Summary
タンデム クロマチンのステップバイ ステップ プロトコルについて述べる免疫沈降配列 (tChIP-Seq) 細胞型特異ゲノムワイドなヒストン修飾の解析を可能にします。
Abstract
エピジェネティック制御は、遺伝子発現の中心的な役割を果たしています。ヒストン修飾は、1960 年代に発見された、ので、その生理学的および病理学的機能が幅広く研究されています。確かに、次世代のディープ シーケンスと特定のヒストン修飾抗体を介してクロマチン免疫沈降 (チップ) の出現は遺伝子エピジェネティック制御の私達の眺めをもたらしました。逆に、組織は通常種類の多様な細胞で構成されて、彼らの複雑な混合物の特定の細胞型のエピゲノムを調査する課題が分析。ゲノムワイドなセル型固有クロマチンの状態に対処するため我々 は最近セルからタグ ヒストン蛋白によるクロマチンの選択的浄化に基づいているタンデム クロマチン免疫沈降配列 (tChIP-Seq) を開発チップ以下続く金利の種類このプロトコルの目標は tChIP 以下のベスト ・ プラクティスの導入この手法は、組織固有のエピゲノム多様なヒストン修飾とそのモデル生物の調査のための多機能なツールを提供します。
Introduction
動物の組織は、多様な細胞の種類で構成されます。各細胞の遺伝子の規則では、セルの種類を定義します。クロマチン修飾 DNA メチル化とヒストン修飾、遺伝子発現の細胞型特異性の根底にあります。したがって、各細胞型におけるエピジェネティクス制御の測定が望まれているが、それは技術的な挑戦をされています。
特定のセル型でエピジェネティクスを調べるためには、タンデム クロマチン免疫沈降シーケンス (Seq tChIP) は最近開発された(図 1)1だったTChIP、コアのエピトープ タグ ヒストン H2B は細胞型特異プロモーターから表されます。材料は種々 の細胞の混合物から開始されますが、この機能によりクロマチン興味のセルからの分離です。次チップ Seq-変更されたヒストン マークと次世代のディープ シーケンスを介してクロマチン精製 DNA を隔離した-我々 はゲノムワイドな標的細胞型のエピジェネティックな状態を監視できます。
この手法を使用すると、最近のヒストン H3 リジン 4 (H3K4me3) 蛋白質ニューロン固有トリメチルを調査したマーク。その研究では、Cre を介する組み換え (Rosa26CAG floxed pA H2B フラグ) に表現された蛋白質の C 末端タグ付きのフラグ H2B のノックアウトのマウスを開発しました。CamK2a プロモーターの制御下で Cre 小胞体 (ER) の遺伝子を持つマウスとの交雑、による得られたマウス ラインはタモキシフェン注入 (Camk2aH2B フラグ)1にアクティブなニューロンの H2B フラグを誘発しました。アンチ H3K4me3 抗体 tChIP Seq を行ったマウスの確立されたラインの脳から始まって、.H3K4me3 マークは、しばしばプロモーター領域に対応するのでニューロン1特異的に発現する Mrna の何百もを見出す可能性があります。
ここでは、組織郭清からライブラリーの構築(図 1)へのステップをカバーする典型的な tChIP Seq 手法について述べる。この議定書の最終的な目標は、tChIP Seq のパフォーマンスと他のセルタイプおよびヒストンの修正にこのメソッドの将来のアプリケーションのためのベスト プラクティスを共有することです。
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Protocol
記載のすべてのメソッドを理化学研究所 (H27-EP071) の安全部門によって承認し、関連するガイドラインと規制を実施します。
1. 組織切離
- 小さな断片に興味の組織を解剖 (約 < 3 mm2) 晴れた春のはさみを使用しています。
注: 大きな組織片、凍結に時間がかかるし、より小さな部分が結果に影響を与える可能性がありますどちらのバッファーの大きいボリュームに持ち越されます。 - 液体窒素で満たされた清潔な容器に切り裂かれた組織片を追加し、2 mL の管 (チューブあたり 1 個) に液体窒素で満たされたそれらを収集します。
注: 親水性表面と管のこの手順お勧めします。 - > 残りの液体窒素を蒸発させるためオープンのキャップと 5 分-80 ° C にチューブを置きます。
注: キャップを閉じた後組織片格納できます-80 ° C で使用する前に 1 ヶ月。
2. セル固定
注意: このステップの便利な極低温研削盤を使用しています。代替の装置を使用できます。
- 金属の氷棚の組織サンプルを含む場所、2 mL 蛋白低結合管は液体窒素で冷やしています。
- 1.5 mL チューブと液体窒素で寒さに金属弾を配置します。金属氷ラック上に置きます。
- 2 mL 管を開き、チューブに prechilled の金属製の弾丸を配置します。キャップ ハンディ極低温研削機のチューブ ホルダーに 2 mL 管を設定し、すぐに 1 分の液体窒素で組み立てられたチューブ ホルダーをつけます。
- 便利な極低温研削盤の外側のカセットに凍結チューブ ホルダーを挿入し、30 の 60 回を積極的に振る s。
- チューブ ホルダーを分解、金属の行頭文字を削除、-20 ° C のクーラーのサンプルの場所、2 mL 管 prechilled
- 次のステップで定着剤の凍結を防ぐため 15 分-20 ° C でクーラーのサンプルを置きます。
- ベンチにクーラーのサンプルを持って、チューブのフタを開け、すぐにそれに 1% のホルムアルデヒドの 900 μ L を滴下します。数回ピペッティングした後に新たに 2 mL 管 900 μ L の 1% のホルムアルデヒドと 23 ° C で設定インキュベーターの緩やかな回転と 10 分のための修正を含む懸濁液を転送します。
注意: ホルムアルデヒドは有毒、有害であります。 - 固定反応を停止するには、各管および 4 ° C で 3,000 × g で 5 分間遠心分離機に 2.5 M のグリシンの 100 μ L を追加します。上清を捨てます。
- 冷たいリン酸緩衝生理食塩水 (PBS)、4 ° C で 3,000 × g で 5 分間遠心分離の 1 つの mL を追加し、上澄みを廃棄します。2 回 (合計 3 洗浄) この手順を繰り返します。
注: 固定サンプルは液体窒素によってフラッシュ凍結し、-80 ° C で保存されますをすることができます。 - 換散バッファー 1 を 500 μ l 添加 (50 mM 4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic 酸 (HEPES)-島 (pH 7.5)、140 mM の NaCl、1 mM エチレンジアミン四酸 (EDTA) (pH 8.0)、10 %w/v のグリセロール、0.5 w/v NP-40、0.25 %w/v トリトン X-100, と 0.1 x プロテアーゼ阻害剤カクテル) ペレット、ピペットで移しなさいいくつかの回に、4 ° C で 10 分間回転
注: 1 の換散バッファーする必要がありますフィルター、使用する前に 4 ° C で保存します。 - 4 ° C で 3,000 × g で 5 分間遠心分離し、上澄みを廃棄します。
- 換散バッファー 2 の 1 mL を追加 (10 mM トリス-HCl (pH 8.0)、200 mM の NaCl、1 mM EDTA (pH 8.0)、0.5 mM グリコールエーテルジアミン四酢酸、およびプロテアーゼ抑制剤のカクテル × 0.1)、ペレットに渦と 4 ° C で 10 分間回転
注: 2 の換散バッファーする必要がありますフィルターし、使用前に 4 ° C で保存します。 - 4 ° C で 3,000 × g で 5 分間遠心分離し、上澄みを廃棄します。
- ペレットに 1 x プロテアーゼ抑制剤のカクテルと radioimmunoprecipitation 検定法 (RIPA) バッファーの 800 μ L を追加し、ピペッティングでペレットを再懸濁します。
- 4 ° C で 3,000 × g で 5 分間遠心分離し、上澄みを廃棄します。
- 500 μ L の 1 x プロテアーゼインヒビター カクテル、RIPA バッファーを追加します。
- 4 ° C で 3,000 × g で 5 分間遠心分離し、上澄みを廃棄します。
- 1 x プロテアーゼインヒビター カクテル、RIPA バッファーの 1 つの mL を追加します。すぐに次のステップに進みます。
3. せん断クロマチン
- 超音波発生装置管に液を転送し、ultrasonicator にチューブを配置します。
- 次の設定で、クロマチンをせん断: 気温: 4 ° C最大入射電力: 175 W。負荷時間率: 10%サイクル/バースト: 200;時間: 2,400 s。
- 1.5 mL 蛋白質低結合管および 4 ° C で 20,000 × g で 5 分間遠心するサンプルを転送します。
- 新しいタンパク質低バインド チューブに上清を収集します。
注: サンプル フラッシュ液体窒素で凍結でき-80 ° C で保存
DNA (逆架橋) の品質チェック
- ライセートのミックス 20 μ L、180 μ L チップ溶出バッファーの (10 mM トリス-HCl (pH 8.0)、300 mM の NaCl、5 mM EDTA (pH 8.0)、および 1 %w/v ナトリウム dodecyl 硫酸塩 (SDS)) ポリメラーゼの連鎖反応 (PCR) 管。サーマルサイクラー蓋が開いたまま 6 時間サーマルサイクラーの 65 ° C でサンプルをインキュベートします。過剰変性を避けるためには、サーマルサイクラー オープンの蓋をしてください。
注: チップ溶出バッファーする必要がありますフィルター、使用する前に室温で保存します。この培養は、一夜にして拡張できます。 - 10 mg/mL RNase の 1 μ L を追加、渦と 37 ° C, 30 分インキュベートします。
- 15 mg/mL の 6.5 μ L を追加, プロテイナーゼ K、渦、55 ° C の 60 分間インキュベートし、。
- DNA 低結合管への反応を転送、5 mg/mL グリコーゲンおよび渦の 4 μ L を追加します。室温で 18,000 × g で、フェノール/クロロホルム/イソアミル アルコール (25:24:1) の 5 分間遠心する 200 μ L を追加します。
- 新しい DNA 低いバインド チューブに上清を転送します。トリス EDTA 塩バッファーを 200 μ l 添加 (トリス-HCl (pH 8.0) 10 mM、1 mM EDTA (pH 8.0)、および 200 mM の NaCl) 残りのフェノール/クロロホルム/イソアミル アルコール溶液と室温で 18,000 × g で 5 分間遠心します。上清を収集し、最初の上澄みをミックスします。
- 冷たいエタノールの 900 μ L を追加し、-20 ° C で 1 時間インキュベート
注: このインキュベーションは、4-6 h に拡張できます。 - 4 ° C で 18,000 × g で 30 分間遠心
- 上清を捨てます。ペレットと 4 ° C で 18,000 × g で 30 分間遠心する冷たい 75% エタノール 1 mL を追加します。(合計で 2 回洗濯) この手順を繰り返します。
- 徹底的に上澄みを廃棄し、室温で 1 分風乾します。
- トリス-EDTA (TE) バッファーの 50 μ L を追加し、それが 4 ° C、30 分間室温で一晩インキュベートし、DNA を溶解します。ボルテックスやピペッティングを避けます。「入力」としてこの DNA し必要な場合、ライブラリの準備のため使用します。
- 製造元の指示に従って蛍光光度計と DNA 濃度の測定 (参照のテーブル素材) マイクロ電気泳動マシンとサイズ分布をチェック (図に示すように代表的なデータを参照してください2 a). 使用 10 ng またはこの試金のためのより少ない DNA。
注: 100-500 塩基対 (bp) の断片が DNA の 50% 以上をください。
5. 反フラグ抗体による純化
注意: ニューロン tChIP-Seq、8 マウス脳組織が通常使用 tChIP Seq の 1 つのサンプル 2 を準備するタンデム免疫浄化によって浄化された DNA の ng (手順 7.1 を参照)。私たちの手で 0.1 ng まだ DNA の提供高品質 DNA ライブラリ チップ Seq (門田、未発表)。したがって、理論的には、単一のマウスかもしれないニューロン tChIP シーケンスを実行するのに十分です興味の組織切片・細胞のタイプの必要な量を最適化してください。Imumuno 浄化の実験の否定的な制御、脳組織ライセート H2B フラグ式なしマウスからする必要があります準備、使用されます。
- 共役タンパク低結合管に羊抗マウス免疫グロブリン G (IgG) を磁気ビーズの 200 μ L をピペットします。
- マグネット スタンドにチューブを置き、クリアになる上清の 1 分待ちます。上澄みを廃棄、氷冷 PBS と渦の 1 つの mL を追加します。(合計で 2 回洗濯) この手順を繰り返します。
- 1 mg/mL 反フラグ抗体の 20 μ L を追加し、4 ° C で 5 時間回転
注: このインキュベーションは、一夜にして拡張できます。 - 次のステップ 5.2 ビーズを洗浄します。15 mL チューブにビーズを配置します。
- RIPA バッファーの 1110 μ L のビードを再停止しなさい、試薬、180 x Denhardt の液 50 μ L、プロテアーゼ阻害剤のカクテル、100 の 10 μ L と手順 3 で準備ライセートの 6.8 mL ブロック x 10 の 900 μ L を追加します。5 蛋白質低バインド チューブにこの混合物を分割します。4 ° C で 6 時間回転します。
注: このインキュベーションは、一夜にして拡張できます。 - また、マグネット スタンドにチューブを置き、クリアになる上清の 1 分待ちます。上澄みを廃棄、RIPA バッファーの 1 mL を加え、優しく混ぜます。この手順を 5 回繰り返します (合計で 6 洗浄)。すべてのビーズを単一蛋白質低バインド チューブにプールします。
- チップ溶出バッファーを 200 μ l 添加し、室温で 15 分間回転します。4.11 (図 2 b と Cに示すように代表的なデータを参照してください) の手順で説明するように DNA の品質を確認します。すぐに次のステップに進みます。
6. アンチ H3K4me3 抗体と逆架橋親和性の浄化
注: 次ビーズの準備手順 5.7 まで (6.1-6.4) の手順を実行します。
- 2 mL 蛋白低結合管に羊抗マウス IgG に共役の磁性体ビーズ 40 μ L をピペットします。
- また、マグネット スタンドにチューブを置き、クリアになる上清の 1 分待ちます。上澄みを廃棄、氷冷 PBS の 1 mL を加え、優しく混ぜます。(合計で 2 回洗濯) この手順を繰り返します。
- 1 mg/mL 抗 H3K4me3 抗体の 4 μ L を追加し、4 ° C で 6 時間回転
- 次のステップ 6.2 ビーズを洗浄します。2 mL 蛋白低結合管にビーズを配置します。
- RIPA バッファーの 1558 μ L のビードを再停止しなさい、試薬、Denhardt のソリューション x 50 の 40 μ L、プロテアーゼ阻害剤のカクテル、100 の 2 μ L、ステップ 5.7 で作製した溶出液 200 μ L をブロック × 10 の 200 μ L を追加します。4 ° C で一晩回転します。
注: チップ溶出バッファーで SDS はこの培養で 10 倍以上希釈しました。 - また、マグネット スタンドにチューブを置き、クリアになる上清の 1 分待ちます。上澄みを廃棄、RIPA バッファーの 1 mL を加え、優しく混ぜます。この手順を 4 回繰り返します (合計 5 洗浄)。最後の洗浄後、DNA 低いバインド チューブにビーズを転送、上澄みを廃棄します。
- チップ溶出バッファーを 200 μ l 添加し、室温で 15 分間回転します。溶出液を新しい DNA の低 bindingTube に転送します。
注意: 溶出液は-80 ° C で保存することができます。 - DNA の decrosslinking のステップ 4 に従ってください。TE バッファーの 20 μ L で浄化された DNA を再懸濁します。
- 4.11 (図 2 Dに示すように代表的なデータを参照してください) の手順で説明するように DNA の品質を確認します。(省略可能)定量的 pcr 法による濃縮分析2を前述のよう。10 倍大きい濃縮を観察する必要がありますか。
7. ライブラリーの構築
- 各入力とチップの DNA サンプルは、マイクロ電気泳動用ソフトウェアの塗抹標本の分析機能を使用して 100-500-bp の領域における DNA の割合を計算します。2 を取得するために必要な試料量を推定 100-500 bp DNA の ng。「入力」のサンプルとして、100-500-bp の範囲で 20 ng DNA を使用します。
- 8 ストリップ PCR チューブに DNA のサンプルをピペット、次の終わり修復反応とサイズ選択 H2O DNA の量が比例してスケール アップ 10 μ L を超えた場合に 10 μ L (オプション) 合計ボリュームを表示するを追加します。
- 最後修理マスター ミックスを調製 (材料の表を参照してください)。DNA に終わり修理マスター ミックスの 4 μ L を追加し、20 ° C で 30 分間インキュベート
- 10 mm トリス-塩素、pH 8.5 36 μ L を追加して室温で 5 分間インキュベート 0.6 x 体積 (30 μ L) のリバーシブル固定 (スプリング) 磁気ビーズを相します。
- マグネット スタンドにチューブを置き、上澄みが明確になるまで待ちます。
- 上清を新しいチューブに転送 SPRI 磁性ビーズの 1.2 x ボリューム (60 μ L) を追加して、室温で 5 分間インキュベートします。
- マグネット スタンドにチューブを置き、上澄みが明確になるまで待ちます。
- 80% の 200 μ L で 2 回ビーズを洗ってエタノール、磁石チューブをまだしがみつきます。
- 簡単に下部に残留の EtOH を収集し、背面磁石チューブを遠心分離機します。残留の EtOH を徹底的に削除します。
- チューブの蓋はエタノールが蒸発を許可するように 1-2 分間開いたままにしておきます。
- 蓋を閉めるし、氷の上の管を保ちます。
注: 今、ビーズの 100-500 bp の DNA のサイズ選択を受けた。2 倍のサイズの選択の詳細については、製造元の web サイト (www.beckman.com) になれます。 - 準備はテーリング マスター ミックス (材料の表を参照してください)。
- A テーリング マスター ミックスの 10 μ L を (ステップ 7.10) からビーズを再懸濁します、30 ° C で 30 分間インキュベート
- ポリエチレング リコール (PEG) の 1.8 x ボリューム (18 μ L) を追加/食塩、室温で 5 分間インキュベートします。
- DNA を浄化するために 7.7 7.11 の手順に従います。
- 結紮バッファー ミックスを準備 (材料の表を参照してください)。
- 結紮バッファー ミックス (ステップ 7.14) からビーズの 8 μ L をピペット 1 μ M アダプターの 1 μ L を追加し、ビードを再停止しなさい。入力のサンプルを 5 μ M アダプターの 1 μ L を使用します。多重については各サンプルの別のアダプターを使用してください。
- DNA のリガーゼの 1 μ L を追加し、20 ° C で 15 分間インキュベート
- ペグ/食塩の 1.0 x ボリューム (10 μ L) を追加、ビードを再停止しなさい、室温で 5 分間インキュベートします。
- DNA を浄化するために 7.7 7.10 の手順に従います。
- 10 mM チューブに pH 8.5 トリス-の Cl の 25 μ L をピペットし、ビードを再停止しなさい。
- ペグ/食塩の 1.0 x ボリューム (25 μ L) を追加し、室温で 5 分間インキュベートします。
- DNA を浄化するために 7.7 7.10 の手順に従います。
- 10 mM チューブに pH 8.5 トリス-の Cl の 11 μ L をピペットし、ビードを再停止しなさい。
- マグネット スタンドにチューブを置き、上澄みが明確になるまで待ちます。
- 新しい 8 ストリップ PCR チューブに上清を収集します。
- リアルタイム PCR マスター ミックスを調製 (詳細については資料を参照してください)。
- 384 ウェル定量的 PCR (qPCR) 板でリアルタイム PCR マスター ミックスの 8.5 μ L をピペット、1.5 μ L アダプターの結紮 (ステップ 7.26) からの DNA を追加します。
- 空井戸の各蛍光標準の 10 μ L をピペットします。
- リアルタイム PCR は次のプログラムを実行: (98 ° C、45 s) 1 サイクル x (98 ° C、15 s、60 ° C、30 s、30 のための 72 ° C s) x 20 サイクルと (72 ° C、60 s) 1 サイクル x。
- 蛍光標準 2 の蛍光強度に到達するために必要な PCR のサイクル数を決定します。
- 準備 PCR マスター ミックス (材料の表を参照してください)。
- (ステップ 7.26) から残りのアダプター結紮 DNA を PCR マスター ミックスの 11.5 μ L をピペットし、ステップ 7.31 で決定された PCR のサイクルのステップ 7.30 に示したように PCR を行います。
- ペグ/食塩の 1.0 x ボリューム (20 μ L) を追加し、室温で 5 分間インキュベートします。
- DNA を浄化するために 7.7 7.10 の手順に従います。
- 10 mM チューブに pH 8.5 トリス-の Cl の 20 μ L をピペットし、ビードを再停止しなさい。
- マグネット スタンドにチューブを置き、上澄みが明確になるまで待ちます。
- 新しい 1.5 mL DNA 低いバインド チューブに上清を収集します。
- 4.11 (図 2 e と Fに示すように代表的なデータを参照してください) の手順で説明するようにライブラリの品質を確認します。ライブラリの DNA サンプルの 1 μ L を使用します。(省略可能)QPCR 前述2濃縮分析を実行します。10 倍大きい濃縮を観察する必要がありますか。
8. シーケンス
- 次世代シーケンサーのライブラリをシーケンス (図 3に示すように代表的なデータを参照してください)。
注: シーケンス深さのデータ解析のための十分なは、3有機体のゲノムのサイズによって異なります。人間、マウス、少なくとも 2000 万のシングル エンドの読み取りを得ることを推奨します。読み取りの収量、よると多重化は、費用効果が大きいかもしれない。
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Representative Results
ここでは、我々 は組織切離、固定化、セル換散、タンデム精製クロマチンと次世代シーケンサーのための DNA ライブラリの準備について説明します。手順の中に 1 つは成功したシーケンスは、複数のステップ (図 2) で鍵である DNA の品質をテストできます。単一ヌクレオソームは、147 bp DNA 4で囲まれている通常、せん断の DNA はそのサイズよりも短くしないでください。超音波、直後後 DNA は分離され (図 2 a) マイクロ電気泳動マシン上で実行します。サイズの範囲を最適化するために最善の努力にもかかわらず、我々 はまだ unsheared に残った DNA (約 2 kbp) の人口があった。この段階で 100 500 bp から及ぶ DNA の割合は人口の 50% 以上をする必要があります。マイクロ電気泳動マシンと至る DNA の量を使用して再度、反フラグ (図 2 b) 抗体、抗 H3K4me3 抗体 (図 2 D) 親和性の浄化後、DNA の分離の品質がチェックされました。100-500 bp を推定しました。我々 はしばしばこの段階で 2 の kbp フラグメントへの強いバイアスをみ、SPRI 磁性ビーズによるダブルのサイズ選択はこの画分を削除しました。
H2B フラグなしマウスからライセート脳で式が使用された否定的な制御サンプルと H2B フラグを DNA の免疫精製の特異性が確認された (図 2)。我々 は通常否定的な制御サンプルからごくわずかな量の DNA を検出しました。
A テーリング、アダプター結紮と PCR、配列ライブラリの品質が確認された (図 2 e)。通常、250-600 bp DNA が得られました。成功した通常のチップと tChIP はあった qPCR2プライマー (図 2 f) GAPDH 遺伝子のプロモーター領域を用いた濃縮分析によって立証されます。
代表を読むゲノム ブラウザーによるニューロンの遺伝子 (Camk2a、Slc17a7、および Gria1) に沿って分布は図 3に示します。全脳 tChIP Seq をニューロン tChIP Seq による遺伝子の 5 ' 端に読み取りの濃縮が認められました。
図 1: tChIP シーケンスの模式図この図は、水戸市から変更されている m.ら。1この図の拡大版を表示するにはここをクリックしてください。 。
図 2: DNA 品質チェックします。(A、 B D、およびE)せん断クロマチン DNA (A) 反フラグ抗体 (B) しアンチ H3K4me3 抗体 (C)、(D) の最後のライブラリと精製 DNA のマイクロ電気泳動機械を用いて簡便。緑と紫の数字で強調表示されているピークは、内部サイズ規格を表しています。青の破線は、下流の分析のために考慮する DNA サイズ領域を示します。フー: 蛍光ユニット。
(C) DNA の量は反フラグ免疫浄化によって回復。各ポイントは、独立した複製を表します。(F) ターゲットに GAPDH qPCR による濃縮分析。各ポイントは、独立した複製を表します。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 3: ニューロン tChIP シーケンス内の分布を読む(A ~ C)代表的なニューロン ニューロン tChIP Seq とコントロール全体の脳 tChIP Seq 遺伝子分布と読みが表示されます。回転数: 百万のリードを読み取ります。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
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Discussion
我々 のプロトコル フラグ タグ H2B の式がタモキシフェン投与により誘導されるマウスの脳の神経細胞の最適化を行った。H2B 式、原料、組織および組織の量に使用プロモーターが成功 tChIP シーケンスの極めて重要なパラメーターしたがって、これらの要因の最適化は、興味のセル タイプごとに考慮されなければなりません。
このプロトコルに使用するプロシージャの間の重要なステップは、DNA がクロマチン長さが 100-500 bp5を達成するためにせん断です。一般に、超音波手順の標準化難しいさまざまな要因によって異なりますので固定条件、使用される組織、超-超音波処理に使用する装置、機器を設定すると、他の中で。したがって、この DNA せん断ステップのトライアル アンド エラー最適化は、個々 の実験の必要があります。超-超音波の代わりにミクロコッカスヌクレアーゼ治療は素朴なチップ方法6で使われている、単一のサイズのヌクレオソーム DNA を隔離するためのオプションをする必要があります。同種 DNA のサイズ分布、理想的な剪断が Dna は、図 2 aに示すように、複数の集団を示すかもしれない。SPRI 磁性ビーズの二重サイズの選択上記のよう、長いサイズの DNA のフラグメントの削除に役立ちます。
ライブラリの準備が 1 を必要とする通常、100-500 bp DNA の ng。この要件に基づき、ニューロンの脳組織の最初の材料をスケール アップ。ただし、この手順は珍しいセル型から非常に小さいサンプルの挑戦かもしれない。このような場合は、チップを与えずを Tn5 トランスポザーゼ リガーゼではなくに基づいて、少ない材料7を必要とするより良い代替手段があります。
それにもかかわらず、この現在のプロトコルは材料の主要な細胞型に限定されます。私たちの手で元の細胞集団に標的細胞の 10% の占有率は、ターゲット セル1からクロマチンの公正な浄化を提供しました。しかし、さらに多くの稀なセルタイプを対象と非対象セルから汚染された DNA から DNA の分離を区別するためにエピトープ タグで免疫沈降の細かい最適化が保証されます。データ分析のベスト プラクティスは、実験を開始するために使用全体の組織から制御 tChIP Seq 解析するデータを比較することを強くお勧めします。外発現 H2B フラグ タンパク質から重要なバイアスがわかったので分析を比較し、背景1に濃縮 (または枯渇) ごとに分析する必要があります。このコントロールは、私たち確かに普遍的表現 H2B フラグ (ローザH2B フラグ) を使ってマウス線を作成、tChIP Seq1を実行されます。データのより詳細な解釈がされている1に説明しました。
我々 の分析に基づいて、ニューロンから H3K4me3 tChIP Seq 提供 FACS ソート ニューロンから RNA シーケンスより知られているニューロン特異遺伝子の同等および/またはより良い検出8と翻訳のリボソーム アフィニ ティー精製 (トラップ)-Seq9。たとえば、知られている軸索・樹状突起のローカライズされた遺伝子が効率的にニューロン tChIP Seq1を使用して回収された.驚くことに、私たちの tChIP Seq プロモーター関連付けられているヒストン マークに制限はありませんがも他様々 なヒストン修正10に該当する抗体が利用可能な場合。さらに、他のモデル生物でタグ ヒストン蛋白によるクロマチンを分離する方法を使用できます。ここで FLAG エピトープを使用コア ヒストン蛋白質のタグ、他のタグを適用できます。DNA をホルムアルデヒド固定は最もよく11蛋白質のリジン残基で発生するので多くのリジンを含むタグはエピトープのタグ付けによって先入観を排除するために避けるべき。したがって、tChIP Seq アプローチは、多くの種類のエピジェネティクス研究の文脈に沿って多様な組織で汎用性の高いはずです。
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Disclosures
著者が明らかに何もありません。
Acknowledgments
私たちは論文の批判的な読みの岩崎研究室のすべてのメンバーに感謝します。この作品は文部省科学研究領域 (S.N. と点火する JP17H05679 #26113005); 科学研究の部分で支えられました科研費若手研究者教育省、科学、スポーツ、(文部科学省); 日本の文化から (A) (点火する JP17H04998)先駆的プロジェクト「携帯電話の進化」とすべての理化学研究所プロジェクト「病気とエピゲノム」理化学研究所から (S.N. 点火し)。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Protein LoBind tube, 2 mL | Eppendorf | No. 0030108132 | For cell lysis |
| Protein LoBind tube, 1.5 mL | Eppendorf | No. 0030108116 | For ChIP and library preparation |
| DNA LoBind tube, 1.5 mL | Eppendorf | No. 0030108051 | For ChIP and library preparation |
| 8-strip PCR tube | BIO-BIK | 3247-00 | For ChIP and library preparation |
| SK Mill | TOKKEN | SK-200 | Handy cryogenic grinder to make cell powder for fixation |
| Metal bullet | TOKKEN | SK-100-DLC10 | Accessory of SK Mill |
| 2 mL stainless steel tube | TOKKEN | TK-AM5-SUS | An option for cell lysis |
| 2 mL stainless steel tube holder | TOKKEN | SK-100-TL | An option for cell lysis |
| 16% formaldehyde (w/v), methanol-free | Pierce | 28906 | To fix cells. Prepare 1% solution before use. |
| Glycine | Nacalai Tesque | 17109-35 | Prepare 2.5 M stock |
| D-PBS (-)(1x) | Nacalai Tesque | 14249-24 | For washing lysate and purified DNA |
| HEPES | Nacalai Tesque | 02443-05 | For Lysis buffer 1. Prepare 1 M, pH 7.5 stock. |
| 5 M NaCl, molecular biology grade | Nacalai Tesque | 06900-14 | For Lysis buffer 1, Lysis buffer 2, ChIP Elution Buffer, and Tris-EDTA-NaCl Buffer |
| 0.5 M EDTA, molecular biology grade | Wako Pure Chemical Industries, Ltd. | 311-90075 | For Lysis buffer 1, Lysis buffer 2, ChIP Elution Buffer, and Tris-EDTA-NaCl Buffer |
| Glycerol | Wako Pure Chemical Industries, Ltd. | 072-04945 | For lysis buffer 1 |
| NP-40 | Nacalai Tesque | 25223-75 | For lysis buffer 1 |
| Triton X-100, molecular biology grade | Nacalai Tesque | 12967-32 | For Lysis buffer 1 |
| Tris | Nacalai Tesque | 35406-91 | For Lysis buffer 2, ChIP Elution Buffer, and Tris-EDTA-NaCl Buffer. Prepare 1 M, pH 8.0 stock. |
| 0.1 M EGTA pH neutral | Nacalai Tesque | 08947-35 | For Lysis Buffer 2 |
| Protease inhibitor cocktail (100x) | Nacalai Tesque | 25955-24 | To block degradation of protein |
| RIPA buffer | Thermo Fisher Scientific | 89900 | For cell lysis and washing |
| milliTUBE 1 mL AFA Fiber | Covaris | 520130 | Sonicator tube. Accessory of Focused-ultrasonicator |
| Focused-ultrasonicator | Covaris | S220 or E220 | To digest DNA into adequate size for ChIP-Seq |
| UltraPure 10% SDS | Thermo Fisher Scientific | 15553-027 | For ChIP Elution Buffer |
| RNase A | Nacalai Tesque | 30141-14 | To purify DNA from lysate |
| Proteinase K, recombinant, PCR Grade | Sigma-Aldrich | 3115887001 | To purify DNA from lysate |
| Ethanol | Wako Pure Chemical Industries, Ltd. | 054-07225 | Make 70% solution |
| Monoclonal anti-FLAG M2 antibody produced in mouse | Sigma-Aldrich | F1804 | To purify chromatin expressed in cells of interest |
| Dynabead M-280 Sheep Anti-Mouse IgG | Thermo Fisher Scientific | 11201D | This can be used for anti-FLAG IP and anti-H3K4me3 IP |
| Anti-tri-methyl histone H3 (K4), mouse monoclonal antibody | Wako Pure Chemical Industries, Ltd. | 301-34811 | Any other antibody that works for ChIP analysis will work |
| 10x Blocking Reagent | Sigma-Aldrich | 11096176001 | For blocking during affinity purification |
| Denhardt’s solution | Nacalai Tesque | 10727-74 | For blocking during affinity purification |
| Glycogen (5 mg/ml) | Thermo Fisher Scientific | AM9510 | To purify DNA from lysate |
| Qubit 2.0 Fluorometer | Thermo Fisher Scientific | Q32866 | For quantification of isolated DNA |
| Qubit dsDNA HS Assay Kit | Thermo Fisher Scientific | Q32851 | For quantification of isolated DNA |
| 0.5 mL tube | Axygen | 10011-830 | For quantification by Qubit |
| Phenol/chloroform/isoamyl alcohol (25:24:1) | Nacalai Tesque | 25970-56 | To purify DNA from lysate |
| AMPure XP beads | Beckman Coulter | A63881 | SPRI magnetic beads for library preparation |
| Metal ice rack | Funakoshi | IR-1 | To keep the cell lysate frozen |
| Sample Cooler | New England Biolabs | T7771S | Helps fix cells with minimal damage |
| 2100 Bioanalyzer | Agilent Technologies | G2939BA | To check the quality of isolated DNA fragments. Another fragment analyzer can be used. |
| Bioanalyzer 2100 Expert Software | Agilent Technologies | G2946CA | Supplied with the Bioanalyzer |
| High Sensitivity DNA Kit | Agilent Technologies | 5067-4626 | To check the quality of the isolated DNA fragments |
| KAPA LTP Library Preparation Kit | Roche | 07961898001 | Supplied with 10x KAPA End Repair Buffer, KAPA End Repair Enzyme Mix, KAPA A-Tailing Buffer, KAPA A-Tailing Enzyme, KAPA Ligation Buffer, KAPA DNA Ligase, and PEG/NaCl solution |
| NEXTflex DNA Barcodes | BIOO Scientific | NOVA-514101 | Adapter for library preparation. Supplied with DNA Barcode Adapters and Primer Mix. |
| KAPA Real-Time Library Amplification Kit | Roche | 07959028001 | Supplied with 2x KAPA HiFi HS real-time PCR Master Mix, PCR Primer Mix, and Fluorescent Standards |
| 2x KAPA HiFi HotStart ReadyMix | Roche | KM2602 | For library preparation. Additionally, this enzyme may be required for the KAPA Real-Time Library Amplification Kit |
| Buffer EB | Qiagen | 19086 | 10 mM Tris-Cl, pH 8.5 for elution of DNA |
| 386-well qPCR plate | Thermo Fisher Scientific | 4309849 | For real-time PCR |
| QuantStudio 7 Flex Real-Time PCR System | Thermo Fisher Scientific | 4485701 | To quantify DNA |
| MicroAmp Optical Adhesive Film | Thermo Fisher Scientific | 4311971 | For real-time PCR |
| MicroAmp Clear Adhesive Film | Thermo Fisher Scientific | 4306311 | For plate sealing |
| End-repair master mix | Combine 1.4 µL of 10x KAPA End Repair Buffer, 1 µL of KAPA End Repair Enzyme Mix, and 1.6 µL of H2O | ||
| A-taling master mix | Combine 1 µL of KAPA A-Tailing Buffer, 0.6 µL of KAPA A-Tailing Enzyme, and 8.4 µL of H2O | ||
| Ligation buffer mix | Combine 2 µL of KAPA ligation buffer and 6 µL of H2O | ||
| Real-time PCR master mix | Combine 5 µL of 2x KAPA HiFi HS real-time PCR Master Mix, 0.35 µL of PCR Primer Mix (10 µM each of forward primer AATGATACGGCGACCACCGAG and reverse primer CAAGCAGAAGACGGCATACGAG), and 3.15 µL of H2O | ||
| PCR master mix | Combine 10 µL of 2x KAPA HiFi Ready Mix, 0.9 µL of PCR Primer Mix, and 0.6 µL of H2O | ||
| Integrative Genomics Viewer | Broad Institute | IGV_2.3.88 | Genome browser to visualize sequencing data |
| DNA olgionucleotide: 5′-GCCTACGCAGGTCTTGCTGAC-3′ | Eurofins Genomics | A primer to amplify the promoter region of GAPDH | |
| DNA olgionucleotide: 5′-CGAGCGCTGACCTTGAGGTC-3′ | Eurofins Genomics | A primer to amplify the promoter region of GAPDH | |
| SYBR Premix Ex Taq | Takara | RR420L | To quantify the DNA corresponding to the GADPH promoter region |
| Thermal Cycler Dice | Takara | TP870 | To quantify the DNA corresponding to the GADPH promoter region |
References
- Mito, M., et al. Cell type-specific survey of epigenetic modifications by tandem chromatin immunoprecipitation sequencing. Scientific Reports. 8 (1), 1143 (2018).
- Kadota, M., et al. CTCF binding landscape in jawless fish with reference to Hox cluster evolution. Scientific Reports. 7 (1), 4957 (2017).
- Jung, Y. L., et al. Impact of sequencing depth in ChIP-seq experiments. Nucleic Acids Research. 42 (9), (2014).
- Becker, P. B., Workman, J. L. Nucleosome remodeling and epigenetics. Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 5 (9), a017905 (2013).
- Kidder, B. L., Zhao, K. Efficient library preparation for next-generation sequencing analysis of genome-wide epigenetic and transcriptional landscapes in embryonic stem cells. Methods in Molecular Biology. , 3-20 (2014).
- Gilfillan, G. D., et al. Limitations and possibilities of low cell number ChIP-seq. BMC Genomics. 13, 645 (2012).
- Schmidl, C., Rendeiro, A. F., Sheffield, N. C., Bock, C. ChIPmentation: fast, robust, low-input ChIP-seq for histones and transcription factors. Nature Methods. 12 (10), 963-965 (2015).
- Zhang, Y., et al. An RNA-sequencing transcriptome and splicing database of glia, neurons, and vascular cells of the cerebral cortex. Journal of Neuroscience. 34 (36), 11929-11947 (2014).
- Hornstein, N., et al. Ligation-free ribosome profiling of cell type-specific translation in the brain. Genome Biology. 17 (1), 149 (2016).
- Zhao, Y., Garcia, B. A. Comprehensive catalog of currently documented histone modifications. Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 7 (9), a025064 (2015).
- Hoffman, E. A., Frey, B. L., Smith, L. M., Auble, D. T. Formaldehyde crosslinking: a tool for the study of chromatin complexes. The Journal of Biological Chemistry. 290 (44), 26404-26411 (2015).
