Summary
Det här protokollet beskriver tillverkning av mikrofabricerade enheter från MY133-V2000 att eliminera artefakter som ofta uppstår i mikrokanaler på grund av de inte matchar refractive index mellan microchannel strukturer och en vattenlösning. Detta protokoll används en akryl innehavaren för att komprimera den inkapslade enheter, förbättrar vidhäftning både kemiskt och mekaniskt.
Abstract
Användning av mikrofabricerade enheter har vuxit fram som ett avgörande verktyg för biomedicinska tillämpningar. I kombination med moderna mikroskopi tekniker, kan dessa enheter implementeras som en del av en robust plattform som är kapabla att göra samtidiga kompletterande mätningar. Den primära utmaningen skapad av kombinationen av dessa två tekniker är en felmatchning i brytningsindex mellan de material som traditionellt används för att göra mikroflödessystem enheter och de aqueous lösningar som vanligtvis används i biomedicin. Denna obalans kan skapa optiska artefakter nära kanal eller enhet kanterna. En lösning är att minska brytningsindex för det material som används för att tillverka enheten med hjälp av en fluorerad polymer såsom MY133-V2000 vars brytningsindex är liknande till det av vatten (n = 1,33). Här, byggandet av en mikroflödessystem enhet gjord av MY133-V2000 med mjuk litografi tekniker demonstreras, använda O2 plasma i samband med en akryl innehavaren för att öka vidhäftning mellan MY133-V2000 fabricerade enheten och den Polydimetylsiloxan (PDMS) substrat. Enheten testas sedan genom inkubation det fylld med cell Odlingsmedier för 24 h att demonstrera enheten förmåga att upprätthålla cell kultur förutsättningar under en typisk imaging experiment. Slutligen används kvantitativa fas mikroskopi (QPM) att mäta fördelningen av massan inom levande vidhäftande cellerna i microchannel. På så sätt demonstreras ökad precision, aktiverad genom att tillverka enheten från en låg brytningsindex polymer såsom MY133-V2000 i stället för traditionell mjuk litografi material såsom PDMS. Sammantaget kan detta tillvägagångssätt för att fabricera mikroflödessystem enheter integreras lätt i befintliga mjuk litografi arbetsflöden för att minska optiska artefakter och öka mätprecision.
Introduction
Utvecklingen av mikrofabricerade teknik har möjliggjort ett brett utbud av ny biomedicinsk teknik som utnyttjar den unika fysiken mikroskopisk skala flöden1,2. Detta inkluderar de diagnostiska tekniker som byggt på mikroflödessystem plattformar som kvantifiera kliniskt relevanta biomarkörer, inklusive cell stelhet3, ytmarkörer4och tillväxt5. Genom att manipulera enstaka celler, kan ultrakalla enheter också användas att mäta biomarkörer heterogenitet, till exempel som en indikator på malignitet6. Möjligheten att kombinera mikroflödessystem applikationer med mikroskopi har ytterligare ökat nyttan av dessa plattformar genom att tillåta enheter som mäter flera biomarkörer samtidigt7.
QPM är en mikroskopi-teknik som mäter fasförskjutning som ljuset passerar genom och interagerar med frågan släpper transparenta prover. Massan av enskilda celler kan beräknas från QPM mätningar, med hjälp av kända förhållandet mellan brytningsindex och biomassa densitet8,9. Tidigare arbete har visat att QPM kan mäta kliniskt relevanta parametrar såsom cell tillväxt10,11 och cell mekaniska egenskaper via oordning styrka12. Kombination med mikrofluidik, kan QPM användas för att mäta cell beteende i en mycket kontrollerad miljö i vitro. En av de främsta utmaningarna att kombinera QPM med mikrofluidik är högt brytningsindex för de flesta polymerer som används för att konstruera mikroflödessystem kanaler via mjuk litografi13.
En viktig utmaning inför kombinationen av mikrofluidik med olika tekniker för mikroskopi är en felmatchning mellan brytningsindex av enhetens material i förhållande till brytningsindex för vatten14,15. En metod att bemöta detta är med hjälp av en låg brytningsindex polymer såsom CYTOP16 eller MY133-V200013. Det senare är en fluorerade ultraviolett (UV)-botas akrylat polymer som har ett brytningsindex som liknar vatten (n = 1,33) och som är kompatibel med mjuk litografi tekniker, vilket möjliggör en smidig integrering i många etablerade mikrofabricerade enheten fabrication arbetsflöden. Detta gör MY133-V2000 inte endast lämplig för mikroflödessystem enhet tillverkning, men också gör att den kan lätt kombineras med QPM och andra mikroskopi tillvägagångssätt, för att mäta cell beteende både på kolonin och i enskild cell skala. MY133-V2000 eliminerar artefakter på grund av fas uppackning genom att producera lite, om någon, fasförskjutning som ljus passerar genom gränssnittet vatten-MY133.
Trots att eliminera obalansen i brytningsindex, är en stor utmaning som är associerad med enheter tillverkade av fluorerade polymerer, såsom MY133-V2000, låg adherencen till andra material såsom glas eller PDMS. Detta arbete visar tillverkning av en MY133-V2000 mikroflödessystem enhet med mjuk litografi. Använda O2 plasma för att behandla ytan av både kanalen och PDMS garanterar substrat kombinerat med en custom-fabricerade akryl hållare att enheten följer underlaget, att skapa en sluten kanal. Denna enhet är lämplig för cellodling och QPM att mäta massan av celler i kanalen, som har viktiga program för att mäta tillväxt av levande celler och intracellulär transport av cell biomassa, som båda har klinisk relevans i diagnostik medicin och drug discovery.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. tillverkning av Polydimetylsiloxan negativa
-
Beredning av Polydimetylsiloxan
- Åtgärd 18 g PDMS silikonelastomerer och 1,8 g av bota reagens. Häll en mäta båt som innehåller elastomer bota reagensen.
- Blanda elastomer och bota reagensen kraftigt i 1 min och Lägg blandningen i en vakuumkammare för 30 min.
- Ta bort PDMS från dammsuga, Häll 15 g på det negativa med hjälp av en cookie cutter (radie = 3,8 cm) att hålla PDMS körs på sidan, och täcka resterande PDMS blandningen.
- Placera formen som innehåller PDMS in i vakuum kammaren i 10 min.
- Ta bort mögel som innehåller PDMS från vakuumkammare, placera den på en värmeplatta som anges till 150 ° C i 60 min att bota, och täck den med aluminiumfolie.
- Häll den resterande PDMS på en inverterad glas petriskål (10 cm i diameter), använda en annan cookie cutter som gjutform, för att skapa en pad av PDMS. Sätta in detta i en vakuumkammare tills den PDMS negationen är helt botad.
- Överföra petriskål med PDMS från dammsuga till förvärmd värmeplattan att bota vid 150 ° C i 60 min.
-
Plasma ytbehandling av Polydimetylsiloxan
- Infoga ett vasst rakblad under PDMS och cookie cutter att ta försiktigt bort PDMS från negativ.
- Använd en vass hobbykniv för att skära ut negationen från den största biten av PDMS; Det ska skäras med tillräckligt buffert område att fästa en annan bit av PDMS ovanpå det utan att hindra negationen.
- Infoga ett vasst rakblad under den härdade PDMS med negationen till försiktigt PDMS från petriskål.
- Använda en hobbykniv att skära ut en bit av PDMS från pad som är i samma storlek som bit skär för negativa. Sedan skär en rektangel av den nya bit av PDMS med tillräckligt med utrymme för att passa det runt microchannel när det placeras ovanpå negationen.
- Lägg båda bitar av PDMS (negativa och rektangeln) på ett platt substrat (t.ex. en bild gjord av glas, kvarts, polystyren eller annat material) och infoga dem i en radiofrekvens (RF) plasma renare. Stäng dörren och försegla kammaren av evakuera luften med hjälp av en vakuumpump. Injicera luften upp till ett tryck av 400 mTorr med en digital vakuumtryck controller.
Obs: Om det substrat som används för plasma rengöring inte har använts i plasma renare, Lägg in plasma renare genom att själv för 60 s före behandling av negationen, för att förhindra akryl baslager fastnar substrat. - Slå på RF-inställningen till hög, och en rosa luft plasma bör visas i visningsfönstret. Plasma-behandla två bitar av PDMS för 30 s, sedan stänga av RF-inställningen. Att luft att sakta inträda i kammaren för att förhindra ett turbulent luftflöde från störande innehållet i kammaren.
- Ta bort PDMS från plasma renare och placera den på en bänkmonterade. Sedan försiktigt Invertera PDMS rektangeln över negationen och tryck ned den med ett par pincett. Låt den vila i 10 min att tillåta två bitar av PDMS att följa varandra.
-
Fluorosilane ytbehandling av den negativa Polydimetylsiloxan
- Använd en dropper att sätta 2 droppar triklor (1H, 1H, 2H, 2H-perfluoro-octyl) silan (PFOTS) till en liten väger båten och infoga den i en glas vakuumkammare.
- Invertera PDMS på en bit aluminiumfolie (så att den microchannel negationen vänd uppåt) och sätta den i glas vakuum kammaren. Sedan evakuera kammaren kontinuerligt under 24 h.
2. tillverkning av den MY133 Microchannel
-
Bildar MY133-V2000 microchannel struktur
- Fyll den negativa PDMS med 400 µL av MY133-V2000.
Obs: Negationen får något överfyllas. - Placera den MY133 V2000-fyllda PDMS negativa i vakuumkammare för 2 h att ta bort eventuella bubblor.
- Ta bort MY133-V2000 från vakuum och tryck långsamt på en glasskiva mot toppen av det något överfyllt negationen att skapa en plan yta av MY133-V2000 och att förhindra att syre att hämma polymerisation.
Obs: PDMS, på ytan kanal kommer delvis hämma polymerisation, möjliggör limning i senare skeden. Glasskiva har en något reducerad UV öppenhet (35%) jämfört med kvarts, som hjälper till att förhindra någon gulfärgning av härdade enheten. - Infoga MY133-V2000 i en 400 W UV-ugn och Ställ in UV-strålningen till 50% av den maximal intensiteten för 300 s att bota den MY133-V2000 microchannel.
Obs: Peak våglängd används för att bota enheten är ca 375 nm med en bandbredd på ca 25 nm. Cirka 4 500 mJ/cm2 maktens användes för att bota microchannel, vilket är något mer än dubbla den lägsta härdning makt som rekommenderas av tillverkaren.
- Fyll den negativa PDMS med 400 µL av MY133-V2000.
-
Bygga akryl innehavaren
- Rita akryl baslager med en vektor ritning programvara. Kontrollera baslagret är en rektangel som är 1,5 mm tjocka, 75 mm lång och 25 mm bred, med en centrerad rektangel som mäter 25 x 11 mm.
- Rita akryl mitten lagret med hjälp av en vektor ritprogram. Kontrollera det mellersta skiktet är en rektangel (1,5 mm tjock, 75 mm lång och 25 mm bred) med en centrerad kvadrat (5 x 5 mm) och två cirklar (båda med en diameter av 3 mm) åtskilda av 15 mm.
- Rita det akryl översta lagret med hjälp av en vektor ritprogram. Kontrollera att det översta lagret är en rektangel (3 mm tjock, 30 mm lång och 25 mm bred) med en centrerad kvadrat (5 x 5 mm) och två cirklar (båda med en diameter av 3 mm) åtskilda av 15 mm.
- Klipp ut de enhet mönster skapat i ritprogrammet vektor med en laserskärare. Använda prov inställningarna för 100% effekt och 30% hastighet. Kör programmet två gånger för att säkerställa att akryl skärs ut.
- Tryck hål i det akryl översta lagret med en storlek M5 0,80-mm att trycka verktyget.
- Torka akryl bitar med aceton till att ta bort eventuella kvarvarande märken eller brännskador.
-
Limning av MY133-V2000 i akryl hållaren
- Fäst baslagret akryl glassubstrat med en adhesiv såsom cyanoakrylat superlim. Placera två små droppar på kanterna av akryl och sedan använda ett disponibla verktyg för att sprida jämnt limmet. Placera glassubstrat på akryl och låt limmet torka använda vikten på glaset för att hålla den på plats.
- Coat exponerade glaset med 100 µL av PDMS med positiv förskjutning pipett; sedan in en vakuum spin coater baslagret och ange det till 1 500 rpm för 2 min till jämt täcka glaset med en PDMS film ca 10 µm tjock.
- Ta bort baslagret från den spin coater och noggrant torka bort någon överflödig PDMS som belagd i akryl med aceton och papper handduk. Var noga med att inte störa den ohärdade PDMS.
- Grädda baslager med PDMS i en ugn vid 65 ° C i 2 h att bota PDMS.
- Pipettera 1 mL av PDMS på en glasskiva och Använd sedan en annan glasskiva för att jämnt fördelade i PDMS tills det börjar sippra ut sidorna. Bota detta på en värmeplatta vid 150 ° C i 10 min.
- Skär den härdade PDMS i en rektangel med samma mått som MY133-V2000 enheten och sedan använder det mellersta lagret av akryl som gjutform, stansa hål för reservoaren och skär en kvadrat fönster i PDMS att göra PDMS packningen.
- Placera den MY133-V2000, kanal sida upp, på samma eller en liknande platta substrat som används för plasma-behandling av PDMS i steg 1.2.5. Placera akryl baslager som innehåller härdade PDMS substratet tillsammans med MY133-V2000 kanalen i O2 plasma renare. Ställ in vakuum trycket till 200 mTorr och RF-nivå till hög och ytan-treat kanal och glas substrat för 30 s.
- Med pincett, omedelbart Placera kanalen MY133-V2000-ner i det rektangulära utklippt av bas lager akryl så att den MY133-V2000 kontakter PDMS.
- Placera den PDMS packningen ovanpå MY133-V2000 enheten, rada upp hålen i packningen med reservoarer i enheten.
- Placera oavslutade enheten på en upphöjd plattform ovanför bänken att ge en fastspänning yta för enheten montering.
- Utdrag 3 mL av akryl cement med en spruta. Distribuera tillräckligt akryl cement ovanpå baslager att tillhandahålla en tunn beläggning. Gör pälsen som även som möjligt och låt inte de materiella sippra in i kanal.
- Placera mitten av lager akryl pjäsen ovanpå bas lager akryl. Kontrollera att hålen radas med behållarna i MY133-V2000 kanalen.
- Använda 3 små klämmor för att hålla baslagret och mellanlager tillsammans som tätt som möjligt under 2 minuter medan akryl cement hårdnar, för att limma bitar av akryl tillsammans. Säkerställa att behållarna inte blockeras under detta steg för att förhindra luft från att bli instängd under MY133-V2000 enheten.
- Ta bort trycket från enheten och placera akryl cement på mitten lagret i förlägger av förväntade kontakt med det översta lagret av akryl.
- Placera det översta lagret av akryl på mitten lagret lappa av den akryl, se till att hålen är i linje med reservoarerna, och låt det vila på bänken för 2 min medan akryl cement torkar.
3. testa och använda enhetens MY133-V2000
-
Läcka testning
- Testa MY133-V2000 enheten genom att lägga till 10 µL livsmedelsfärgämne eller avjoniserat vatten till en reservoar hålen att testa för vidhäftning och flöde.
- Infoga en tub (med en 1/8-i yttre diameter) i behållaren och Anslut den andra ändan till ett vakuum fälla. Slå vakuum vidare till pull färgen eller vatten genom kanalen för att säkerställa att en framgångsrik enhet skapas.
- Kolla under ett mikroskop för att kontrollera att det inte finns några läckor i kanal eller reservoar, Fyll behållaren med etanol och tillåta etanolen att stå i rumstemperatur i 10 min. Sedan, dra etanol genom att använda vakuum, för att rengöra färgämnet eller vatten ur kanal.
- Spraya kanalen med etanol och sätta det i en steril polystyren maträtt. Linda den hårt med parafilm och förvara det i en steril miljö tills behövs.
Obs: vid denna punkt, enheten måste hanteras aseptiskt för att förhindra kontamination. När du är redo att använda enheten, bör utsidan av behållaren steriliseras med etanol och förde in en biosäkerhet skåp innan du öppnar förpackningen.
-
Plätering MCF7 celler i MY133-V2000 enheten
- Odla MCF7 cellerna på 10-cm petriskålar i en komplett media bestående av Dulbeccos minsta viktigt medium (DMEM), kompletterad med 10% fetalt bovint serum, penicillin-streptomycin, glutamin och icke-essentiella aminosyror, i en cell kultur inkubator som bibehåller en fuktig atmosfär som innehåller 5% CO2 och 20% O2 vid en temperatur av 37 ° C. Växa cellerna till ungefärligt 80% sammanflödet innan sådd dem i microchannel.
- Först spraya polystyren skålen som innehåller microchannel med 70% etanol. Sedan sätta det i biosäkerhet skåp innan du tar bort den parafilm skydda kanalen från omgivande laboratoriemiljö.
- Immobilisera mänskliga-plasmaderiverade Fibronektin på microchannel ytan genom att späda ut det i Dulbeccos fosfatbuffrad saltlösning (DPBS) till 10 µg/mL. Sedan injicera 20 µL av denna lösning i kanalen och inkubera det vid 20 ° C i 45 min.
- Tvätta den Fibronektin lösningen ur kanal genom att injicera 20 µL av cell kultur media i kanalen, och gör det möjligt att Inkubera vid 20 ° C i 10 min.
- Tvätta cellerna med 10 mL av DPBS och trypsinize celler genom att tillsätta 1 mL 1 x trypsin. Inkubera cellerna vid 37 ° C för 7 min. neutralisera trypsin med 9 mL av komplett media.
- Injicera 20 µL av cellerna i kanalen och inkubera dem vid 37 ° C i 45-120 min så att den bifogade filen till substratet innan imaging.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Det här protokollet beskriver tillverkning av MY133-V2000, en fluorerade polymer med lågt brytningsindex matchning som vatten. En viktig funktion i detta protokoll är hur man kan övervinna bristande vidhäftning som kännetecknar fluorerade polymerer med hjälp av syre plasma och genom att tillverka enheten inom en akryl innehavaren att tillhandahålla extra mekaniska kraften som krävs för att täta kanalen mot PDMS substratet (figur 1). Låg brytningsindex för den sista enheten visas tydligt på en makroskopisk skala (figur 2). Kanterna på en kanal som tillverkade av detta material är tydligt i luft (figur 2A) men blir svårt att urskilja när nedsänkt i vatten (figur 2B) på grund av den nära matchen i brytningsindex. Detta ger en snabb kontroll av de optiska egenskaperna hos materialet efter tillverkning. Ett framgångsrikt genomförda enhet visas i figur 2C, där den MY133-V2000 microchannel kan ses inkapslat av den akryl som ger den extra mekanisk kraft som krävs för att försegla microchannel. En framgångsrik enhet bör visa god vidhäftning (utan luftbubblor) mellan enheten och substrat. Förekomsten av en luftbubbla i mitten av kanalen enheten indikerar att luften inte var tillåten att fly under bindning, troligen på grund av ett hinder av reservoarerna när akryl cement uppsättningar. Denna enhet visar också väl fastsatta akryl/glas lager med minimal bugande av glassubstrat. Problem i detta område kan åtgärdas genom att antingen sprida limmet jämnare mellan akryl och glas eller genom att minska tjockleken på mikroflödessystem enheten att förebygga stress på hållaren. Slutligen visar behållarna i alla tre paneler tydliga kanter, med inga luftspalter vid kanterna. Detta är en annan potentiell problemområde för enhet-substrat vidhäftning som elimineras genom användning av en enhet mögel med perfusion hamnar byggdes.
På mikroskopisk nivå introduceras få, om några, artefakter på grund av fas uppackning genom att matcha de refractive indexen microchannel och cell kulturmassmedia. Detta visar att massan av celler kan kvantifieras just ens i närheten av kanal väggarna (figur 3). Sammantaget dessa resultat visar, på både en makroskopisk skala och på en mikroskopisk skala, fördelarna med att använda en fluorerade polymer för att matcha index av Refraktionen mellan fabrication materialet i microchannel till vattenhaltiga cell kultur media.
Figur 1 : MY133-V2000 mjuk litografi arbetsflödet. (A) efter att fylla formen med MY133-V2000, menisken är komprimerad med en glasskiva för att skapa en platt yta och härdade i en UV-ugn. Observera att höjden av negationen av behållarna är jämförbar med höjden av mögel att skapa djupa reservoarer 3 mm i diameter. (B) efter kapning av akryl, akryl bottenlagret limmas mot ett täckglas före spin-beläggning med PDMS. De översta två akryl lagrarna är laminerade tillsammans med akryl cement. (C) den härdade MY133-V2000 enhet (kanal sidan uppåt) och täckglaset är ytbehandlade med O2 plasma. (D) Slutligen enheten monteras av vidhäftning ytbehandlade sidorna av enheten och täckglas. PDMS packningen placeras ovanpå MY133-V2000 enheten och akryl är fäst med akryl cement, med hålen i både PDMS packningen och det mellersta lagret av den akryl foder upp med behållarna. Den monterade enheten spänns sedan för hand i 2 min tills akryl cement torkar. (E), Sprängskiss av enheten visar hur enheten monteras. (F), A ritningen visar ett tvärsnitt genom microchannel av den färdiga enheten. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2 : Bilder av ifyllda MY133-V2000 enheter. (A) kanterna på MY133-V2000 enheten är tydligt synliga i luften. (B) när nedsänkt i vatten, kanterna på samma MY133-V2000 enhet försvinner på grund av den nära matchen i refractive index. (C), Detta fotografi visar en färdig enhet med en akryl hållare. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 3 : Cellmassan kan kvantifieras just nära microchannel strukturer. Mätningar av cellmassan av nymalen seedade MCF7 celler i den MY133-V2000 microchannel visar inga artefakter på grund av fas omslag nära (A och B) väggen eller (C), i mitten av kanalen. Dessa artefakter undviks i MY133-V2000 kanalen på grund av noggrant matchade refractive index för kanal materialet och cell kulturmassmedia. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
MY133-V2000 kan användas som ett alternativ till traditionella mjuka litografi fabrication material såsom PDMS. Tidigare arbete har visat att material med ett högt brytningsindex, såsom PDMS, införa betydande artefakter nära kanal väggarna på grund av de inte matchar index av refraktion mellan fabrication materialet och den aqueous lösningen inuti kanalen 13. MY133-V2000 möjliggör matchande brytningsindex för mikroflödessystem enheten till de vattenlösningar som vanligen används i biomedicinska tillämpningar. Detta minskar imaging artefakter när du kombinerar mikrofluidik med avancerad mikroskopi tekniker, som ger en klar fördel jämfört med traditionella mikroflödessystem fabrication material. Artefakt minskningen mikroflödessystem kanaler möjliggörs genom detta system möjliggör fluorescens och kvantitativa fas mikroskopi (figur 3) signaler till kvantifieras mer exakt, även i närheten av microchannel strukturer13.
Som en fluorerade polymer uppvisar MY133-V2000 vanligtvis låg friktion mellan kanal struktur och andra material, alltså införa en stor begränsning jämfört med traditionell tillverkning material. För att övervinna denna utmaning, både kemisk ytbehandling (O2 plasma) utöver mekanisk kompression skapad av klämma enheten och PDMS packningen mellan substratet och en bit av akryl används. Den lägre elasticitetsmodulen av PDMS (jämfört med MY133-V2000) är kritisk till överföring av mekanisk kraft från akryl till MY133-V2000 enheten, eftersom det är deformerbara nog att komprimeras, gör det möjligt att hålla microchannel på plats medan samtidigt håller det förseglade mot underlaget.
Två viktiga felpunkter kan uppstå när fabricera mikrokanaler användande den här metod och bör vara noterade när felsökning. Dessa är läckage från reservoaren på grund av överskott slagg och läckage från mitten av kanalen där kraften från mekanisk kompression är ett minimum. Även en liten mängd slagg från stansning hål för behållarna förhindrade att reservoaren följa underlaget ordentligt. För att förhindra läckor från reservoaren, innehåller den microchannel negationen små pelare, 3 mm i diameter, som är liknande i höjd som mögel, så att behållarna kan gjutas som en del av microchannel utan att behöva använda ett verktyg för att stansa hål för behållarna. Hålslagning för reservoarer efter härdning skapar slagg som måste tvättas bort utan att skada kanalen (figur 1A). Detta är svårt att uppnå i praktiken. För att förhindra läckor från mitten av kanalen, var det viktigt att täcka reservoarerna under monteringen för att tillåta luft att fly från under enheten. Om behållarna hindras när limning enheten tillsammans, går luft under enheten inte att fly, att skapa ett utrymme för vätska att sippra ur kanal.
Detta protokoll, presenterar därför en metod för att förbättra vidhäftning både genom ytbehandling och montering av enheten i en akryl hållare, mildra de negativa effekterna av fluorination på de vidhäftande egenskaperna av polymeren. Enheterna var fylld med vätska och inkuberas i upp till 24 h, visar att enheten förblir funktionell för varaktigheten av en typisk imaging experiment. MY133-V2000, kan som tillverkning material för en mikroflödessystem enhet, kombineras med QPM att mäta cell biomassa. QPM har tidigare visat att mäta tillväxten av levande celler med en större precision än konventionella metoder17. Använda QPM, kan en live-cell narkotika svar mätas med encelliga resolution11,18,19. Kombination med MY133-V2000, kan celler vara odlade i kanalen för minst 1 d, aktivera tillväxten av celler skall bestämmas exakt. Kombinerar fördelarna med både mikrofluidik och QPM möjliggör mätning av tillväxt och live drog Svaren av celler under kontrollerade förhållanden.
Framtida tillämpningar av denna teknik innebär att införliva det i mer avancerade mikroflödessystem och kvantitativ mikroskopi experiment. Elasticiteten i MY133-V200013 är kompatibel med avancerade mikroflödessystem tekniker såsom pneumatiska ventiler, ytterligare möjliggör tillverkning av komplexa geometrier och experimentell design. Resultaten presenteras här demonstrera användningen av detta material för att göra kvantitativa mätningar använder QPM. MY133-V2000 bör också vara förenliga med andra kvantitativ mikroskopi tekniker, såsom Frster resonans energi överföring eller fluorescens livstid mikroskopi. Detta tillvägagångssätt möjliggör också att enheten ska monteras på och tätad mot PDMS substrat, aktivera avancerade experimentella konstruktioner såsom encapsulating fluorophores i substratet. Sammantaget minskar MY133-V2000 artefakter när att göra kvantitativa mätningar i vattenlösningar i mikrokanaler, vilket gör det ett idealiskt material för tillverkning av mikrofabricerade kanaler för att göra hög precision biomedicinsk mätningar.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna har något att avslöja.
Acknowledgments
Detta arbete stöds av University of Utah för Vice ordföranden för forskning, liksom av medel i samband med bevilja P30 CA042014 tilldelas the Huntsman Cancer Institute och Kapitalkravsförordningen programmet på Huntsman Cancer Institute.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| MY133-V2000 | MY Polymers | MY133-V2000 | |
| Sylgard 184 | Ellsworth Adhesives | 184 SIL ELAST KIT 0.5KG | |
| Fisher Premium microscope slides | Fisher Scientific | 12-544-4 | |
| .118"(3.0mm) x 12" x 12" Acrylic Sheet | United States Plastic Corp | 44290 | |
| .060"(1.5mm) x 12" x 12" Acrylic Sheet | United States Plastic Corp | 44200 | |
| SCIGRIP 3 Very Fast Set Acrylic Cement | United States Plastic Corp | 45735 | |
| Standard Aluminum Foil (.6 mm thick) | VWR | 89107-726 | |
| Kim Wipes | Fisher Scientific | 06-666 | |
| Insta-Cure+ Super Glue | Bob Smith Industries | BSI-109 | |
| 1/8" PVC tubing | McMaster Carr | 5231K55 | |
| McCormick Food Coloring | Target | 13353207 | |
| X-Acto #1 Precision Knife | X-Acto | X3201 | |
| X-Acto #18 Heavyweight wood chiseling blade | X-Acto | X218 | |
| VWR Razor Blades | VWR | 55411-055 | |
| Surface Treated Cell Culture Dishes | Fisher Scientific | FBO12922 | |
| Fibronectin Human Plasma | Sigma-Aldritch | F0895-1MG | |
| Trypsin-EDTA 10x | Fisher Scientific | 15-400-054 | |
| Corning Dulbecco's Phosphate Buffered Saline | Fisher Scientific | MT21030CM | |
| Gibco Penicillin-Streptomycin | Fisher Scientific | 15-140-148 | |
| HyClone Nonessential Amino Acids 100x | Fisher Scientific | SH3023801 | |
| Fetal Bovine Serum | Omega Scientific | FB-12 | |
| Corning DMEM with L-glutamine and glucose | Fisher Scientific | MT10013CV | |
| Trichloro(1H,1H,2H,2H-perfluorooctyl)silane | Sigma-Aldritch | 448931 | Reacts violently with water |
| Ethanol, 200 proof Decon Labs | Fisher Scientific | 04-355-223 | |
| Acetone | Fisher Scientific | A18P-4 | |
| Bel-Art 42025 Plastic Dessicator | Cole-Parmer | EW-06514-30 | |
| Epilog Fusion Laser Cutter, 120 W | Epilog Laser | Epilog Fusion M2 32 Laser | |
| Isotemp Stirring Hotplate | Fisher Scientific | SP88850200 | |
| Ateco 14111 1.5 inch stainless steel cutter | Ateco | 14111 | |
| Pyrex Glass Cell Culture Dish | Fisher Scientific | 08-747B | |
| Radio Frequency Plasma Cleaner | Harrick Plasma | PDC-32G | Used with Oxygen gas |
| Black Hole Laboratories Digivac | Black Hole Laboratories | Model 215 | |
| Intelli-Ray Ultraviolet Oven | Uvitron | UVO338 | |
| Compact Spin Coater | MTI Corporation | VTC-100A | |
| Fisher Brand Isotemp Oven | Fisher Scientific | 15-103-0510 | Forced Air Convection |
| Gilson Positive Displacement Pipette P1000 | Fisher Scientific | FD10006G | |
| HeraCell VIOS 160i | Fisher Scientific | 13 998 212PM |
References
- Zare, R. N., Kim, S. Microfluidic platforms for single-cell analysis. Annual Review Biomedical Engineering. 12, 187-201 (2010).
- Neuzi, P., Giselbrecht, S., Lange, K., Huang, T. J., Manz, A. Revisiting lab-on-a-chip technology for drug discovery. Nature Reviews Drug Discovery. 11 (8), 620-632 (2012).
- Xu, W., et al. Cell stiffness is a biomarker of the metastatic potential of ovarian cancer cells. PLoS ONE. 7 (10), 46609 (2012).
- Karakas, H. E., et al. A microfluidic chip for screening individual cancer cells via eavesdropping on autophagy-inducing crosstalk in the stroma niche. Scientific Reports. 7 (1), 2050 (2017).
- DeBerardinis, R. J., Lum, J. J., Hatzivassiliou, G., Thompson, C. B. The biology of cancer: metabolic reprogramming fuels cell growth and proliferation. Cell Metabolism. 7 (1), 11-20 (2008).
- Yin, H., Marshall, D. Microfluidics for single cell analysis. Current Opinion in Biotechnology. 23 (1), 110-119 (2012).
- Kemper, B., et al. Monitoring of laser micromanipulated optically trapped cells by digital holographic microscopy. Journal of Biophotonics. 3 (7), 425-431 (2010).
- Barer, R. Interference micorscopy and mass determination. Nature. 169 (4296), 366-367 (1952).
- Zangle, T. A., Teitell, M. A. Live-cell mass profiling: an emerging approach in quantitative biophysics. Nature Methods. 11 (12), 1221-1228 (2014).
- Chun, J., et al. Rapidly quantifying drug sensitivity of dispersed and clumped breast cancer cells by mass profiling. Analyst. 137 (23), 5495-5498 (2012).
- Reed, J., et al. Live cell interferometry reveals cellular dynamism during force propagation. Acs Nano. 2 (5), 841-846 (2011).
- Eldridge, W. J., Steelman, Z. A., Loomis, B., Wax, A. Optical Phase Measurements of Disorder Strength Link Microstructure to Cell Stiffness. Biophysical Journal. 112 (4), 692-702 (2017).
- Kim, D. N. H., Kim, K. T., Kim, C., Teitell, M. A., Zangle, T. A. Soft lithography fabrication of index-matched microfluidic devices for reducing artifacts in fluorescence and quantitative phase imaging. Microfluidics and Nanofluidics. 22 (1), 11 (2018).
- Byron, M. L., Variano, E. A. Refractive-index-matched hydrogel materials for measuring flow-structure interactions. Experiments in Fluids. 54 (2), 6 (2013).
- Ogawa, T., Hanada, Y. Microfabrication of the UV transparent polymer CYTOP using a conventional pulsed green laser. Applied Physics a-Materials Science & Processing. 122 (3), 6 (2016).
- Hanada, Y., Ogawa, T., Koike, K., Sugioka, K. Making the invisible visible: a microfluidic chip using a low refractive index polymer. Lab on a Chip. 16 (13), 2481-2486 (2016).
- Zangle, T. A., Burnes, D., Mathis, C., Witte, O. N., Teitell, M. A. Quantifying biomass changes of single CD8+ T cells during antigen specific cytotoxicity. PLoS One. 8 (7), 68916 (2013).
- Huang, D., et al. High Speed Live Cell Interferometry: A New Method for Rapidly Quantifying Tumor Drug Resistance and Heterogeneity. Analytical Chemistry. 90 (5), 3299-3306 (2018).
- Mir, M., Bergamaschi, A., Katzenellenbogen, B. S., Popescu, G. Highly sensitive quantitative imaging for monitoring single cancer cell growth kinetics and drug response. PLoS ONE. 9 (2), 89000 (2014).
