Summary
탠덤 chromatin 위한 단계별 프로토콜 설명 immunoprecipitation 시퀀싱 (tChIP-Seq) 셀 형식 관련 게놈 넓은 히스톤 수정의 분석을 가능 하 게.
Abstract
후 성적인 규정 유전자 발현에 있는 중앙 역할을 재생합니다. 히스톤 수정 1960 년대에서 발견 되었다, 이후 그 생리 및 병 적인 기능 광범위 하 게 공부 되었다. 실제로, 다음-세대 깊은 시퀀싱 및 특정 히스톤 수정 항 체를 통해 chromatin immunoprecipitation (칩)의 출현 게놈에 걸쳐 후 성적인 규칙의 우리의 보기를 혁명 하고있다. 반대로, 조직 일반적으로 다양 한 종류의 세포를 구성 하 고 그들의 복잡 한 혼합물 특정 세포 유형에 epigenome 조사 분석 도전 포즈. 게놈 넓은 방식 셀 유형 특정 chromatin 상태를 해결 하기 위해 우리는 최근 협동 chromatin immunoprecipitation 시퀀싱 (tChIP-Seq), chromatin의 선택적 정화 셀에서 태그 코어 히스톤 단백질에 의해 기반으로 개발 뒤에 칩이 관심의 종류 이 프로토콜의 목표는 tChIP이 모범 사례 소개 이 기술은 다양 한 히스톤 수정 및 모형 유기 체에서 조직 관련 epigenome 조사에 대 한 다양 한 도구를 제공합니다.
Introduction
다양 한 세포 유형 동물의 조직에 의하여 이루어져 있다. 유전자 규칙 각 셀에 셀 형식을 정의합니다. Chromatin 수정 DNA 메 틸 화와 히스톤 수정-셀 형 특이성 유전자 발현의 기반이 됩니다. 따라서, 각 세포 유형에 있는 후 성적인 규정의 측정, 원하는 하지만 그것은 기술적인 도전 하고있다.
특정 셀 형식에 epigenetics 조사, 탠덤 chromatin immunoprecipitation 시퀀싱 (tChIP-Seq) 최근 개발 된 (그림 1)1했다. TChIP에 피토 프 태그 코어 히스톤 단백질 H2B 셀 형식 관련 발기인에서 표현 된다. 소재는 다양 한 종류의 세포 혼합물에서 시작 하지만이 기능은 관심의 세포에서 chromatins의 절연이 있습니다. 다음 칩 Seq-히스톤 수정 마크와의 다음-세대 깊은 시퀀싱을 통해 chromatin 정화 절연 DNA-우리 게놈 넓은 방식 대상된 세포 유형의 후 성적인 상태를 모니터링할 수 있습니다.
이 기술을 사용 하 여, 우리 신경 관련 trimethylation 히스톤 H3 리 4 (H3K4me3)에서 단백질의 최근 조사 표. 그 연구에 우리 개발 노크에 마우스는 C-말기 플래그 태그 H2B에 단백질 Cre 중재 재결합 (Rosa26CAG floxed pA H2B-플래그)에 따라 표현 했다. CamK2a 발기인의 통제 Cre endoplasmic 그물 (응급실) 유전자를 보유 하는 마우스와 함께 횡단에 의해 얻은 마우스 선 tamoxifen 주입 (Camk2aH2B 플래그)1시 활성 뉴런에서 H2B 플래그를 유도 한다. 설립된 마우스 라인의 두뇌에서 시작, 우리는 안티-H3K4me3 항 체와 tChIP-Seq 수행. H3K4me3 마크는 종종 발기인 지구에 해당, 이후 우리 신경1에서 구체적으로 표현 하는 mRNAs의 수백을 발견 수 있습니다.
여기, 우리는 도서관 건설 (그림 1)를 조직 해 부에서 단계를 커버 하는 전형적인 tChIP-Seq 메서드를 설명 합니다. 이 프로토콜의 최종 목표는 tChIP-Seq의 성능 및 다른 세포 유형 및 히스톤 수정이이 방법의 미래 응용 프로그램에 대 한 우리의 모범 사례를 공유 하는 것입니다.
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Protocol
여기에 설명 된 모든 메서드를 RIKEN (H27-EP071)의 안전 부문에 의해 승인 하 고 관련 지침 및 규정 실시 되었습니다.
1. 조직 해 부
- 작은 조각으로 관심의 조직 부 (약 < 3 m m2) 좋은 봄이 위를 사용 하 여.
참고: 큰 조직 파편, 동결 하는 데 걸리는 그리고 작은 조각 버퍼, 결과 영향을 미칠 수 있습니다 둘 다의 더 큰 볼륨에 수행 한다. - 액체 질소로 채워진 깨끗 한 용기에 해 부 조직 파편을 추가 하 고 액체 질소로 채워진 2 mL 튜브 (관 당 1 조각)으로 그들을 수집 합니다.
참고:이 단계는 친수성 표면 튜브 권장 됩니다. - > 5 분 남은 액체 질소를 증발 오픈 캡-80 ° C에서 튜브를 놓습니다.
참고: 뚜껑을 닫은 후 조직 조각은 저장할 수 있습니다-80 ° C에서 사용 하기 전에 한 달 동안.
2. 셀 고정
참고: 우리는이 단계에 대 한 편리한 저온 분쇄기를 사용. 다른 장치를 사용할 수 있습니다.
- 장소는 2 mL 단백질 낮은 바인딩 튜브 금속 얼음 선반에 조직 샘플을 포함 하는 액체 질소에 차게.
- 1.5 mL 튜브에 액체 질소로 냉각 금속 총알을 놓습니다. 금속 얼음 선반에 놓습니다.
- 2 mL 튜브를 열고 튜브에 prechilled 금속 총알을 배치 합니다. 뚜껑을 닫고, 편리한 저온 분쇄기의 튜브 홀더에 2 mL 튜브를 설정 하 고 즉시 1 분 액체 질소에 조립된 튜브 홀더를 찍어.
- 고정된 튜브 홀더 편리한 저온 분쇄기의 외부 카세트에 넣고 30 60 시간을 적극적으로 악수 s.
- 튜브 홀더를 분해, 금속 총알을 제거 하 고 장소 2 mL 튜브 샘플 쿨러에-20 ° c.에 prechilled
- 다음 단계에서 정착 액의 동결을 방지 하기 위해 15 분 동안-20 ° C에 샘플 쿨러를 놓습니다.
- 샘플 쿨러 벤치, 튜브의 뚜껑을 열고 가져오고 즉시 그것에 1% 포름알데히드의 900 µ L를 똑. 여러 번 pipetting 후 새로운 2 mL-튜브 1% 포름알데히드와 23 ° c.에 설정 하는 인큐베이터에서 부드러운 회전으로 10 분에 대 한 수정 프로그램의 900 µ L를 포함으로 정지 전송
주의: 포름알데히드는 유독 하 고 유해한입니다. - 중지 하려면 고정 반응, 각 튜브와 4 ° c.에 3000 x g에 5 분 동안 원심 분리기를 100 µ L 2.5 M 글리신의 추가 폐기는 상쾌한.
- 얼음 처럼 차가운 인산 염 버퍼 식 염 수 (PBS), 4 ° C에서 3000 x g에 5 분 동안 원심 분리기의 1 mL을 추가 하 고 삭제는 상쾌한. 이 단계를 두 번 (총에서 3 세척)를 반복 합니다.
참고: 고정된 샘플 플래시-액체 질소로 냉동 고-80 ° c.에 저장 될 수 있습니다. - 세포의 용 해 버퍼 1 500 µ L 추가 (50 mM 4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic 산 (HEPES)-코 (pH 7.5), 140 mM NaCl, 1 mM ethylenediaminetetraacetic 산 (EDTA) (pH 8.0), 10 %w / v 글리세롤, 0.5 %w / v NP-40, 0.25 %w / v Triton X-100, 그리고 0.1 x protease 억제제 칵테일) 펠 릿, 피펫으로 여러 번 하 고 4 ° c.에서 10 분 동안 회전
참고: 세포의 용 해 버퍼 1 필터링 및 사용 하기 전에 4 ° C에서 저장 되어야 한다. - 4 ° C에서 3000 x g에 5 분 동안 centrifuge 고는 상쾌한 삭제.
- 세포의 용 해 버퍼 2의 1 mL을 추가 (10 mM Tris HCl (pH 8.0), 200 mM NaCl, 1 mM EDTA (pH 8.0), 0.5 m m EGTA, 및 프로 테아 제 억제 물 칵테일 x 0.1), 펠 릿을 소용돌이, 4 ° c.에서 10 분 동안 회전 하는 고
참고: 세포의 용 해 버퍼 2 필터링 및 사용 하기 전에 4 ° C에서 저장 되어야 한다. - 4 ° C에서 3000 x g에 5 분 동안 centrifuge 고는 상쾌한 삭제.
- 펠 릿을 1 x 프로 테아 제 억제 물 칵테일 radioimmunoprecipitation (RIPA)의 분석 결과 버퍼의 800 µ L을 추가 하 고 pipetting으로 펠 릿을 resuspend.
- 4 ° C에서 3000 x g에 5 분 동안 centrifuge 고는 상쾌한 삭제.
- RIPA 버퍼 1 x 프로 테아 제 억제 물 칵테일의 500 µ L를 추가 합니다.
- 4 ° C에서 3000 x g에 5 분 동안 centrifuge 고는 상쾌한 삭제.
- RIPA 버퍼 1 x 프로 테아 제 억제 물 칵테일의 1 mL를 추가 합니다. 즉시 다음 단계를 진행 합니다.
3입니다. chromatin 전단
- Sonicator 튜브는 lysate 전송 하 고 튜브를 ultrasonicator에 놓습니다.
- 다음 설정으로는 chromatin 전단: 온도: 4 ° C; 피크 사고 전력: 175 W; 의무 비율: 10%; 사이클/버스트: 200; 그리고 시간: 2400 s.
- 1.5 mL 단백질 낮은 바인딩 튜브 및 4 ° c.에 20000 x g에 5 분 동안 원심 분리기 샘플을 전송
- 새로운 단백질 낮은 바인딩 튜브에는 상쾌한을 수집 합니다.
참고: 샘플 수 있습니다 플래시-액체 질소에서 냉동 고-80 ° c.에 저장
4. 품질 검사 DNA (가교 역)
- lysate의 믹스 20 µ L 및 칩 차입 버퍼의 180 µ L (10 mM Tris HCl (pH 8.0), 300 mM NaCl, 5 mM EDTA (pH 8.0), 그리고 1 %w / v 나트륨 라우릴 황산 염 (SDS)) 중 합 효소 연쇄 반응 (PCR) 튜브에서. 65 ° c 6 h 열 cycler 뚜껑 오픈에 대 한 열 cycler에서 샘플을 품 어. -변성을 피하기 위해 열 cycler 오픈의 뚜껑을 유지.
참고: 칩 차입 버퍼 필터링 및 사용 하기 전에 실내 온도에 저장 되어야 한다. 이 외피는 하룻밤을 확장할 수 있습니다. - 추가 10 mg/mL RNase의 1 µ L, 소용돌이, 그리고 30 분 동안 37 ° C에서 품 어.
- 추가 15 mg/mL의 6.5 µ L 성분을 K, 소용돌이, 그리고 60 분 55 ° C에서 품 어.
- 전송 DNA 낮은 바인딩 튜브에 대 한 반응, 5 mg/mL glycogen, 그리고 소용돌이의 4 µ L를 추가 합니다. 그런 다음 실 온에서 18000 x g에서 페 놀/클로 프롬/isoamyl 알콜 (25:24:1) 및 5 분 동안 원심 분리기의 200 µ L를 추가 합니다.
- 새로운 DNA 낮은 바인딩 튜브는 상쾌한 전송. 트리 스-EDTA-NaCl 버퍼의 200 µ L 추가 (10 mM Tris HCl (pH 8.0), 1 mM EDTA (pH 8.0), 및 200 mM NaCl) 나머지 페 놀/클로 프롬/isoamyl 알콜 솔루션을 실 온에서 18000 x g에 5 분 동안 원심 분리기. 상쾌한을 수집 하 고 첫 번째 상쾌한 혼합.
- 얼음 처럼 차가운 에탄올의 900 µ L을 추가 하 고 1 시간-20 ° c.에 대 한 품 어
참고:이 화 4-6 h를 확장할 수 있습니다. - 4 ° c.에 18000 x g에서 30 분 동안 원심 분리기
- 폐기는 상쾌한. 펠 릿을 4 ° c.에 18000 x g에서 30 분 동안 원심 분리기 차가운 75% 에탄올의 1 mL을 추가 (총에서 두 세척)이이 단계를 반복 합니다.
- 상쾌한을 철저 하 게 무시 하 고 실 온에서 1 분 동안 건조.
- 트리 스-EDTA (테) 버퍼의 50 µ L을 추가 하 고 그것은 30 분 동안 실내 온도에 또는 4 ° C에서 하룻밤 배양 하 여 DNA를 분해. Vortexing 또는 pipetting 하지 마십시오. "입력"으로이 DNA를 유지 하 고 필요한 경우 라이브러리 준비를 위해 그것을 사용.
- 제조업체의 지시에 따라 fluorometer DNA 농도 측정 ( 테이블의 자료를 참조) 미세 전기 기계와 크기 분포를 확인 하 고 ( 그림에에서 표시 된 대표적인 데이터 참조 2A). 사용 10 ng 또는이 분석 결과 대 한 더 적은 DNA.
참고: 100-500의 기본적인 쌍 (bp)의 파편 DNA의 50% 이상을 해야 합니다.
5. 친 화력 정화 반대로 플래그 항 체에 의해
참고: 신경 tChIP-Seq, 8 쥐에서 뇌 조직은 일반적으로 사용 tChIP-Seq의 한 샘플에 대 한 2를 준비 하 협동 면역-정화에 의해 순화 된 DNA의 ng (단계 7.1 참조). 우리의 손에서 0.1 ng의 DNA 여전히 제공 높은 품질 DNA 라이브러리 칩 Seq (회, 미 출판). 따라서, 이론적으로, 단일 마우스 신경 tChIP-이 수행 하기에 충분 한 있을 수 있습니다. 필요한 금액은 관심의 조직 및 세포 유형에 대 한 최적화 되어야 합니다. Imumuno 정화 실험의 부정적인 컨트롤에 대 한 뇌 조직의 lysate H2B 플래그 식 없이 쥐에서 해야 될 준비 하 고 사용.
- 단백질 낮은 바인딩 튜브로 양 반 마우스 면역 글로불린 G (IgG)를 활용 하는 자석 구슬의 200 µ L 플라스틱
- 마그네틱 스탠드에 튜브를 놓고 분명 될 상쾌한에 대 일 분 동안 대기 합니다. 상쾌한, 얼음 처럼 차가운 PBS 및 소용돌이의 1 mL을 추가. (총에서 두 세척)이이 단계를 반복 합니다.
- 1 mg/mL 반대로 플래그 항 체의 20 µ L을 추가 하 고 5 h 4 ° c.에 대 한 회전
참고:이 외피는 하룻밤을 확장할 수 있습니다. - 워시 다음 단계 5.2 구슬. 15 mL 튜브에 비즈를 놓습니다.
- RIPA 버퍼의 1110 µ L에 구슬 resuspend 하 고 차단 하는 시 약 180 Denhardt의 솔루션 x 50 µ L, 프로 테아 제 억제 물 칵테일, x 100의 10 µ L, 3 단계에서에서 준비 lysate의 6.8 mL x 10의 900 µ L를 추가 합니다. 5 단백질 낮은 바인딩 튜브에이 혼합물을 분할. 6 h 4 ° c.에 대 한 회전
참고:이 외피는 하룻밤을 확장할 수 있습니다. - 마그네틱 스탠드에 튜브를 놓고 분명 될 상쾌한에 대 일 분 동안 대기 합니다. 삭제는 상쾌한 RIPA 버퍼의 1 mL을 추가 하 고 부드럽게 혼합. 이 단계를 반복 하 여 5 회 (총에서 6 세척). 단일 단백질 낮은 바인딩 관으로 모든 구슬 풀.
- 칩 차입 버퍼의 200 µ L을 추가 하 고 실 온에서 15 분 동안 회전. 4.11 ( 그림 2B와 C에서처럼 대표적인 데이터 참조) 단계에서 설명한 대로 DNA의 품질을 확인 합니다. 즉시 다음 단계를 진행 합니다.
6. 친 화력 정화 안티-H3K4me3 항 체와 역방향 가교에 의해
참고: 있는 다음 구슬 준비 단계 (6.1-6.4) 단계 5.7 하기 전에 수행 되어야 한다.
- 2 mL-단백질 낮은 바인딩 튜브로 양 반 마우스 IgG에 활용 된 자석 구슬의 40 µ L 플라스틱
- 마그네틱 스탠드에 튜브를 놓고 분명 될 상쾌한에 대 일 분 동안 대기 합니다. 삭제는 상쾌한, 얼음 처럼 차가운 PBS의 1 mL을 추가 하 고 부드럽게 혼합. (총에서 두 세척)이이 단계를 반복 합니다.
- 1 mg/mL 안티-H3K4me3 항 체의 4 µ L을 추가 하 고 6 h 4 ° c.에 대 한 회전
- 워시 다음 단계 6.2 구슬. 2 mL 단백질 낮은 바인딩 관으로 구슬 놓습니다.
- RIPA 버퍼의 1558 µ L에 구슬 resuspend 하 고 차단 하는 시 약, Denhardt의 솔루션 x 50의 40 µ L, 프로 테아 제 억제 물 칵테일, x 100의 2 µ L 및 준비 단계 5.7 eluate의 200 µ L x 10의 200 µ L를 추가 합니다. 4 ° c.에 하룻밤 회전
참고: 칩 차입 버퍼에 SDS이이 외피에 10 배 이상 희석 되었다. - 마그네틱 스탠드에 튜브를 놓고 분명 될 상쾌한에 대 일 분 동안 대기 합니다. 삭제는 상쾌한 RIPA 버퍼의 1 mL을 추가 하 고 부드럽게 혼합. 이 단계를 반복 하 여 4 회 (총에서 5 세척). 마지막 세척 후 DNA 낮은 바인딩 튜브에 비즈를 전송 하 고 삭제는 상쾌한.
- 칩 차입 버퍼의 200 µ L을 추가 하 고 실 온에서 15 분 동안 회전. 새로운 DNA 낮은 bindingTube는 eluate 전송.
참고:는 eluate-80 ° c.에 저장 될 수 있다 - DNA의 decrosslinking에 대 한 4 단계를 따릅니다. 20 µ L의 TE 버퍼에 순화 된 DNA를 resuspend.
- 4.11 ( 2D 그림에에서 표시 된 대표적인 데이터 참조) 단계에서 설명한 대로 DNA의 품질을 확인 합니다. (선택 사항) 양이 많은 PCR에 의해 농축 분석 수행 이전2에 설명 된 대로. Ten-fold 또는 큰 농축을 관찰 해야 합니다.
7. 도서관 건축
- 각 입력 및 칩 DNA 샘플에 대 한 미세 전기 기계에 대 한 소프트웨어의 얼룩 분석 기능을 사용 하 여 100-500-bp 지역에서 DNA의 비율을 계산 합니다. 추정 2를 얻을 하는 데 필요한 샘플 볼륨 100-500 bp DNA의 ng. 100-500-혈압 범위에 20 ng DNA를 사용 하 여 "입력된" 샘플으로.
- DNA 샘플 8 스트립 PCR 튜브에 플라스틱 고 다음 최종 수리 반응 및 크기 선택 H2O 10 µ L. (선택 사항) 총 볼륨을가지고 DNA의 볼륨 10 µ L, 비율을 초과 하는 경우를 추가 합니다.
- 준비 끝-복구 마스터 믹스 ( 재료의 표참조). DNA에 최종 복구 마스터 믹스의 4 µ L을 추가 하 고 20 ° c.에 30 분 동안 품 어
- 10 mM Tris-Cl, pH 8.5의 36 µ L을 추가 하 고 고체의 0.6 x 볼륨 (30 µ L) 가역 immobilization (SPRI) 자석 구슬 상 고 실 온에서 5 분 동안 품 어.
- 마그네틱 스탠드에 튜브를 놓고는 상쾌한 취소 될 때까지 기다립니다.
- 새로운 튜브에는 상쾌한 전송 SPRI 자석 구슬, 1.2 x 볼륨 (60 µ L)를 추가 하 고 실 온에서 5 분을 품 어.
- 마그네틱 스탠드에 튜브를 놓고는 상쾌한 취소 될 때까지 기다립니다.
- 80%의 200 µ L로 두 번 구슬을 씻어 EtOH, 자석에 여전히 튜브를 들고.
- 짧게 원심 튜브 하단에 잔여 EtOH를 수집 하 고 다시 제자리에 자석. 잔여 EtOH를 철저 하 게 제거 합니다.
- 관 뚜껑을 증발 EtOH 수 있도록 1-2 분 동안 열어 둡니다.
- 뚜껑 닫고 얼음에 튜브를 유지 합니다.
참고: 지금 당신을 가져올 구슬에 100-500 bp의 DNA 크기 선택. 더블 사이즈 선택에 대 한 자세한 내용은 제조업체의 웹 사이트 (www.beckman.com)에서 찾을 수 있습니다. - A-미행 마스터 준비 믹스 ( 재료의 표참조).
- A-미행 마스터 믹스의 10 µ L로 (단계 7.10)에서 구슬 resuspend와 30 ° c.에 30 분 동안 품 어
- 폴 리 에틸렌 글리콜 (PEG)의 1.8 x 볼륨 (18 µ L)를 추가 / NaCl 솔루션 및 실 온에서 5 분 동안 품 어.
- 단계 7.7-7.11 DNA를 정화 합니다.
- 결 찰 버퍼 믹스를 준비 ( 재료의 표참조).
- 플라스틱 (에서 단계 7.14) 구슬에 결 찰 버퍼 믹스의 8 µ L, 1 µ M 어댑터의 1 µ L을 추가 하 고 구슬 resuspend. 5 µ M 어댑터의 1 µ L를 사용 하 여 입력된 샘플에 대 한. 다중화 각 샘플에 대 한 다른 어댑터를 사용 하는 것이 좋습니다.
- DNA 리가의 1 µ L을 추가 하 고 20 ° c.에 15 분 동안 품 어
- 못/NaCl 솔루션의 1.0 x 볼륨 (10 µ L)를 추가 하 고 resuspend 구슬, 실 온에서 5 분 동안 품 어.
- 단계 7.7-7.10 DNA를 정화 합니다.
- 25 µ L 10 mM Tris-Cl, 튜브에 pH 8.5의 플라스틱 그리고 resuspend 구슬.
- 못/NaCl 솔루션의 1.0 x 볼륨 (25 µ L)를 추가 하 고 실 온에서 5 분 동안 품 어.
- 단계 7.7-7.10 DNA를 정화 합니다.
- 11 µ L 10 mM Tris-Cl, 튜브에 pH 8.5의 플라스틱 그리고 resuspend 구슬.
- 마그네틱 스탠드에 튜브를 놓고는 상쾌한 취소 될 때까지 기다립니다.
- 새로운 8 스트립 PCR 튜브에는 상쾌한을 수집 합니다.
- 실시간 PCR 마스터 믹스를 준비 (자세한 자료 참조).
- 384 잘 정량 PCR (정량) 접시에 실시간 PCR 마스터 믹스 8.5 µ L 플라스틱 하 고 어댑터의 1.5 µ L 출혈 (단계 7.26)에서 DNA를 추가 합니다.
- 빈 우물에 각 형광 표준의 10 µ L 플라스틱
- 다음 프로그램으로 실시간 PCR 수행: (45 98 ° C s) 1 주기, x (15 98 ° C s, 60 ° C 30에 대 한 s, 72 ° C 30에 대 한 s) 20 주기 x 그리고 (60 72 ° C s) 1 주기 x.
- PCR 주기 형광 표준 2의 형광 강도 도달 하는 데 필요한 수를 결정 합니다.
- PCR 마스터 준비 믹스 ( 재료의 표참조).
- (단계 7.26)에서 나머지 어댑터 출혈 DNA에 PCR 마스터 믹스의 11.5 µ L 플라스틱 고 같이 단계 7.30 PCR 주기 단계 7.31에서와 PCR을 수행 합니다.
- 못/NaCl 솔루션의 1.0 x 볼륨 (20 µ L)를 추가 하 고 실 온에서 5 분 동안 품 어.
- 단계 7.7-7.10 DNA를 정화 합니다.
- 20 µ L 10 mM Tris-Cl, 튜브에 pH 8.5의 플라스틱 그리고 resuspend 구슬.
- 마그네틱 스탠드에 튜브를 놓고는 상쾌한 취소 될 때까지 기다립니다.
- 새로운 1.5 mL-DNA 낮은 바인딩 튜브에는 상쾌한을 수집 합니다.
- 4.11 ( 그림 2E와 F에표시 된 대표적인 데이터 참조) 단계에 설명 된 대로 라이브러리의 품질을 확인 합니다. 라이브러리 DNA 샘플의 1 µ L을 사용 합니다. (선택 사항) 앞에서 설명한 2정량 여 농축 분석을 수행 합니다. Ten-fold 또는 큰 농축을 관찰 해야 합니다.
8입니다. 시퀀싱
- 다음-세대 시퀀서에서 라이브러리 순서 (대표 데이터 그림3 참조).
참고: 시퀀스 깊이 데이터 분석에 대 한 충분 한 유기 체3의 게놈 크기에 따라 달라 집니다. 인간을 위한 마우스, 우리 적어도 20-40 백만 일자형 읽기를 얻는 것이 좋습니다. 읽기의 수익률에 따라 멀티플렉싱 비용 효과적인 수 있습니다.
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Representative Results
여기, 우리 조직 절 개, 고정, 세포 세포의 용 해, 탠덤 정화 chromatin, 및 DNA 도서관 준비 다음-세대 시퀀서에 대 한 설명. 절차, 중 하나는 여러 단계 (그림 2)에서 성공적인 시퀀싱 열쇠 DNA의 품질을 테스트할 수 있습니다. 때문에 단일 nucleosome 147 bp DNA 4로 일반적으로 둘러싸여, 전단된 DNA 크기 보다 짧은 수 없습니다. Ultrasonication, 직후 DNA는 고립 되었고 미세 전기 기계 (그림 2A)에서 실행. 크기 범위를 최적화 하기 위해 우리의 최선의 노력에도 불구 하 고 우리는 여전히 unsheared 유지 (약 2 kbp) DNA의 인구가 있었다. 이 단계에서 100-500 bp에서 배열 하는 DNA의 분수는 인구의 50% 이상 이어야 한다. 반대로 플래그 항 체 (그림 2B)와 안티-H3K4me3 항 체 (그림 2D) 친 화력 정화, 후 격리 된 DNA의 품질에서 배열 하는 DNA의 양과 미세 전기 기계를 사용 하 여 다시 확인 했다 100-500 bp 추정 되었다. 비록 우리는 종종 2 kbp 파편이이 단계에 대 한 강한 편견이 관찰, SPRI 자성 구슬에 의해 두 배 크기 선택이이 분수를 제거.
H2B 플래그에 DNA의 면역-정화의 특이성 lysate H2B 플래그 없이 쥐에서 어떤 두뇌에서 식 사용 되었다 부정적인 제어 샘플 확인 되었다 (그림 2C). 우리는 일반적으로 부정적인 컨트롤 샘플에서 무시할 수 양의 DNA 발견.
다음 A-미행, 어댑터 결 찰, 그리고 PCR, 시퀀싱 라이브러리의 품질 확인 (그림 2E). 일반적으로, 250-600 bp DNA 얻은 했다. 성공적인 일반 칩과 tChIP는 정량2 (그림 2F) GAPDH 유전자의 발기인 지구를 대상으로 하는 뇌관을 사용 하 여 농축 분석에 의해 입증 되었다.
대표 읽기 배포판 게놈 브라우저에 의해 신경 유전자 (Camk2a, Slc17a7, 및 Gria1)에 따라 그림 3에 나와 있습니다. 신경 tChIP-Seq 뇌 tChIP-Seq에 의해 유전자의 5 ' 끝에 읽기의 농축이 관찰 되었다.
그림 1: tChIP이 도식 표현 이 그림에서 수정 된 M. 외. 1. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 2: DNA 품질 체크. (A, B, D및 E) Electropherogram 전단된 chromatin DNA (A), DNA 백신 플래그 항 체 (B) 안티-H3K4me3 항 체 (C), 그리고 마지막 라이브러리 (D)와 정화에 대 한 미세 전기 기계를 사용 하 여 얻은. 녹색과 보라색 숫자 강조 봉우리 내부 크기 표준을 나타냅니다. 파란색 파선 다운스트림 분석에 대 한 고려는 DNA 크기 영역을 나타냅니다. 푸: 형광 단위입니다.
(C) 항 플래그 면역-정화 되는 DNA의 양을. 각 포인트는 독립적인 복제를 나타냅니다. (F) 농축 GAPDH 대상으로 정량 분석. 각 포인트는 독립적인 복제를 나타냅니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 3: 신경 tChIP이 분포를 읽고 (A C) 읽기 배포판 신경 tChIP-Seq에 제어 뇌 tChIP-Seq 대표 신경 유전자에 따라 표시 됩니다. RPM: 백만 읽기 당 읽습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
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Discussion
우리의 프로토콜 플래그 태그 H2B 표현의 tamoxifen 주입에 의해 유도 된다 마우스 뇌의 뉴런에 대 한 최적화 되었다. 발기인 H2B 식, 시작 조직 자료의 양과 조직에 사용 되는 성공적인 tChIP-이 대 한 중추적인 매개 변수 따라서, 이러한 요소의 최적화 관심의 각 세포 유형에 대 한 고려 되어야 한다.
이 프로토콜에 사용 되는 절차 중 중요 한 단계는 100-500 bp5는 chromatin 길이를 전단 하는 DNA 이다. 일반적으로, ultrasonication 단계 표준화 이후 매우 다양 한 요인;에 따라 도전 고정 조건, 사용 하는 조직, 울트라-쥡니다, 사용 장비 및 장비 설정, 다른 사람의 사이에서. 따라서,이 DNA의 전단 단계의 재판 및 오류 최적화 개별 실험에 필요한 것입니다. 울트라-쥡니다, 대신 micrococcal nuclease 치료 순진한 칩 방법6사용 단일 nucleosome 크기의 DNA를 분리 하는 옵션이 있어야 합니다. 비록는 균질 성 DNA의 크기 분포는 이상적, 전단 DNAs 그림 2A와 같이 여러 인구를 표시할 수 있습니다. SPRI 자석 구슬의 두 배 크기 선택, 위에서 설명한 대로 더 이상 크기의 DNA 파편의 제거에 도움이 됩니다.
일반적으로, 라이브러리 준비 필요 1 100-500 bp DNA의 ng. 이 요구 사항에 따라, 우리는 신경에 대 한 뇌 조직의 초기 자료를 축척. 그러나,이 절차는 드문 종류에서 매우 작은 샘플에 대 한 도전 수 있습니다. 이러한 경우에는 리가 대신 Tn5 transposase에 기반 하며 덜 소재7, 칩 mentation 더 나은 대안이 있을 수 있습니다.
그럼에도 불구 하 고,이 현재 프로토콜 자료에서 주요 셀 형식으로 제한 됩니다. 우리의 손에서 원래 세포 인구에 대상된 셀의 10% 인 대상 셀1에서 chromatin의 공정한 정화를 제공. 그러나, 더 많은 희귀 세포 유형, 대상 경우 피토 프 태그에 의해 immunoprecipitation의 미세한 최적화 비 대상 셀에서 오염 된 DNA에서 분리 된 DNA를 구별 하 보증 됩니다. 데이터 분석의 모범 사례에 대 한 실험을 시작 하는 데 사용 하는 전체 조직에서 제어 tChIP-Seq 분석 데이터를 비교 것이 좋습니다. 이후 우리는 것 표현된 H2B 플래그 단백질에서 상당한 편견을 발견, 분석은 비교 고 배경1로 농축 (또는 고갈) 분석 해야 합니다. 이 컨트롤에 대 한 우리는 참으로 편 표현 H2B-플래그 (사H2B 플래그) 마우스 라인을 만들어 하 고 tChIP-Seq1을 수행. 데이터의 자세한 해석 되었습니다1을 설명한.
우리의 분석을 바탕으로, H3K4me3 tChIP-뉴런에서 Seq 제공 FACS 정렬 신경 세포에서 RNA-Seq 보다 알려진된 신경 관련 유전자의 비교 및/또는 더 나은 탐지8 및 번역 리보솜 친 화력 정화 (트랩)-Seq9. 예를 들어 알려진된 축 삭/모 수석 지역화 유전자 신경 tChIP-Seq1를 사용 하 여 효율적으로 복구 되었습니다. 놀랍게도, 우리의 tChIP-Seq 발기인 관련 히스톤 마크에 대 한 제한 하지만 항 체를 사용할 수 있는 경우 다른 다양 한 히스톤 수정10 에 적용 됩니다. 또한, 태그 코어 히스톤 단백질에 의해 chromatin 분리 전략 다른 모델 유기 체에 사용할 수 있습니다. 여기 우리가 사용 되지만 플래그 epitope 코어 히스톤 단백질 태그, 다른 태그를 적용할 수 있습니다. 포름알데히드 고정 DNA에 단백질11의 리 진 잔류물에서 가장 일반적으로 발생, 이후 많은 리와 태그 피토 프 태그 편견을 제거 하기 위해 피해 야 한다. 따라서, tChIP-Seq 접근 후 연구에서 상황의 많은 종류에 따라 다양 한 조직에서 다양 한 해야 합니다.
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Disclosures
저자는 공개 없다.
Acknowledgments
우리는 원고의 중요 한 독서의 이와사키 연구소의 모든 구성원을 감사합니다. 이 작품은 의해 부분적으로 지원 한 선진적인 과학 연구에 대 한 혁신적인 지역 (S.N. 고 S.I. 하 JP17H05679 #26113005); 젊은 과학자 들에 대 한 특정 (A) (JP17H04998 S.I. 하) 교육, 과학, 스포츠, 및 일본 (MEXT);의 문화에서 그리고는 개척 프로젝트 "세포 진화"와 모든 RIKEN 프로젝트 "질병 및 Epigenome" RIKEN에서 (S.N. S.I. 하)입니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Protein LoBind tube, 2 mL | Eppendorf | No. 0030108132 | For cell lysis |
| Protein LoBind tube, 1.5 mL | Eppendorf | No. 0030108116 | For ChIP and library preparation |
| DNA LoBind tube, 1.5 mL | Eppendorf | No. 0030108051 | For ChIP and library preparation |
| 8-strip PCR tube | BIO-BIK | 3247-00 | For ChIP and library preparation |
| SK Mill | TOKKEN | SK-200 | Handy cryogenic grinder to make cell powder for fixation |
| Metal bullet | TOKKEN | SK-100-DLC10 | Accessory of SK Mill |
| 2 mL stainless steel tube | TOKKEN | TK-AM5-SUS | An option for cell lysis |
| 2 mL stainless steel tube holder | TOKKEN | SK-100-TL | An option for cell lysis |
| 16% formaldehyde (w/v), methanol-free | Pierce | 28906 | To fix cells. Prepare 1% solution before use. |
| Glycine | Nacalai Tesque | 17109-35 | Prepare 2.5 M stock |
| D-PBS (-)(1x) | Nacalai Tesque | 14249-24 | For washing lysate and purified DNA |
| HEPES | Nacalai Tesque | 02443-05 | For Lysis buffer 1. Prepare 1 M, pH 7.5 stock. |
| 5 M NaCl, molecular biology grade | Nacalai Tesque | 06900-14 | For Lysis buffer 1, Lysis buffer 2, ChIP Elution Buffer, and Tris-EDTA-NaCl Buffer |
| 0.5 M EDTA, molecular biology grade | Wako Pure Chemical Industries, Ltd. | 311-90075 | For Lysis buffer 1, Lysis buffer 2, ChIP Elution Buffer, and Tris-EDTA-NaCl Buffer |
| Glycerol | Wako Pure Chemical Industries, Ltd. | 072-04945 | For lysis buffer 1 |
| NP-40 | Nacalai Tesque | 25223-75 | For lysis buffer 1 |
| Triton X-100, molecular biology grade | Nacalai Tesque | 12967-32 | For Lysis buffer 1 |
| Tris | Nacalai Tesque | 35406-91 | For Lysis buffer 2, ChIP Elution Buffer, and Tris-EDTA-NaCl Buffer. Prepare 1 M, pH 8.0 stock. |
| 0.1 M EGTA pH neutral | Nacalai Tesque | 08947-35 | For Lysis Buffer 2 |
| Protease inhibitor cocktail (100x) | Nacalai Tesque | 25955-24 | To block degradation of protein |
| RIPA buffer | Thermo Fisher Scientific | 89900 | For cell lysis and washing |
| milliTUBE 1 mL AFA Fiber | Covaris | 520130 | Sonicator tube. Accessory of Focused-ultrasonicator |
| Focused-ultrasonicator | Covaris | S220 or E220 | To digest DNA into adequate size for ChIP-Seq |
| UltraPure 10% SDS | Thermo Fisher Scientific | 15553-027 | For ChIP Elution Buffer |
| RNase A | Nacalai Tesque | 30141-14 | To purify DNA from lysate |
| Proteinase K, recombinant, PCR Grade | Sigma-Aldrich | 3115887001 | To purify DNA from lysate |
| Ethanol | Wako Pure Chemical Industries, Ltd. | 054-07225 | Make 70% solution |
| Monoclonal anti-FLAG M2 antibody produced in mouse | Sigma-Aldrich | F1804 | To purify chromatin expressed in cells of interest |
| Dynabead M-280 Sheep Anti-Mouse IgG | Thermo Fisher Scientific | 11201D | This can be used for anti-FLAG IP and anti-H3K4me3 IP |
| Anti-tri-methyl histone H3 (K4), mouse monoclonal antibody | Wako Pure Chemical Industries, Ltd. | 301-34811 | Any other antibody that works for ChIP analysis will work |
| 10x Blocking Reagent | Sigma-Aldrich | 11096176001 | For blocking during affinity purification |
| Denhardt’s solution | Nacalai Tesque | 10727-74 | For blocking during affinity purification |
| Glycogen (5 mg/ml) | Thermo Fisher Scientific | AM9510 | To purify DNA from lysate |
| Qubit 2.0 Fluorometer | Thermo Fisher Scientific | Q32866 | For quantification of isolated DNA |
| Qubit dsDNA HS Assay Kit | Thermo Fisher Scientific | Q32851 | For quantification of isolated DNA |
| 0.5 mL tube | Axygen | 10011-830 | For quantification by Qubit |
| Phenol/chloroform/isoamyl alcohol (25:24:1) | Nacalai Tesque | 25970-56 | To purify DNA from lysate |
| AMPure XP beads | Beckman Coulter | A63881 | SPRI magnetic beads for library preparation |
| Metal ice rack | Funakoshi | IR-1 | To keep the cell lysate frozen |
| Sample Cooler | New England Biolabs | T7771S | Helps fix cells with minimal damage |
| 2100 Bioanalyzer | Agilent Technologies | G2939BA | To check the quality of isolated DNA fragments. Another fragment analyzer can be used. |
| Bioanalyzer 2100 Expert Software | Agilent Technologies | G2946CA | Supplied with the Bioanalyzer |
| High Sensitivity DNA Kit | Agilent Technologies | 5067-4626 | To check the quality of the isolated DNA fragments |
| KAPA LTP Library Preparation Kit | Roche | 07961898001 | Supplied with 10x KAPA End Repair Buffer, KAPA End Repair Enzyme Mix, KAPA A-Tailing Buffer, KAPA A-Tailing Enzyme, KAPA Ligation Buffer, KAPA DNA Ligase, and PEG/NaCl solution |
| NEXTflex DNA Barcodes | BIOO Scientific | NOVA-514101 | Adapter for library preparation. Supplied with DNA Barcode Adapters and Primer Mix. |
| KAPA Real-Time Library Amplification Kit | Roche | 07959028001 | Supplied with 2x KAPA HiFi HS real-time PCR Master Mix, PCR Primer Mix, and Fluorescent Standards |
| 2x KAPA HiFi HotStart ReadyMix | Roche | KM2602 | For library preparation. Additionally, this enzyme may be required for the KAPA Real-Time Library Amplification Kit |
| Buffer EB | Qiagen | 19086 | 10 mM Tris-Cl, pH 8.5 for elution of DNA |
| 386-well qPCR plate | Thermo Fisher Scientific | 4309849 | For real-time PCR |
| QuantStudio 7 Flex Real-Time PCR System | Thermo Fisher Scientific | 4485701 | To quantify DNA |
| MicroAmp Optical Adhesive Film | Thermo Fisher Scientific | 4311971 | For real-time PCR |
| MicroAmp Clear Adhesive Film | Thermo Fisher Scientific | 4306311 | For plate sealing |
| End-repair master mix | Combine 1.4 µL of 10x KAPA End Repair Buffer, 1 µL of KAPA End Repair Enzyme Mix, and 1.6 µL of H2O | ||
| A-taling master mix | Combine 1 µL of KAPA A-Tailing Buffer, 0.6 µL of KAPA A-Tailing Enzyme, and 8.4 µL of H2O | ||
| Ligation buffer mix | Combine 2 µL of KAPA ligation buffer and 6 µL of H2O | ||
| Real-time PCR master mix | Combine 5 µL of 2x KAPA HiFi HS real-time PCR Master Mix, 0.35 µL of PCR Primer Mix (10 µM each of forward primer AATGATACGGCGACCACCGAG and reverse primer CAAGCAGAAGACGGCATACGAG), and 3.15 µL of H2O | ||
| PCR master mix | Combine 10 µL of 2x KAPA HiFi Ready Mix, 0.9 µL of PCR Primer Mix, and 0.6 µL of H2O | ||
| Integrative Genomics Viewer | Broad Institute | IGV_2.3.88 | Genome browser to visualize sequencing data |
| DNA olgionucleotide: 5′-GCCTACGCAGGTCTTGCTGAC-3′ | Eurofins Genomics | A primer to amplify the promoter region of GAPDH | |
| DNA olgionucleotide: 5′-CGAGCGCTGACCTTGAGGTC-3′ | Eurofins Genomics | A primer to amplify the promoter region of GAPDH | |
| SYBR Premix Ex Taq | Takara | RR420L | To quantify the DNA corresponding to the GADPH promoter region |
| Thermal Cycler Dice | Takara | TP870 | To quantify the DNA corresponding to the GADPH promoter region |
References
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