TChIP-Seq: Cell-Type-specifieke Epigenome profilering

Summary

We beschrijven een stapsgewijze protocol voor tandem chromatine immunoprecipitation sequencing (tChIP-Seq) waarmee de analyse van cel-type-specifieke genoom-brede Histon wijziging.

Abstract

Epigenetische regulatie speelt een centrale rol in genexpressie. Aangezien Histon wijziging werd ontdekt in de jaren 1960, zijn de functies van de fysiologische en pathologische uitvoerig bestudeerd. Inderdaad, de komst van de volgende generatie diepe Sequencen en chromatine immunoprecipitation (ChIP) via specifieke Histon wijziging antistoffen heeft een revolutie teweeggebracht in onze visie op de Epigenetische regulatie over het genoom. Omgekeerd, weefsels bestaan meestal uit diverse celtypes, en hun complex mengsel vormt analytische uitdagingen op het onderzoek naar de epigenome in een bepaald celtype. Om aan te pakken de cel type-specifieke chromatine staat in een genoom-brede manier, ontwikkeld we onlangs tandem chromatine immunoprecipitation sequencing (tChIP-Seq), die is gebaseerd op de selectieve zuivering van de chromatine tagged kern Histon eiwitten uit cel typen van belang, gevolgd door ChIP-Seq. Het doel van dit protocol is de invoering van beste praktijken van tChIP-Seq. Deze techniek biedt een veelzijdig instrument voor weefsel-specifieke epigenome onderzoek in diverse histone modificaties en modelorganismen.

Introduction

Weefsels van dieren bestaan uit diverse celtypes. De genregulatie in elke cel definieert het celtype. Wijzigingen van de chromatine - DNA methylering en Histon modificatie - ten grondslag liggen aan de specificiteit van de cel-type van de genexpressie. Dus de meting van de Epigenetische regulatie in elk celtype heeft al verlangd, maar het is een technische uitdaging geweest.

Om te onderzoeken de epigenetica in een bepaald celtype, was tandem chromatine immunoprecipitation sequencing (tChIP-Seq) onlangs ontwikkelde ()Figuur 1)¹. In tChIP, epitoop-gelabeld kern Histon eiwit H2B uitgedrukt van een cel-type-specifieke promotor. Deze functie kan de isolatie van de chromatins uit de cellen van belang, hoewel het materiaal uit een mengsel van verschillende celtypes begint. Volgende ChIP-Seq — chromatine zuivering via een bewerkt-Histon mark en de volgende generatie diepe sequentiebepaling van geïsoleerd DNA — wij de epigenetische status van de gerichte celtype in een genoom-brede manier kunnen controleren.

Met behulp van deze techniek, we onlangs onderzocht neuron-specifieke trimethylation van Histon H3 eiwit op lysine 4 (H3K4me3) merken. In deze studie ontwikkelden we een knock-in muis in welke C-terminaal vlag-gelabeld H2B eiwit werd uitgedrukt op Cre-gemedieerde recombinatie (Rosa26^{CAG floxed-pA H2B-vlag}). Door kruising met een muis bezitten van het Cre-endoplasmic reticulum (ER) gen onder de controle van de promotor van de CamK2a, geïnduceerde de lijn verkregen muis H2B-vlag in actieve neuronen op tamoxifen injectie (Camk2a^H2B-vlag)¹. Vanaf de hersenen van de gevestigde muis lijn, we tChIP-Seq met anti-H3K4me3 antistof uitgevoerd. Aangezien H3K4me3 merken komen vaak met promotor regio's overeen, kunnen we honderden mRNAs specifiek uitgedrukt in neuronen¹ontdekken.

Hier beschrijven we een typisch tChIP-Seq methode dat betrekking heeft op de stappen van weefsel dissectie naar bibliotheek bouw ()Figuur 1). Het uiteindelijke doel van dit protocol is het delen van onze best practices voor de prestaties van tChIP-Seq en de toekomstige toepassing van deze methode op andere celtypes en histone modificaties.

Protocol

Alle hierin beschreven methoden zijn goedgekeurd door de deling van de veiligheid van RIKEN (H27-EP071) en uitgevoerd met de desbetreffende richtsnoeren en voorschriften.

1. de weefsels dissectie

1. Ontleden van de weefsels van belang in kleine stukjes (ongeveer < 3 mm²) met fijne lente schaar.
   Opmerking: Grotere weefsel fragmenten duren langer om te bevriezen en kleinere stukken over grotere volumes van buffer, zowel die van invloed kunnen zijn op de resultaten zal dragen.
2. De ontleed weefsel fragmenten toevoegen aan een schoon container gevuld met vloeibare stikstof en verzamelen ze in 2 mL buizen (1 stuk per buis) gevuld met vloeibare stikstof.
   Opmerking: Buizen met een hydrofiele oppervlak worden aanbevolen voor deze stap.
3. Plaats de buizen bij-80 ° C voor > 5 min met de dop open voor het verdampen van de resterende vloeibare stikstof.
   Opmerking: Na het sluiten van het GLB, weefsel fragmenten kunnen worden opgeslagen bij-80 ° C gedurende één maand vóór gebruik.

2. cel fixatie

Opmerking: Hebben We een handige cryogene grinder gebruikt voor deze stap. Een alternatief apparaat kan worden gebruikt.

1. Plaats de 2 mL-eiwit lage bindende buizen met de weefselsteekproeven op een rek van metalen ijs gekoeld in vloeibare stikstof.
2. Breng een metalen kogel in een 1,5 mL-buis en chill met vloeibare stikstof. Plaats het op het ijs van de metalen rek.
3. Open de tube-2 mL en plaats van de prechilled van de metalen kogel in de buis. Sluiten van het GLB, zet de 2 mL-buizen in de houder van de buis van een handige cryogene grinder en onmiddellijk Dompel de houder van de geassembleerde buis in vloeibare stikstof voor 1 min.
4. De houder van de bevroren buis invoegen in de buitenste cassette van de handige cryogene grinder en schud krachtig 60 keer voor 30 s.
5. Demonteren van de houder van de buis, verwijder de metalen kogel en plaats de 2 mL-buis op een monster koeler prechilled bij-20 ° C.
6. Leg het monster koeler bij-20 ° C gedurende 15 minuten ter voorkoming van bevriezing van de fixeerspray in de volgende stap.
7. Brengen van het monster koeler aan de Bank, open het deksel van de buis en onmiddellijk druppelen 900 µL van 1% formaldehyde erin. Na meerdere malen pipetteren, spoel de suspensie in nieuwe 2 mL-buis met 900 µL van 1% formaldehyde en correctie voor 10 min met zachte rotatie in een incubator vastgesteld op 23 ° C.
   Let op: Formaldehyde is giftig en schadelijk.
8. Om te stoppen met de reactie van fixatie, voeg 100 µL van 2,5 M glycine aan elke buis en Centrifugeer gedurende 5 min bij 3000 x g bij 4 ° C. Verwijder het supernatant.
9. Voeg 1 mL ijskoud-fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS), centrifuge voor 5 min bij 3000 x g bij 4 ° C, en verwijder het supernatant. Herhaal deze stap twee keer (3 wasbeurten in totaal).
   Opmerking: Vaste monsters kunnen worden flash-bevroren door vloeibare stikstof en opgeslagen bij-80 ° C.
10. Voeg 500 µL van Lysis Buffer 1 (50 mM 4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic zuur (HEPES)-KOH (pH 7.5), 140 mM NaCl, 1 mM ethyleendiamminetetra zuur (EDTA) (pH 8,0), 10% w/v glycerol, 0,5% w/v NP-40, 0,25% w/v Triton X-100 en 0.1 x proteaseinhibitor cocktail) naar de pellet, Pipetteer meerdere malen, en draaien voor 10 min bij 4 ° C.
    Opmerking: Lysis-buffermengsel 1 moet worden gefilterd en opgeslagen bij 4 ° C vóór gebruik.
11. Centrifugeer gedurende 5 min bij 3000 x g bij 4 ° C en de vloeistof wordt weggeworpen.
12. Voeg 1 mL Lysis Buffer 2 (10 mM Tris-HCl (pH 8,0), 200 mM NaCl, 1 mM EDTA (pH 8,0), 0,5 mM EGTA, en 0.1 x proteaseinhibitor cocktail) naar de pellet, vortex, en draaien voor 10 min bij 4 ° C.
    Opmerking: Lysis-buffermengsel 2 moet worden gefilterd en opgeslagen bij 4 ° C vóór gebruik.
13. Centrifugeer gedurende 5 min bij 3000 x g bij 4 ° C en de vloeistof wordt weggeworpen.
14. 800 µL van radioimmunoprecipitation assay (RIPA) buffer met 1 x proteaseinhibitor cocktail toevoegen aan de pellet en resuspendeer de pellet door pipetteren.
15. Centrifugeer gedurende 5 min bij 3000 x g bij 4 ° C en de vloeistof wordt weggeworpen.
16. Voeg 500 µL van RIPA buffer met 1 x proteaseinhibitor cocktail.
17. Centrifugeer gedurende 5 min bij 3000 x g bij 4 ° C en de vloeistof wordt weggeworpen.
18. Voeg vervolgens 1 mL van RIPA buffer met 1 x proteaseinhibitor cocktail. Ga onmiddellijk naar de volgende stap.

3. de chromatine schuintrekken

1. Breng de lysate tot een koker ultrasoonapparaat en plaats vervolgens de buis op een ultrasonicator.
2. De chromatine afschuiving met de volgende instellingen: temperatuur: 4 ° C; incident piekvermogen: 175 W; plicht factor: 10%; cycli/burst: 200; en tijd: 2.400 s.
3. Het monster overbrengen in een 1,5 mL-eiwit lage bindende buis en Centrifugeer gedurende 5 min bij 20.000 x g bij 4 ° C.
4. De bovendrijvende substantie in een nieuwe eiwit lage bindende buis verzamelen.
   Opmerking: Het monster kan worden flash-bevroren in vloeibare stikstof en opgeslagen bij-80 ° C.

4. kwaliteitscontrole van DNA (Reverse Crosslinking)

1. Mix 20 µL van de lysate en 180 µL van ChIP elutie Buffer (10 mM Tris-HCl (pH 8,0), 300 mM NaCl, 5 mM EDTA (pH 8.0) en 1% w/v natrium dodecyl sulfaat (SDS)) in een buis van polymerase kettingreactie (PCR). Incubeer het monster bij 65 ° C in een thermische cycler gedurende 6 uur met de thermische cycler deksel open. Houd het deksel van de thermische cycler open om te voorkomen dat overmatig denaturatie.
   Opmerking: De ChIP elutie Buffer moet worden gefilterd en opgeslagen bij kamertemperatuur vóór gebruik. Deze incubatietijd kan worden uitgebreid tot 's nachts.
2. Voeg 1 µL van 10 mg/mL RNase A, vortex, en Incubeer bij 37 ° C gedurende 30 minuten.
3. Voeg 6.5 µL van 15 mg/mL proteïnase K, vortex, en Incubeer bij 55 ° C gedurende 60 minuten.
4. Overdracht van de reactie op een lage DNA-bindende buis, Voeg 4 µL van 5 mg/mL glycogeen, en vortex. Dan, voeg 200 µL van fenol/chloroform/Isoamylalcohol (25:24:1) en Centrifugeer gedurende 5 min bij 18.000 x g bij kamertemperatuur.
5. Het supernatant overbrengen in een nieuwe DNA lage bindende buis. Voeg 200 µL van Tris-EDTA-NaCl buffer (10 mM Tris-HCl (pH 8,0), 1 mM EDTA (pH 8.0) en 200 mM NaCl) voor de resterende fenol/chloroform/Isoamylalcohol oplossing en Centrifugeer gedurende 5 min bij 18.000 x g bij kamertemperatuur. De bovendrijvende vloeistof verzamelen en meng met het eerste supernatant.
6. Voeg 900 µL van ijskoude ethanol en incubeer gedurende 1 uur bij-20 ° C.
   Opmerking: Deze incubatietijd kan worden uitgebreid tot 4 - 6 h.
7. Centrifugeer gedurende 30 minuten bij 18.000 x g bij 4 ° C.
8. Verwijder het supernatant. Voeg 1 mL ijskoud 75% ethanol tot de pellet en Centrifugeer gedurende 30 minuten bij 18.000 x g bij 4 ° C. Herhaal deze stap (twee wasbeurten in totaal).
9. Verwijder het supernatant grondig en drogen voor 1 minuut bij kamertemperatuur.
10. Voeg 50 µL van Tris-EDTA (TE) buffer en het DNA los door broeden bij kamertemperatuur gedurende 30 min. of bij 4 ° C's nachts. Vermijd vortexing of pipetteren. Houd dit DNA als 'input' en gebruiken voor bibliotheek voorbereiding indien nodig.
11. Meten van de concentratie van DNA met een Fluorimeter volgens de instructie van de fabrikant (Zie tabel van materialen) en controleer de grootteverdeling met een microfluidic elektroforese machine (Zie representatieve gegevens weergegeven in figuur 2a). gebruik 10 ng of minder DNA voor deze test.
    Opmerking: Fragmenten van 100 tot 500 basenparen (bp) moeten make-up 50% of meer van het DNA.

5. affiniteit zuivering door Anti-Flag antilichaam

Opmerking: Voor neuron tChIP-Seq, hersenen weefsels van 8 muizen worden doorgaans gebruikt voor een steekproef van tChIP-Seq te bereiden 2 ng van gezuiverde DNA tandem immuun-gezuiverd door (zie stap 7.1). In onze handen, 0.1 ng van DNA nog steeds geboden kwalitatief hoogwaardige DNA bibliotheken voor ChIP-Seq (Kadota, onuitgegeven). Dus, in theorie, een enkele muis kan het volstaan voor het uitvoeren van neuron tChIP-Seq. Het normbedrag moet worden geoptimaliseerd voor het type van het weefsels en cellen van belang. Voor de negatieve controle van de imumuno-zuivering experiment, moet hersenweefsel lysate van Muizen zonder elke expressie H2B-vlag worden opgesteld en gebruikt.

1. Pipetteer 200 µL van de magnetische kralen geconjugeerd met schapen anti-muis immunoglobuline G (IgG) in een buis van lage binding aan eiwitten.
2. Plaats de buis op een magnetische staan en wachten op 1 min. voor het supernatant te duidelijk geworden. Verwijder het supernatant en voeg 1 mL ijskoud PBS en vortex. Herhaal deze stap (twee wasbeurten in totaal).
3. Voeg 20 µL van 1 mg/mL Dizzee RASCAL antilichaam en roteren voor 5 uur bij 4 ° C.
   Opmerking: Deze incubatietijd kan worden uitgebreid tot 's nachts.
4. Wassen van de kralen die volgende stap 5.2. Plaats de kralen in een tube van 15 mL.
5. Resuspendeer de kralen in 1110 µL van de buffer RIPA en voeg vervolgens 900 µL van 10 x blokkeren reagens, 180 µL van 50 x Denhardt de oplossing 10 µL van 100 x proteaseinhibitor cocktail en 6.8 mL van de lysate bereid in stap 3. Dit mengsel wordt gesplitst door 5 eiwit lage bindende buizen. Draaien voor 6 uur bij 4 ° C.
   Opmerking: Deze incubatietijd kan worden uitgebreid tot 's nachts.
6. Plaats de buis op de magnetische standaard en wacht 1 minuut voor het supernatant te duidelijk geworden. Verwijder het supernatant, voeg 1 mL buffer RIPA en meng voorzichtig. Herhaal deze stap 5 keer (6 wasbeurten in totaal). Het zwembad van alle de kralen in een buis van de lage bindende één eiwit.
7. Voeg 200 µL van ChIP elutie Buffer en roteer gedurende 15 minuten bij kamertemperatuur. Controleer de kwaliteit van het DNA zoals beschreven in stap 4.11 (Zie representatieve gegevens weergegeven in figuur 2B en C). Ga onmiddellijk naar de volgende stap.

6. affiniteit zuivering door het antilichaam van de Anti-H3K4me3 en omgekeerde Crosslinking

Opmerking: De volgende kraal voorbereiding die stappen (6.1-6.4) moeten worden uitgevoerd vóór stap 5.7.

1. Pipetteer 40 µL van magnetische kralen geconjugeerd met schapen-antimuis IgG in een lage binding van 2 mL-eiwitten-buis.
2. Plaats de buis op de magnetische standaard en wacht 1 minuut voor het supernatant te duidelijk geworden. Verwijder het supernatant, voeg 1 mL ijskoud PBS en meng voorzichtig. Herhaal deze stap (twee wasbeurten in totaal).
3. Voeg 4 µL van 1 mg/mL anti-H3K4me3 antilichaam en roteer gedurende 6 uur bij 4 ° C.
4. Wassen van de kralen die volgende stap 6.2. Plaats de kralen in een lage binding van 2 mL-eiwitten-buis.
5. Resuspendeer de kralen in 1558 µL van de buffer RIPA en voeg vervolgens 200 µL van 10 x blokkeren reagens, 40 µL van 50 x de Denhardt oplossing, 2 µL van 100 x proteaseinhibitor cocktail en 200 µL van het eluaat bereid in stap 5.7. 'S nachts draaien bij 4 ° C.
   Opmerking: De SDS in de buffer van de elutie ChIP was meer dan 10 keer in deze incubatie verdund.
6. Plaats de buis op de magnetische standaard en wacht 1 minuut voor het supernatant te duidelijk geworden. Verwijder het supernatant, voeg 1 mL buffer RIPA en meng voorzichtig. Herhaal deze stap 4 keer (5 wasbeurten in totaal). Na de laatste wash, de kralen overboeken naar een DNA lage bindende buis, en verwijder het supernatant.
7. Voeg 200 µL van ChIP elutie Buffer en roteer gedurende 15 minuten bij kamertemperatuur. Het eluaat overbrengen in een nieuwe laag bindingTube van DNA.
   Opmerking: Het eluaat kan worden achtergelaten bij-80 ° C.
8. Volg stap 4 voor de decrosslinking van DNA. Resuspendeer de gezuiverde DNA in 20 µL van TE buffer.
9. Controleer de kwaliteit van het DNA zoals beschreven in stap 4.11 (Zie representatieve gegevens weergegeven in figuur 2D). (optioneel) Verrijking analyses door kwantitatieve PCR uit te voeren zoals eerder beschreven². Tienvoudige of grotere verrijking moet worden nageleefd.

7. bibliotheek bouw

1. Bereken het percentage van DNA in de regio van de 100-500-bp met behulp van de functie analyse uitstrijkje van de software voor de machine van de Elektroforese van het microfluidic voor elke input en ChIP DNA-monster. Het monstervolume vereist voor het verkrijgen van 2 schatten ng van 100 tot 500 bp DNA. Gebruik 20 ng DNA in het bereik van 100-500-bp als de "input" monster.
2. Pipetteer DNA-monsters in 8-strip PCR buizen en H₂O om het totale volume aan 10 µL. (optioneel) als de hoeveelheid DNA groter is dan 10 µL, proportioneel schaal-up toe te voegen de volgende reactie van de einde-reparatie en de selectie van de grootte.
3. Bereiden van eind-reparatie master mix (Zie Tabel van materialen). 4 µL van eind-reparatie master mix toevoegen aan het DNA en incubeer gedurende 30 minuten bij 20 ° C.
4. Voeg 36 µL van 10 mM Tris-Cl, pH 8,5 en 0,6 x volume (30 µL) van de vaste fase omkeerbare immobilisatie (SPRI) magnetische kralen en incubeer gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur.
5. Plaats de buis op een magnetische standaard en wacht totdat het supernatans duidelijk wordt.
6. Het supernatant overbrengen naar een nieuwe buis, toevoegen van 1.2 x hoeveelheid (60 µL) SPRI magnetische kralen, en 5 minuten bij kamertemperatuur incuberen.
7. Plaats de buis op een magnetische standaard en wacht totdat het supernatans duidelijk wordt.
8. Wassen van de kralen tweemaal met 200 µL van 80% EtOH, de buis houdt nog steeds aan de magneet.
9. Kort centrifugeren de buis voor het verzamelen van de resterende EtOH onderaan en plaats deze terug op de magneet. De residuele EtOH grondig verwijderen.
10. Laat het deksel van de buis open voor 1-2 min om de EtOH te verdampen.
11. Sluit het deksel en de buis op ijs te houden.
    Opmerking: Nu u hebt verkregen DNA grootte-geselecteerd van 100 tot 500 bp op de parels. Verdere details over de selectie van de dubbele grootte kunnen worden gevonden op de website van de fabrikant (www.beckman.com).
12. Voorbereiding A-tailing master mix (Zie Tabel van materialen).
13. Resuspendeer de kralen (uit stap 7.10) met 10 µL van A-tailing master mix en incubeer gedurende 30 minuten bij 30 ° C.
14. Toevoegen van 1,8 x volume (18 µL) van polyethyleenglycol (PEG) / NaCl-oplossing en incubeer gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur.
15. Volg stappen 7.7-7.11 voor het zuiveren van het DNA.
16. Bereiden van afbinding buffer mix (Zie Tabel van materialen).
17. Pipetteer 8 µL van afbinding buffer mix op de kralen (uit stap 7.14), voeg 1 µL van 1 µM adapter en resuspendeer de kralen. Gebruik 1 µL van 5 µM adapter voor de input steekproef. Overweeg het gebruik van verschillende adapters voor elk monster voor multiplexing.
18. Voeg 1 µL van DNA Ligase en incubeer gedurende 15 minuten bij 20 ° C.
19. 1.0 x-volume (10 µL) van PEG/NaCl-oplossing toevoegen, resuspendeer de kralen en incubeer gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur.
20. Volg stappen 7.7-7.10 voor het zuiveren van het DNA.
21. Pipetteer 25 µL van 10 mM Tris-Cl, pH 8,5 in de buis en resuspendeer de kralen.
22. Voeg 1.0 x volume (25 µL) PEG/NaCl-oplossing toe en incubeer gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur.
23. Volg stappen 7.7-7.10 voor het zuiveren van het DNA.
24. Pipetteer 11 µL van 10 mM Tris-Cl, pH 8,5 in de buis en resuspendeer de kralen.
25. Plaats de buis op een magnetische standaard en wacht totdat het supernatans duidelijk wordt.
26. De bovendrijvende substantie in een nieuwe 8-strip PCR buis verzamelen.
27. Bereiden van real-time PCR master mix (Zie materialen voor details).
28. Pipetteer 8,5 µL voor real-time PCR master mix in een 384-well kwantitatieve PCR (qPCR)-plaat en voeg 1,5 µL van de adapter afgebonden DNA (uit stap 7,26).
29. Pipetteer 10 µL van elke TL standaard in lege wells.
30. Uitvoeren van PCR in real time met het volgende programma: (98 ° C voor 45 s) x 1 cyclus, (98 ° C gedurende 15 s, 60 ° C gedurende 30 s, 72 ° C gedurende 30 s) x 20 cycli, en (72 ° C gedurende 60 s) x 1 cyclus.
31. Bepaal het aantal cycli van PCR die nodig zijn voor het bereiken van de intensiteit van de fluorescentie van de TL standaard 2.
32. Voorbereiden van de PCR-master mix (Zie Tabel van materialen).
33. Pipetteer 11,5 µL van het PCR master mix in de resterende adapter-afgebonden DNA (uit stap 7,26) en het uitvoeren van PCR zoals aangegeven in stap 7.30 met de cycli van PCR bepaald in stap 7.31.
34. Voeg 1.0 x volume (20 µL) PEG/NaCl-oplossing toe en incubeer gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur.
35. Volg stappen 7.7-7.10 voor het zuiveren van het DNA.
36. Pipetteer 20 µL van 10 mM Tris-Cl, pH 8,5 in de buis en resuspendeer de kralen.
37. Plaats de buis op een magnetische standaard en wacht totdat het supernatans duidelijk wordt.
38. De bovendrijvende substantie in een nieuwe 1,5 mL-DNA lage bindende buis verzamelen.
39. Controleer de kwaliteit van de bibliotheek zoals beschreven in stap 4.11 (Zie representatieve gegevens weergegeven in figuur 2E en F). Gebruik 1 µL van het DNA-monster van bibliotheek. (optioneel) Verrijking analyses uit te voeren door qPCR zoals eerder beschreven ². Tienvoudige of grotere verrijking moet worden nageleefd.

8. sequencing

1. Volgnummer van de bibliotheken in een volgende generatie sequencer (Zie representatieve gegevens afgebeeld in Figuur 3).
   Opmerking: De volgorde diepte voldoende voor de data-analyse zal variëren afhankelijk van de grootte van het genoom van het organisme³. Voor mens en muis, is het raadzaam te verkrijgen van ten minste 20-40 miljoen single-end leest. Volgens het rendement van leest, multiplexing mogelijk kosteneffectieve.

Representative Results

Hier beschrijven we de weefsel dissectie, fixatie, lysis van de cel, tandem zuivering van chromatine, en DNA bibliotheek voorbereiding voor de volgende generatie sequencers. Tijdens de procedures, kan een test de kwaliteit van het DNA, dat de sleutel tot succesvolle sequencing, in meerdere stappen (Figuur 2 is). Aangezien een enkele nucleosoom meestal door 147 bp DNA ^{4 omgeven wordt}, mag sheared DNA niet korter zijn dan die grootte. Onmiddellijk na met ultrasone trillingen, werd het DNA geïsoleerd en draaien op een machine elektroforese microfluidic (figuur 2A). Ondanks onze beste inspanningen voor het optimaliseren van de groottewaaier, hadden we nog een bevolking van DNA (ongeveer 2 kbp), dat bleef unsheared. Bij deze stap moet de Fractie van DNA variërend van 100-500 bp 50% of meer van de bevolking. Na de zuivering van de affiniteit van Dizzee RASCAL antilichaam (figuur 2B) en vervolgens op anti-H3K4me3 antistof (figuur 2D), werd de kwaliteit van de geïsoleerde DNA gecontroleerd weer met behulp van de machine van de Elektroforese van het microfluidic, en de hoeveelheid DNA variërend van 100-500 bp werd geschat. Hoewel we vaak sterker overhellen naar 2 kbp fragmenten op deze stap waargenomen, verwijderd dubbel de grootte selectie door SPRI magnetische kralen deze fractie.

De specificiteit van immuun-zuivering van DNA op H2B-vlag werd bevestigd met de negatieve controlemonsters, in welke hersenen van Muizen zonder H2B-vlag lysate expressie werd gebruikt (figuur 2C). We meestal verwaarloosbare hoeveelheden DNA uit de negatieve controlemonsters gedetecteerd.

Na A-tailing adapter afbinding en PCR, de kwaliteit van de sequencing-bibliotheek is geverifieerd (figuur 2E). Meestal 250-600 bp DNA werd verkregen. De succesvolle regelmatige ChIP- en tChIP waren blijkt uit de analyse van de verrijking met qPCR² gebruikend inleidingen die zijn gericht op de regio van de promotor van het GAPDH gen (figuur 2F).

Vertegenwoordiger Lees distributies langs neuron genen (Camk2a, Slc17a7 en Gria1) door genoom-browser zijn afgebeeld in Figuur 3. De verrijking van leest aan het einde van de 5 ' van genen door neuron tChIP-Seq over hele hersenen tChIP-Seq werd waargenomen.

Figuur 1: schematische weergave van de tChIP-Seq. Dit cijfer is gewijzigd van Mito, M. et al.. ¹. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

Figuur 2: DNA kwaliteitscontrole. (A, B, Den E) Het Electropherogram wordt verkregen met behulp van een microfluidic elektroforese machine voor sheared chromatine DNA (A), DNA gezuiverd met Anti-Flag antilichaam (B) en vervolgens op anti-H3K4me3 antistof (C), en op de definitieve bibliotheek (D). De pieken gemarkeerd met groene en paarse getallen vertegenwoordigen de grootte van de interne normen. Blauwe, gestreepte lijnen geven de DNA grootte gebieden overwogen voor downstream-analyse. FU: fluorescentie eenheden.
(C) de hoeveelheid DNA teruggevonden door de Anti-Flag immuun-zuivering. Elk punt vertegenwoordigt een onafhankelijke repliceren. (F) analyse van verrijking door qPCR gericht op GAPDH. Elk punt vertegenwoordigt een onafhankelijke repliceren. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

Figuur 3: lezen van distributies in neuron tChIP-Seq. (A-C) Lees distributies langs representatieve neuron genen in neuron tChIP-Seq en controle hele hersenen tChIP-Seq worden weergegeven. RPM: leest per miljoen leest. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

Discussion

Ons protocol is geoptimaliseerd voor de neuronen van de hersenen van de muis, waarin de uitdrukking van vlag-gelabeld H2B wordt veroorzaakt door tamoxifen injectie. Initiatiefnemers gebruikt voor H2B expressie, uitgangsmateriaal weefsel, en het bedrag van de weefsels worden centrale parameters voor succesvolle tChIP-Seq. Dus, de optimalisatie van deze factoren moet worden beschouwd als voor elk celtype van belang.

Een kritieke stap onder de procedures die in dit protocol is het DNA Schuintrekken om te bereiken een lengte van de chromatine van 100-500 bp⁵. In het algemeen, is de standaardisatie van de stap met ultrasone trillingen uitdagend omdat het is sterk afhankelijk van een aantal factoren; fixatie voorwaarden, de weefsels gebruikt, de apparatuur die wordt gebruikt voor ultra-ultrasoonapparaat en de apparatuur instellen, onder anderen. Trial-and-error optimalisatie van deze DNA schuintrekken stap zal dus vereist voor individuele experimenten. In plaats van ultra-ultrasoonapparaat, moet micrococcal nuclease behandeling zitten een premieaffaire voor het isoleren van één nucleosoom middelgrote DNA, zoals gebruikt in de naïeve ChIP methode⁶. Hoewel de homogene grootteverdeling van DNA is ideaal, schuingetrokken kunnen ANI's weergeven de meerdere bevolkingsgroepen, zoals weergegeven in figuur 2A De dubbele grootte selectie van SPRI magnetische kralen, kunt zoals hierboven beschreven, u verwijderen de langere middelgrote van DNA-fragmenten.

Bibliotheek voorbereiding vereist normaliter, 1 ng van 100-500 bp DNA. Gebaseerd op deze eis, wij het oorspronkelijke materiaal van het hersenweefsel voor de neuronen opgeschaald. Nochtans, kan deze procedure zijn uitdagend voor zeer kleine steekproeven van zeldzame celtypes. In dergelijke gevallen wellicht ChIP ring, die is gebaseerd op Tn5 transposase in plaats van ligase en vereist minder materiaal⁷, beter alternatief.

Deze huidige protocol is echter beperkt tot de belangrijkste celtypen in het materiaal. In onze handen verstrekt 10% bezetting van gerichte cellen in de oorspronkelijke celpopulatie eerlijke zuivering van de chromatine van target cellen¹. Echter als zelfs meer zeldzame celtypes zijn gericht, zal dan fijner optimalisatie van immunoprecipitation door de epitoop tag gerechtvaardigd zijn om te onderscheiden van de geïsoleerde DNA van verontreinigde DNA uit niet-doelgerichte cellen. Voor beste praktijken van de data-analyse raden wij de gegevens vergelijkt met de tChIP-Seq controleanalyse uit het hele weefsel gebruikt voor het initiëren van het experiment. Omdat we significante vooroordelen uit exogenously uitgedrukt H2B-vlag eiwitten vonden, moet de analyse worden vergeleken en geanalyseerd door verrijking (of uitputting) op de achtergrond-¹. Voor dit besturingselement, dat wij inderdaad een muis regel gemaakt met overal uitgedrukt H2B-vlag (Rosa^H2B-vlag) en tChIP-Seq¹uitgevoerd. Een meer gedetailleerde interpretatie van de gegevens is al eerder besproken¹.

Op basis van onze analyse, het H3K4me3 tChIP-Seq van neuronen geboden vergelijkbare en/of betere opsporing van bekende neuron-specifieke genen dan RNA-Seq van neuronen FACS-gesorteerd op⁸ en vertalen ribosoom affiniteit zuivering (TRAP)-Seq⁹. Bijvoorbeeld, zijn bekende axon/dendriet-gelokaliseerde genen efficiënt hersteld met behulp van neuron tChIP-Seq¹. Opmerkelijk is onze tChIP-Seq is niet beperkt voor de promotor-geassocieerde Histon mark maar geldt ook voor andere verschillende histone modificaties¹⁰ als de antilichamen beschikbaar zijn. Daarnaast kan de strategie van het isoleren van chromatine door tagged kern Histon eiwitten worden gebruikt in andere modelorganismen. Hoewel hier we gewend de vlag epitoop tag van de core Histon proteïne, kunnen andere codes worden toegepast. Aangezien formaldehyde fixatie aan DNA wordt meestal aan lysine residuen van een eiwit¹¹plaatsvindt, moet een tag met veel lysine om vooroordelen weg te worden vermeden door de epitoop tagging. Aldus, de aanpak van de tChIP-Seq moet zijn veelzijdig in verschillende weefsels langs allerlei contexten epigenetische studies.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Protein LoBind tube, 2 mL	Eppendorf	No. 0030108132	For cell lysis
Protein LoBind tube, 1.5 mL	Eppendorf	No. 0030108116	For ChIP and library preparation
DNA LoBind tube, 1.5 mL	Eppendorf	No. 0030108051	For ChIP and library preparation
8-strip PCR tube	BIO-BIK	3247-00	For ChIP and library preparation
SK Mill	TOKKEN	SK-200	Handy cryogenic grinder to make cell powder for fixation
Metal bullet	TOKKEN	SK-100-DLC10	Accessory of SK Mill
2 mL stainless steel tube	TOKKEN	TK-AM5-SUS	An option for cell lysis
2 mL stainless steel tube holder	TOKKEN	SK-100-TL	An option for cell lysis
16% formaldehyde (w/v), methanol-free	Pierce	28906	To fix cells. Prepare 1% solution before use.
Glycine	Nacalai Tesque	17109-35	Prepare 2.5 M stock
D-PBS (-)(1x)	Nacalai Tesque	14249-24	For washing lysate and purified DNA
HEPES	Nacalai Tesque	02443-05	For Lysis buffer 1. Prepare 1 M, pH 7.5 stock.
5 M NaCl, molecular biology grade	Nacalai Tesque	06900-14	For Lysis buffer 1, Lysis buffer 2, ChIP Elution Buffer, and Tris-EDTA-NaCl Buffer
0.5 M EDTA, molecular biology grade	Wako Pure Chemical Industries, Ltd.	311-90075	For Lysis buffer 1, Lysis buffer 2, ChIP Elution Buffer, and Tris-EDTA-NaCl Buffer
Glycerol	Wako Pure Chemical Industries, Ltd.	072-04945	For lysis buffer 1
NP-40	Nacalai Tesque	25223-75	For lysis buffer 1
Triton X-100, molecular biology grade	Nacalai Tesque	12967-32	For Lysis buffer 1
Tris	Nacalai Tesque	35406-91	For Lysis buffer 2, ChIP Elution Buffer, and Tris-EDTA-NaCl Buffer. Prepare 1 M, pH 8.0 stock.
0.1 M EGTA pH neutral	Nacalai Tesque	08947-35	For Lysis Buffer 2
Protease inhibitor cocktail (100x)	Nacalai Tesque	25955-24	To block degradation of protein
RIPA buffer	Thermo Fisher Scientific	89900	For cell lysis and washing
milliTUBE 1 mL AFA Fiber	Covaris	520130	Sonicator tube. Accessory of Focused-ultrasonicator
Focused-ultrasonicator	Covaris	S220 or E220	To digest DNA into adequate size for ChIP-Seq
UltraPure 10% SDS	Thermo Fisher Scientific	15553-027	For ChIP Elution Buffer
RNase A	Nacalai Tesque	30141-14	To purify DNA from lysate
Proteinase K, recombinant, PCR Grade	Sigma-Aldrich	3115887001	To purify DNA from lysate
Ethanol	Wako Pure Chemical Industries, Ltd.	054-07225	Make 70% solution
Monoclonal anti-FLAG M2 antibody produced in mouse	Sigma-Aldrich	F1804	To purify chromatin expressed in cells of interest
Dynabead M-280 Sheep Anti-Mouse IgG	Thermo Fisher Scientific	11201D	This can be used for anti-FLAG IP and anti-H3K4me3 IP
Anti-tri-methyl histone H3 (K4), mouse monoclonal antibody	Wako Pure Chemical Industries, Ltd.	301-34811	Any other antibody that works for ChIP analysis will work
10x Blocking Reagent	Sigma-Aldrich	11096176001	For blocking during affinity purification
Denhardt’s solution	Nacalai Tesque	10727-74	For blocking during affinity purification
Glycogen (5 mg/ml)	Thermo Fisher Scientific	AM9510	To purify DNA from lysate
Qubit 2.0 Fluorometer	Thermo Fisher Scientific	Q32866	For quantification of isolated DNA
Qubit dsDNA HS Assay Kit	Thermo Fisher Scientific	Q32851	For quantification of isolated DNA
0.5 mL tube	Axygen	10011-830	For quantification by Qubit
Phenol/chloroform/isoamyl alcohol (25:24:1)	Nacalai Tesque	25970-56	To purify DNA from lysate
AMPure XP beads	Beckman Coulter	A63881	SPRI magnetic beads for library preparation
Metal ice rack	Funakoshi	IR-1	To keep the cell lysate frozen
Sample Cooler	New England Biolabs	T7771S	Helps fix cells with minimal damage
2100 Bioanalyzer	Agilent Technologies	G2939BA	To check the quality of isolated DNA fragments. Another fragment analyzer can be used.
Bioanalyzer 2100 Expert Software	Agilent Technologies	G2946CA	Supplied with the Bioanalyzer
High Sensitivity DNA Kit	Agilent Technologies	5067-4626	To check the quality of the isolated DNA fragments
KAPA LTP Library Preparation Kit	Roche	07961898001	Supplied with 10x KAPA End Repair Buffer, KAPA End Repair Enzyme Mix, KAPA A-Tailing Buffer, KAPA A-Tailing Enzyme, KAPA Ligation Buffer, KAPA DNA Ligase, and PEG/NaCl solution
NEXTflex DNA Barcodes	BIOO Scientific	NOVA-514101	Adapter for library preparation. Supplied with DNA Barcode Adapters and Primer Mix.
KAPA Real-Time Library Amplification Kit	Roche	07959028001	Supplied with 2x KAPA HiFi HS real-time PCR Master Mix, PCR Primer Mix, and Fluorescent Standards
2x KAPA HiFi HotStart ReadyMix	Roche	KM2602	For library preparation. Additionally, this enzyme may be required for the KAPA Real-Time Library Amplification Kit
Buffer EB	Qiagen	19086	10 mM Tris-Cl, pH 8.5 for elution of DNA
386-well qPCR plate	Thermo Fisher Scientific	4309849	For real-time PCR
QuantStudio 7 Flex Real-Time PCR System	Thermo Fisher Scientific	4485701	To quantify DNA
MicroAmp Optical Adhesive Film	Thermo Fisher Scientific	4311971	For real-time PCR
MicroAmp Clear Adhesive Film	Thermo Fisher Scientific	4306311	For plate sealing
End-repair master mix			Combine 1.4 µL of 10x KAPA End Repair Buffer, 1 µL of KAPA End Repair Enzyme Mix, and 1.6 µL of H2O
A-taling master mix			Combine 1 µL of KAPA A-Tailing Buffer, 0.6 µL of KAPA A-Tailing Enzyme, and 8.4 µL of H2O
Ligation buffer mix			Combine 2 µL of KAPA ligation buffer and 6 µL of H2O
Real-time PCR master mix			Combine 5 µL of 2x KAPA HiFi HS real-time PCR Master Mix, 0.35 µL of PCR Primer Mix (10 µM each of forward primer AATGATACGGCGACCACCGAG and reverse primer CAAGCAGAAGACGGCATACGAG), and 3.15 µL of H2O
PCR master mix			Combine 10 µL of 2x KAPA HiFi Ready Mix, 0.9 µL of PCR Primer Mix, and 0.6 µL of H2O
Integrative Genomics Viewer	Broad Institute	IGV_2.3.88	Genome browser to visualize sequencing data
DNA olgionucleotide: 5′-GCCTACGCAGGTCTTGCTGAC-3′	Eurofins Genomics		A primer to amplify the promoter region of GAPDH
DNA olgionucleotide: 5′-CGAGCGCTGACCTTGAGGTC-3′	Eurofins Genomics		A primer to amplify the promoter region of GAPDH
SYBR Premix Ex Taq	Takara	RR420L	To quantify the DNA corresponding to the GADPH promoter region
Thermal Cycler Dice	Takara	TP870	To quantify the DNA corresponding to the GADPH promoter region