של ביומסה צפיפות8,9. עבודה קודמים הראו כי אולאנזפין הוא מסוגל מדידת פרמטרים הרלוונטית קלינית כגון תא הצמיחה10,11 ו תא תכונות מכניות דרך ההפרעה כוח12. בשילוב עם מיקרופלואידיקה, אולאנזפין פוטנציאלי ניתן למדוד בהתנהגות התא הסביבה מבוקרת מאוד במבחנה. אחד האתגרים העיקריים שילוב אולאנזפין עם מיקרופלואידיקה הוא השבירה הגבוה במדד של פולימרים רוב נעשה שימוש כדי לבנות את ערוצי microfluidic באמצעות הדפס אבן רכה13.
מהווה אתגר חשוב מול השילוב של מיקרופלואידיקה עם טכניקות שונות של מיקרוסקופ הוא ההתאמה בין מקדם שבירה של החומר המכשיר יחסית מקדם שבירה של מים14,15. שיטה אחת לכתובת זו היא באמצעות פולימר מקדם שבירה נמוך כגון CYTOP16 או MY133-V200013. האחרון הוא fluorinated אולטרה סגול (UV)-פולימר אקרילט לריפוי זה בעל אינדקס השבירה דומה למים (n = 1.33) וזה תואם עם טכניקות הדפס אבן רכה, המאפשר שילוב חלקה לתוך microfluidic הוקמה רבים זרימות עבודה ייצור המכשיר. זה גורם MY133-V2000 מתאים לא רק ייצור ההתקן microfluidic, אך גם מאפשר לו בקלות לשלב עם אולאנזפין וגישות אחרות מיקרוסקופ, למדוד בהתנהגות התא-המושבה והן בקנה מידה תא בודד. MY133-V2000 מבטלת חפצים עקב שלב הסרת העטיפה על ידי ייצור ההתחלתי קצת, אם בכלל, כמו אור שעובר דרך הממשק מים-MY133.
למרות ביטול של התאמה שבירה, אחד האתגרים הגדולים הקשורים עם המכשירים מפוברק של פולימרים fluorinated, כגון MY133-V2000, הוא הדבקות חומרים אחרים כגון זכוכית או PDMS נמוכה. העבודה הנוכחית ממחישה את ייצור של מכשיר microfluidic MY133-V2000 באמצעות הדפס אבן רכה. שימוש פלזמה2 O לטיפול השטח של הערוץ והן את PDMS המצע בשילוב עם מחזיק אקרילי אישית מפוברק מבטיח כי המכשיר דבקה המצע, יצירת ערוץ אטום. מכשיר זה הינו מתאים תרבית תאים, אולאנזפין כדי למדוד את המסה של התאים לערוץ שבו יש יישומים חשובים מודדים את הצמיחה של תאים חיים, התעבורה תאיים של ביומסה התא, אשר שניהם יש הרלוונטיות הקלינית אבחון גילוי תרופות וסמים.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. ייצור של התשליל Polydimethylsiloxane
-
הכנת polydimethylsiloxane
- מידה 18 גרם של אלסטומר סיליקון PDMS ו- 1.8 g מהתרכובת ריפוי. שופכים הכימית ריפוי לתוך סירה מדידה המכילה את elastomer.
- לערבב את elastomer הכימית ריפוי נמרצות במשך 1 דקה ולשים את התערובת לתוך תא ואקום למשך 30 דקות.
- הסר את PDMS של שואב האבק, למזוג 15 גרם על גבי התשליל באמצעות חותכן עוגיות (radius = 3.8 ס מ) כדי למנוע את PDMS פועל בצד ולכסות את התערובת PDMS הנותרים.
- לשים את התבנית המכילה את PDMS אל החדר ואקום למשך 10 דקות.
- להסיר את התבנית המכילה את PDMS מן החדר ואקום, להניחה על פלטה חמה מוגדר כ- 150 מעלות צלזיוס למשך 60 דקות לרפא, לכסות אותו ברדיד אלומיניום.
- לשפוך PDMS שנותרו על גבי זכוכית הפוכה צלחת פטרי (10 ס מ קוטר), באמצעות חותכן עוגיות אחר כתבנית, כדי ליצור משטח של PDMS. את זה אל החדר ואקום עד השלילי PDMS נרפאה לחלוטין.
- להעביר את צלחת פטרי עם PDMS הוואקום הכיריים preheated לרפא ב 150 מעלות צלזיוס למשך 60 דקות.
-
פלזמה טיפול פני שטח של polydimethylsiloxane
- הכנס סכין גילוח חד מתחת את PDMS, החותך את העוגיה בזהירות להסיר את PDMS השלילי.
- להשתמש בסכין חדה תחביב כדי לגזור את השלילי של היצירה גדול יותר של PDMS; זה צריך להיות חתוך עם מספיק שטח מאגר לצרף עוד חתיכה של PDMS על גבי זה ללא הפרעה את השלילי.
- הכנס סכין גילוח חד מתחת PDMS נרפא עם השליליות בזהירות להסיר את PDMS צלחת פטרי.
- השתמש לחתוך סכין תחביב לחתוך חתיכה של PDMS מהמקלדת הוא באותו גודל כמו החלק השלילי. לאחר מכן, חותכים מלבן מתוך היצירה החדשה של PDMS עם מספיק מקום להתאים את זה מסביב microchannel כאשר מניחים אותה על גבי התשליל.
- שים את שני החלקים של PDMS (את השלילי, את המלבן) על גבי מצע שטוח (כגון שקופית עשוי זכוכית, קוורץ, פוליסטירן או חומר אחר) ולהוסיפם בפלזמה בתדר רדיו (RF) מנקה. . סגור את הדלת ויסגור את התא ע י פינוי האוויר באמצעות משאבה ואקום. הכנסת האוויר תלוי בלחץ של 400 mTorr באמצעות בקר לחץ ואקום דיגיטלי.
הערה: אם המצע המשמש לניקוי פלזמה לא נעשה שימוש ב הפלזמה מנקה, להכניס את זה הפלזמה מנקה מעצמו 60 s לפני בטיפול השליליות, על מנת למנוע את שכבת בסיס אקרילי נדבקות המצע. - להפוך את ההגדרה RF גבוהה, מסך פלזמה אוויר ורוד אמור להופיע בחלון הצפייה. פלזמה-פינוק שתי חתיכות של PDMS ל 30 s, ואז לבטל את הגדרת RF. לאפשר לאוויר להתחיל לאט לאט החדר על מנת למנוע זרימת האוויר הסוער מטריד את התוכן של התא.
- להסיר את PDMS הפלזמה מנקה ומניחים אותו על benchtop. . אז, בזהירות להפוך את המלבן PDMS מעל השלילי ולחץ כלפי מטה עם זוג מלקחיים. תן לזה לנוח 10 דקות לאפשר שתי חתיכות של PDMS לדבוק אחד בשני.
-
טיפול פני שטח Fluorosilane polydimethylsiloxane שלילית
- שימוש טפטפת לשים 2 טיפות טריכלורו (1H 1H, 2H, 2H-perfluoro-תמצית) silane (PFOTS) לתוך קטן שוקל הסירה והוספתו לתוך תא ואקום זכוכית.
- להפוך את PDMS על גבי פיסת נייר אלומיניום (כך השלילי microchannel פונה כלפי מעלה) והכניס אותו לתוך תא ואקום זכוכית. לאחר מכן, לפנות את החדר באופן רציף במשך 24 שעות ביממה.
2. ייצור של Microchannel MY133
-
הקמת המבנה microchannel MY133-V2000
- למלא את PDMS שלילי עם 400 µL של MY133-V2000.
הערה: השלילי חייב להיות מעט יתר על המידה. - מניחים את PDMS MY133-V2000-מילוי שלילי אל החדר ואקום במשך שעתיים להסיר את כל הבועות.
- הסר MY133-V2000 של שואב האבק והקש לאט שקופית מזכוכית נגד העליון של השלילי מעט יתר על המידה כדי ליצור משטח שטוח של MY133-V2000 וכדי למנוע עיכוב פלמור של חמצן.
הערה: PDMS, על פני ערוץ, חלקית לעכב את פלמור, הפעלת מליטה בשלבים יותר. השקופית זכוכית יש שקיפות UV מופחת מעט (35%) לעומת קוורץ, אשר מסייעת למנוע כל הצהבה של המכשיר נרפא. - הכנס MY133-V2000 לתוך תנור W UV 400 והגדר את קרינת UV 50% העוצמה המקסימלית 300 s כדי לרפא את microchannel MY133-V2000.
הערה: אורך הגל שיא להשתמש כדי לרפא את המכשיר הוא כ 375 nm עם רוחב פס של 25 ננומטר. MJ/cm כ 4,5002 כוח שימשה לרפא את microchannel, אשר נמצא מעט יותר מהמינימום כפול אשפרה כוח המומלץ על ידי היצרן.
- למלא את PDMS שלילי עם 400 µL של MY133-V2000.
-
בניין בעל אקריליק
- ציור אקריליק שכבת הבסיס באמצעות תוכנת הציור וקטורית. ודא שכבת הבסיס היא מלבן זה 1.5 מ מ עבה, 75 מ מ רב, ועד 25 מ מ רחב, עם מלבן ממורכז המודד 25 מ"מ x 11 מ"מ.
- לצייר את שכבת אמצע אקריליק באמצעות וקטור תוכנת ציור. ודא שכבת אמצע מלבן (1.5 מ מ עבה, 75 מ מ וארוך 25 מ"מ) עם ריבוע ממורכז (5 מ מ x 5 מ מ), שני מעגלים (שניהם בקוטר של 3 מ מ) מופרדים על-ידי 15 מ מ.
- לצייר את השכבה העליונה אקריליק באמצעות וקטור תוכנת ציור. ודא שהשכבה העליונה היא מלבן (בעובי 3 מ מ, 30 מ מ וארוך 25 מ"מ) עם ריבוע ממורכז (5 מ מ x 5 מ מ), שני מעגלים (שניהם בקוטר של 3 מ מ) מופרדים על-ידי 15 מ מ.
- לגזור את העיצובים התקן שנוצר בתוכנת ציור וקטורי בחותך לייזר. השתמש בהגדרות מדגם של מהירות כוח, 30% 100%. הפעל את התוכנית פעמיים כדי להבטיח אקריליק היא לחתוך החוצה.
- הקש על החורים בשכבה העליונה אקריליק באמצעות כלי הקשה 0.80-מ מ גודל M5.
- נגב את חתיכות אקרילי עם אצטון כדי להסיר את כל סימני שיורית או כוויות.
-
מליטה של MY133-V2000 ב מחזיק אקרילי
- לצרף שכבת הבסיס של אקריליק המצע זכוכית באמצעות דבק, כגון דבק סופר דבק מגע. במקום שתי טיפות קטנות על הקצוות של אקריליק ולאחר מכן להשתמש כלי חד פעמיות להפיץ באופן שווה את הדבק. למקם את המצע זכוכית על גבי אקריליק ולאפשר את דבק יבש באמצעות המשקל של הזכוכית כדי להחזיקו במקום.
- המעיל הזכוכית חשופים עם 100 µL של PDMS באמצעות פיפטה של תזוזה חיובית; לאחר מכן, להוסיף שכבת הבסיס coater ספין ואקום ולהגדיר אותו 1,500 סל"ד למשך 2 דקות אחיד מעיל הזכוכית עם סרט PDMS כ 10-מיקרומטר עבה.
- הסרת שכבת הבסיס coater ספין, בזהירות לנגב כל PDMS עודף זה מצופה של אקריליק עם אצטון, נייר מגבת. להיזהר שלא להפריע את PDMS משומרים.
- אופים את שכבת הבסיס עם PDMS בתנור ב 65 מעלות צלזיוס במשך שעתיים כדי לרפא את PDMS.
- פיפטה 1 מ"ל של PDMS על זכוכית ולהשתמש, לאחר מכן, עוד שקופיות זכוכית להפיץ באופן שווה את PDMS עד שזה יתחיל לזלוג החוצה הצדדים. . לרפא את זה על פלטה חמה ב 150 מעלות צלזיוס למשך 10 דקות.
- חותכים את PDMS נרפא מלבן עם אותן מידות כמו המכשיר MY133-V2000 ואז, באמצעות השכבה אמצע של אקריליק כתבנית, מנקבים חורים עבור המאגר גזור ריבוע הצגת החלון PDMS כדי להפוך את האטם PDMS.
- הנח את MY133-V2000, לצד ערוץ למעלה, זהה או מצע שטוח דומים המשמשים לטיפול פלזמה-PDMS שלב 1.2.5. מניחים שכבת הבסיס אקרילי המכיל את המצע PDMS נרפא לצד ערוץ MY133-V2000 ב פלזמה2 O מנקה. הגדר את הלחץ ואקום 200 mTorr ו- RF ברמה גבוהה ולהתייחס השטח-המצע ערוץ וזכוכית ב-30 s.
- באמצעות מלקחיים, מיד להניח את ערוץ MY133-V2000 לצד השני ב אזור החיתוך מלבני של אקריליק שכבת הבסיס כגון MY133-V2000 אנשי קשר PDMS.
- מקם את האטם PDMS על גבי המכשיר MY133-V2000, בתור החורים האטם עם המאגרים במכשיר.
- מניחים את המכשיר לא סגורים על גבי משטח מוגבה מעל הספסל כדי לספק משטח clamping להרכבה התקן.
- חילוץ 3 מ"ל של צמנט אקרילי באמצעות מזרק. להפיץ מספיק צמנט אקרילי על גבי שכבת הבסיס כדי לספק ציפוי דק. להפוך את המעיל כמו אפילו ככל האפשר ולא לתת את seep גשמי לתוך הערוץ.
- מניחים שכבת אמצע היצירה אקרילי על גבי אקריליק שכבת הבסיס. ודא כי החורים בשורה אחת עם המאגרים של הערוץ MY133-V2000.
- השתמש תופסנים קטנים 3 להחזיק את שכבת הבסיס, אמצע שכבת יחד כמו צמוד ככל האפשר למשך 2 דקות תוך צמנט אקרילי מתקשה להתחבר החלקים של אקריליק ביחד. ודא כי המאגרים הם לא כל כך הפריע במהלך שלב זה כדי למנוע אוויר מלהיות לכוד מתחת המכשיר MY133-V2000.
- להסיר את הלחץ של ההתקן ומקם צמנט אקרילי על שכבת אמצע במקומות של מגע הצפוי עם השכבה העליונה של אקריליק.
- מניחים שכבה עליונה של אקריליק על היצירה שכבת אמצע של אקריליק, המבטיח כי מיושרים החורים עם המאגרים, ולאפשר לנוח על הספסל למשך 2 דקות בזמן צמנט אקרילי מתייבש.
3. בדיקה ושימוש של המכשיר MY133-V2000
-
דליפה בדיקות
- לבדוק את המכשיר MY133-V2000 על-ידי הוספת 10 µL של המאכל או מים יונים באחד החורים מאגר לבדיקת אדהזיה של זרימה.
- הכנס צינור (בקוטר 1/8-ב החיצוני) לתוך המאגר וחבר את הקצה השני מלכודת ואקום. הפעל את ואקום כדי למשוך הצבע או את המים דרך ערוץ כדי לוודא כי מכשיר מוצלח נוצר.
- לבדוק תחת מיקרוסקופ כדי לוודא כי ישנן אין דליפות ערוץ או מאגר, מילוי המאגר עם אתנול, ולאפשר האתנול לשבת בטמפרטורת החדר למשך 10 דקות. לאחר מכן, משוך האתנול דרך באמצעות שואב האבק, לנקות את צבען או מים מן התעלה.
- לרסס את הערוץ עם אתנול והכניס אותו לתוך תבשיל פוליסטירן סטרילי. לעטוף את זה בחוזקה עם מצלמות-מיקרוסקופים ואחסן אותו בסביבה סטרילית עד שהוא נדרש.
הערה: בשלב זה, המכשיר להיות מטופלת גילוח ורחיצה כירורגית על מנת למנוע זיהום. כשתהיה מוכן להשתמש בהתקן, החלק החיצוני של המכולה צריכים לעקר באמצעות אתנול והביא לתוך ארון לפני פתיחת המכולה אבטחה.
-
ציפוי MCF7 בתאים המכשיר MY133-V2000
- לגדל תאים MCF7 על צלחות פטרי ס מ-10 בתקשורת מלאה המורכבת המינימום חיוני בינוני של Dulbecco (DMEM), בתוספת 10% סרום שור עוברית, פניצילין-סטרפטומיצין, גלוטמין ו חומצות אמינו שאינן הכרחיות, חממה תרבות תא זה שומר על אווירה לח המכיל 5% CO2 ו- 20% O2 בטמפרטורה של 37 ° C. לגדול התאים כ 80% הנהרות לפני זריעה אותם ב microchannel.
- ראשית, לרסס את המנה פוליסטירן המכיל את microchannel עם 70% אתנול. לאחר מכן, להתאים אותה אבטחה בארון לפני הסרת את מצלמות-מיקרוסקופים מגן על הערוץ מתוך סביבת מעבדה אמביינט.
- לשתק fibronectin האדם פלזמה-נגזר על פני השטח microchannel על ידי לדלל אותה ב- saline פוספט באגירה של Dulbecco (DPBS) µg 10/מ. לאחר מכן, להזריק µL 20 של פתרון זה לתוך התעלה, דגירה זה ב 20 מעלות צלזיוס למשך 45 דקות.
- לשטוף את הפתרון fibronectin התעלה על ידי שהזרקת 20 µL תא תרבות המדיה לתוך התעלה, ולאפשר לו דגירה ב 20 מעלות צלזיוס למשך 10 דקות.
- רוחצים את התאים עם 10 מ"ל של DPBS, את trypsinize בתאים על-ידי הוספת 1 מ"ל של טריפסין 1 x. דגירה התאים ב 37 מעלות צלזיוס במשך 7 דקות נטרול טריפסין 9 מ של התקשורת מלאה.
- מזריקים µL 20 של התאים לתוך התעלה, דגירה אותם ב 37 מעלות צלזיוס למשך 45-120 דקות לאפשר את הקובץ המצורף המצע לפני הדמיה.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
פרוטוקול זה מתאר את הזיוף של MY133-V2000, פולימר fluorinated עם שבירה נמוך ההתאמה של מים. תכונה מרכזית של פרוטוקול זה הוא כיצד להתגבר על היעדר אדהזיה היא מאפיין של פולימרים fluorinated באמצעות חמצן פלזמה ועל ידי בדיית המכשיר בתוך מחזיק אקרילי כדי לספק את כוח מכני נוסף נדרש כדי לסגור את הערוץ נגד המצע PDMS (איור 1). מקדם שבירה נמוך של המכשיר האחרון מוצג בבירור בסולם מאקרוסקופית (איור 2). הקצוות של ערוץ עשוי חומר זה נראים בבירור באוויר (איור 2א) אבל להיות קשה להבחין כשהוא שקוע בתוך המים (איור 2B) בשל ההתאמה קרוב ב שבירה. זה מספק בדיקה מהירה של המאפיינים אופטי של החומר לאחר פבריקציה נוספת. מכשיר שהסתיימו בהצלחה מוצג באיור 2C, שבו ניתן לראות את microchannel MY133-V2000 כמוס על ידי אקרילי המספק את כוח מכני נוסף נדרש כדי לאטום את microchannel. מכשיר מוצלח צריך להראות טוב אדהזיה (ללא בועות אוויר) בין ההתקן לבין המצע. הנוכחות של בועת אוויר במרכז התעלה התקן מציין כי האוויר היה אסור לברוח במהלך מליטה, ככל הנראה עקב חסימה של המאגרים כאשר אקריליק מלט סטים. מכשיר זה גם מראה היטב מודבקת אקריליק/זכוכית שכבות עם בואינג מינימלי של המצע זכוכית. בעיות בתחום זה ניתן לטפל על ידי הפצת הדבק בין שכבות הזכוכית לאקריליק באופן אחיד יותר או על-ידי הפחתת העובי של המכשיר microfluidic כדי למנוע לחץ על המחזיק. לבסוף, המאגרים של כל שלושת לוחות הצג קצוות ברורים, עם הפערים האוויר לא בקצוות. . זה אזור הבעיה פוטנציאלי אחר עבור אדהזיה התקן-המצע זה הוא חוסל על ידי השימוש של תבנית התקן עם יציאות זלוף שנבנה בשנת
בקנה מידה מיקרוסקופי, מוצגים חפצים מעטים, אם בכלל, עקב שלב הסרת העטיפה על ידי התאמת את מדדי השבירה של microchannel ואמצעי התקשורת התרבות תאים. זה מדגים כי ניתן לכמת במדויק המסה של התאים אפילו בקרבת הקירות ערוץ (איור 3). באופן קולקטיבי, אלה תוצאות הצג, שניהם בסולם מאקרוסקופית ו בקנה מידה מיקרוסקופי, יתרונות השימוש פולימר fluorinated כדי להתאים את מדדי השבירה בין חומר פבריקציה נוספת של microchannel התא מימית תרבות התקשורת.
איור 1 : MY133-V2000 ליתוגרפיה רך זרימת. (א) לאחר מילוי העובש עם MY133-V2000, אלך להביא את האלונקה נדחס באמצעות זכוכית כדי ליצור דירה משטח נרפא בתנור UV. שימו לב כי הגובה של התשליל של המאגרים להשוות גובה התבנית ליצירת ברזרבות עמוקות 3 מ מ קוטר. (B) לאחר חיתוך של אקריליק, השכבה התחתונה אקריליק מודבקים coverslip זכוכית לפני ספין-ציפוי זה עם PDMS. העליון שתי שכבות אקריליק הם למינציה יחד באמצעות צמנט אקרילי. (ג) MY133-V2000 נרפא המכשיר (צד ערוץ למעלה) ואת coverslip את פני השטח-מטופלים באמצעות פלזמה2 O. (ד) בסופו של דבר, המכשיר מורכב על-ידי שמירה בצדדים שטופלו השטח של המכשיר, coverslip יחד. האטם PDMS ואז מונחת על גבי המכשיר MY133-V2000 ואקריליק מחוברת באמצעות צמנט אקרילי, עם החורים של הן PDMS אטם את שכבת אמצע של אקריליק להתיישר עם המאגרים. המכשיר מורכב הוא ואז כשכרטיס ביד למשך 2 דקות עד צמנט אקרילי מתייבש. (E) תצוגה מורחבת של המכשיר מראה איך המכשיר מורכב. (F) של הציור מראה חתך הרוחב דרך microchannel של המכשיר סיים. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
איור 2 : תמונות של התקנים MY133-V2000 הושלמה. המחזיקים מעמד לזמן ארוך במובהק (א') הקצוות של המכשיר MY133-V2000 גלויים באוויר. (B) כאשר שקוע במים, הקצוות של אותו התקן MY133-V2000 נעלמים בגלל ההתאמה קרוב ב מדדי השבירה. (ג) התמונה הזאת מראה התקן סיים עם מחזיק אקרילי. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
איור 3 : תא בנפח גדול ניתן לכמת במדויק ליד מבנים microchannel. מדידות של המסה תא של MCF7 טרי הזריעה, בתאים microchannel MY133-V2000 הצג אין ממצאים עקב שלב גלישת ליד (A ו- B) בקיר או (ג) למרכז של הערוץ. לכלוכים אלה הם נמנעו בערוץ MY133-V2000 בגלל מדדי השבירה מקרוב מתאימים של החומר ערוץ ואמצעי התקשורת התרבות תאים. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
MY133-V2000 יכול לשמש כחלופה ליתוגרפיה רך מסורתי ייצור חומרים כגון PDMS. העבודות הקודמות הראו כי חומרים עם גבוהה אינדקס השבירה, כגון PDMS, להציג ממצאים משמעותיים ליד ערוץ חומות עקב השבירה של מדדי המאולתר בין החומר ייצור של תמיסה מימית בתוך הערוץ 13. MY133-V2000 מאפשרת התאמת את מקדם שבירה של המכשיר microfluidic הפתרונות מימית בשימוש נפוץ ביישומים הביו-רפואית. זה מפחית חפצים הדמיה בשעת שילוב מיקרופלואידיקה עם טכניקות מתקדמות מיקרוסקופ, מתן יתרון מובהק על פני microfluidic מסורתי ייצור חומרים. ההפחתה החפץ בערוצים microfluidic מתאפשרת על ידי קרינה פלואורסצנטית מאפשרת המערכת הזה שלב כמותיים מיקרוסקופ (איור 3) אותות כדי להיות מדויקת יותר לכמת, אפילו בסמיכות מבנים microchannel13.
כמו פולימר fluorinated, MY133-V2000 בדרך כלל מוצגים אדהזיה נמוך בין המבנה ערוץ וחומרים אחרים, ובכך היכרות עם מגבלה משמעותית בהשוואה חומרי ייצור מסורתיים. כדי להתגבר על האתגר הזה, משמשים שני פני שטח טיפול כימי (פלזמה2 O) בנוסף דחיסה מכני שנוצרו על-ידי לסחוט את המכשיר, את האטם PDMS בין המצע חתיכה של אקריליק. הנפח התחתון של PDMS (לעומת MY133-V2000) היא קריטית כדי העברת כוח מכני אקריליק המכשיר MY133-V2000, כי זה deformable מספיק כדי להיות דחוס, ולאפשר לו להחזיק את microchannel במקום בזמן במקביל מחזיקים. את זה אטום נגד המצע
שתי נקודות חשובות של כשל שניתן נתקל כאשר בדיית microchannels בשיטה זו ופתרון בעיות צריך להיות כאשר ציין. אלו הן דליפה מן המאגר בשל עודף סיגים נזילה מאזור המרכז של הערוץ שבו הכוח בדחיסה מכני הוא לכל הפחות. אפילו כמות קטנה של סיגים של ניקוב חורים המאגרים מנעו המאגר הקפדה על המצע כראוי. כדי למנוע דליפות מן המאגר, מכיל השלילי microchannel קטן עמודים, 3 מ מ קוטר, הדומים גובה כמו כייר, כך ניתן לצקת כחלק microchannel המאגרים מבלי להשתמש בכלי לתת אגרוף חורים המאגרים. ניקוב חורים מאגרים לאחר ריפוי יוצר סיגים. זה חייב להיות שטף ללא פגיעה בערוץ (איור 1א'). זה קשה להשיג בפועל. כדי למנוע דליפות מהמרכז של הערוץ, הוא היה קריטי לא כדי לכסות את המאגרים במהלך ההרכבה כדי לאפשר לאוויר לברוח מתחת המכשיר. אם המאגרים הם נחסמת בעת הדבקת יחד המכשיר, אוויר מתחת ההתקן אין אפשרות לברוח, יצירת מרחב עבור נוזלים לחלחל התעלה.
פרוטוקול זה, לכן, מציג שיטה לשיפור הדבקה דרך טיפול פני שטח והן מרכיבה את המכשיר במחזיק אקרילי, מקלים את ההשפעות השליליות של fluorination על מאפייני הפולימר דבק. המכשירים היו מלאות בנוזל, מודגרות עבור עד 24 שעות, הוכחת כי המכשיר נשאר פונקציונלי לתקופת ניסוי הדמיה טיפוסי. MY133-V2000, כחומר פבריקציה נוספת עבור התקן microfluidic, יכול להיות משולב עם אולאנזפין כדי למדוד את התא ביומסה. בעבר, אולאנזפין הוכח כדי למדוד את הצמיחה של תאים חיים עם דיוק רב יותר מאשר גישות קונבנציונליות17. שימוש אולאנזפין, ניתן למדוד לתגובה סמים לחיות תאים עם רזולוציה תא בודד11,18,19. בשילוב עם MY133-V2000, תאים יכולים להיות מחונן בערוץ במשך לפחות 1 י, המאפשר את קצב הצמיחה של התאים נקבע במדויק שילוב היתרונות של מיקרופלואידיקה והן אולאנזפין מאפשר מדידת הצמיחה ולחיות סמים תגובות של תאים בתנאים מבוקרים.
יישומים עתידיים של טכניקה זו כוללות שילוב זה microfluidic מתקדמים יותר וניסויים מיקרוסקופ כמותית. האלסטיות של MY133-V200013 הוא תואם עם טכניקות מתקדמות microfluidic כגון שסתומים פנאומטיים, בהמשך הפעלת הזיוף של לסימולציה ועיצובים ניסיוני. התוצאות המובאות כאן מדגימים את השימוש בחומר זה עבור ביצוע מדידות כמותיים באמצעות אולאנזפין. MY133-V2000 צריך גם להיות תואם עם מיקרוסקופ כמותיים טכניקות טיפול נוספות, Frster תהודה האנרגיה להעברה או קרינה פלואורסצנטית שלמים מיקרוסקופ. גישה זו מאפשרת גם עבור התקן כדי להיות רכוב על ואטום נגד מצע PDMS, המאפשרים עיצובים מוטוריים מתקדמים כגון לבצע fluorophores במצע. בסך הכל, MY133-V2000 מפחיתה לכלוכים בעת ביצוע מדידות כמותיים בפתרונות מימית של microchannels, הפיכתה של חומר אידיאלי עבור הזיוף של microfluidic ערוצים עבור ביצוע מדידות ביו ברמת דיוק גבוהה.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
המחברים אין לחשוף.
Acknowledgments
עבודה זו נתמכה על ידי אוניברסיטת יוטה משרד סגן הנשיא למחקר, כמו גם על ידי קרנות בשיתוף עם גרנט CA042014 P30 זכה מכון הסרטן האנטסמן, התוכנית CRR במכון הסרטן הצייד.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| MY133-V2000 | MY Polymers | MY133-V2000 | |
| Sylgard 184 | Ellsworth Adhesives | 184 SIL ELAST KIT 0.5KG | |
| Fisher Premium microscope slides | Fisher Scientific | 12-544-4 | |
| .118"(3.0mm) x 12" x 12" Acrylic Sheet | United States Plastic Corp | 44290 | |
| .060"(1.5mm) x 12" x 12" Acrylic Sheet | United States Plastic Corp | 44200 | |
| SCIGRIP 3 Very Fast Set Acrylic Cement | United States Plastic Corp | 45735 | |
| Standard Aluminum Foil (.6 mm thick) | VWR | 89107-726 | |
| Kim Wipes | Fisher Scientific | 06-666 | |
| Insta-Cure+ Super Glue | Bob Smith Industries | BSI-109 | |
| 1/8" PVC tubing | McMaster Carr | 5231K55 | |
| McCormick Food Coloring | Target | 13353207 | |
| X-Acto #1 Precision Knife | X-Acto | X3201 | |
| X-Acto #18 Heavyweight wood chiseling blade | X-Acto | X218 | |
| VWR Razor Blades | VWR | 55411-055 | |
| Surface Treated Cell Culture Dishes | Fisher Scientific | FBO12922 | |
| Fibronectin Human Plasma | Sigma-Aldritch | F0895-1MG | |
| Trypsin-EDTA 10x | Fisher Scientific | 15-400-054 | |
| Corning Dulbecco's Phosphate Buffered Saline | Fisher Scientific | MT21030CM | |
| Gibco Penicillin-Streptomycin | Fisher Scientific | 15-140-148 | |
| HyClone Nonessential Amino Acids 100x | Fisher Scientific | SH3023801 | |
| Fetal Bovine Serum | Omega Scientific | FB-12 | |
| Corning DMEM with L-glutamine and glucose | Fisher Scientific | MT10013CV | |
| Trichloro(1H,1H,2H,2H-perfluorooctyl)silane | Sigma-Aldritch | 448931 | Reacts violently with water |
| Ethanol, 200 proof Decon Labs | Fisher Scientific | 04-355-223 | |
| Acetone | Fisher Scientific | A18P-4 | |
| Bel-Art 42025 Plastic Dessicator | Cole-Parmer | EW-06514-30 | |
| Epilog Fusion Laser Cutter, 120 W | Epilog Laser | Epilog Fusion M2 32 Laser | |
| Isotemp Stirring Hotplate | Fisher Scientific | SP88850200 | |
| Ateco 14111 1.5 inch stainless steel cutter | Ateco | 14111 | |
| Pyrex Glass Cell Culture Dish | Fisher Scientific | 08-747B | |
| Radio Frequency Plasma Cleaner | Harrick Plasma | PDC-32G | Used with Oxygen gas |
| Black Hole Laboratories Digivac | Black Hole Laboratories | Model 215 | |
| Intelli-Ray Ultraviolet Oven | Uvitron | UVO338 | |
| Compact Spin Coater | MTI Corporation | VTC-100A | |
| Fisher Brand Isotemp Oven | Fisher Scientific | 15-103-0510 | Forced Air Convection |
| Gilson Positive Displacement Pipette P1000 | Fisher Scientific | FD10006G | |
| HeraCell VIOS 160i | Fisher Scientific | 13 998 212PM |
References
- Zare, R. N., Kim, S. Microfluidic platforms for single-cell analysis. Annual Review Biomedical Engineering. 12, 187-201 (2010).
- Neuzi, P., Giselbrecht, S., Lange, K., Huang, T. J., Manz, A. Revisiting lab-on-a-chip technology for drug discovery. Nature Reviews Drug Discovery. 11 (8), 620-632 (2012).
- Xu, W., et al. Cell stiffness is a biomarker of the metastatic potential of ovarian cancer cells. PLoS ONE. 7 (10), 46609 (2012).
- Karakas, H. E., et al. A microfluidic chip for screening individual cancer cells via eavesdropping on autophagy-inducing crosstalk in the stroma niche. Scientific Reports. 7 (1), 2050 (2017).
- DeBerardinis, R. J., Lum, J. J., Hatzivassiliou, G., Thompson, C. B. The biology of cancer: metabolic reprogramming fuels cell growth and proliferation. Cell Metabolism. 7 (1), 11-20 (2008).
- Yin, H., Marshall, D. Microfluidics for single cell analysis. Current Opinion in Biotechnology. 23 (1), 110-119 (2012).
- Kemper, B., et al. Monitoring of laser micromanipulated optically trapped cells by digital holographic microscopy. Journal of Biophotonics. 3 (7), 425-431 (2010).
- Barer, R. Interference micorscopy and mass determination. Nature. 169 (4296), 366-367 (1952).
- Zangle, T. A., Teitell, M. A. Live-cell mass profiling: an emerging approach in quantitative biophysics. Nature Methods. 11 (12), 1221-1228 (2014).
- Chun, J., et al. Rapidly quantifying drug sensitivity of dispersed and clumped breast cancer cells by mass profiling. Analyst. 137 (23), 5495-5498 (2012).
- Reed, J., et al. Live cell interferometry reveals cellular dynamism during force propagation. Acs Nano. 2 (5), 841-846 (2011).
- Eldridge, W. J., Steelman, Z. A., Loomis, B., Wax, A. Optical Phase Measurements of Disorder Strength Link Microstructure to Cell Stiffness. Biophysical Journal. 112 (4), 692-702 (2017).
- Kim, D. N. H., Kim, K. T., Kim, C., Teitell, M. A., Zangle, T. A. Soft lithography fabrication of index-matched microfluidic devices for reducing artifacts in fluorescence and quantitative phase imaging. Microfluidics and Nanofluidics. 22 (1), 11 (2018).
- Byron, M. L., Variano, E. A. Refractive-index-matched hydrogel materials for measuring flow-structure interactions. Experiments in Fluids. 54 (2), 6 (2013).
- Ogawa, T., Hanada, Y. Microfabrication of the UV transparent polymer CYTOP using a conventional pulsed green laser. Applied Physics a-Materials Science & Processing. 122 (3), 6 (2016).
- Hanada, Y., Ogawa, T., Koike, K., Sugioka, K. Making the invisible visible: a microfluidic chip using a low refractive index polymer. Lab on a Chip. 16 (13), 2481-2486 (2016).
- Zangle, T. A., Burnes, D., Mathis, C., Witte, O. N., Teitell, M. A. Quantifying biomass changes of single CD8+ T cells during antigen specific cytotoxicity. PLoS One. 8 (7), 68916 (2013).
- Huang, D., et al. High Speed Live Cell Interferometry: A New Method for Rapidly Quantifying Tumor Drug Resistance and Heterogeneity. Analytical Chemistry. 90 (5), 3299-3306 (2018).
- Mir, M., Bergamaschi, A., Katzenellenbogen, B. S., Popescu, G. Highly sensitive quantitative imaging for monitoring single cancer cell growth kinetics and drug response. PLoS ONE. 9 (2), 89000 (2014).
