Summary
Dieses Protokoll beschreibt die Herstellung von mikrofluidischen Geräten aus MY133-V2000, Artefakte zu beseitigen, die oft in Mikrokanälen durch unpassende Brechungsindizes zwischen Microchannel Strukturen und einer wässrigen Lösung entstehen. Dieses Protokoll verwendet einen Acryl-Halter, um die gekapselte Gerät, Verbesserung der Adhäsion chemisch und mechanisch zu komprimieren.
Abstract
Die Verwendung von mikrofluidischen Geräten entstanden als bestimmende Werkzeug für biomedizinische Anwendungen. In Kombination mit modernen mikroskopiertechniken können diese Geräte als Teil einer robusten Plattform in der Lage, simultane ergänzende Messungen implementiert werden. Die primäre Herausforderung durch die Kombination dieser beiden Techniken ist das Missverhältnis im Brechungsindex zwischen traditionell zu mikrofluidischen Geräten verwendeten Materialien und die wässrigen Lösungen in der Regel in der Biomedizin verwendet. Diese Diskrepanz kann optische Artefakte am Kanal oder Gerät Rand erstellen. Eine Lösung ist zur Verringerung der Brechungsindex des Materials verwendet, um das Gerät mit einem fluorierten Polymer wie MY133-V2000 dessen Brechungsindex ähnlich dem des Wassers ist zu fabrizieren (n = 1,33). Hier, der Bau eines mikrofluidischen Geräts gemacht aus MY133-V2000 mit weichen Lithographie Techniken demonstriert, mit O2 Plasma in Verbindung mit einer Acryl Halterung zur Erhöhung der Haftung zwischen dem Gerät und MY133-V2000 hergestellt und die Polydimethylsiloxan (PDMS) Substrat. Das Gerät wird dann von Bebrüten es gefüllt mit Zellkulturmedien für 24 h zu zeigen, die Fähigkeit des Geräts weiterhin Zelle Kulturbedingungen im Laufe eines typischen imaging Experiment getestet. Schließlich dient der quantitativen Phase Mikroskopie (QPM) zur Messung der Verteilung der Masse in den live adhärenten Zellen in der Microchannel. Auf diese Weise wird die erhöhte Präzision, aktiviert durch die Herstellung des Geräts aus einem niedrigen Brechungsindex Polymer wie MY133-V2000 anstelle der traditionellen weiche Lithographie Materialien wie PDMS, demonstriert. Insgesamt dieser Ansatz für die Herstellung von mikrofluidischen Geräten leicht integrierbar in bestehende weiche Lithographie Workflows um optische Artefakte zu reduzieren und Messgenauigkeit zu erhöhen.
Introduction
Die Entwicklung von mikrofluidischen Technologie ermöglichte eine Vielzahl neuer biomedizinischer Techniken, die die einzigartige Physik der mikroskopischen Skala fließt1,2nutzen. Dazu gehören die diagnostischen Techniken gebaut auf mikrofluidischen Plattformen, die klinisch relevante Biomarkern, einschließlich Zelle Steifigkeit3, oberflächenmarker-4und Wachstum5zu quantifizieren. Durch die Manipulation einzelner Zellen, mikrofluidischen Geräten auch einsetzbar, Biomarker Heterogenität, zum Beispiel als Indikator für Malignität6zu messen. Die Fähigkeit, mikrofluidische Anwendungen mit Mikroskopie zu verbinden das Dienstprogramm dieser Plattformen für Geräte, die simultane Messung von mehreren Biomarker ermöglicht weiter gestiegen7.
QPM ist eine Mikroskopie-Technik, die die Phasenverschiebung misst wie Licht durchläuft und mit der Materie im Inneren transparenten Proben interagiert. Die Masse der einzelnen Zellen kann von QPM Messungen berechnet werden, mithilfe der bekannten Beziehung zwischen Brechungsindex und der Biomasse Dichte8,9. Bisherigen Arbeit hat gezeigt, dass QPM in der Lage ist, klinisch relevante Parameter wie z. B. Zelle Wachstum10,11 und Zelle mechanische Eigenschaften über Unordnung Stärke12messen. In Kombination mit Mikrofluidik QPM potenziell lässt sich Zelle Verhalten in einem sehr kontrollierten Umgebung in Vitrozu messen. Eines der primären Herausforderungen QPM mit Mikrofluidik zu verbinden ist hohen Brechungsindex von den meisten Polymeren verwendet, mikrofluidische Kanäle über weiche Lithographie13zu konstruieren.
Eine wichtige Herausforderung für die Kombination von Mikrofluidik mit verschiedenen mikroskopiertechniken ist das Missverhältnis zwischen der Brechungsindex des Materials im Verhältnis zu der Brechungsindex von Wasser14,15Gerät. Eine Methode, um dies zu beheben ist die Verwendung von einem niedrigen Brechungsindex Polymer wie CYTOP16 oder MY133-V200013. Letzteres ist eine fluorierte ultravioletten (UV)-heilbar Acrylat Polymer, das hat einen Brechungsindex ähnlich wie Wasser (n = 1,33) und mit weichen Lithographie Techniken, so dass für eine reibungslose Integration in vielen etablierten mikrofluidischen kompatibel ist Gerät-Fertigung-Workflows. Dies macht MY133-V2000 nicht nur geeignet für mikrofluidischen Gerät Fertigung, sondern auch ermöglicht es leicht kombinierbar mit QPM und andere Ansätze Mikroskopie Zelle Verhalten in der Kolonie und auf einer einzelligen Skala zu messen. MY133-V2000 beseitigt Artefakte durch Phase Auspacken durch wenig, wenn überhaupt, Phasenverschiebung als Licht durchläuft die Wasser-MY133-Schnittstelle herzustellen.
Obwohl das Missverhältnis im Brechungsindex zu eliminieren, ist eine große Herausforderung, die verbunden sind mit den Geräten hergestellt aus fluorierten Polymeren, z. B. MY133-V2000, die geringe Einhaltung von anderen Materialien wie Glas oder PDMS. Die vorliegende Arbeit zeigt die Herstellung einer MY133-V2000 mikrofluidischen Vorrichtung mit weichen Lithographie. Mit O2 Plasma zur Behandlung von der Oberfläche des Kanals und der PDMS Substrat kombiniert mit einem Custom-fabrizierten Acryl Halter sorgt dafür, dass das Gerät hält sich an das Substrat, Schaffung eines verschlossenen Kanals. Dieses Gerät eignet sich für Zellkultur und QPM, die Masse von Zellen in den Kanal zu messen, die wichtige Anwendungen zur Messung des Wachstums von lebenden Zellen und den intrazellulären Transport von Zelle Biomasse hat klinischen Relevanz, die beide in der Diagnostik haben Medizin und Drug Discovery.
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Protocol
1. Herstellung von Polydimethylsiloxan negativ
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Vorbereitung von Polydimethylsiloxan
- 18 g PDMS-Silikon-Elastomer und 1,8 g des kurierenden Reagenz zu messen. Gießen Sie die Aushärtung Reagenz in ein Messgerät Boot mit dem Elastomer.
- Mischen Sie das Elastomer und Aushärtung Reagenz energisch für 1 min und setzen Sie die Mischung in eine Vakuumkammer für 30 min.
- Entfernen Sie die PDMS aus dem Vakuum, Gießen 15 g auf die negativen mit einem Ausstecher (Radius = 3,8 cm) zu verhindern, dass die PDMS laufen weg von der Seite, und decken Sie die restlichen PDMS-Mischung.
- Setzen Sie die Form mit dem PDMS in die Vakuumkammer für 10 Minuten.
- Entfernen Sie den Schimmel mit PDMS aus der Vakuumkammer, legen Sie es auf einer heißen Platte eingestellt auf 150 ° C für 60 min. zu heilen, und mit Alufolie abdecken.
- Gießen Sie die restlichen PDMS auf einer umgekehrten Glas Petrischale (10 cm im Durchmesser), verwenden eine andere Ausstecher als Form, um ein Polster von PDMS zu erstellen. Setzen Sie diese in die Vakuumkammer, bis die PDMS negativen vollständig ausgehärtet ist.
- Übertragen Sie die Petrischale mit der PDMS aus dem Vakuum auf der vorgeheizten Heizplatte, bei 150 ° C für 60 min. zu heilen.
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Plasma-Oberflächenbehandlung von Polydimethylsiloxan
- Einfügen einer scharfen Rasierklinge unter dem PDMS und der Ausstecher entfernen vorsichtig die PDMS vom negativ.
- Verwenden Sie ein scharfes Hobby Messer zum Ausschneiden der negatives aus der größere Teil des PDMS; Es sollte geschnitten werden, mit genügend Pufferbereich um ein weiteres Stück des PDMS oben drauf ohne Behinderung das Negative zu befestigen.
- Legen Sie eine scharfe Rasierklinge unter der ausgehärteten PDMS mit dem negativen, entfernen vorsichtig die PDMS aus der Petrischale.
- Verwendung schneiden Sie ein Hobby Messer, schneiden Sie ein Stück des PDMS aus dem Pad, der die gleiche Größe wie das Stück ist für die negativen. Dann schneiden Sie ein Rechteck aus das neue Stück von PDMS mit genug Platz, um um die Microchannel passen, wenn es auf die negativen platziert wird.
- Legen Sie beide Teile des PDMS (das Negative und das Rechteck) auf einem flachen Substrat (z. B. eine Folie aus Glas, Quarz, Polystyrol oder anderem Material gefertigt) und fügen Sie sie in eine Radiofrequenz (RF) Plasma Reiniger. Die Tür schließen und Versiegeln der Kammers durch die Luft, die mit Hilfe einer Vakuumpumpe evakuieren. Luft bis zu einem Druck von 400 mTorr mit einem digitalen Vakuum-Druck-Controller zu injizieren.
Hinweis: Wenn das Substrat für die Plasmareinigung verwendet nicht im Plasma Reiniger verwendet worden ist, steckte es in das Plasma sauberer selbst für 60 s vor zur Behandlung von den negativen, um zu verhindern, dass die Acryl Basisschicht festhalten an das Substrat. - Die RF-Einstellung zu hoch drehen, und ein rosa Luftplasma im Sichtfenster erscheinen soll. Plasma-Behandlung die zwei Stücke des PDMS für 30 s, dann die RF-Einstellung deaktivieren. Damit die Luft langsam die Kammer erneut eingeben, um zu verhindern, dass einen turbulenten Luftstrom stören den Inhalt der Kammer.
- Entfernen Sie die PDMS aus dem Plasma Reiniger und legen Sie es auf eine Tischplatte. Dann sorgfältig Invertieren der PDMS-Rechteck über die negativen und mit einer Zange leicht andrücken. 10 min bis die zwei Stücke des PDMS, aneinander haften zu lassen ruhen lassen.
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Fluorosilane Oberfl ächenbehandlung negative Polydimethylsiloxan
- Verwenden Sie eine Pipette um 2 Tropfen Trichloro (1H, 1H, 2H, 2H-Perfluoro-Octyl) Silan (PFOTS) in ein kleines Boot wiegen und stecken Sie ihn in einer Vakuumkammer Glas.
- Invertieren der PDMS auf ein Stück Alufolie (so, dass die Microchannel-negativ nach oben zeigt) und steckte es in die Vakuumkammer Glas. Dann, Evakuierung der Kammer kontinuierlich für 24 h.
(2) Herstellung von MY133 Microchannel
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Bilden die MY133-V2000 Microchannel-Struktur
- Füllen Sie die PDMS negative mit 400 µL MY133-V2000.
Hinweis: Das Negative muss leicht überfüllt werden. - Legen Sie MY133 V2000-gefüllten PDMS negativ in die Vakuumkammer für 2 h um alle Luftblasen zu entfernen.
- Entfernen Sie MY133-V2000 aus dem Vakuum und langsam auf einen Glasobjektträger gegen oben leicht überfüllten negativ auf eine flache Oberfläche des MY133-V2000 zu schaffen und zu verhindern, dass Sauerstoff Hemmung der Polymerisation.
Hinweis: PDMS, wird an der Kanal-Oberfläche, teilweise die Polymerisation hemmen Verklebung in späteren Stadien ermöglichen. Die Glas-Folie hat eine leicht reduzierte UV-Transparenz (35 %) im Vergleich zu Quarz, die verhindert, dass Vergilbung des ausgehärteten Gerätes. - Fügen Sie MY133-V2000 400 W UV-Ofen und stellen die UV-Strahlung auf 50 % der maximalen Intensität für 300 s, MY133-V2000 Microchannel zu heilen.
Hinweis: Die Spitzenwellenlänge verwendet, um das Gerät zu heilen ist ca. 375 nm mit einer Bandbreite von etwa 25 nm. Ca. 4.500 mJ/cm2 der Macht wurde verwendet, um die Microchannel zu heilen, das ist etwas mehr als verdoppeln das Minimum Härtung macht, die vom Hersteller empfohlenen.
- Füllen Sie die PDMS negative mit 400 µL MY133-V2000.
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Aufbau der Acryl-Halter
- Zeichnen Sie das Acryl Basis-Layer mit einem Vektor Zeichnung Software. Stellen Sie sicher, dass die Basisschicht ist ein Rechteck, das 1,5 mm dick, ist 75 mm lang und 25 mm breit, mit einer zentrierten Rechteck, das 25 mm x 11 mm groß.
- Zeichnen Sie das Acryl Mid-Layer mit einem Vektor-Zeichenprogramm Software. Stellen Sie sicher, dass die mittlere Schicht ist ein Rechteck (1,5 mm dick, 75 mm lang und 25 mm breit) mit einem zentrierten Quadrat (5 x 5 mm) und zwei Kreise (beide mit einem Durchmesser von 3 mm), getrennt durch 15 mm.
- Zeichnen Sie die Acryl oberste Schicht mit einem Vektor-Zeichenprogramm Software. Stellen Sie sicher, dass die oberste Schicht ein Rechteck (3 mm stark, 30 mm lang und 25 mm breit) mit einem zentrierten Quadrat (5 x 5 mm) und zwei Kreise (beide mit einem Durchmesser von 3 mm) durch 15 mm getrennt ist.
- Schneiden Sie die Gerätedesigns in der Vektor Zeichnung Software mit einem Laser-Cutter erstellt. Verwenden Sie die Probe-Einstellungen von 100 % und 30 % Geschwindigkeit. Führen Sie das Programm zweimal, um sicherzustellen, dass das Acryl herausgeschnitten wird.
- Tippen Sie auf die Löcher in der Acryl Deckschicht Werkzeuganwendung Größe M5 0,80 mm tippen.
- Wischen Sie die Acryl Stücke mit Aceton zu entfernen alle verbleibenden Marken oder Verbrennungen.
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Verklebung von MY133-V2000 in der Acryl-Halterung
- Befestigen Sie die Tragschicht des Acryls an dem Glassubstrat mit einem Kleber, wie super Cyanacrylat-Klebstoff. Zwei kleine Tropfen an den Rändern des Acryls und dann verwenden Sie eine Einweg-Tool, um den Klebstoff gleichmäßig zu verteilen. Legen Sie das Glassubstrat auf Acryl und lassen Sie den Kleber trocknen lassen, mit dem Gewicht des Glases, um in Position zu halten.
- Mantel der exponierten Glas mit 100 µL PDMS mit einer Pipette positive Verschiebung; dann legen Sie die Basisschicht in einem Vakuum Spin Coater und setzen Sie ihn auf 1.500 u/min, 2 min, gleichmäßig zu beschichten, das Glas mit einem PDMS-Film ca. 10 µm dick.
- Entfernen Sie die Basisschicht aus der Spin Coater und wischen Sie sorgfältig jede überschüssige PDMS ab, die das Acryl mit Aceton und Papier Handtuch beschichtet. Achten Sie darauf, nicht ausgehärteten PDMS zu stören.
- Backen Sie die Tragschicht mit PDMS in einem Ofen bei 65 ° C für 2 h, die PDMS zu heilen.
- 1 mL der PDMS auf einen Glasobjektträger Pipette, und verwenden Sie dann eine andere Glas-Folie, um die PDMS gleichmäßig zu verteilen, bis es beginnt, die Seiten zu sickern. Dies auf einer heißen Platte bei 150 ° C für 10 min zu heilen.
- Geschnitten Sie die ausgehärteten PDMS in ein Rechteck mit den gleichen Abmessungen wie das MY133-V2000 Gerät und dann Lochen für das Reservoir mit dem Mid-Layer des Acryls als Form, und schneiden Sie ein Quadrat Sichtfenster in der PDMS PDMS Dichtung zu machen.
- Legen Sie das MY133-V2000 Kanal Seite oben, auf die gleiche oder eine ähnliche flache Substrat wie bei Plasma-Behandlung von der PDMS im Schritt 1.2.5. Legen Sie die Acryl Basis-Layer mit dem ausgehärteten PDMS Substrat neben der MY133-V2000-Kanal in der O2 Plasma Reiniger. Die Vakuum-Druck auf 200 mTorr und der RF auf hohem Niveau und Oberfläche-Leckerbissen der Kanal und Glas Substrat für 30 s.
- Mit Pinzette, sofort platzieren Sie MY133-V2000 Kanal Seite nach unten in den rechteckigen Ausschnitt der Basisschicht Acryl derart, dass die MY133-V2000 die PDMS Kontakte.
- Legen Sie die PDMS Dichtung oben auf dem MY133-V2000 Gerät, Schlange, die Löcher in die Dichtung mit den Stauseen im Gerät.
- Platzieren Sie das unvollendete Gerät auf einer erhöhten Plattform über der Bank eine Spannfläche für Gerätemontage anzubieten.
- 3 mL Acryl Zement mit einer Spritze zu extrahieren. Verteilen Sie ausreichend Acryl Zement auf die Tragschicht, eine dünne Schicht bieten. Machen Sie das Fell selbst wie möglich und lassen Sie nicht die materiellen sickern in den Kanal.
- Legen Sie die Mid-Layer Acryl auf die Basisschicht Acryl. Stellen Sie sicher, dass die Löcher mit den Stauseen von der MY133-V2000-Kanal-up Line.
- 3 kleine Klammern verwenden, um die Basisschicht halten und mittlere Schicht zusammen so eng wie möglich für 2 min während der Acryl Zement härtet die Stücke aus Acryl zusammen zu binden. Sicherstellen Sie, dass die Behälter während dieses Schrittes zu verhindern, dass Luft gefangen unter dem MY133-V2000 Gerät nicht behindert werden.
- Entfernen Sie den Druck aus dem Gerät und Acryl Zement auf die Mittelschicht in den Orten der erwarteten Kontakt mit der Deckschicht aus Acryl.
- Legen Sie die oberste Schicht des Acryls auf der Mid-Layer Stück des Acryls, um sicherzustellen, dass die Löcher mit den Stauseen ausgerichtet sind und lassen sie Rest auf der Bank für 2 min, während der Acryl Zement trocknet.
3. Prüfung und Nutzung des Gerätes MY133-V2000
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Dichtheitsprüfung
- Testen Sie das MY133-V2000 Gerät durch Zugabe von 10 µL Lebensmittelfarbe oder deionisiertes Wasser in eines der Löcher Reservoir für die Haftung und den Fluss zu testen.
- Legen Sie ein Rohr (mit einem 1/8 Zoll Außendurchmesser) in den Behälter und schließen Sie das andere Ende an eine Vakuum-Falle. Drehen Sie das Vakuum an ziehen der Farbstoff oder Wasser durch den Kanal um sicherzustellen, dass eine erfolgreiche Gerät erstellt wird.
- Überprüfen Sie unter dem Mikroskop um sicherzustellen, dass keine Lecks in den Kanal oder Behälter vorhanden sind, füllen Sie den Tank mit Ethanol und ermöglichen Sie das Ethanol für 10 min bei Raumtemperatur sitzen. Ziehen Sie dann das Ethanol durch die Verwendung des Vakuums, um Farbstoff oder Wasser aus dem Kanal zu reinigen.
- Sprühen Sie den Kanal mit Ethanol und steckte es in einen sterilen Polystyrol Teller. Wickeln Sie es fest mit Parafilm und speichern Sie es in einer sterilen Umgebung bis benötigt.
Hinweis: an dieser Stelle muss das Gerät aseptisch behandelt werden, um Kontaminationen zu vermeiden. Wenn Sie bereit sind, das Gerät zu verwenden, sollte die Außenseite des Behälters mit Ethanol und brachte in eine biologische Kabinett vor dem Öffnen des Behälters sterilisiert werden.
-
Galvanischen Zellen MCF7 im MY133-V2000 Gerät
- Wachsen Zellen MCF7 auf 10 cm Petrischalen in eine kompletten Medien Dulbeccos minimalen wesentliche Medium (DMEM), ergänzt mit 10 % fötalen Rinderserum, Penicillin-Streptomycin, Glutamin und nicht-essentiellen Aminosäuren in einer Zelle Kultur Inkubator bestehend, eine feuchte Atmosphäre mit 5 % CO2 und 20 % O2 bei einer Temperatur von 37 ° C. Wachsen Sie die Zellen zu etwa 80 % Zusammenfluss bevor sie in die Microchannel Seeder.
- Zuerst Sprühen Sie die Polystyrol Teller, der mikrokanal mit 70 % Ethanol enthält. Dann bringt es in die Biosicherheit Kabinett vor dem Entfernen der Parafilm Schutz des Kanals von der ambient Laborumgebung.
- Immobilisieren Sie Plasma gewonnenen Fibronektin auf der Microchannel-Oberfläche durch Verdünnen es in Dulbeccos Phosphat-gepufferte Kochsalzlösung (DPBS) bis 10 µg/mL. Dann in den Kanal 20 µL dieser Lösung zu injizieren und bei 20 ° C für 45 min inkubieren.
- Waschen der Fibronektin-Lösung aus dem Kanal durch Injektion 20 µL Zellkulturmedien in den Kanal, und lassen Sie es bei 20 ° C für 10 min inkubieren.
- Waschen Sie die Zellen mit 10 mL des DPBS und trypsinize der Zellen durch Zugabe von 1 mL 1 X Trypsin. Inkubieren Sie die Zellen bei 37 ° C für 7 min. neutralisieren die Trypsin mit 9 mL der komplette Medien.
- Injizieren Sie 20 µL der Zellen in den Kanal und inkubieren sie bei 37 ° C für 45-120 min um die Anlage auf das Substrat vor Bildgebung ermöglichen.
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Representative Results
Dieses Protokoll beschreibt die Herstellung von MY133-V2000, ein fluorierter Polymer mit einem niedrigen Brechungsindex passend die des Wassers. Ein wesentliches Merkmal dieses Protokolls ist wie das Fehlen von Adhäsion zu überwinden, die charakteristisch für fluorierte Polymere mit Sauerstoffplasma und durch die Herstellung der Geräte innerhalb einer Acryl Halterung ermöglichen die zusätzliche mechanische Kraft erforderlich, um den Kanal zu versiegeln gegen das PDMS Substrat (Abbildung 1). Die niedrigen Brechungsindex des endgültigen Geräts wird deutlich auf einer makroskopischen Skala (Abbildung 2). Die Kanten eines Kanals machte aus diesem Material sind deutlich zu sehen in Luft (Abb. 2A), aber schwierig zu unterscheiden, wenn unter Wasser (Abbildung 2B) aufgrund der engen Match im Brechungsindex. Dies ermöglicht eine schnelle Überprüfung der optischen Eigenschaften des Materials nach der Herstellung. Eine erfolgreich abgeschlossene Gerät ist in Abbildung 2C, wo die MY133-V2000 Microchannel gesehen werden kann durch das Acryl, das die zusätzliche mechanische Kraft erforderlich, um die Microchannel Dichtung bietet gekapselt gezeigt. Eine erfolgreiche Gerät sollte guten Haftung zwischen dem Gerät und dem Substrat (frei von Luftblasen) zeigen. Das Vorhandensein einer Luftblase in der Mitte des gerätekanals zeigt an, dass die Luft nicht entweichen während der Bindung, sehr wahrscheinlich durch eine Verstopfung der Stauseen wenn das Acryl Zement Sätze durfte. Dieses Gerät zeigt auch gut eingehalten Acryl/Glasschichten mit minimalen Verbeugung von dem Glassubstrat. Probleme in diesem Bereich können durch die beiden Verbreitung des Klebstoffs zwischen den Acryl und Glas Schichten gleichmäßiger oder durch eine Verringerung der Dicke der mikrofluidischen Vorrichtung zur Verhütung von Stress auf den Inhaber gerichtet werden. Schließlich zeigen die Stauseen in allen drei Panels klare Kanten, mit kein Luftspalt an den Rändern. Dies ist ein weiterer potenzieller Problembereich für Gerät-Substrat-Haftung, die durch die Verwendung einer Form Gerät mit Perfusion Ports erbaute eliminiert wird.
Auf einer mikroskopischen Skala sind wenige, wenn überhaupt, Artefakte durch Phase Auspacken durch den Abgleich der Brechungsindizes der Microchannel und den Zellkulturmedien eingeführt. Dies zeigt, dass die Masse von Zellen genau kann, sogar in der Nähe der Kanalwände (Abbildung 3 quantifiziert werden). Gemeinsam, diese Ergebnisse zeigen, auf beide einer makroskopischen Skala und einer mikroskopischen Skala, die Vorteile der Verwendung einer fluorierten Polymeren entsprechend der Indizes der Brechung zwischen der Fertigung Material der Microchannel, wässrigen Zellkulturmedien.
Abbildung 1 : MY133-V2000 weiche Lithographie Workflow. (A) nach dem Befüllen der Formwerkzeugs mit MY133-V2000, Meniskus ist komprimiert mit einem Objektträger auf eine flache Oberfläche und ausgehärteten UV Ofen erstellen. Beachten Sie, dass die Höhe des Negativs der Stauseen vergleichbar mit der Höhe des Werkzeugs ist erstelle ich tiefen Stauseen 3 mm im Durchmesser. (B) nach dem Schneiden des Acryls, Acryl Bodenschicht mit einem Glas deckgläschen vor der Spin-Beschichtung verklebt wird es mit PDMS. Die oberen zwei Acryl Schichten sind laminiert zusammen mit Acryl Zement. (C) die ausgehärtete MY133-V2000-Gerät (Kanal Seite nach oben) und dem Deckglas sind oberflächenbehandelt mit O2 Plasma. (D) schließlich ist das Gerät durch die Einhaltung oberflächenbehandelte Seiten des Gerätes und Deckglas zusammen montiert. PDMS-Dichtung wird dann oben auf dem MY133-V2000 Gerät platziert und das Acryl ist verbunden mit Acryl Zement mit den Löchern sowohl der PDMS-Dichtung und die mittlere Schicht der Acryl Schlange mit den Stauseen. Das zusammengebaute Gerät wird dann von hand für 2 min geklemmt, bis Acryl Zement trocknet. (E) eine Explosionszeichnung des Gerätes zeigt, wie das Gerät montiert ist. (F) A Zeichnung zeigt den Querschnitt durch die Microchannel des fertigen Gerätes. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
Abbildung 2 : Bilder von abgeschlossenen MY133-V2000 Geräte. (A) die Ränder des MY133-V2000 Gerätes sind deutlich sichtbar in der Luft. (B) Wenn in Wasser getaucht, verschwinden die Kanten der gleichen MY133-V2000 Vorrichtung aufgrund der enge Übereinstimmung in Brechungsindizes. (C) dieses Foto zeigt ein fertige Gerät mit einer Acryl-Halter. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
Abbildung 3 : Zellmasse in der Nähe von Microchannel Strukturen genau quantifiziert werden kann. Messungen von der Zellmasse frisch gesäten MCF7-Zellen in der MY133-V2000 Microchannel zeigen keine Artefakte durch Phase-Verpackung in der Nähe (A und B), der Wand oder (C) der Mitte des Kanals. Diese Artefakte sind im MY133-V2000 Kanal wegen der eng aufeinander abgestimmte Brechungsindizes von der Kanal-Material und den Zellkulturmedien vermieden. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
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Discussion
MY133-V2000 kann als Alternative zu traditionellen weiche Lithographie Herstellung Materialien wie PDMS verwendet werden. Bisherigen Arbeit hat gezeigt, dass Materialien mit einem hohen Brechungsindex, wie PDMS, bedeutende Artefakte in der Nähe der Kanalwände aufgrund der unpassende Indizes der Brechung zwischen der Herstellung Material und die wässrige Lösung in den Kanal einführen 13. MY133-V2000 ermöglicht die Anpassung der Brechungsindex des mikrofluidischen zu den wässrigen Lösungen häufig in biomedizinischen Anwendungen verwendet. Dies reduziert bildgebenden Artefakte beim Mikrofluidik mit fortgeschrittenen mikroskopiertechniken, bietet einen entscheidenden Vorteil gegenüber traditionellen mikrofluidischen Herstellung Materialien zu kombinieren. Die Artefakt-Reduzierung in mikrofluidischen Kanälen möglich dieses System ermöglicht Fluoreszenz und quantitativen Phase Mikroskopie (Abbildung 3) Signale genauer quantifiziert werden, sogar in unmittelbarer Nähe zum Microchannel Strukturen13.
Als fluorierte Polymer Exponate MY133-V2000 in der Regel geringe Haftung zwischen der Kanalstruktur und anderen Materialien, damit die Einführung einer großen Einschränkung im Vergleich zu traditionellen Herstellung Materialien. Um diese Herausforderung zu meistern, werden sowohl chemische Oberflächenbehandlung (O2 Plasma) neben der mechanischen Kompression erstellt durch zusammendrücken des Geräts und die PDMS-Dichtung zwischen dem Substrat und ein Stück Acryl verwendet. Der geringere Elastizitätsmodul von PDMS (im Vergleich zu MY133-V2000) ist entscheidend für mechanische Kraft aus Acryl auf MY133-V2000-Gerät zu übertragen da verformbaren genug komprimiert werden, ist erlaubt es, während der Microchannel festzuhalten Gleichzeitig hält es gegen den Untergrund abgedichtet.
Zwei wichtige Punkte des Scheiterns sind anzutreffen, wenn Mikrokanäle mit dieser Methode zu fabrizieren und notierte bei Fehlersuche sollte. Diese sind Leckagen aus dem Reservoir durch überschüssige Schlacken und Leckage aus der Mitte des Kanals, wo die Kraft von der mechanischen Kompression auf ein Minimum ist. Sogar eine kleine Menge von Schlacke aus Stanzen von Löchern für die Stauseen verhindert, dass das Reservoir an das Substrat richtig. Zur Vermeidung von Leckagen aus dem Reservoir enthält die Microchannel-negativen kleine Säulen, 3 mm Durchmesser, die in der Höhe wie die Form ähneln, so dass die Stauseen als Bestandteil der Microchannel umgewandelt werden können, ohne eine Tool verwenden, um die Löcher für die Stauseen zu Stanzen. Stanzen von Löchern für Stauseen nach Aushärtung Schlacke erzeugt, die ohne Beschädigung des Kanals (Abb. 1A) abgespült werden muss. Dies ist in der Praxis schwer zu erreichen. Zur Vermeidung von Leckagen aus der Mitte des Kanals war es wichtig, nicht die Stauseen während der Montage abzudecken, um Luft von unter dem Gerät entweichen kann. Wenn die Stauseen behindert werden, wenn das Gerät zusammen zu kleben, ist Luft unter das Gerät nicht in der Lage zu entkommen, schafft einen Raum für Flüssigkeit aus dem Kanal zu versickern.
Dieses Protokoll stellt daher eine Methode zur Verbesserung der Haftung durch Oberflächenbehandlung und Montage des Gerätes in einer Acryl Halterung, Milderung der negativen Auswirkungen der Fluorierung auf die klebtechnischen Eigenschaften des Polymers. Die Geräte wurden mit Flüssigkeit gefüllt und für bis zu 24 h, zeigen, dass das Gerät für die Dauer einer typischen imaging Experiment funktionstüchtig bleibt inkubiert. MY133-V2000, als Herstellung Material für ein mikrofluidischen Gerät kombinierbar mit QPM Zelle Biomasse zu messen. Zuvor hat QPM gezeigt, um das Wachstum von lebenden Zellen mit präziser als herkömmliche Ansätze17zu messen. Verwendung von QPM kann eine Droge zu Leben-Zelle Antwort mit einzelligen Auflösung11,18,19gemessen werden. In Kombination mit MY133-V2000 können Zellen kultiviert werden, im Kanal für mindestens 1 d, so dass die Wachstumsrate der Zellen, um genau bestimmt werden. Verbindet die Vorteile eines Mikrofluidik und QPM ermöglicht die Messung von Wachstum und Droge Reaktionen der Zellen unter kontrollierten Bedingungen zu leben.
Zukünftige Anwendungen dieser Technik beinhalten Einbeziehung in weiter fortgeschrittenen mikrofluidischen und quantitative Mikroskopie Experimente. Die Elastizität des MY133-V200013 ist kompatibel mit fortgeschrittenen mikrofluidischen Techniken wie Pneumatische Ventile, weiter ermöglichen die Fertigung von komplexen Geometrien und experimentellen Designs. Die hier vorgestellten Ergebnisse zeigen die Verwendung dieses Materials für die Herstellung von quantitativen Messungen mittels QPM. MY133-V2000 sollte auch kompatibel mit anderen quantitative mikroskopiertechniken, wie z. B. Frster Resonanz Energie Transfer oder Fluoreszenz Lifetime Mikroskopie. Dieser Ansatz ermöglicht auch das Gerät auf montiert und abgedichtet gegen ein PDMS-Substrat ermöglicht erweiterte experimentellen Designs wie Verkapselung Fluorophore im Substrat. Insgesamt reduziert MY133-V2000 Artefakte bei quantitativen Messungen in wässrigen Lösungen in Mikrokanälen, so dass es ein ideales Material für die Herstellung von mikrofluidischen Kanäle für die Herstellung von hochpräzisen biomedizinische Messungen.
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Disclosures
Die Autoren haben nichts preisgeben.
Acknowledgments
Diese Arbeit wurde von der University of Utah, das Amt des Vizepräsidenten für Forschung, sowie durch Mittel in Verbindung mit erteilen P30 CA042014 verliehen, dem Huntsman Cancer Institute und der CRR-Programm am Huntsman Cancer Institute unterstützt.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| MY133-V2000 | MY Polymers | MY133-V2000 | |
| Sylgard 184 | Ellsworth Adhesives | 184 SIL ELAST KIT 0.5KG | |
| Fisher Premium microscope slides | Fisher Scientific | 12-544-4 | |
| .118"(3.0mm) x 12" x 12" Acrylic Sheet | United States Plastic Corp | 44290 | |
| .060"(1.5mm) x 12" x 12" Acrylic Sheet | United States Plastic Corp | 44200 | |
| SCIGRIP 3 Very Fast Set Acrylic Cement | United States Plastic Corp | 45735 | |
| Standard Aluminum Foil (.6 mm thick) | VWR | 89107-726 | |
| Kim Wipes | Fisher Scientific | 06-666 | |
| Insta-Cure+ Super Glue | Bob Smith Industries | BSI-109 | |
| 1/8" PVC tubing | McMaster Carr | 5231K55 | |
| McCormick Food Coloring | Target | 13353207 | |
| X-Acto #1 Precision Knife | X-Acto | X3201 | |
| X-Acto #18 Heavyweight wood chiseling blade | X-Acto | X218 | |
| VWR Razor Blades | VWR | 55411-055 | |
| Surface Treated Cell Culture Dishes | Fisher Scientific | FBO12922 | |
| Fibronectin Human Plasma | Sigma-Aldritch | F0895-1MG | |
| Trypsin-EDTA 10x | Fisher Scientific | 15-400-054 | |
| Corning Dulbecco's Phosphate Buffered Saline | Fisher Scientific | MT21030CM | |
| Gibco Penicillin-Streptomycin | Fisher Scientific | 15-140-148 | |
| HyClone Nonessential Amino Acids 100x | Fisher Scientific | SH3023801 | |
| Fetal Bovine Serum | Omega Scientific | FB-12 | |
| Corning DMEM with L-glutamine and glucose | Fisher Scientific | MT10013CV | |
| Trichloro(1H,1H,2H,2H-perfluorooctyl)silane | Sigma-Aldritch | 448931 | Reacts violently with water |
| Ethanol, 200 proof Decon Labs | Fisher Scientific | 04-355-223 | |
| Acetone | Fisher Scientific | A18P-4 | |
| Bel-Art 42025 Plastic Dessicator | Cole-Parmer | EW-06514-30 | |
| Epilog Fusion Laser Cutter, 120 W | Epilog Laser | Epilog Fusion M2 32 Laser | |
| Isotemp Stirring Hotplate | Fisher Scientific | SP88850200 | |
| Ateco 14111 1.5 inch stainless steel cutter | Ateco | 14111 | |
| Pyrex Glass Cell Culture Dish | Fisher Scientific | 08-747B | |
| Radio Frequency Plasma Cleaner | Harrick Plasma | PDC-32G | Used with Oxygen gas |
| Black Hole Laboratories Digivac | Black Hole Laboratories | Model 215 | |
| Intelli-Ray Ultraviolet Oven | Uvitron | UVO338 | |
| Compact Spin Coater | MTI Corporation | VTC-100A | |
| Fisher Brand Isotemp Oven | Fisher Scientific | 15-103-0510 | Forced Air Convection |
| Gilson Positive Displacement Pipette P1000 | Fisher Scientific | FD10006G | |
| HeraCell VIOS 160i | Fisher Scientific | 13 998 212PM |
References
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