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Developmental Biology

मानव मौलिक रोगाणु कोशिका की पीढ़ी-pluripotency प्रेरित Pluripotent स्टेम कोशिकाओं से Embryoid निकायों की सतह पर कोशिकाओं की तरह

Published: January 11, 2019 doi: 10.3791/58297
Automatic Translation
1, 1, 1, 2, 1
1Center for Cancer Research, Massachusetts General Hospital, 2Department of Molecular Genetics, Weizmann Institute of Science

Summary

मौलिक रोगाणु कोशिकाओं (PGCs) शुक्राणु और अंडे दोनों के आम अग्रदूत हैं । मानव भ्रूण PGCs साइटोकिंस की बातचीत के माध्यम से pluripotent epiblast कोशिकाओं से निर्दिष्ट कर रहे हैं । यहां, हम एक 13 दिन के प्रोटोकॉल का वर्णन मानव कोशिकाओं transcriptomally जैसी PGCs embryoid निकायों की सतह पर प्रधानमंत्री-pluripotency प्रेरित pluripotent स्टेम कोशिकाओं से प्रेरित ।

Abstract

मौलिक रोगाणु कोशिकाएं (PGCs) सभी germline कोशिकाओं के आम पुरोगामी हैं । माउस भ्रूण में, के एक संस्थापक जनसंख्या ~ ४० PGCs pluripotent epiblast कोशिकाओं से प्रेरित कर रहे है साइटोकिंस के लिए एक्सपोजर द्वारा आर्केस्ट्रा, अस्थि morphogenetic प्रोटीन 4 (Bmp4) सहित । मानव भ्रूण में, जल्दी से PGCs की जर्दी थैली के endodermal दीवार पर हमल के 3rd सप्ताह के अंत के आसपास की पहचान की गई है, लेकिन थोड़ा मानव PGC विनिर्देश और उनके प्रारंभिक विकास की प्रक्रिया के बारे में जाना जाता है । मानव भ्रूण PGCs के अध्ययन के तकनीकी और नैतिक बाधाओं को दरकिनार, किराए सेल संस्कृति मॉडल हाल ही में pluripotent स्टेम सेल से उत्पंन किया गया है । यहां, हम मानव PGC की तरह कोशिकाओं (hPGCLCs) के मजबूत उत्पादन के लिए एक 13 दिन के प्रोटोकॉल का वर्णन । मानव प्रेरित pluripotent स्टेम सेल (hiPSCs) प्रधान pluripotency राज्य में बनाए रखा ४८ घंटे के लिए 4i भोली reprogramminging माध्यम में मशीन हैं, एकल कोशिकाओं को असंबद्ध, और microwells में पैक । भोले pluripotency राज्य में hiPSCs के लंबे समय तक रखरखाव महत्वपूर्ण गुणसूत्र विचलन का कारण बनता है और बचा जाना चाहिए । microwells में hiPSCs को embryoid निकायों (EBs) के रूप में एक अतिरिक्त 24 घंटे के लिए बनाए रखा जाता है, जो तब plasticware प्रेरण माध्यम में एक कमाल की स्थिति के तहत कम पालन hPGCLC में कल्चरित होते हैं, जिनमें उच्च एकाग्रता होती है । रिकॉमबिनेंट मानव BMP4 । EBs आगे के लिए प्रसंस्कृत में 8 दिनों के लिए कर रहे है कमाल, गैर अनुयाई हालत hPGCLCs की अधिकतम पैदावार प्राप्त करने के लिए । immunohistochemistry द्वारा, hPGCLCs आसानी से लगभग सभी EBs में अपनी सतह पर विशेष रूप से OCT4 व्यक्त कोशिकाओं के रूप में पता चला रहे हैं । जब EBs enzymatically असंबद्ध और FACS संवर्धन के अधीन हैं, hPGCLCs CD38 + कोशिकाओं के रूप में 40-45% उपज के साथ एकत्र किया जा सकता है ।

Introduction

मौलिक रोगाणु कोशिकाओं (PGCs) दोनों लिंगों में सभी germline कोशिकाओं के आम पुरोगामी हैं । स्तनधारी भ्रूण में PGCs के विकास पर हमारे ज्ञान के अधिकांश प्रयोगशाला चूहों1,2के अध्ययन के माध्यम से प्राप्त किया गया है । भ्रूण के दिन 6.0, माउस भ्रूण, 6 या इसी तरह की छोटी संख्या के PGC के अग्रदूतों में epiblast में स्थित हैं, और के एक संस्थापक जनसंख्या ~ ४० PGCs उन से एक हड्डी morphogenetic प्रोटीन पर निर्भर तरीके से प्रेरित कर रहे है Bmp2 और Bmp4 से सटे स्रावित कक्षों. जल्दी से जल्द मानव PGCs अब तक भ्रूण में पहचान3हमल के तीसरे सप्ताह के अंत में चारों ओर जर्दी थैली के endodermal दीवार पर थे । क्योंकि इस पलायन PGCs माउस भ्रूण में मनाया जाता है के रूप में एक ही स्थान है, यह संभव है कि मनाया मानव PGCs प्रवास के पथ पर नहीं बल्कि संस्थापक जनसंख्या में थे । हालांकि, PGCs या मानव भ्रूण में PGC अग्रदूतों के पहले के चरणों वापस अनुरेखण अध्ययन लापता हो गया है ।

मानव भ्रूण PGCs के लिए उपयोग दोनों तकनीकी और नैतिक बाधाओं के कारण चुनौतीपूर्ण है । इन बाधाओं को दूर करने के लिए PGC सेल कल्चर मॉडल्स को ह्यूमन pluripotent स्टेम सेल (पीएससी) से हाल ही में जेनरेट किया गया है । Pluripotency germline और तीन भ्रूण रोगाणु परतों4में अंतर करने के लिए सेलुलर क्षमता है । जबकि मानव पीएससी mTeSR1 माध्यम में बनाए रखा (एक तैयार करने के लिए उपयोग करते हैं, वाणिज्यिक उपलब्ध माध्यम प्राइम pluripotency राज्य में मानव पीएससी के रखरखाव के लिए तैयार) extracellular मैट्रिक्स प्रोटीन के साथ लेपित व्यंजन पर है प्राइम-स्टेट pluripotency 4, २०१३ में याकूब हैना की लैब से पता चला है कि प्राइम pluripotency कोशिकाओं को भोली pluripotency अवस्था में रूपांतरित कर भोले मानव स्टेम सेल मीडियम (NHSM) से प्रोटीन से युक्त केमिकल अवरोधक kinases ERK1/2, GSK3, JNK, रॉक, PKC, और p38 MAPK के साथ ही वृद्धि कारक लिफ, TGF, bFGF5. भोले-pluripotency मानव पीएससी से, २०१५ में हैना और अजीम सुरांनी के नेतृत्व में एक शोध समूह ने hPGCLCs6से मानव PGC की तरह कोशिकाओं (पीएससी) का पहला मजबूत उत्पादन पूरा किया । बाद में, हमारे सहित कई अंय प्रयोगशालाओं, पीएससी से थोड़ा अलग प्रोटोकॉल7,8,9,10का उपयोग कर hPGCLCs के उत्पादन की सूचना दी । हमारे अध्ययन सबूत प्रदान की है कि hPGCLCs विभिंन प्रोटोकॉल का उपयोग कर उत्पंन (जो हमारे पहले प्रकाशित अध्ययन के एस10तालिका में संक्षेप हैं) एक दूसरे10के समान transcriptomally हैं । उपलब्ध साक्ष्य प्रारंभिक चरण मानव भ्रूण PGCs करने के लिए मानव PGCLCs की समानता का समर्थन करता है से पहले वैश्विक epigenetic विलोपन7 और/या chemotactic माइग्रेशन10।

माउस भ्रूण PGCs, माउस PGCLCs, और मानव PGCLCs के अध्ययन (लेकिन मानव PGCs के लिए केवल बहुत ही सीमित उपयोग के साथ) से पता चला है कि PGC विनिर्देशन के आणविक तंत्र माउस और मानव1,6के बीच काफी अलग हैं, 7,8,9,10,11,12,13,14,15,16 ,17. उदाहरण के लिए, Prdm14 माउस भ्रूण में PGC विनिर्देशन में महत्वपूर्ण भूमिका निभाता है, लेकिन मानव PGC विनिर्देशन में अपनी भूमिका1,15सीमित लगता है । इसके विपरीत, EOMESODERMIN द्वारा SOX17 की प्रेरण PGC विनिर्देश6,11,14के लिए आवश्यक है, जबकि इन प्रतिलेखन कारकों माउस PGC विनिर्देश15के लिए औषधालय लग रहे हैं । अध्ययन के इन प्रारंभिक उपलब्धियों का उपयोग hPGCLCs दृढ़ता से मानव भ्रूण PGCs के एक किराए के रूप में इस सेल संस्कृति मॉडल के महत्व का समर्थन ।

हाल ही में प्रकाशित अध्ययन, जीनोमिक डीएनए कॉपी संख्या विश्लेषण के हमारे लैब गहरी अनुक्रमण मूल्यांकन शामिल है, पता चला है कि भोली pluripotency राज्य में पीएससी के लंबे समय तक रखरखाव गुणसूत्र अस्थिरता के जोखिम को काफी बढ़ जाती है और संरचनात्मक विसंगतियों । यह घटना दोनों माउस18 और मानव19 पीएससी के साथ मनाया गया । हैना/सुरांनी द्वारा रिपोर्ट किए गए मूल hPGCLC उत्पादन प्रोटोकॉल को पीएससी में बनाए रखने के लिए विकसित किया गया था । मानव पीएससी और PGCLCs के सामान्य द्विगुणित कैरयोटाइप को संरक्षित करने के लिए हमने एक संशोधित प्रोटोकाल विकसित किया जिसमें मानव पीएससी केवल ७२ घंटे10के लिए 4i माध्यम के संपर्क में आ रहे हैं, जो इस लेख में प्रस्तुत है । प्राइम pluripotency राज्य के अंतर्गत मानव iPSCs (hiPSCs) बनाए रखे जाते हैं. तुरंत EB गठन से पहले, कोशिकाओं ४८ घंटे के लिए 4i भोली reprogramminging मध्यम (एक संशोधित NHSM माध्यम) में मशीन हैं । इसके बाद असंबद्ध और microwells में पैक किया जाता है जो 4i माध् यम में अतिरिक् त 24 घंटों के लिए EBs बनाते हैं । EBs hPGCLC प्रेरण माध्यम में बनाए रखा जाता है रिकॉमबिनेंट मानव BMP4 के एक उच्च एकाग्रता के लिए एक कमाल की हालत के तहत नहीं लगाव संस्कृति के लिए 8 दिनों के लिए hPGCLCs की अधिकतम उपज प्राप्त करने के लिए । 8 दिन EB संस्कृति के बाद, hPGCLCs असंबद्ध EB कोशिकाओं से FACS के रूप में CD38 + कोशिकाओं को FACS-sortable एकल सेल निलंबन में ~ ४०% उपज के साथ अलग किया जा सकता है । जबकि अन्य प्रकाशित तरीकों7,8,9, हमारे संशोधनों से पहले मूल प्रोटोकॉल सहित6, आम तौर पर विशिष्ट के बिना सहज रूप से गठित सेल समुच्चय में hPGCLCs उत्पन्न स्थानीयकरण, हमारे प्रोटोकॉल द्वारा उत्पादित hPGCLC embryoid निकायों (EBs) की सतह पर मनाया जाता है ।

Protocol

1. प्रधान Pluripotency राज्य में hiPSCs की कोशिका संस्कृति

  1. extracellular मैट्रिक्स प्रोटीन लेपित व्यंजन की तैयारी
    1. गल Matrigel (extracellular मैट्रिक्स प्रोटीन) एक फ्रिज में बर्फ पर या एक ठंडा कमरे में रात भर (नहीं गल कमरे के तापमान पर या एक गर्म पानी के स्नान का उपयोग) । Aliquot मैट्रिक्स प्रोटीन (~ २०० μL; एक Aliquot की मात्रा प्रत्येक बैच के लिए निर्माता द्वारा निर्धारित किया जाता है और शीशी के लेबल पर संकेत) बाँझ कम बांध केंद्रापसारक ट्यूब या बर्फ पर सेल cryopreservation ट्यूबों में । यह solidification से बचने के लिए वितरण के दौरान extracellular मैट्रिक्स प्रोटीन बर्फ ठंडा रखने के लिए महत्वपूर्ण है । -८० ° c पर aliquots स्टोर ।
    2. extracellular मैट्रिक्स प्रोटीन के साथ कोट सेल संस्कृति प्लास्टिक के बर्तन के लिए, 25 मिलीलीटर बर्फ के साथ एक aliquot पतला-ठंडा DMEM/F12 और ३ १०-मुख्यमंत्री व्यंजन (~ 8 मिलीलीटर/ न्यूनतम 1 घंटे के लिए कमरे के तापमान पर व्यंजन की मशीन । कोटिंग के बाद, बर्तन Parafilm का उपयोग कर सील किया जा सकता है और एक सप्ताह तक के लिए कमरे के तापमान पर संग्रहीत ।
    3. प्रधान pluripotency hiPSCs के टीका से तुरंत पहले व्यंजन से महाप्राण मीडियम । यह आवश्यक नहीं है कि मध्यम या कैल्शियम के साथ लेपित बर्तन धोने/मैग्नीशियम मुक्त फॉस्फेट-बफर खारा [पंजाब (-)] ।
  2. प्रधान pluripotency राज्य में hiPSC संस्कृति की दीक्षा
    1. जोड़ें 2 µ एल के ५० mM Y27632 [अवरोधक के Rho-जुड़े प्रोटीन कळेनासे (ROCK)] के लिए 10 mTeSR1 मध्यम के एक 15 मिलीलीटर केंद्रापसारक ट्यूब में मिलीलीटर । 1 मिलीलीटर जमे हुए सेल स्टॉक से १ १०-मुख्यमंत्री डिश में सेल संस्कृति शुरू करने के लिए 10 मिलीलीटर मध्यम पूरक-रॉक अवरोधक की दो ट्यूबों तैयार करें । उसी दिन Y27632-अनुपूरक माध्यम का प्रयोग करें । 5 मिनट के लिए एक ३७ ° c पानी स्नान में गर्म Y27632-पूरक मध्यम ।
      नोट: यह प्रोटोकॉल mTeSR1 में बनाए रखा hiPSCs के साथ अच्छी तरह से काम करता है । जब hiPSCs अंय मीडिया में बनाए रखा है के साथ मानव पीएससी विकास का समर्थन कर रहे है प्रधानमंत्री या भोली pluripotency की डिग्री, hPGCLCs की उपज काफी भिंन हो सकते हैं ।
      नोट: पूरा mTeSR1 की शेल्फ जीवन 4 डिग्री सेल्सियस और 6 महीने में-20 डिग्री सेल्सियस पर 2 सप्ताह है, लेकिन फिर से ठंड खराब प्रदर्शन का कारण बनता है । हम पर mTeSR1 के ४० मिलीलीटर aliquots फ्रीज-20 ° c उपयोग तक ।
    2. गल एक शीशी प्राइमेड pluripotency hiPSC फ्रोजन स्टॉक (१.०-३.० x 106 कोशिकाओं में 1 मिलीलीटर cryopreservation मध्यम) एक ३७ ° c पानी स्नान का उपयोग कर । गल के तुरंत बाद, एक शीशी की पूरी सामग्री एक ट्यूब (10 मिलीलीटर) में गर्म Y27632-पूरक मध्यम के हस्तांतरण ।
    3. कमरे के तापमान पर सेल निलंबन केंद्रापसारक, 8 मिनट के लिए ३०० x g । supernatant त्यागें और 10 मिलीलीटर गर्म Y27632 के साथ सेल गोली पुनः स्थगित-अंय ट्यूब से पूरक ।
    4. समान रूप से एक extracellular मैट्रिक्स प्रोटीन-लेपित 10-सेमी डिश में सेल निलंबन फैल गया । एक त्रिकोणीय गैस सह2 मशीन में पकवान प्लेस (३७ ° c, ६.५% हे2, 5% सह2) । एक कम ऑक्सीजन दबाव के तहत hiPSC संस्कृति बनाए रखें ।
    5. मध्यम (mTeSR1 बिना Y27632) हर दिन बदलें । रॉक अवरोधक (Y27632) hiPSC अस्तित्व के लिए महत्वपूर्ण है तुरंत बाद एकल कोशिकाओं को पृथक्करण । एक बार hiPSCs extracellular मैट्रिक्स प्रोटीन पर पालन-लेपित सतह के रूप में समान रूप से वितरित > 10% के साथ छोटे समुच्चय प्रवाह (जो आम तौर पर टीका के बाद 16 घंटे के भीतर पूरा हो जाता है), Y27632 औषधालय है । बहुत जल्दी मध्यम Y27632 के बिना असंबद्ध hiPSCs के टीका के बाद परिवर्तन लगभग पूरा सेल मौत का कारण हो सकता है ।
  3. Passaging प्रधानमन्त्री pluripotency hiPSCs
    नोट: मार्ग प्रधानमंत्री pluripotency hiPSCs जब कालोनियों प्रभावी विकास क्षेत्र के ~ ८०% पर कब्जा । प्रायोगिक reproducibility के लिए सही passaging प्रक्रियाएं और घनत्व महत्वपूर्ण है । हमने देखा है कि hPGCLC प्रेरण की दक्षता hiPSC संस्कृतियों के बीच काफी अलग नहीं है 6 एक जमे हुए शेयर से दीक्षा के बाद दिन (एक या दो मार्ग शामिल) या एक महीने (> 10 मार्ग शामिल) । hPGCLC की प्रेरण सफलतापूर्वक दो महीने के लिए बनाए रखा hiPSCs से किया गया था, हालांकि दक्षता मात्रात्मक मूल्यांकन नहीं किया गया था ।
    1. 5 मिनट के लिए कमरे के तापमान के लिए एक 15 मिलीलीटर केंद्रापसारक ट्यूब और equilibrate में सेल पृथक्करण एंजाइम मिश्रण के 4 मिलीलीटर ले लो ।
    2. गरम 10 मिलीलीटर पंजाबियों (-) एक 15 मिलीलीटर में > 5 मिनट के लिए ३७ डिग्री सेल्सियस पर एक पानी के स्नान में ट्यूब ।
    3. ५० mM Y27632 (रॉक अवरोधक) के 2 µ एल जोड़ें 10 मिलीलीटर mTeSR1 मध्यम से एक 15 मिलीलीटर केंद्रापसारक ट्यूब में । रॉक अवरोध करनेवाला के दो ट्यूबों तैयार-पूरक 10 मिलीलीटर मध्यम और एक ही दिन में उपयोग करें । एक और 15 मिलीलीटर केंद्रापसारक ट्यूब में, Y27632 जोड़ने के बिना 5 मिलीलीटर mTeSR1 ले लो । 5 मिनट के लिए एक ३७ ° c जल स्नान में गरम मध्यम +/Y27632 ।
      नोट: चरण 1.3.3 में तैयार सभी मध्यम aliquots में Y27632 हो सकता है ।
    4. 10-सेमी डिश और कुल्ला कोशिकाओं से महाप्राण पुराने मध्यम एक बार गर्म 10 मिलीलीटर पंजाबियों (-) के साथ । पंजाब छोड़ो (-) और पकवान के लिए पृथक्करण एंजाइम के 4 मिलीलीटर जोड़ें । एक CO2 मशीन में पकवान प्लेस (त्रि गैस मशीन काम करता है, लेकिन आवश्यक नहीं) के लिए ~ 4 मिनट तक कोशिकाओं के नीचे से अलग । धीरे प्लास्टिक कोशिकाओं ऊपर और नीचे एकल सेल निलंबन बनाने के लिए ।
    5. Y27632 बिना 5 मिलीलीटर मध्यम (एक 15 एमएल ट्यूब में कुल मात्रा के बारे में 9 मिलीलीटर है) युक्त गर्म ट्यूब को hiPSC एकल सेल निलंबन स्थानांतरण । कमरे के तापमान पर सेल निलंबन, 8 मिनट के लिए ३०० x g केंद्रापसारक ।
    6. supernatant त्यागें और Y27632 युक्त गर्म मध्यम मध्यम के 10 मिलीलीटर के साथ सेल गोली resuspend ।
    7. एक ४०-µm सेल छलनी का उपयोग कर सेल समुच्चय निकालें और एक कल्टर काउंटर का उपयोग कोशिका घनत्व का निर्धारण ।
    8. गर्म Y27632-पूरक मध्यम के साथ सेल निलंबन पतला 10 मिलीलीटर में ३.० x 106 कोशिकाओं को प्राप्त करने के लिए एक extracellular मैट्रिक्स प्रोटीन लेपित 10 सेमी पकवान inoculate । एक त्रिकोणीय गैस सह2 मशीन में inoculated पकवान प्लेस (३७ ° c, ६.५% हे2, 5% सह2) ।
    9. मध्यम (mTeSR1 बिना Y27632) हर दिन बदलें ।

2. hPGCLCs की जनरेशन

नोट: जब एक 10 सेमी डिश में hiPSC कोशिकाओं (mTeSR1 मध्यम, extracellular मैट्रिक्स प्रोटीन-लेपित) ~ ८०% प्रवाह तक पहुंचता है (लगभग 107 कोशिकाओं) निंन चरणों का आरंभ करें ।

  1. extracellular मैट्रिक्स प्रोटीन लेपित व्यंजन (1 दिवस) की तैयारी
    1. गल एक aliquot extracellular मैट्रिक्स प्रोटीन की बर्फ पर और 25 मिलीलीटर बर्फ में पतला-ठंडा DMEM/
    2. 6 के लिए पतला extracellular मैट्रिक्स प्रोटीन वितरण-अच्छी तरह से प्लेटें (1 मिलीलीटर/ एक aliquot कोट करने के लिए पर्याप्त है 24 कुओं (4 प्लेटें) । न्यूनतम 1 घंटे के लिए कमरे के तापमान पर प्लेटें । अप्रयुक्त लेपित प्लेटों सील और एक सप्ताह के लिए कमरे के तापमान पर संग्रहित किया जा सकता है ।
    3. प्राइम pluripotency hiPSCs के टीका से तुरंत पहले प्लेटों से मीडियम महाप्राण. यह आवश्यक नहीं है कि मध्यम या पंजाब (-) के साथ लेपित व्यंजन धोए जाएं ।
  2. टीका के प्रधान pluripotency hiPSCs में extracellular मैट्रिक्स प्रोटीन-लेपित प्लेट्स (1 दिन)
    1. 5 मिनट के लिए कमरे के तापमान के लिए एक 15 मिलीलीटर केंद्रापसारक ट्यूब और equilibrate में सेल पृथक्करण एंजाइम के 4 मिलीलीटर ले लो ।
    2. गरम 10 मिलीलीटर पंजाबियों (-) एक 15 मिलीलीटर में > 5 मिनट के लिए ३७ डिग्री सेल्सियस पर एक पानी के स्नान में ट्यूब ।
    3. ५० mM Y27632 (रॉक अवरोधक) के 7 µ एल जोड़ें ३५ मिलीलीटर mTeSR1 मध्यम में एक ५०-एमएल केंद्रापसारक ट्यूब । एक ही दिन में Y27632-अनुपूरक माध्यम का प्रयोग करें । कुल ७० मिलीलीटर Y27632-पूरक मध्यम और 15 मिनट के लिए एक ३७ डिग्री सेल्सियस पानी के स्नान में मध्यम गर्म के लिए दो ट्यूबों बनाओ ।
    4. 10-सेमी डिश और कुल्ला कोशिकाओं से महाप्राण पुराने मध्यम एक बार गर्म 10 मिलीलीटर पंजाबियों (-) के साथ । पंजाब छोड़ो (-) और डिश के लिए सेल पृथक्करण एंजाइम के 4 मिलीलीटर जोड़ें । एक CO2 मशीन में पकवान प्लेस (त्रि गैस मशीन काम करता है, लेकिन आवश्यक नहीं) के लिए ~ 4 मिनट तक कोशिकाओं के नीचे से अलग । धीरे प्लास्टिक कोशिकाओं ऊपर और नीचे एकल सेल निलंबन बनाने के लिए ।
    5. 10 मिलीलीटर Y27632-पूरक मध्यम युक्त गर्म ट्यूब के लिए hiPSC एकल सेल निलंबन स्थानांतरण । कमरे के तापमान पर सेल निलंबन, 8 मिनट के लिए ३०० x g केंद्रापसारक ।
    6. supernatant त्यागें और 10 मिलीलीटर गरम Y27632-पूरक मध्यम के साथ सेल गोली पुनः स्थगित ।
    7. सेल समुच्चय और एक कल्टर काउंटर का उपयोग कर कोशिकाओं को हटाने के लिए एक सेल छलनी (४० µm ताकना आकार) के माध्यम से फिल्टर सेल निलंबन ।
    8. ५.० x 106 कोशिकाओं को ५० मिलीलीटर गरम Y27632-पूरक मध्यम में hiPSC एकल सेल निलंबन पतला ।
    9. Inoculate 2 मिलीलीटर सेल निलंबन (२.० x 105 कोशिकाओं) लेपित 6 अच्छी तरह से प्लेटें (4 प्लेटें, 24 कुओं) के प्रत्येक कुआं में । सुनिश्चित करें कि कक्षों को समान रूप से प्रत्येक कुआं में वितरित किया गया है. एक त्रिकोणीय गैस सह2 मशीन में सेल संस्कृति प्लेट प्लेस (३७ ° c, ६.५% हे2, 5% CO2) ।
      नोट: इनोक्युलम सेल घनत्व और भी वितरण में एक अच्छी तरह से महत्वपूर्ण है । क्योंकि 10 में hiPSCs के टीका-मुख्यमंत्री व्यंजन अंय क्षेत्रों की तुलना में काफी अधिक कोशिका घनत्व का कारण हो सकता है । यहां तक कि एकल सेल hiPSCs के सेल घनत्व 6 अच्छी तरह से प्लेटों के साथ और अधिक आसानी से प्राप्त किया जा सकता है ।
    10. टीका के बाद 24 घंटे में 2 मिलीलीटर/अच्छी तरह से mTeSR1 (बिना Y27632) के साथ मध्यम बदलें ।
  3. 4i-भोली (ERK-निर्दलीय) pluripotent प्रकोष्ठों के प्रधान pluripotency राज्य hiPSCs का रूपांतरण (दिन 3 और दिन 4)
    1. इस प्रकार (3 दिन और 4 दिन) के रूप में एक ५०-एमएल केंद्रापसारक ट्यूब में पूरा 4i भोली pluripotency माध्यम तैयार: ५० एमएल के 4i बेसल मीडियम, 5 µ l के 30 एमएम CHIR99021, 5 µ एल के 10 एमएम के PD0325901, 5 µ एल के 20 एमएम के BIRB796, 5 µ एल के ५० एमएम के SP600125 है, और ५० mM Y27632 के 5 µ l ।
      नोट: एक रेफ्रिजरेटर में रात भर में-८० डिग्री सेल्सियस और गल 4i बेसल मध्यम । प्रयोग करने से पहले ताजा 4i पूरा मध् यम तुरंत तैयार करें । 4i केमिकल्स (CHIR, पीडी, BIRB और SP) के एक्सपोजर को मजबूत लाइट से बचें । 4 ° c या रात भर या उससे अधिक जमे हुए 4i पूर्ण माध्यम को संग्रहित न करें ।
    2. 15 मिनट के लिए एक ३७ डिग्री सेल्सियस पानी बैच में गर्म ५० मिलीलीटर 4i पूरा माध्यम है । मध्यम से गरम हुआ 4i पूर्ण मध्यम (2 मिलीलीटर/) ४८ पर और ७२ घंटे टीका के बाद बदलें । मध्यम परिवर्तन का सटीक समय उच्च hPGCLC उपज और प्रयोगात्मक reproducibility प्राप्त करने के लिए महत्वपूर्ण है ।
      नोट: इस शर्त के तहत 4i hiPSC संस्कृति का घनत्व अधिक है और टीका के बाद 48-72 घंटे में धाराप्रवाह बन जाता है, लेकिन यह सामांय है ।
  4. EB गठन microwell प्लेट्स का उपयोग (दिन 5)
    1. एक ५०-एमएल केंद्रापसारक ट्यूब में और यह एक ३७ ° c पानी स्नान के लिए उपयोग करने से पहले ~ 15 मिनट में गरम 4i पूरा मध्यम के ५० मिलीलीटर तैयार करें ।
    2. गर्म ३५ मिलीलीटर DMEM/F12 में एक ५०-एमएल केंद्रापसारक ट्यूब में एक ३७ ° c पानी स्नान के लिए ~ उपयोग करने से पहले 15 मिनट ।
    3. एक microwell प्लेट तैयार करें
      1. एक microwell प्लेट के 8 सक्रिय कुओं में 5% (डब्ल्यू/वी) फिल्टर-निष्फल Pluronic एफ-१२७ डिटर्जेंट जोड़ें ( सामग्री की तालिकादेखें; ०.५ मिलीलीटर/
      2. कमरे के तापमान पर microwell प्लेट, १,००० x g के लिए 5 मिनट के लिए, हवा के बुलबुले के अभाव को सुनिश्चित करने के लिए एक औंधा माइक्रोस्कोप के साथ microwells का निरीक्षण करें । डिटर्जेंट के साथ कोट microwells करने के लिए कमरे के तापमान पर 30 मिनट के लिए microwell थाली छोड़ दें ।
      3. गरम DMEM के साथ pipetting और कुल्ला कुओं द्वारा microwell प्लेट के कुओं से डिटर्जेंट समाधान त्यागें/F12 (2 मिलीलीटर/
      4. कमरे के तापमान पर microwell प्लेट, 5 मिनट के लिए १,००० x g केंद्रापसारक । हवा के बुलबुले के अभाव को सुनिश्चित करने के लिए एक औंधा माइक्रोस्कोप के साथ microwells का निरीक्षण करें ।
        नोट: हवा के बुलबुले अभी भी microwells में मनाया जाता है, तो microwell शीट अभी भी दृढ़ता से अच्छी तरह से नीचे करने के लिए चिपके हुए है की जांच करें ।
      5. microwell प्लेट के कुओं से pipetting और कुल्ला कुओं से DMEM/f12 को छोड़ कर गरम DMEM/f12 (2 मिलीलीटर/
      6. दोहराएँ चरण 2.4.3.3-2.4.3.4.
      7. microwell प्लेट के कुल्ला कुओं में 4i पूरा माध्यम जोड़ें (1 मिलीलीटर/ शेष 4i एक ३७ ° c पानी स्नान में पूर्ण मध्यम रखें ।
      8. कमरे के तापमान पर microwell प्लेट, 5 मिनट के लिए १,००० x g केंद्रापसारक । हवा के बुलबुले के अभाव को सुनिश्चित करने के लिए एक औंधा माइक्रोस्कोप के साथ microwells का निरीक्षण करें ।
      9. microwell प्लेट को त्रिकोणीय गैस मशीन में रखें (३७ ° c, ६.५% हे2, 5% सह2) जब तक 4i hiPSCs का टीका न हो ।
    4. एक microwell प्लेट में 4i iPSCs का टीका
      1. एक 15-एमएल केंद्रापसारक ट्यूब और 5 मिनट के लिए कमरे के तापमान के लिए equilibrate में सेल पृथक्करण एंजाइम के 13 मिलीलीटर ले लो ।
      2. गरम ५० एमएल पंजाबियों (-) में एक ५०-एमएल केंद्रापसारक ट्यूब > 5 मिनट के लिए ३७ ° c में एक पानी के स्नान में ।
      3. भोली hiPSC कोशिका संस्कृति और कुल्ला कोशिकाओं के 24 कुओं से महाप्राण पुराने माध्यम से एक बार गरम 2 मिलीलीटर/ पंजाब छोड़ो (-) और जोड़ें ०.५ मिलीलीटर/अच्छी तरह से पृथक्करण एंजाइम । एक सह2 मशीन में सेल संस्कृति प्लेट प्लेस (३७ ° c) ~ 4 मिनट तक के लिए कोशिकाओं को नीचे से अलग । धीरे प्लास्टिक कोशिकाओं ऊपर और नीचे एकल सेल निलंबन बनाने के लिए ।
      4. hiPSC सिंगल सेल सस्पेंशन को गर्म करने वाले 20 एमएल 4i को पूरा मीडियम ट्रांसफर करें । कमरे के तापमान पर सेल निलंबन, 8 मिनट के लिए ३०० x g केंद्रापसारक ।
      5. supernatant त्यागें और 5 एमएल गरम 4i पूर्ण माध्यम के साथ सेल गोली resuspend ।
      6. सेल समुच्चय को दूर करने के लिए एक सेल छलनी (४० µm ताकना आकार) के माध्यम से फ़िल्टर सेल निलंबन । 1 एमएल गरम 4i पूर्ण माध्यम के साथ 3 बार धो सेल छलनी । एक कल्टर काउंटर का उपयोग कोशिकाओं गिनती ।
      7. 4i के सिंगल सेल सस्पेंशन को पतला करे भोले hiPSCs को 27.0-32.4 x 106 कोशिकाओं में 9 एमएल का प्री-वार्म 4i पूरा मीडियम. ध्यान दें कि 4i पूर्ण मध्यम पहले से ही Y27632 शामिल हैं ।
      8. एक त्रिकोणीय गैस मशीन (2.4.3.9) से 8 अच्छी तरह में 4i पूरा माध्यम के 1 मिलीलीटर युक्त microwell प्लेट ले लो । Inoculate 1 मिलि 4i भोली hiPSC निलंबन (3.0-3.6 x 106 कक्ष/ इस कोशिका घनत्व महत्वपूर्ण है । सुनिश्चित करें कि कोशिकाओं को समान रूप से एक अच्छी तरह से धीरे pipetting द्वारा वितरित कर रहे हैं ।
      9. कमरे के तापमान पर microwell प्लेट केंद्रापसारक, 3 मिनट के लिए १०० x जी ।
      10. एक त्रिकोणीय गैस सह2 मशीन में microwell प्लेट प्लेस (३७ ° c, ६.५% हे2, 5% सह2) । microwells में गोली लगी कोशिकाओं को परेशान मत करो । 24-30 घंटे के लिए गर्मी कोशिकाओं । एक रात की मशीन (~ 16 घंटे) आमतौर पर तंग EBs के गठन के लिए अपर्याप्त है ।
  5. EBs का रॉक संस्कृति के लिए कम लगाव प्लेटों के हस्तांतरण (6 दिवस)
    1. इस प्रकार (6 दिन 13 दिन) के रूप में एक ५० मिलीलीटर केंद्रापसारक ट्यूब में hPGCLC पूरा माध्यम तैयार:
      20 मिलीलीटर hPGCLC बेसल मध्यम, 4 μL की ५०० मिमी 2-Mercaptoethanol, ५० μL की 20 मिलीग्राम/एमएल एल-Ascorbic एसिड की 4 μL, ५० एमएम की Y27632, ५० μL की १०० μg/एमएल रिकॉमबिनेंट ह्यूमन BMP4, 4 μL की ५०० μg/एमएल मानव एससीएफ, 4 μL की २५० μg/एमएल मानव EGF , और २५० μg/एमएल मानव लिफ के 8 μL ।
      नोट: उपयोग करने से पहले ताजा hPGCLC पूरा माध्यम तुरंत तैयार करें और प्रकाश के लिए जोखिम से बचें । hPGCLC पूरा मध्यम 4 डिग्री सेल्सियस या रात भर या लंबे समय में जमे हुए दुकान नहीं है ।
      नोट: BMP4 की एकाग्रता बहुत अधिक है । इष्टतम BMP4 एकाग्रता BMP4 के बैचों के बीच अलग हो सकता है. बहुत-BMP4 के बहुत अंतर को दृढ़ता से hPGCLC उत्पादन प्रभावित करते हैं । पूर्ण hPGCLC माध्यम में BMP4 के अभाव में, hPGCLCs की उपज बहुत कम6है । पूरा hPGCLC माध्यम में अन्य cytokine के महत्व को हैना/सुरांनी6द्वारा वर्णित किया गया था ।
      नोट: इस प्रोटोकॉल में, पूर्ण hPGCLC माध्यम में मानव लिफ के अंतिम एकाग्रता १०० एनजी/एमएल6,10है । अंतिम लिफ एकाग्रता हमारे सहित पहले प्रकाशित अध्ययनों में इस्तेमाल किया, 1 μg/एमएल था । जब मानव लिफ एजेंट की विशिष्ट गतिविधि > 10000 इकाइयों/μg (ED५० < ०.१ एनजी/एमएल), १०० एनजी/एमएल लिफ EBs से hPGCLC पीढ़ी का समर्थन करने के लिए पर्याप्त है ।
    2. स्थानांतरण EBs
      1. एक पानी के स्नान में ३७ डिग्री सेल्सियस पर 5 मिनट > के लिए गर्म 5 मिलीलीटर hPGCLC बेसल मध्यम और 20 मिलीलीटर hPGCLC पूरा माध्यम ।
      2. ध्यान से एक सेल छलनी ऊपर नीचे एक ५० एमएल के शंकु ट्यूब ऊपर नीचे जगह है ।
      3. प्लास्टिक microwell थाली के प्रत्येक अच्छी तरह से बहुत धीरे थाली microwells से EBs को अलग करने के लिए । EBs में शामिल नहीं कक्षों को निकालने के लिए कक्ष छलनी के माध्यम से प्रत्येक की सभी सामग्रियों को फ़िल्टर करें ।
      4. hPGCLC बेसल मध्यम से 1 मिलीलीटर के साथ सेल छलनी पर धो EBs बनाए रखा । धीरे से धो 5 बार दोहराएं ।
      5. धोया EBs अब एक छलनी की झिल्ली पर बनाए रखे हैं, जो एक ५०-एमएल शंकु ट्यूब उल्टा पर है । एक ताजा ५०-एमएल शंकु ट्यूब सेल छलनी पर रखें ताकि सेल छलनी आम तौर पर नई ट्यूब में तैनात है । फिर जल्दी से नई ट्यूब के साथ सेल छलनी उलटा । सेल छलनी और ट्यूब अब सामांय स्थिति में हैं, और EBs कोशिका छलनी की झिल्ली के नीचे हैं ।
      6. सेल छलनी की झिल्ली के ऊपर से 18 मिलीलीटर गर्म hPGCLC पूरा माध्यम जोड़कर शंकु ट्यूब में EBs लीजिए । इस प्रकार, मध्यम झिल्ली के माध्यम से जाना और झिल्ली के निचले हिस्से पर संलग्न EBs इकट्ठा ट्यूब के नीचे करने के लिए नीचे जाएगा ।
      7. प्लेट एक कम लगाव 6 के कुओं में EBs के निलंबन अच्छी तरह से थाली (3 मिलीलीटर/
      8. एक झूला पर कम लगाव प्लेट प्लेस-एक त्रिकोणीय गैस मशीन में कदम झूली कुरसी (३७ ° c, ६.५% हे2, 5% सह2) । पर कमाल की गति सेट ~ 20 प्रति मिनट बदल जाता है ।
        नोट: EBs कुओं और फ्यूज के केंद्र में कुल क्योंकि घूमता आंदोलन लागू नहीं है । ध्यान से EBs समग्र नहीं है ताकि कमाल गति को समायोजित करें । भी जोरदार कमाल शारीरिक रूप से EBs नुकसान होगा ।
        नोट: कम ऑक्सीजन दबाव दृढ़ता से EB संस्कृति के लिए सिफारिश की है ।
  6. EBs की सतह पर hPGCLCs की पीढ़ी (7 दिन-13 दिन)
  7. नए सिरे से हर दिन 20 मिलीलीटर hPGCLC पूरा मध्यम तैयार करते हैं । कमाल के बिना, EBs नीचे कुओं के नीचे ~ 1 मिनट में डूब जाएगा । पुराने मध्यम को सुखाने के बिना निकालें EBs (~ ०.२ मिलीलीटर/वैसे पुराने माध्यम रह सकते हैं) और हर दिन ताजा hPGCLC पूरा मीडियम जोड़ें (3 एमएल/

3. EBs का Immunohistochemical धुंधला (दिवस 10 – दिन 13)

  1. formaldehyde-फिक्स्ड, आयल-एंबेडेड (FFPE) immunostaining के लिए extracellular मैट्रिक्स प्रोटीन ब्लॉक में EBs embedding
    1. OCT4+ कोशिकाओं के रूप में hPGCLCs की पहचान करने के लिए, एक १.५ मिलीलीटर कम-बाइंड microcentrifuge ट्यूब में फसल EBs । EBs नीचे करने के लिए सिंक करने दें या संक्षेप में कमरे के तापमान पर (2 सेकंड) केंद्रापसारक और मध्यम त्यागें । बर्फ-ठंडा पंजाबियों के साथ कुल्ला EBs (-) ।
    2. पंजाबियों को हटाएं (-) और बर्फ के 1 मिलीलीटर-ठंडा 1% (डब्ल्यू/वी) में मशीन EBs बर्फ पर 5 मिनट के लिए (-) पंजाब में सोडियम azide । EBs नीचे करने के लिए सिंक करने दें या संक्षेप में (2 सेकंड) कमरे के तापमान पर केंद्रापसारक । छोड़ें supernatant, और कुल्ला EBs बर्फ के साथ ठंडे पंजाबियों (-) ।
      नोट: सोडियम azide के अलावा intracellular प्रोटीन और आरएनए टेप का क्षरण धीमा कर देती है ।
    3. गल २०० बर्फ पर extracellular मैट्रिक्स प्रोटीन के µ एल और EBs युक्त microcentrifuge ट्यूब में जोड़ें । जेल जम जाता है जब तक ~ 10 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर ट्यूब छोड़ दें ।
    4. पंजाब में 4% formaldehyde के 1 मिलीलीटर जोड़ें (-) और कोमल कमाल के साथ 15 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर गर्मी ।
      नोट: इस चरण के दौरान EBs और extracellular मैट्रिक्स प्रोटीन दोनों तय होते हैं । बिना किसी निर्धारण के, जेल ब्लॉकों निर्जलीकरण की प्रक्रिया के दौरान विघटित हो सकता है । पूर्व निश्चित EBs जेल ब्लॉक में एम्बेडेड हैं, तो EBs जेल ब्लॉक के साथ फिर से तय कर रहे हैं और खत्म हो सकता है ।
    5. छोड़ें formaldehyde, और कुल्ला EBs एक बार बर्फ ठंडे पंजाबियों के साथ (-) । ७०% इथेनॉल की 1 मिलीलीटर जोड़ें । जेल एंबेडेड EBs एक सप्ताह के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर ७०% इथेनॉल में संग्रहित किया जा सकता है ।
    6. एक मानक FFPE प्रोटोकॉल के साथ जेल एंबेडेड EBs प्रक्रिया । 5-माइक्रोन मोटाई FFPE स्लाइड तैयार करें । स्लाइड्स को रात भर सूखने दें और immunostaining तक कमरे के तापमान पर उन्हें स्टोर करें ।
      नोट: हमारी दिनचर्या FFPE प्रोटोकॉल इस प्रकार है: ७०% इथेनॉल, दो परिवर्तन, 1 घंटे प्रत्येक; ८०% इथेनॉल, एक परिवर्तन, 1 घंटे; ९५% इथेनॉल, एक परिवर्तन, 1 घंटे; १००% इथेनॉल, तीन परिवर्तन, १.५ एक घंटा; xylene, तीन परिवर्तन, १.५ घंटा प्रत्येक; आयल मोम (58-60 ° c), दो परिवर्तन, 2 घंटे प्रत्येक । निर्जलित ऊतकों को तेल ब्लॉकों में एंबेडेड और 3-10 माइक्रोन (आमतौर पर 5 माइक्रोन) में कटौती कर रहे हैं ।
    7. धुंधला करने के लिए, पूरी तरह से शुष्क स्लाइड में ५६ ° c ओवन के लिए ंयूनतम 30 min. Deparaffinize और xylenes और वर्गीकृत शराब श्रृंखला के साथ हाइड्रेट स्लाइड । फिर 5 मिनट के लिए नल के पानी में स्लाइड धो लें ।
    8. अंतर्जात peroxidases को निष्क्रिय करने के लिए, 10 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर BLOXALL अवरुद्ध समाधान के साथ हाइड्रेटेड स्लाइड । फिर 5 मिनट के लिए पंजाबियों के साथ स्लाइड धो ।
    9. 20 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर सामान्य हार्स सीरम (अन्य प्रजातियों में उत्पन्न द्वितीयक एंटीबॉडी के सामान्य सीरा) के साथ स्लाइड ब्लॉक.
    10. एक विरोधी OCT-3/4 बकरी प्राथमिक एंटीबॉडी (-) के साथ 4 डिग्री सेल्सियस पर रात भर में ०.१% BSA से पतला के साथ गर्मी स्लाइड (एक प्राथमिक एंटीबॉडी के लिए कमजोर पड़ने और गर्मी की स्थिति का अनुकूलन) । फिर पंजाबियों के साथ स्लाइड धो लें (-) कमरे के तापमान पर तीन बार, 5 मिनट प्रत्येक ।
    11. विरोधी बकरी आईजीजी (सहिजन peroxidase-संयुग्मित माध्यमिक एंटीबॉडी घोड़ा द्वारा उत्पंन) के साथ स्लाइड की मशीन 30 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर सामग्री की तालिकादेखें । फिर पंजाबियों के साथ स्लाइड धो लें (-) कमरे के तापमान पर तीन बार, 5 मिनट प्रत्येक ।
    12. मिश्रण आवश्यक मात्रा में ढाब धुंधला सब्सट्रेट ( सामग्री की तालिकादेखें) तुरंत उपयोग करने से पहले और कमरे के तापमान पर 5 मिनट के लिए पूरा ढाब धुंधला समाधान में गर्मी स्लाइड । मॉनिटर ढाब एक औंधा माइक्रोस्कोप का उपयोग कर और प्रतिक्रिया को रोकने के दाग जब OCT4+ कोशिकाओं को जल्दी से बहते नल के पानी में स्लाइड धोने द्वारा कल्पना कर रहे हैं ।
    13. वर्गीकृत शराब और xylenes श्रृंखला के साथ स्लाइड निर्जलीकरण । स्लाइड लेज़र-कैप्चर microdissection के लिए तैयार हैं । उच्च संकल्प सूक्ष्म टिप्पणियों के लिए बढ़ते मध्यम ( सामग्री की तालिकादेखें) का उपयोग कर स्थायी FFPE स्लाइड तैयार करें ।

4. EBs से hPGCLCs का FACS संवर्धन (दिवस 10 – दिन 13)

  1. Embryoid शरीर पृथक्करण किट के एंजाइम मिश्रण की तैयारी
    1. एंजाइम मिक्स 1 बफर एक्स और भंवर के १,९०० µ एल के लिए ५० µ एल एंजाइम पी जोड़कर तैयार करते हैं । 15 मिनट के लिए एक ३७ ° c जल स्नान में गर्म एंजाइम मिश्रण 1 ।
    2. एंजाइम मिश्रण 2 को 10 µ एल एंजाइम ए जोड़कर तैयार 20 µ एल बफर Y ।
    3. मिक्स एंजाइम घोला जा सकता है 1 और 2 पूरा EB पृथक्करण एंजाइम मिश्रण तैयार करने के लिए ।
  2. Dissociating EBs
    1. कम लगाव प्लेटों से फसल EBs और एक 15 मिलीलीटर केंद्रापसारक ट्यूब में कमरे के तापमान पर केंद्रापसारक, ३०० एक्स जी के लिए 2 मिनट । supernatant को छोड़ें और 10 मिलीलीटर पंजाबियों (-) के साथ EBs को पुनः निलंबित करें । फिर से केंद्रापसारक ।
    2. supernatant त्यागें और पूर्ण EB पृथक्करण एंजाइम मिश्रण (4.1.3) के साथ EBs resuspend । EBs असंबद्ध है जब तक 15-20 मिनट के लिए एक ३७ ° c पानी स्नान में EB सस्पेंशन । गर्मी के दौरान, धीरे प्लास्टिक हर 3-5 मिनट पर EBs पृथक्करण की सुविधा के लिए । वैकल्पिक रूप से, Embryoid बॉडी पृथक्करण प्रोग्राम के साथ एक स्वचालित dissociator का उपयोग करें ।
    3. आइस-कोल्ड 8 एमएल वाले पंजाबियों को जोड़ें (-) to असंबद्ध EB सेल सस्पेंशन. एक ४०-µm सेल छलनी के माध्यम से सेल निलंबन फ़िल्टर । सेल छलनी को 1 मिलीलीटर बर्फ-ठंडा पंजाबियों के साथ धो लें (-) तीन बार ।
    4. कल्टर काउंटर का उपयोग करके फ़िल्टर किए गए कक्ष में कक्षों की गणना करना.
    5. 4 डिग्री सेल्सियस पर सेल निलंबन केंद्रापसारक, 8 मिनट के लिए ३०० x जी और supernatant त्यागें । बर्फ के साथ सेल गोली फिर से स्थगित-ठंड 10 मिलीलीटर पंजाबियों (-) ।
    6. दो ट्यूबों, कोई नहीं-धुंधला नियंत्रण (~ 105 कोशिकाओं) और विरोधी CD38 धुंधला (सभी शेष कोशिकाओं) के लिए अंय के लिए एक में सेल निलंबन विभाजित ।
    7. 4 डिग्री सेल्सियस, 8 मिनट के लिए ३०० x जी में दो ट्यूबों केंद्रापसारक ।
  3. hPGCLCs के विरोधी CD38 धुंधला और FACS संवर्धन
    1. २०० µ एल बर्फ के साथ कोई दाग नियंत्रण के लिए सेल गोली resuspend-ठंडा 3% (डब्ल्यू/वी) BSA और 1% (डब्ल्यू/वी) पंजाब में सोडियम azide (-) । बर्फ पर प्लेस जब तक प्रवाह cytometry ।
      नोट: सोडियम azide के अलावा सेल सतह से CD38 की internalization धीमा कर देती है ।
    2. एंटी-CD38 के लिए सेल गोली resuspend बर्फ के साथ धुंधला-ठंडा 3% (डब्ल्यू/वी) BSA और 1% (डब्ल्यू/वी) पंजाब में सोडियम azide (-) के लिए 1 x 10 १०० प्रति6 कोशिकाओं µ l
    3. एक FACS ग्रेड, APC-संयुग्मित विरोधी CD38 एंटीबॉडी के 1 x 106 कोशिकाओं के प्रति 10 µ एल जोड़ें । एल्यूमीनियम पंनी के साथ ट्यूब कवर करने के लिए प्रकाश जोखिम से बचने के । कोमल कमाल के साथ ४५ मिनट के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर मशीन ।
    4. 5 मिलीलीटर बर्फ-ठंडा पंजाबियों जोड़ें (-) और 4 डिग्री सेल्सियस पर केंद्रापसारक, 8 मिनट के लिए ३०० x जी । supernatant छोड़ें और 5 मिलीलीटर बर्फ-ठंडा पंजाबियों (-) के साथ सेल गोली resuspend । दोहराएं पंजाब के साथ धो (-) कुल में तीन बार ।
    5. ५०० μL बर्फ के साथ सेल गोली resuspend-ठंडा 3% (डब्ल्यू/वी) BSA और 1% (w/v) पंजाब में सोडियम azide (-) FACS के लिए एक सेल घनत्व पर्याप्त है ।
    6. CD38+ कोशिकाओं है, जो आम तौर पर स्पष्ट रूप से प्रतिष्ठित कोशिका आबादी फार्म के रूप में hPGCLCs समृद्ध । CD38+ कोशिकाओं की पहचान सुनिश्चित करने के लिए कोई दाग नियंत्रण का उपयोग करें । hPGCLCs की विशिष्ट उपज सभी FACS के 1-5% है-दिन से 10 EBs और 20-40% 13 EBs दिन से जांच की एकल कोशिकाओं ।

Representative Results

microwell थाली यहां इस्तेमाल किया 24 अच्छी तरह से प्रारूप में है और 8 microwell चादरें, जिनमें से प्रत्येक १,२०० EBs तक के गठन का समर्थन करता है जोत कुओं है । से लगभग २४,०००,००० 4i भोली pluripotency कोशिकाओं, इस microwell प्लेट आम तौर पर उत्पंन ~ ८,००० EBs EB प्रति ~ ३,००० कोशिकाओं से मिलकर । लगातार कमाल के साथ EBs के गैर-अनुयाई संस्कृति के दौरान, बरकरार EBs की संख्या धीरे से सहज आत्म-ध्वस्त होने की वजह से कम हो जाती है, और ~ ३,००० EBs बच प्रोटोकॉल के 13 दिन तक । इन जीवित EBs के अधिकांश उनकी सतह पर 50-200 hPGCLCs है (EBs के धारावाहिक वर्गों में OCT4 + कोशिकाओं के immunohistochemical का पता लगाने के द्वारा अनुमानित; चित्र देखें 8), पावरफुल ~ १००,००० OCT4 + hPGCLCs कुल में । एंजाइमी एकल कोशिकाओं में EBs के पाचन एक अपेक्षाकृत अक्षम प्रक्रिया है, FACS-समृद्ध CD38 की उपज को कम करने + hPGCLCs को ९,०००-४७,००० कोशिकाओं । हमारे हाथ में, छह स्वतंत्र लेकिन लगातार प्रयोगों के बैचों के एक औसत १४,०३८ ± ५,७३१ (± SEM मतलब) था । क्योंकि CD38-नेगेटिव EB कोशिकाओं की कोशिकाएं एक्सप्रेस OCT4 mRNA (qPCR) या प्रोटीन (Immunohistochemistry) केवल बहुत ही कमजोर है, अगर पूरी तरह से अनुपस्थित नहीं, सभी EB कोशिकाओं दृढ़ता से व्यक्त OCT4 प्रोटीन व्यावहारिक रूप से CD38 + hPGCLCs की पूरी आबादी के बराबर हैं ।

इस प्रोटोकॉल के महत्वपूर्ण पैरामीटर कोशिका घनत्व भी शामिल है । जब २.० x 105 मानव iPSCs एक extracellular मैट्रिक्स प्रोटीन में inoculated रहे है 6 अच्छी तरह से सेल संस्कृति प्लेट (९.६० सेमी2 विकास क्षेत्र प्रति अच्छी तरह से) 2 मिलीलीटर Y27632-पूरक मध्यम (2.2.9) के साथ, कोशिकाओं के बारे में तक पहुंच जाएगा 20-30% 24 पर प्रवाह घंटे बाद टीका (चित्रा 1) । Y7632 के अभाव में mTeSR1 माध्यम में एक अतिरिक्त 24 घंटे की संस्कृति के बाद, कोशिकाओं को एकीकृत और फार्म कालोनियों, पर कब्जा ~ 30% के विकास क्षेत्र (चित्रा 2) । कोशिकाएं तो 4i reprogramminging मीडियम (2.3.2) में कल्चरल होती हैं । 4i माध् यम में संस् कृति के 24 घंटे बाद, कोशिकाएं धाराप्रवाह (चित्रा 3) बन जाती हैं । 4i माध् यम में अतिरिक् त 24 घंटे की संस् कृति कोशिकाओं को घनी पैक (figure 4) बनाती है । मध्यम परिवर्तन के सटीक समय (हर 24 घंटे +/EBs और hPGCLCs के सफल गठन के लिए सेल घनत्व महत्वपूर्ण हैं ।

4i माध् यम में ४८ घंटे की संस् कृति के बाद, कोशिकाएं असंबद्ध और inoculated की microwell थाली में होती हैं, जिसके आकार (२.४) में वेल्स ४०० µm है । हालांकि इस व्यावसायिक रूप से उपलब्ध microwell प्लेट निर्माता द्वारा कम आसंजन सतह के लिए लेपित है, डिटर्जेंट के साथ ताजा पुनः कोटिंग (2.4.3) अवांछित कोशिका आसंजन के जोखिम को कम करने के लिए सिफारिश की है । ८०० µm microwells hPGCLCs की कम उपज के परिणामस्वरूप, ठीक से विभेदक निर्देशित के लिए EB आकार के महत्व का सुझाव । 4i माध्यम में inoculated कोशिकाओं को 24-30 घंटे में microwells में EBs फार्म होगा, जो एक मानक, उल्टे चरण कंट्रास्ट माइक्रोस्कोप (चित्रा 5) का उपयोग कर मनाया जा सकता है । EBs के परिपत्र समोच्च पर स्पष्ट रूप से दिखाई और गर्मी के 24 घंटे के बाद हो जाते हैं । पहले ही समय पर कटाई EBs (जैसे, 16 घंटे टीका के बाद) उनके परिपत्र समोच्च स्पष्ट रूप से दिखाई दे रहा है पहले की सिफारिश नहीं है क्योंकि इस तरह के EBs बहुत यंत्रवत नुकसान और आसानी से नष्ट करने के लिए असुरक्षित हैं । ध्यान दें कि भोले hiPSCs की महत्वपूर्ण मात्रा EBs में शामिल नहीं हैं, जो सामान्य है. कम अनुयाई सतह (2.5.2) पर EBs की संस्कृति का घोड़ा की दीक्षा से पहले इन विनिर्मित कोशिकाओं को दूर धोया जाएगा । यह भी ध्यान दें कि, हमारे प्रोटोकॉल में, EBs में बनते हैं 4i भोली pluripotency माध्यम-hPGCLC माध्यम में नहीं. hPGCLC माध्यम से एक्सपोजर से पहले 4i माध् यम में ठोस EBs का पूर्व गठन EBs की सतह पर hPGCLCs के वितरण के लिए महत् वपूर्ण है ।

EBs एक कमाल के तहत hPGCLC माध्यम में बनाए रखा, गैर अनुयाई संस्कृति की स्थिति एकत्रीकरण या फ्यूजन (चित्रा 6 और चित्रा 7) के बिना अपने गोलाकार आकार बनाए रखने जाएगा. भी कमजोर कमाल की हालत EB एकत्रीकरण और फ्यूजन का कारण होगा, लेकिन बहुत कठोर हालत EBs को नष्ट कर देगा । मानव PGCLCs के रूप में hPGCLC माध्यम में 5 दिन संस्कृति के रूप में जल्दी के रूप में EBs की सतह पर OCT4-व्यक्त कोशिकाओं के रूप में उभरने, और 8 दिन संस्कृति (चित्रा 8) तक उनकी संख्या बढ़ जाती है । EBs के आगे की मशीन EBs की समाप्ति और hPGCLCs के नुकसान का कारण हो सकता है । hPGCLC के रूप में FACS + कोशिकाओं (figure 9) के अनुसार संस्कृति के 5-8 दिनों के बाद enzymatically असंबद्ध EB कोशिकाओं से मानव PGCLCs को समृद्ध किया जा सकता है ।

Figure 1
चित्रा 1: Y27632 में मानव iPSC सेल संस्कृति-पूरक मध्यम 24 घंटे टीका के बाद । सेल घनत्व के बारे में 20-30% धाराप्रवाह है । रॉक अवरोधक Y27632 की उपस्थिति में, कोशिकाओं को लंबे, कील की तरह बढ़ाव के साथ अच्छी तरह से फैल जाते हैं । स्केल बार = १०० माइक्रोन । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 2
चित्रा 2: ह्यूमन iPSC सेल कल्चर ४८ घंटे बाद टीका । कोशिकाओं को कुल कालोनियों के फार्म का, कब्जा ~ विकास क्षेत्र के 30% । स्केल बार = १०० माइक्रोन । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 3
चित्रा 3: ह्यूमन iPSC सेल कल्चर 24 घंटे के लिए एक 4i reprogramminging माध्यम में मशीन । कोशिकाओं को प्रभावित करने के लिए पहुंच । स्केल बार = १०० माइक्रोन । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 4
चित्रा 4: मानव iPSC सेल संस्कृति 4i ४८ घंटे के लिए reprogramminging माध्यम में मशीन । धाराप्रवाह कोशिकाएं घनी पैक होती हैं । स्केल बार = १०० माइक्रोन । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 5
चित्रा 5: मानव iPSC EBs 4i reprogramminging माध्यम में 24 घंटे की मशीन के बाद microwells में गठन किया । EBs के परिपत्र समोच्च 24-30 घंटे में टीका के बाद दिखाई बन जाते हैं । जब समोच्च एक चरण कंट्रास्ट माइक्रोस्कोप के तहत की पुष्टि की है, EBs एक कमाल संस्कृति हालत को हस्तांतरण के लिए तैयार हैं । स्केल बार = ५०० माइक्रोन । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 6
चित्रा 6: मानव iPSC EBs hPGCLC माध्यम में 24 घंटे के लिए मशीन । EBs काफी हद तक अपने गोलाकार आकार बनाए रखते हैं. स्केल बार = ५०० माइक्रोन । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 7
चित्रा 7: मानव iPSC EBs hPGCLC माध्यम में १९२ घंटे के लिए मशीन । EBs 24 घंटे की संस्कृति में अपनी उपस्थिति की तुलना में बढ़े हैं, लेकिन वे अभी भी काफी हद तक कोई एकत्रीकरण या संलयन के साथ गोलाकार आकार बनाए रखने । स्केल बार = ५०० माइक्रोन । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 8
चित्र 8: मानव PGCLCs व्यक्त OCT4 hiPSC EBs के hPGCLC माध्यम में १९२ घंटे के लिए मशीन की सतह पर स्थानीयकृत रहे हैं । EBs extracellular मैट्रिक्स प्रोटीन में एंबेडेड थे और FFPE स्लाइड immunohistochemical OCT4 (ढाब सब्सट्रेट) के धुंधला के लिए कार्रवाई की । स्केल बार = 1 मिमी. कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 9
चित्र 9: मानव PGCLCs को FACS+ कोशिकाओं के रूप में CD38 करके enzymatically असंबद्ध EB कोशिकाओं से समृद्ध किया जाता है. 5-8 दिनों के लिए hPGCLC माध्यम में मशीन के बाद, EBs एक सेल निलंबन तैयार करने के लिए पाचन एंजाइमी द्वारा असंबद्ध जा सकता है । hPGCLCs FACS (लाल डॉट्स) द्वारा CD38+ कोशिकाओं के रूप में समृद्ध किया जा सकता है । EB कोशिकाओं है कि CD38 (नीले डॉट्स) व्यक्त नहीं भी नकारात्मक नियंत्रण के रूप में एकत्र किया जाना चाहिए । CD38 के FACS गेट्स-पॉजिटिव और CD38-नेगेटिव कोशिकाओं को हर प्रकार की कोशिकाओं के संदूषण से बचने के लिए चौड़े मार्जिन (green डॉट्स) के साथ अलग किया जाना चाहिए । ऊपरी और निचले पैनलों विरोधी CD38 एंटीबॉडी धुंधला, क्रमशः के साथ या बिना FACS प्रोफाइल दिखाते हैं । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Discussion

hPGCLCs का मजबूत उत्पादन यहां वर्णित प्रोटोकॉल का उपयोग कर सामांय द्विगुणित कैरयोटाइप10के साथ मानव iPSCs के तीन स्वतंत्र क्लोन के साथ पुष्टि की गई । ये iPSC क्लोन एक ही मानव नवजात चमड़े की त्वचा fibroblast सेल संस्कृति10से प्राप्त किए गए थे । वे अनुरोध पर जांचकर्ताओं को इस लेख के लेखकों द्वारा प्रदान की जाएगी और उचित सामग्री हस्तांतरण समझौते और जमे हुए रहते मानव कोशिकाओं के शिपिंग व्यवस्था के तहत । यह वर्तमान में है कि सामांय कैरयोटाइप मजबूत hPGCLC उत्पादन के लिए हमारे प्रोटोकॉल या अंय प्रयोगशालाओं द्वारा सूचित उन का उपयोग करने के लिए आवश्यक है के रूप में अज्ञात है ।

हाल के अध्ययनों से पता चला है कि hiPSCs11 या ESCs14 से hPGCLCs का उत्पादन क्योटो विश्वविद्यालय8 के Saitou समूह द्वारा वर्णित प्रोटोकॉल का उपयोग EOMESODERMIN की अभिव्यक्ति पर निर्भर है, एक टी बॉक्स प्रतिलेखन के लिए आवश्यक कारक SOX17 की प्रेरण । SOX17 को मास्टर वंश मानव pluripotent स्टेम सेल6के germline भेदभाव में प्रतिलेखन कारक का निर्धारण के रूप में कार्य करने लगता है । EOMESODERMIN EOMES जीन द्वारा इनकोडिंग है, और CRISPR/EOMES के Cas9 नॉकआउट की वजह से SOX17 में प्रेरण के लगभग पूरा अभाव hPGCLC उत्पादन की स्थिति11, और अंय जीनों की अभिव्यक्ति का एक ही पैटर्न के बाद SOX17-अशक्त पीटकर कोशिकाओं । hPGCLC प्रेरण संस्कृति के दौरान EOMES-नल नॉकआउट कोशिकाओं में एक inducible वेक्टर से EOMESODERMIN का इजहार कुशलतापूर्वक hPGCLC सहित germline जीन की प्रेरण के रूप में अच्छी तरह से मजबूत SOX17 उत्पादन को बचाया । इसके विपरीत, प्रेरित SOX17 भी मजबूत PGCLC उत्पादन बचाया लेकिन EOMES उत्प्रेरण के बिना । इस प्रकार, EOMESODERMIN SOX17 के एक महत्वपूर्ण नदी के ऊपर उत्प्रेरण है, और यह मानव pluripotent स्टेम कोशिकाओं से hPGCLC प्रेरण में EOMESODERMIN की सबसे महत्वपूर्ण भूमिका है । हमारे प्रोटोकॉल hiPSCs10में SOX17 लाती है, लेकिन EOMESODERMINE प्रेरण पर अपनी निर्भरता के लिए निर्धारित होने का इंतजार कर रहा है ।

यह प्रोटोकॉल प्राइमेड धर्मांतरित-pluripotency ह्यूमन iPSCs को mTeSR1 मीडियम में बनाए रखने के लिए ERK-इंडिपेंडेंट भोली pluripotency को 4i reprogramminging मीडियम6में ९६ घंटे के लिए रखा गया है, जो एक संशोधित भोली मानव स्टेम सेल मीडियम (NHSM)5है । हमारा प्रयास वही मानव iPSC क्लोन के साथ शुरू hPGCLCs उत्पंन करने के लिए, लेकिन अंय व्यावसायिक रूप से उपलब्ध मानव iPSC विकास मीडिया में बनाए रखने से पहले इस 4i reprogramminging मध्यम कम hPGCLC पैदावार की डिग्री बदलती में हुई । हालांकि अब चाहे दूसरे मीडिया में अवधि के अनुकूलन hPGCLC उत्पादन में सुधार या नहीं रहता है भविष्य के अध्ययन में निर्धारित किया जाना है, इस अवलोकन से पता चलता है कि मानव iPSCs के प्राइमेड pluripotency की सटीक स्थिति से पहले 4i reprogramminging काफी hPGCLC माध्यम में 4i माध् यम और EB विभेद में EB गठन पर प्रभाव डालता है ।

hiPSCs से hPGCLCs का उत्पादन हमारे प्रोटोकॉल निंनलिखित मजबूत और उच्च reproducible है, आंशिक रूप से microwell प्लेटों के उपयोग के कारण है कि EBs की एक बड़ी संख्या के कुशल उत्पादन सक्षम (~ ८,००० EBs प्रति बैच) एक समान आकार के साथ (३,००० hiPSCs प्रति EB) । EBs की संख्या आसानी से प्रयोग के एक बैच में हमारे प्रोटोकॉल का उपयोग कर का उत्पादन अभी तक नियमित रूप से U-नीचे सेल संस्कृति कुओं का उपयोग कर तरीकों से बड़ा हो सकता है । समान रूप से hPGCLCs के साथ जड़ी EBs आकार की एक बड़ी संख्या का उत्पादन उच्च प्रवाह रासायनिक प्रदर्शन के अद्वितीय अवसर प्रदान करने के लिए छोटे आणविक वजन उत्प्रेरक या अवरोधकों को प्रभावित करने की पहचान कर सकते है PGC विनिर्देश या उनके epigenetic reprogramminging जैसे जैविक विशेषताओं । इस तरह के EBs भी germline सेल विषालु की बड़ी संख्या के विषाक्तता आकलन के लिए उपयोगी हो सकता है, न केवल पर्यावरण प्रदूषण सहित, लेकिन यह भी नैदानिक रूप से निर्धारित दवाओं कीमोथेरेपी एजेंटों के रूप में ।

प्रस्तुत प्रोटोकॉल का उपयोग hPGCLCs के मजबूत और reproducible उत्पादन के महत्वपूर्ण कारकों में शामिल हैं (i) extracellular मैट्रिक्स प्रोटीन पर mTeSR1 में बनाए रखा स्वस्थ hiPSCs का उपयोग, (ii) निर्दिष्ट और कड़ाई के रूप में कोशिकाओं की सही संख्या inoculate करने के लिए मध्यम परिवर्तन और उपसंस्कृति के समय का पालन करें, (iii) मानव रिकॉमबिनेंट BMP4 का एक अच्छा बहुत का चयन करने के लिए, और (iv) रॉकिंग संस्कृति के दौरान EBs की शारीरिक क्षति को कम करने के लिए । यह हमारा अनुभव है कि BMP4 रिएजेंट का सबसे अच्छा बहुत BMP4 पुनर्अभिकर्ताओं के अंय बहुत जबकि 2x या अधिक से अधिक खुराक की आवश्यकता १०० एनजी/ दूसरी ओर, hPGCLCs उत्पादन की उपज BMP4 की सबसे अच्छी जगह का उपयोग कर के बजाय BMP4 की उच्च खुराक में कमी आई (जैसे, २०० एनजी/ हम रिकॉमबिनेंट मानव BMP4 hPGCLC पीढ़ी के समर्थन में अपने प्रदर्शन के लिए कई विक्रेताओं से प्राप्त की और सबसे अच्छा बहुत की एक बड़ी राशि सुरक्षित एजेंट के कई अलग बहुत परीक्षण करने की सलाह देते हैं ।

हमारे hPGCLC प्रोटोकॉल की एक अनूठी विशेषता है कि hPGCLCs EBs10 (चित्रा 8) के सबसे बाहरी सतह परत पर स्थानीयकृत कर रहे हैं, जबकि अन्य प्रोटोकॉल सेल एग्रीगेट6,8के बीच में hPGCLCs उत्पन्न कर सकते हैं । Embryoid निकायों ऐसी सतह के रूप में कई अलग परतों के रूप में करते हैं, बाहरी कवच, भीतरी खोल, और कोर, और केंद्रीय कोर क्षेत्रों अक्सर पोषक तत्वों की सीमित आपूर्ति के कारण, ऑक्सीजन, के रूप में अच्छी तरह के रूप में प्रो-जीवित विकास कारकों संस्कृति फार्म प्रदान की जाती है माध्यम फैलाना20. EBs के केंद्र की ओर सीमित प्रसार के कारण संभव प्रतिबंधों के बिना EBs की सतह पर hPGCLCs का स्थानीयकरण प्रत्यक्ष, समय और खुराक के लिए फायदेमंद हो सकता है hPGCLCs की दवाओं या औषधीय पदार्थों के लिए जोखिम नियंत्रित या विषाक्तता अध्ययन ।

जबकि माउस PGCLCs दिखाने के मजबूत जीनोम-वाइड डीएनए विमुद्रण नियंत्रण क्षेत्रों को शामिल कम आंशिक रूप से7,19,20, hPGCLCs में वैश्विक gDNA के स्तर की डिग्री के लिए माउस से कमजोर लगता है PGCLCS या PGCs6,7. Transcriptomal प्रोफ़ाइल hPGCLCs माउस PGCLCs10से भ्रूण PGCs की एक पूर्व अवस्था के समान हो सकता है कि सुझाव है । यह बताया गया है कि hPGCLC उत्पादन की स्थिति के तहत EBs की लंबे समय तक संस्कृति gDNA के एक वृद्धि की डिग्री के कारण7; तथापि, चाहे EBs में hPGCLCs की संस्कृति की एक विस्तारित अवधि या अलग कोशिकाओं के रूप में germline भेदभाव के अधिक उंनत चरणों को प्राप्त कर सकते है भविष्य के अध्ययन के द्वारा निर्धारित की जरूरत है ।

Disclosures

लेखकों का खुलासा करने के लिए कुछ नहीं है ।

Acknowledgments

हम प्रारंभिक अध्ययन के दौरान तकनीकी सहायता के लिए शिओमी Yawata और ची Owa स्वीकार करते हैं. इस अध्ययन NIEHS/NIH अनुदान R01 ES023316 और R21ES024861 द्वारा टीएस के लिए, और उड़ान परिचर चिकित्सा अनुसंधान संस्थान (FAMRI) अनुदान द्वारा समर्थित किया गया था JHH ।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Primed pluripotency hiPSC culture
Matrigel Corning 354277 Aliquot Matrigel at the volume indicated by the manufacturer (about 200 μL). Use cold tubes. Store at -80 °C
DMEM/F-12 Thermo Fisher Scientific 21041-025 Store at 4 °C.
mTeSR1 STEMCELL Technologies 85850 Reconstitute by adding 5X Supplement to Basal Medium. The reconstituted medium can be stored at 4 °C for up to
4 weeks without affecting cell culture performance.
Y27632 Axon 1683 Dilute 5 mg Y27632 (MW 320.26) with 312.2 μL water to prepare 50 mM Y27632 stock solution. Sterilize by filtration (0.22 μm). Aliquot 20 μL/tube x 15 tubes and store at -20 °C.
CryoStor CS10 STEMCELL Technologies 07930 Store at 4 °C.
Accutase Innovative cell technologies AT104-500 Cell dissociation enzyme; aliquot 40 mL/tube x 12 tubes and store at -20 °C.
Name Company Catalog Number Comments
4i hiPSC culture
KnockOut DMEM Thermo Fisher Scientific A1286101
KnockOut Serum Replacement Thermo Fisher Scientific 10828028 Aliquot 40 mL/tube x 12 tubes and store at -20 °C.
Penicillin-Streptomycin-Glutamine (100x) Thermo Fisher Scientific 10378016
MEM Non-Essential Amino Acids Solution (100x) Thermo Fisher Scientific 11140050
Insulin from bovine pancreas Sigma-Aldrich I1882-100MG Add 0.1 mL glacial acetic acid to 10 mL water. Sterilize by filtration (0.22 um). Dilute 100 mg insulin lyophilized powder with cold 10 mL the acidified water to make 10 mg/mL stock solution. Aliquot 650 μL/tube x 15 tubes and store at -80 °C.
human LIF PeproTech 300-05 Reconstitute 250 μg human LIF with 250 μL water. Add 750 μL of 0.1% bovine serum albumin in PBS(-) to make 250 μg/mL human LIF stock solution. Specific activity of this product is >10,000 units/μg. Aliquot 40 ul/tube x 25 tubes and store at -80 °C.
human FGF2 R&D Systems 4114-TC Reconstitute 1 mg human FGF2 with 5 mL PBS(-) to make 200 μg/mL human FGF2 stock solution. Aliquot 100 μL/tube x 50 tubes and store at -80 °C.
human TGF-β1 PeproTech 100-21 Reconstitite 50 μg with 50 μL of 10 mM Citric Acid (pH 3.0). Add 150 μL of 0.1% bovine serum albumin in PBS(-) to make 250 μg/mL human TGF-β1 stock solution. Aliquot 4 μL/tube x 50 tubes and store at -80 °C.
4i basal medium Mix the following reagents to make 4i basal medium.
500 mL of KnockOut DMEM
100 mL of KnockOut Serum Replacement
6 mL of Penicillin-Streptomycin-Glutamine (100x)
6 mL of MEM Non-Essential Amino Acids Solution (100x)
650 µL of 10 mg/mL Insulin from bovine pancreas
40 µL of 250 µg/mL human LIF
20 µl of 200 µg/ml human FGF2
4 µl of 250 µg/ml human TGF-β1
Aliquots 40 ml/tube and store at -80 °C.
CHIR99021 Axon 1386 Reconstitute 25 mg CHIR99021 (MW 465.34) with 1791 μL DMSO to make 30 mM CHIR99021 stock solution. Aliquot 50 μL/tube x 35 tubes and store at -20 °C.
PD0325901 Axon 1408 Reconstitute 5 mg PD0325901 (MW 482.19) with 1037 μL DMSO to make 10 mM PD0325901 stock solution. Aliquot 50 μL/tube x 20 tubes and store at -20 °C.
BIRB796 Axon 1358 Reconstitute 10 mg BIRB796 (MW 527.66) with 948 μL DMSO to make 20 mM BIRB796 stock solution. Aliquot 50 μL/tube x 18 tubes and store at -20 °C.
SP600125 Tocris 1496 Reconstitute 10 mg SP600125 (MW220.23) with 908 μL DMSO to make 50 mM SP600125 stock solution. Aliquot 50 μL/tube x 18 tubes and store at -20 °C.
AggreWell400 STEMCELL Technologies 27845 Microwell plate
Pluronic F-127 Sigma-Aldrich P2443 Reconstitute 5 g Pluronic F-127 in 100 mL water to make 5%(w/v) Pluronic F127 stock solution. Sterilize by filtration (0.22 um). Aliqout 50 mL/tube x 2 tubes and store at r.t.
Name Company Catalog Number Comments
hPGCLC culture
Glasgow’s MEM Thermo Fisher Scientific 11710035
Sodium pyruvate (100 mM) Thermo Fisher Scientific 11360070
Penicillin-Streptomycin (100x) Corning 30-002-CI
hPGCLC basal medium Mix the following reagents to make hPGCLC basal medium.
500 mL of Glasgow’s MEM
75 mL of KnockOut Serum Replacement
6 mL of MEM Non-Essential Amino Acids Solution (100x)
6 mL of 100 mM Sodium pyruvate
6 mL of Penicillin-Streptomycin (x100)
Aliquots 40 mL/tube and store at -20 °C.
2-Mercaptoethanol Sigma-Aldrich M3148 Dilute 350 μL 2-Mercaptoethanol (14.3 M) in 9.65 mL PBS(-) to make 500 mM 2-Mercaptoethanol stock solution . Store at 4 °C.
L-Ascorbic acid Sigma-Aldrich A4544 Reconstitute 400 mg L-Ascorbic acid with 20 mL water to make 20 mg/mL L-Ascorbic acid stock solution. Sterilize by filtration (0.22 um). Aliquot 500 μL/tube x 40 tubes and store at -20 °C.
Recombinant human BMP4 R&D Systems 314-BP Reconstitute 1 mg recombinant human BMP4 with 10 mL of 4mM HCl aq. to make 100 μg/mL recombinant human BMP4 stock solution. Aliquot 250 μL/tube x 40 tubes and store at -80 °C.
Human SCF PeproTech 300-07 Reconstitute 250 μg human SCF with 500 μL of 0.1% bovine serum albumin in PBS(-) to make 500 μg/mL human SCF stock solution. Aliquot 35 μL/tube x 14 tubes and store at -80 °C.
Human EGF PeproTech AF-100-15 Reconstitute 1 mg human EGF with 1 mL of 0.1% bovine serum albumin in PBS(-) to make 1 mg/mL human EGF stock solution. Aliqot 100 μL/tube x 10 tubes. Dilute 100 μL of 1 mg/ml human EGF stock solution with 300 μL of 0.1% bovine serum albumin in PBS(-) to make 250 μg/mL humanEGF stock solution. Aliquot 20 μL/tube x 20 tubes. Store at -80 °C.
Cell strainer Corning 352340 Pore size = 40 μm.
50 ml polypropylene conical tube Corning 352070
Low attachment plate Corning 3471
Vari-Mix Platform Rocker Thermofisher M79735Q
Name Company Catalog Number Comments
Immunohistochemical staining
BLOXALL Blocking Solution VECTOR SP-6000
Normal Horse serum
ImmPRESS Reagent Anti-Goat IgG		 VECTOR MP-7405
OCT-3/4 Antibody Santa Cruz SC-8629
ImmPACT DAB VECTOR SK-4105
Permount Thermofisher SP15-100 Mounting medium
Name Company Catalog Number Comments
Isolating hPGCLC
Embryoid Body Dissociation Kit Miltenyi Biotec 130-096-348
Anti-CD38 antibody conjugated to APC abcam ab134399

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References

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Mitsunaga, S., Shioda, K., Isselbacher, K. J., Hanna, J. H., Shioda, T. Generation of Human Primordial Germ Cell-like Cells at the Surface of Embryoid Bodies from Primed-pluripotency Induced Pluripotent Stem Cells. J. Vis. Exp. (143), e58297, doi:10.3791/58297 (2019).

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