Summary
Denne protokol beskriver fabrikation af mikrofluid enheder fra MY133-V2000 at fjerne artefakter, der ofte opstår i microchannels på grund af de fejlagtige refraktivt indeks mellem microchannel strukturer og en vandig opløsning. Denne protokol bruger en akryl indehaveren til at komprimere den indkapslet enhed, forbedre adhæsion både kemisk og mekanisk.
Abstract
Brugen af mikrofluid enheder er opstået som et afgørende redskab til biomedicinske programmer. Når det kombineres med moderne mikroskopi-teknikker, kan disse enheder gennemføres som en del af en robust platform i stand til at foretage samtidige supplerende målinger. Den primære udfordring lavet af en kombination af disse to teknikker er uoverensstemmelse i brydningsindeks mellem traditionelt materialer til at gøre mikrofluid enheder og de vandige opløsninger anvendes typisk i biomedicin. Denne uoverensstemmelse kan oprette optisk artefakter nær kanal eller enhed kanterne. En løsning er at reducere brydningsindekset af det materiale, der anvendes til at fabrikere enheden ved hjælp af en fluorholdig polymer som MY133-V2000 hvis brydningsindeks er lig i vandet (n = 1,33). Her, opførelsen af en mikrofluid enhed lavet af MY133-V2000 bruger bløde litografi teknikker er påvist, ved hjælp af O2 plasma sammenholdt med en akryl indehaveren for at øge vedhæftning mellem enheden og MY133-V2000 fabrikeret og den Polydimethylsiloxan (PDMS) substrat. Enheden er derefter testet ved at inkubere det fyldt med celle kultur medier til 24 h for at vise enhedens evne til at opretholde celle kultur betingelser i løbet af en typisk imaging eksperiment. Endelig, kvantitative fase mikroskopi (QPM) bruges til at måle fordelingen af masse i levende vedhængende cellerne i microchannel. Denne måde, godtgøres den øgede præcision, aktiveret ved opdigte enheden fra et lavt index of refraktion polymer som MY133-V2000 i stedet for traditionelle blødt litografi materialer såsom PDMS. Samlet set kan denne tilgang for at fabrikere mikrofluid enheder let integreres i eksisterende bløde litografi arbejdsprocesser for at reducere optisk artefakter og øge måling præcision.
Introduction
Udviklingen af mikrofluid teknologi har muliggjort en lang række nye biomedicinske teknikker, der udnytter den unikke fysik af mikroskala strømme1,2. Dette omfatter de diagnostiske teknikker bygget på mikrofluid platforme at kvantificere klinisk relevante biomarkører, herunder celle stivhed3, celleoverflademarkører4og vækst5. Ved at manipulere enkelt celler, kan mikrofluid enheder også bruges til at måle biomarkør heterogenitet, for eksempel som en indikator for malignitet6. Evnen til at kombinere mikrofluid programmer med mikroskopi steget yderligere nytte af disse platforme ved at tillade enheder, der måler flere biomarkører samtidig7.
QPM er en mikroskopi teknik, der måler faseskift, som lyset passerer gennem og interagerer med sagen inde i gennemsigtig prøver. Massen af individuelle celler kan beregnes ud fra QPM målinger, ved hjælp af det kendte forholdet mellem brydningsindekset og biomasse massefylde8,9. Tidligere arbejde har vist, at QPM er i stand til at måle klinisk relevante parametre såsom celle vækst10,11 og celle mekaniske egenskaber via lidelse styrke12. Når det kombineres med mikrofluidik, kan QPM potentielt bruges til at måle celle adfærd i et stærkt kontrolleret miljø i vitro. En af de primære udfordringer ved at kombinere QPM med mikrofluidik er høj brydningsindekset af de fleste polymerer, der anvendes til at konstruere mikrofluid kanaler via bløde litografi13.
En vigtig udfordring for kombinationen af mikrofluidik med forskellige mikroskopi-teknikker er misforholdet mellem brydningsindekset af enhed materiale i forhold til brydningsindekset for vand14,15. En metode til at løse dette er gennem brug af en lav brydningsindekset polymer som CYTOP16 eller MY133-V200013. Sidstnævnte er en fluorholdige ultraviolet (UV)-helbredes acrylat polymer, der har en refraktivt indeks svarer til vand (n = 1,33) og der er kompatible med bløde litografi teknikker, giver mulighed for en problemfri integration i mange etablerede mikrofluid enheden fabrikation arbejdsprocesser. Det gør MY133-V2000 ikke kun egnet til mikrofluid indretning fabrikation, men giver også mulighed for at være let kombineret med QPM og andre mikroskopi metoder, til at måle celle opførsel både på kolonien og på en enkelt celle skala. MY133-V2000 eliminerer artefakter som følge af fase udpakning ved at producere lidt, hvis nogen, faseskift som lys passerer gennem vand-MY133 interface.
Selv om at fjerne uoverensstemmelsen i brydningsindeks, er en stor udfordring i forbindelse med enheder fremstillet af fluorholdige polymerer, såsom MY133-V2000, lav overholdelsen af andre materialer som glas eller PDMS. Den nuværende arbejde viser fabrikation af en MY133-V2000 mikrofluid enheden ved hjælp af bløde litografi. Ved hjælp af O2 plasma til behandling af overfladen af både kanalen og PDMS sikrer substrat kombineret med en brugerdefineret opdigtet akryl indehaveren, at enheden klæber til underlaget, at skabe en forseglet kanal. Denne enhed er velegnet til cellekultur og QPM til at måle massen af celler i den kanal, som har vigtige applikationer til at måle væksten af levende celler og intracellulær transport af celle biomasse, som begge har klinisk relevans i diagnostiske medicin og narkotika opdagelsen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. fabrikation af Polydimethylsiloxan Negative
-
Forberedelse af Polydimethylsiloxan
- Foranstaltning 18 g PDMS silikoneelastomer og 1,8 g hærdning reagens. Hæld den hærdning reagens i en måling båd indeholdende elastomer.
- Bland elastomer og hærdning reagenset kraftigt i 1 min og sæt blandingen i et vakuumkammer i 30 min.
- Fjerne PDMS fra vakuum, hæld 15 g på det negative ved hjælp af en cookie cutter (radius = 3,8 cm) til at holde PDMS fra kører ned af siden, og dækker de resterende PDMS blanding.
- Sæt formen indeholder PDMS i vakuumkammer i 10 min.
- Fjerne skimmel indeholdende PDMS fra den vakuumkammer, placere den på en varm tallerken indstillet til 150 ° C i 60 min til at helbrede, og dæk den med alufolie.
- Hæld den resterende PDMS på en omvendt glas petriskål (10 cm i diameter), ved hjælp af en anden cookie cutter som en skimmel, til at oprette en pad af PDMS. Sætte dette ind i en vakuumkammer indtil PDMS negative er helt helbredt.
- Overføre petriskål med PDMS fra vakuum til forvarmet varmepladen at helbrede ved 150 ° C i 60 min.
-
Plasma overfladebehandling af Polydimethylsiloxan
- Indsæt et skarpt barberblad nedenunder PDMS og cookie cutter til fjern forsigtigt PDMS fra negativt.
- Brug en skarp hobbykniv til at skære negativt fra den større stykke af PDMS; Det skal skæres med nok buffer område til at vedhæfte en anden stykke PDMS oven på det uden at hindre negativt.
- Indsæt et skarpt barberblad nedenunder den hærdede PDMS med negativ forsigtigt fjerne PDMS fra petriskålen.
- Brug en hobbykniv til at skære et stykke af PDMS fra den pad, det er den samme størrelse som stykket klippe for negative. Derefter, klip et rektangel af den nye stykke PDMS med plads nok til at passe det omkring microchannel, når det er placeret på toppen af negativt.
- Sætte begge stykker af PDMS (negativt og rektanglets) på et fladt underlag (f.eks. et dias lavet af glas, quartz, polystyren eller andet materiale) og indsætte dem i en radiofrekvens (RF) plasma renere. Lukke døren og forsegle salen af evakuere luften ved hjælp af en vakuumpumpe. Injicere luft op til et tryk på 400 mTorr ved hjælp af en digital vakuum pres controller.
Bemærk: Hvis underlaget anvendes til plasma rengøring ikke er blevet brugt i plasma renere, sætte det ind i plasma renere i sig selv for 60 s forudgående til behandling af negativt, for at forhindre akryl basislaget klistrer til underlaget. - Slå indstillingen RF til høj, og en lyserød luft plasma skal vises i fremviservinduet. Plasma-behandle de to stykker af PDMS for 30 s, slukke derefter indstillingen RF. Tillad luft at indtaste langsomt igen i salen for at forhindre en turbulente luftstrøm fra foruroligende indholdet af salen.
- Fjerne PDMS fra plasmaet renere og placere den på en benchtop. Derefter omhyggeligt invertere PDMS rektangel over negative og trykke det ned med et par pincet. Lad den hvile i 10 min. at lade de to stykker af PDMS at holde sig til hinanden.
-
Fluorosilane overflade behandling af Polydimethylsiloxan negative
- Brug en dråbetæller at sætte 2 dråber af trichlor (1H, 1H, 2H, 2H-perfluoro-octyl) silan (PFOTS) ind i en lille vejer båden og indsætte det i et glas vakuumkammer.
- Invertere PDMS på et stykke aluminiumsfolie (således at microchannel negativt vender opad) og sæt det i glas vakuumkammer. Derefter, evakuere kammer uafbrudt i 24 timer.
2. fremstilling af MY133 Microchannel
-
Danner MY133-V2000 microchannel struktur
- Fyld PDMS negative med 400 µL af MY133-V2000.
Bemærk: Negativt skal lidt overfyldt. - Placere den MY133-V2000-fyldt PDMS negative i vakuumkammer i 2 timer til at fjerne eventuelle bobler.
- Fjerne MY133-V2000 fra vakuum og tryk langsomt på et glas dias mod toppen af det lidt overfyldte negative til at skabe en flad overflade af MY133-V2000 og forhindre ilt i at hæmme polymerisering.
Bemærk: PDMS, på kanal overflade, vil delvist hæmme polymerisering, gør det muligt for binding i senere faser. Glas dias har en lidt reduceret UV gennemsigtighed (35%) sammenlignet med kvarts, som hjælper med at forhindre enhver gulfarvning af hærdede enheden. - Indsæt MY133-V2000 i en 400 W UV ovn og sæt UV stråling til 50% af den maksimale støtteintensitet for 300 s at helbrede MY133-V2000 microchannel.
Bemærk: Peak bølgelængde bruges til at helbrede enheden er ca 375 nm med en båndbredde på omkring 25 nm. Omkring 4.500 mJ/cm2 magtens blev brugt til at helbrede microchannel, som er lidt mere end dobbelt minimum hærdning magt anbefalet af fabrikanten.
- Fyld PDMS negative med 400 µL af MY133-V2000.
-
Bygning akryl indehaveren
- Trække på akryl base lag ved hjælp af en vektor tegning software. Sørg for basislaget er et rektangel, der er 1.5 mm tyk, 75 mm lang og 25 mm bred, med en centreret rektangel, der måler 25 mm x 11 mm.
- Tegne det akryl midt lag ved hjælp af en vektor tegning software. Kontroller midt lag er et rektangel (1,5 mm tyk, 75 mm lang og 25 mm bred) med en centreret square (5 mm x 5 mm) og to cirkler (begge med en diameter på 3 mm) adskilt af 15 mm.
- Tegne det akryl øverste lag ved hjælp af en vektor tegning software. Sørg for det øverste lag er et rektangel (3 mm tyk, 30 mm lang og 25 mm bred) med en centreret square (5 mm x 5 mm) og to cirkler (begge med en diameter på 3 mm) adskilt af 15 mm.
- Skåret ud de enhed design skabt i vektor tegning software med en laser cutter. Bruge eksempler på indstillingerne af 100% magt og 30% hastighed. Køre programmet to gange for at sikre, at akryl er skåret ud.
- Tryk på huller i akryl øverste lag ved hjælp af en størrelse M5 0,80 mm aflytning værktøj.
- Tør de akryl stykker med acetone til at fjerne enhver resterende mærker eller forbrændinger.
-
Limning af MY133-V2000 i akryl indehaveren
- Tillægge glas substrat ved hjælp af et klæbemiddel, såsom ren super lim på akryl base lag. Sted to små dråber på kanten af akryl og derefter bruge en engangs værktøj til jævnt fordelt limen. Placer glas substrat ind på akryl og lad limen tørre ved hjælp af vægten af glasset til at holde det på plads.
- Coat de udsatte glas med 100 µL af PDMS ved hjælp af en positiv forskydning pipette; derefter indsætte basislaget i en vakuum spin coater og sæt den til 1.500 rpm i 2 min til pels jævnt glas med en PDMS film ca 10 µm tykt.
- Fjern basislaget fra spin coater og forsigtigt tørre væk eventuelle overskydende PDMS, der belagt akryl med acetone og papir håndklæde. Pas på ikke at forstyrre det uhærdede PDMS.
- Bage basislaget med PDMS i en ovn ved 65 ° C i 2 timer til at helbrede PDMS.
- Der afpipetteres 1 mL PDMS på et glas dias, og brug derefter et andet glas dias til jævnt fordelt til PDMS indtil det begynder at sive ud i siderne. Helbrede dette på en varmeplade ved 150 ° C i 10 min.
- Skæres den hærdede PDMS i en rektangel med samme dimensioner som MY133-V2000 enheden, og derefter bruger midt lag af akryl som en skimmel, punch huller til reservoiret og klip et kvadrat visning af vinduet i PDMS at gøre PDMS pakning.
- Place MY133-V2000, kanal side op, på den samme eller en lignende flad substrat som anvendes til plasma-behandle PDMS taktfast 1.2.5. Placer den akryl base lag indeholdende den hærdede PDMS substrat sammen med MY133-V2000 kanal i O2 plasma renere. Indstillet af vakuum pres til 200 mTorr og RF til høj og overflade-behandling kanal og glas substrat for 30 s.
- Bruge pincet, straks sted MY133-V2000 kanal-og ned i den rektangulære udskæring af base lag akryl sådan, at MY133-V2000 kontakter PDMS.
- Sted PDMS pakning på toppen af enhedens MY133-V2000 foring op i hullerne i pakning med reservoirer i enheden.
- Placer den ufærdige enhed på en ophøjet platform ovenfor bænk at give en fastspændingsanordninger overflade for enhed forsamling.
- Uddrag 3 mL af akryl cement ved hjælp af en sprøjte. Distribuere nok akryl cement oven på basislaget til at give et tyndt lag. Gør pelsen, som selv som muligt og lad ikke den materielle sive ind i kanalen.
- Placer midten lag akryl stykke på toppen af base lag akryl. Sørg for at hullerne linje op med reservoirer for MY133-V2000 kanal.
- Brug 3 små klemmer til at holde basislaget og midten af lag sammen som meget som muligt for 2 min mens den akryl cement hærder, for at obligation stykkerne af akryl sammen. Sikre at reservoirerne ikke er blokeret i løbet af dette skridt til at forhindre luft i at blive fanget under MY133-V2000 enhed.
- Fjerne presset fra enheden og placere den akryl cement på midten lag på steder af forventede kontakt med den øverste lag af akryl.
- Placere det øverste lag af akryl på midten lag stykke af akryl, sikre at hullerne er afstemt med reservoirer, og lad det hvile på bænken for 2 min mens den akryl cement tørrer.
3. afprøvning og brug af MY133-V2000 enhed
-
Lække test
- Test MY133-V2000 enheden ved at tilføje 10 µL af food dye eller deioniseret vand ind i en af reservoir huller til at teste for vedhæftning og flow.
- Indsætte en slange (med en 1/8-i ydre diameter) i reservoiret og Tilslut anden enden til en vakuum fælde. Slå vakuum på pull farvestoffet eller vand gennem kanalen for at sikre, at en vellykket indretning er oprettet.
- Check under et mikroskop for at kontrollere, at der er nogen utætheder i den kanal eller reservoir, fyld beholderen med ethanol, og tillade ethanol til at sidde ved stuetemperatur i 10 min. Derefter, træk ethanol gennem ved hjælp af vakuum, til at rense farvestof eller vand ud af kanalen.
- Spray kanalen med ethanol og sætte det ind i en steril polystyren parabol. Wrap det stramt med parafilm og gemme det i et sterilt miljø indtil det skal bruges.
Bemærk: på dette tidspunkt, enheden skal håndteres under aseptiske forhold for at forhindre forurening. Når du er klar til at bruge enheden, skal ydersiden af beholderen steriliseres med ethanol og bragt i en biosikkerhed kabinet før åbning af beholderen.
-
Plating MCF7 celler i MY133-V2000 enheden
- Vokse MCF7 celler på 10 cm petriskåle i en komplet media bestående af Dulbeccos mindste afgørende medium (DMEM), suppleret med 10% føtal bovint serum, penicillin-streptomycin, Glutamin og ikke-essentielle aminosyrer, i en celle kultur inkubator, opretholder et fugtigt atmosfære indeholdende 5% CO2 og 20% O2 ved en temperatur på 37 ° C. Vokse celler til ca 80% sammenløbet før såning dem i microchannel.
- Først spray polystyren fadet indeholdende microchannel med 70% ethanol. Derefter, bringe det i biosikkerhed kabinet før du fjerner parafilm beskytte kanalen fra den omgivende laboratoriemiljø.
- Immobilisere menneske-plasmaafledte fibronektin på microchannel overflade ved at fortynde det i Dulbeccos fosfatbufferet saltopløsning (DPBS) til 10 µg/mL. Derefter indsprøjtes 20 µL af denne løsning i kanalen og inkuberes ved 20 ° C i 45 min.
- Vaske fibronektin løsning ud af kanalen ved at indsprøjte 20 µL af celle kultur medier ind i kanalen, og gør det muligt at Inkuber ved 20 ° C i 10 min.
- Cellerne vaskes med 10 mL af DPBS, og trypsinize celler ved tilsætning af 1 mL af 1 x trypsin. Inkuber celler ved 37 ° C i 7 min. Neutraliser trypsin med 9 mL af komplette medier.
- Indsprøjtes 20 µL af celler ind i kanalen og dem der inkuberes ved 37 ° C i 45-120 min. at lade den vedhæftede fil til underlaget inden imaging.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Denne protokol beskriver fabrikation af MY133-V2000, en fluorholdig polymer med en lav brydningsindekset matcher det vand. Et centralt element i denne protokol er hvordan man kan overvinde manglen vedhæftning, der er karakteristisk for fluorholdige polymerer, ved hjælp af ilt plasma og ved opdigte enhed inden for en akryl indehaveren til at give den ekstra mekaniske styrke forpligtet til at forsegle kanalen mod PDMS substrat (figur 1). Lav brydningsindekset af de endelige enhed er klart vist på en makroskopisk skala (figur 2). Kanterne af en kanal, der er fremstillet af dette materiale er tydeligt ses i luften (fig. 2A) men blive vanskeligt at skelne når nedsænket i vand (figur 2B) på grund af den tætte kamp i brydningsindeks. Dette giver et hurtigt tjek af de optiske egenskaber af materialet efter fabrikation. En fuldførte enhed er vist i figur 2C, hvor MY133-V2000 microchannel kan ses indkapslet af akryl, der giver den nødvendige til at forsegle microchannel ekstra mekanisk kraft. En vellykket enhed skal vise god vedhæftning (fri for luftbobler) mellem enheden og substrat. Tilstedeværelsen af en luftboble i midten af enhed kanalen angiver, at luften ikke må slippe under limning, sandsynligvis på grund af en obstruktion af reservoirer når akryl cement sæt. Denne enhed viser også godt overholdt akryl/glas lag med minimal bøjer af glas substrat. Problemer på dette område kan blive behandlet af enten spreder limen mellem akryl og glas lag mere jævnt eller ved at reducere tykkelsen af mikrofluid enheden til forebyggelse af stress på indehaveren. Endelig viser reservoirer i alle tre paneler tydelige kanter, med ingen lufthuller i kanterne. Dette er et andet potentielt problemområde for enhed-substrat vedhæftning, der elimineres ved brug af en enhed mug med perfusion havne bygget.
På en mikroskopisk skala, er få, om nogen, artefakter indført på grund af fase udpakning ved at matche de refraktive indeks af microchannel og celle Kulturmedier. Dette viser, at massen af celler kan kvantificeres præcist selv i nærheden af kanal vægge (figur 3). Kollektivt, disse resultater viser, på både en makroskopisk skala og en mikroskopisk skala, fordelene ved at bruge en fluorholdig polymer til at matche indekser i brydning mellem fabrikation materiale af microchannel til vandige celle kultur medier.
Figur 1 : MY133-V2000 bløde litografi arbejdsproces. (A) efter fylde formen med MY133-V2000, menisken er komprimeret ved hjælp af et glas dias til at oprette en flad overflade og tørret i en UV ovn. Bemærk, at højden af negative af reservoirer sammenlignes med højden af formen til at oprette dyb reservoirer 3 mm i diameter. (B) efter opskæring af akryl, akryl bundlag er fastklæbet til et glas coverslip inden spin-belægning det med PDMS. De øverste to akryl lag er lamineret sammen ved hjælp af akryl cement. (C) den hærdede MY133-V2000 enhed (kanal side opad) og coverslip behandles overflade-ved hjælp af O2 plasma. (D) Endelig, enheden er samlet ved at tilslutte de overfladebehandlet sider af enheden og coverslip sammen. PDMS pakning er så placeret oven på MY133-V2000 enheden og akryl er fastgjort ved hjælp af akryl cement, med huller i både PDMS-pakning og midt lag af akryl foring op med reservoirer. Den samlede enhed er derefter fastspændt i hånden for 2 min, indtil den akryl cement tørrer. (E) en sprængskitse af enheden viser, hvordan enheden er samlet. (F) A tegning viser tværsnit gennem microchannel af den færdige enhed. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2 : Billeder af færdige MY133-V2000 enheder. (A) kanterne af enhedens MY133-V2000 er tydeligt synlig i luften. (B) når nedsænket i vand, kanter af samme MY133-V2000 enheden forsvinder på grund af den tætte kamp i refraktive indeks. (C) Dette fotografi viser en færdig enhed med en akryl indehaveren. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 3 : Cellemasse kan kvantificeres præcist nær microchannel strukturer. Målinger af cellemasse af frisk seedede MCF7 celler i MY133-V2000 microchannel viser ingen artefakter som følge af fase indpakning nær (A og B) væg eller (C) i midten af kanalen. Disse artefakter er undgås i MY133-V2000 kanalen på grund af de nøje afstemt refraktivt indeks af kanal materiale og celle Kulturmedier. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
MY133-V2000 kan bruges som et alternativ til traditionelle blødt litografi fabrikation materialer såsom PDMS. Tidligere arbejde har vist, at materialer med et højt indeks af brydning, såsom PDMS, indføre betydelige artefakter nær kanalen væggene på grund af forkert indekser i brydning mellem fabrikation materiale og den vandige opløsning inde kanalen 13. MY133-V2000 giver mulighed for matchende brydningsindekset af enheden mikrofluid at de vandige opløsninger almindeligt anvendt i biomedicinske programmer. Dette reducerer billeddannelse artefakter, når man kombinerer mikrofluidik med avancerede mikroskopi-teknikker, giver en klar fordel i forhold til traditionelle mikrofluid fabrikation materialer. Artefakt reduktion i mikrofluid kanaler muliggjort af dette system muliggør fluorescens og kvantitative fase mikroskopi (figur 3) signaler til kvantificeres mere præcist, selv i umiddelbar nærhed af microchannel strukturer13.
Som en fluorholdig polymer udviser MY133-V2000 typisk lav friktion mellem kanal struktur og andre materialer, således at indføre en stor begrænsning i forhold til traditionel fabrikation materialer. For at overvinde denne udfordring, bruges både kemisk overfladebehandling (O2 plasma) ud over mekanisk kompression lavet af klemme enheden og PDMS pakning mellem substratet og et stykke af akryl. Den lavere elasticitetsmodul af PDMS (i forhold til MY133-V2000) er kritisk at overføre mekanisk kraft fra akryl til MY133-V2000 enhed, fordi det er deformerbare nok til at blive komprimeret, gør det muligt at holde microchannel på plads mens samtidig holder det forseglet mod underlaget.
To vigtige punkter for fiasko kan være stødt på når opdigte microchannels ved hjælp af denne metode og bør være anført når fejlfinding. Disse er lækage fra reservoir på grund af overskydende slagger og lækage fra midten af den kanal, hvor kraften fra mekanisk kompression er på et minimum. Selv en lille mængde af slagger fra stansning huller til reservoirerne forhindret reservoiret i fastholdelsen af substratet korrekt. For at forhindre lækager fra reservoiret, indeholder microchannel negative små søjler, 3 mm i diameter, der er ens i højden som formen, så at reservoirerne kan blive kastet som en del af microchannel uden at skulle bruge et værktøj til at punch huller til reservoirerne. Stansning huller for reservoirer, efter hærdning skaber slagger, der skal vaskes væk uden at beskadige kanal (fig. 1A). Det er vanskeligt at opnå i praksis. For at forhindre lækager fra midten af den engelske kanal, var det afgørende ikke at dække reservoirerne under forsamlingen for at tillade luft at undslippe fra undersiden af enheden. Hvis reservoirerne er blokeret, når limning enheden sammen, er luft nedenunder enheden ude af stand til at flygte, at skabe et rum for væske til at sive ud af kanalen.
Denne protokol udgør derfor en metode til at forbedre adhæsion gennem både overfladebehandling og monteringsudstyret i en akryl indehaveren, afbøde de negative virkninger af fluorination på de klæbende egenskaber af polymeren. Enhederne var fyldt med væske og inkuberes i op til 24 timer, viser at enheden forbliver funktionel for varigheden af en typisk imaging eksperiment. MY133-V2000, kan som en fabrikation materiale til en mikrofluid enhed, kombineres med QPM til at måle celle biomasse. Tidligere har QPM vist sig at måle væksten i levende celler med en større præcision end konventionelle tilgange17. Bruger QPM, kan en live-celle drug svar måles med én celle resolution11,18,19. Når det kombineres med MY133-V2000, kan celler være kulturperler i kanal for mindst 1 d, gør det muligt vækst af celler til at bestemmes nøjagtigt. Kombinerer fordelene ved både mikrofluidik og QPM giver mulighed for måling af vækst og live drug svar af celler under kontrollerede forhold.
Fremtidige ansøgninger af denne teknik indebærer, indarbejde det i mere avancerede mikrofluid og kvantitative mikroskopi eksperimenter. Elasticiteten i MY133-V200013 er kompatibel med avancerede mikrofluid teknikker såsom pneumatiske ventiler, yderligere aktivering af fabrikation af komplekse geometrier og eksperimenterende design. Resultaterne præsenteres her demonstrere brugen af dette materiale til at foretage kvantitative målinger ved hjælp af QPM. MY133-V2000 bør også være kompatibelt med andre kvantitative mikroskopi-teknikker, såsom Frster resonans energi overførsel eller fluorescens levetid mikroskopi. Denne tilgang giver også mulighed for enheden til at blive monteret på og forseglet mod PDMS substrat, aktivering af avancerede eksperimentelle design som indkapsling fluorophores i underlaget. Samlet set reducerer MY133-V2000 artefakter når at foretage kvantitative målinger i vandige opløsninger i microchannels, hvilket gør det et ideelt materiale til fremstilling af mikrofluid kanaler for at gøre høj præcision biomedicinsk målinger.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ikke noget at oplyse.
Acknowledgments
Dette arbejde blev støttet af University of Utah office vicepræsident for forskning og af midler i forbindelse med give P30 CA042014 tildelt til jægeren Cancer Institute og CRR Program på jægeren Cancer Institute.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| MY133-V2000 | MY Polymers | MY133-V2000 | |
| Sylgard 184 | Ellsworth Adhesives | 184 SIL ELAST KIT 0.5KG | |
| Fisher Premium microscope slides | Fisher Scientific | 12-544-4 | |
| .118"(3.0mm) x 12" x 12" Acrylic Sheet | United States Plastic Corp | 44290 | |
| .060"(1.5mm) x 12" x 12" Acrylic Sheet | United States Plastic Corp | 44200 | |
| SCIGRIP 3 Very Fast Set Acrylic Cement | United States Plastic Corp | 45735 | |
| Standard Aluminum Foil (.6 mm thick) | VWR | 89107-726 | |
| Kim Wipes | Fisher Scientific | 06-666 | |
| Insta-Cure+ Super Glue | Bob Smith Industries | BSI-109 | |
| 1/8" PVC tubing | McMaster Carr | 5231K55 | |
| McCormick Food Coloring | Target | 13353207 | |
| X-Acto #1 Precision Knife | X-Acto | X3201 | |
| X-Acto #18 Heavyweight wood chiseling blade | X-Acto | X218 | |
| VWR Razor Blades | VWR | 55411-055 | |
| Surface Treated Cell Culture Dishes | Fisher Scientific | FBO12922 | |
| Fibronectin Human Plasma | Sigma-Aldritch | F0895-1MG | |
| Trypsin-EDTA 10x | Fisher Scientific | 15-400-054 | |
| Corning Dulbecco's Phosphate Buffered Saline | Fisher Scientific | MT21030CM | |
| Gibco Penicillin-Streptomycin | Fisher Scientific | 15-140-148 | |
| HyClone Nonessential Amino Acids 100x | Fisher Scientific | SH3023801 | |
| Fetal Bovine Serum | Omega Scientific | FB-12 | |
| Corning DMEM with L-glutamine and glucose | Fisher Scientific | MT10013CV | |
| Trichloro(1H,1H,2H,2H-perfluorooctyl)silane | Sigma-Aldritch | 448931 | Reacts violently with water |
| Ethanol, 200 proof Decon Labs | Fisher Scientific | 04-355-223 | |
| Acetone | Fisher Scientific | A18P-4 | |
| Bel-Art 42025 Plastic Dessicator | Cole-Parmer | EW-06514-30 | |
| Epilog Fusion Laser Cutter, 120 W | Epilog Laser | Epilog Fusion M2 32 Laser | |
| Isotemp Stirring Hotplate | Fisher Scientific | SP88850200 | |
| Ateco 14111 1.5 inch stainless steel cutter | Ateco | 14111 | |
| Pyrex Glass Cell Culture Dish | Fisher Scientific | 08-747B | |
| Radio Frequency Plasma Cleaner | Harrick Plasma | PDC-32G | Used with Oxygen gas |
| Black Hole Laboratories Digivac | Black Hole Laboratories | Model 215 | |
| Intelli-Ray Ultraviolet Oven | Uvitron | UVO338 | |
| Compact Spin Coater | MTI Corporation | VTC-100A | |
| Fisher Brand Isotemp Oven | Fisher Scientific | 15-103-0510 | Forced Air Convection |
| Gilson Positive Displacement Pipette P1000 | Fisher Scientific | FD10006G | |
| HeraCell VIOS 160i | Fisher Scientific | 13 998 212PM |
References
- Zare, R. N., Kim, S. Microfluidic platforms for single-cell analysis. Annual Review Biomedical Engineering. 12, 187-201 (2010).
- Neuzi, P., Giselbrecht, S., Lange, K., Huang, T. J., Manz, A. Revisiting lab-on-a-chip technology for drug discovery. Nature Reviews Drug Discovery. 11 (8), 620-632 (2012).
- Xu, W., et al. Cell stiffness is a biomarker of the metastatic potential of ovarian cancer cells. PLoS ONE. 7 (10), 46609 (2012).
- Karakas, H. E., et al. A microfluidic chip for screening individual cancer cells via eavesdropping on autophagy-inducing crosstalk in the stroma niche. Scientific Reports. 7 (1), 2050 (2017).
- DeBerardinis, R. J., Lum, J. J., Hatzivassiliou, G., Thompson, C. B. The biology of cancer: metabolic reprogramming fuels cell growth and proliferation. Cell Metabolism. 7 (1), 11-20 (2008).
- Yin, H., Marshall, D. Microfluidics for single cell analysis. Current Opinion in Biotechnology. 23 (1), 110-119 (2012).
- Kemper, B., et al. Monitoring of laser micromanipulated optically trapped cells by digital holographic microscopy. Journal of Biophotonics. 3 (7), 425-431 (2010).
- Barer, R. Interference micorscopy and mass determination. Nature. 169 (4296), 366-367 (1952).
- Zangle, T. A., Teitell, M. A. Live-cell mass profiling: an emerging approach in quantitative biophysics. Nature Methods. 11 (12), 1221-1228 (2014).
- Chun, J., et al. Rapidly quantifying drug sensitivity of dispersed and clumped breast cancer cells by mass profiling. Analyst. 137 (23), 5495-5498 (2012).
- Reed, J., et al. Live cell interferometry reveals cellular dynamism during force propagation. Acs Nano. 2 (5), 841-846 (2011).
- Eldridge, W. J., Steelman, Z. A., Loomis, B., Wax, A. Optical Phase Measurements of Disorder Strength Link Microstructure to Cell Stiffness. Biophysical Journal. 112 (4), 692-702 (2017).
- Kim, D. N. H., Kim, K. T., Kim, C., Teitell, M. A., Zangle, T. A. Soft lithography fabrication of index-matched microfluidic devices for reducing artifacts in fluorescence and quantitative phase imaging. Microfluidics and Nanofluidics. 22 (1), 11 (2018).
- Byron, M. L., Variano, E. A. Refractive-index-matched hydrogel materials for measuring flow-structure interactions. Experiments in Fluids. 54 (2), 6 (2013).
- Ogawa, T., Hanada, Y. Microfabrication of the UV transparent polymer CYTOP using a conventional pulsed green laser. Applied Physics a-Materials Science & Processing. 122 (3), 6 (2016).
- Hanada, Y., Ogawa, T., Koike, K., Sugioka, K. Making the invisible visible: a microfluidic chip using a low refractive index polymer. Lab on a Chip. 16 (13), 2481-2486 (2016).
- Zangle, T. A., Burnes, D., Mathis, C., Witte, O. N., Teitell, M. A. Quantifying biomass changes of single CD8+ T cells during antigen specific cytotoxicity. PLoS One. 8 (7), 68916 (2013).
- Huang, D., et al. High Speed Live Cell Interferometry: A New Method for Rapidly Quantifying Tumor Drug Resistance and Heterogeneity. Analytical Chemistry. 90 (5), 3299-3306 (2018).
- Mir, M., Bergamaschi, A., Katzenellenbogen, B. S., Popescu, G. Highly sensitive quantitative imaging for monitoring single cancer cell growth kinetics and drug response. PLoS ONE. 9 (2), 89000 (2014).
