Summary
हम मिलकर क्रोमेटिन immunoprecipitation अनुक्रमण (tChIP-Seq) के लिए चरण-दर-चरण प्रोटोकॉल का वर्णन करते है जो कोशिका-प्रकार-विशिष्ट जीनोम-वाइड हिस्टोन संशोधन के विश्लेषण को सक्षम करता है ।
Abstract
Epigenetic विनियमन जीन अभिव्यक्ति में केंद्रीय भूमिकाओं निभाता है । चूंकि हिस्टोन संशोधन 1960 के दशक में खोजा गया था, इसके शारीरिक और रोग कार्यों को बड़े पैमाने पर अध्ययन किया गया है । दरअसल, विशिष्ट हिस्टोन संशोधन एंटीबॉडी के माध्यम से अगली पीढ़ी के गहरे अनुक्रमण और क्रोमेटिन immunoprecipitation (चिप) के आगमन के जीनोम में epigenetic विनियमन के हमारे विचार क्रांति की है । इसके विपरीत, ऊतकों को आम तौर पर विविध प्रकार के सेल से मिलकर बनता है, और उनके जटिल मिश्रण एक विशेष कोशिका प्रकार में epigenome की जांच करने के लिए विश्लेषणात्मक चुनौतियों बन गया है । एक जीनोम में व्यापक तरीके से सेल प्रकार विशिष्ट क्रोमेटिन राज्य को संबोधित करने के लिए, हम हाल ही में मिलकर विकसित क्रोमेटिन immunoprecipitation अनुक्रमण (tChIP-Seq) है, जो क्रोमेटिन के चयनात्मक शुद्धीकरण से टैग कोर हिस्टोन प्रोटीन पर आधारित है सेल ब्याज के प्रकार, चिप Seq द्वारा पीछा किया । इस प्रोटोकॉल का लक्ष्य tChIP-Seq की सर्वोत्तम पद्धतियों का परिचय है. इस तकनीक के विभिंन हिस्टोन संशोधनों और मॉडल जीवों में ऊतक विशिष्ट epigenome जांच के लिए एक बहुमुखी उपकरण प्रदान करता है ।
Introduction
पशुओं के ऊतकों विविध कोशिका प्रकार से मिलकर बनता है । प्रत्येक कोशिका में जीन विनियमन कोशिका प्रकार को परिभाषित करता है. क्रोमेटिन संशोधन-डीएनए मिथाइल और हिस्टोन संशोधन-आबाद जीन अभिव्यक्ति की कोशिका-प्रकार की विशिष्टता । इस प्रकार प्रत्येक कोशिका प्रकार में epigenetic नियमन की माप चाही गई है, लेकिन यह एक तकनीकी चुनौती रही है.
एक विशेष कोशिका प्रकार में epigenetics की जांच करने के लिए, मिलकर क्रोमेटिन immunoprecipitation अनुक्रमण (tChIP-Seq) हाल ही में विकसित किया गया था (चित्रा 1)1. tChIP में epitope-टैग की गई कोर हिस्टोन प्रोटीन H2B एक कोशिका-प्रकार-विशिष्ट प्रवर्तक से व्यक्त की जाती है. हालांकि सामग्री विभिन्न प्रकार के सेल के मिश्रण से शुरू होता है यह सुविधा, ब्याज की कोशिकाओं से chromatins के अलगाव की अनुमति देता है. निंनलिखित चिप-Seq-क्रोमेटिन शुद्धीकरण एक संशोधित-हिस्टोन निशान और अगली पीढ़ी अलग डीएनए की गहरी अनुक्रमण के माध्यम से-हम एक जीनोम चौड़ा तरीके से लक्षित सेल प्रकार की epigenetic स्थिति की निगरानी कर सकते हैं ।
इस तकनीक का प्रयोग, हम हाल ही में lysine 4 (H3K4me3) के निशान पर हिस्टोन H3 प्रोटीन के न्यूरॉन विशिष्ट trimethylation की जांच की । उस अध्ययन में, हम एक दस्तक माउस में जो सी-टर्मिनल फ्लैग-टैग H2B प्रोटीन Cre मध्यस्थता पुनर्संयोजन (Rosa26सीएजी floxed-पीए H2B-झंडा) पर व्यक्त किया गया था विकसित की है । एक माउस के साथ पार करके Cre-endoplasmic जालिका (एर) जीन CamK2a प्रवर्तक के नियंत्रण में, प्राप्त माउस लाइन H2B इंजेक्शन (tamoxifenCamK2a-झंडा)1पर सक्रिय ंयूरॉंस में-झंडा प्रेरित किया । स्थापित माउस लाइन के मस्तिष्क से शुरू, हम विरोधी H3K4me3 एंटीबॉडी के साथ tChIP-Seq प्रदर्शन किया । के बाद से H3K4me3 मार्क्स अक्सर प्रमोटर क्षेत्रों के अनुरूप है, हम mRNAs के सैकड़ों विशेष रूप से न्यूरॉन्स1में व्यक्त की खोज सकता है ।
यहां, हम एक ठेठ tChIP-Seq विधि है कि ऊतक विच्छेदन से पुस्तकालय निर्माण (चित्रा 1)के लिए कदम कवर का वर्णन । इस प्रोटोकॉल का अंतिम लक्ष्य है tChIP-Seq के प्रदर्शन के लिए हमारी सर्वोत्तम प्रथाओं का साझा करना और भविष्य में इस विधि के अनुप्रयोग को अन्य कोशिका प्रकारों और हिस्टोन संशोधनों के लिए.
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Protocol
यहां वर्णित सभी विधियों को आरआईकेईएन (H27-EP071) के सुरक्षा प्रभाग द्वारा अनुमोदित किया गया है और प्रासंगिक दिशानिर्देशों और विनियमों के साथ आयोजित किए गए हैं ।
1. ऊतक विच्छेदन
- काटना छोटे टुकड़ों में ब्याज के ऊतकों (लगभग < 3 मिमी2) ठीक वसंत कैंची का उपयोग कर ।
नोट: बड़े ऊतक टुकड़े फ्रीज करने के लिए अधिक समय ले, और छोटे टुकड़े बफर की बड़ी मात्रा पर ले जाएगा, दोनों के परिणाम को प्रभावित कर सकते हैं । - तरल नाइट्रोजन से भरा एक साफ कंटेनर के लिए विच्छेदित ऊतक टुकड़े जोड़ें और उन्हें 2 मिलीलीटर ट्यूबों (ट्यूब प्रति 1 टुकड़ा) तरल नाइट्रोजन से भर में इकट्ठा ।
नोट: हाइड्रोफिलिक सतह के साथ ट्यूबों इस कदम के लिए सिफारिश कर रहे हैं । - पर ट्यूबों प्लेस-८० ° c > के लिए 5 मिनट के लिए खुला कैप के साथ शेष तरल नाइट्रोजन लुप्त हो जाना ।
नोट: टोपी बंद करने के बाद, ऊतक टुकड़े-८० डिग्री सेल्सियस पर संग्रहीत किया जा सकता है उपयोग करने से पहले एक महीने के लिए ।
2. कक्ष निर्धारण
नोट: हम इस कदम के लिए एक काम क्रायोजेनिक चक्की का इस्तेमाल किया । एक वैकल्पिक तंत्र का इस्तेमाल किया जा सकता है ।
- प्लेस 2 मिलीलीटर प्रोटीन कम बाध्यकारी एक धातु बर्फ पर तरल नाइट्रोजन ठंडा रैक पर ऊतक के नमूनों युक्त ट्यूब ।
- एक १.५ मिलीलीटर में एक धातु गोली-ट्यूब और तरल नाइट्रोजन के साथ ठंडा प्लेस । इसे मेटल आइस रैक पर लगाएं ।
- 2 मिलीलीटर ट्यूब खोलें और ट्यूब में ठंडा धातु गोली जगह है । टोपी बंद करो, एक आसान क्रायोजेनिक चक्की के ट्यूब धारक में 2 मिलीलीटर ट्यूबों सेट, और तुरंत 1 मिनट के लिए तरल नाइट्रोजन में इकट्ठे ट्यूब धारक डुबकी ।
- काम क्रायोजेनिक चक्की के बाहरी कैसेट में जमे हुए ट्यूब धारक डालें और 30 एस के लिए जोरदार ६० बार शेक करें ।
- ट्यूब धारक जुदा, धातु गोली निकालें, और एक नमूना कूलर पर-20 डिग्री सेल्सियस पर 2 मिलीलीटर ट्यूब जगह है ।
- अगले चरण में निर्धारण की ठंड को रोकने के लिए 15 मिनट के लिए-20 डिग्री सेल्सियस पर नमूना कूलर रखें ।
- बेंच के लिए नमूना कूलर लाओ, ट्यूब के ढक्कन खोलो, और तुरंत 1% formaldehyde के ९०० µ एल ड्रिप में यह । pipetting के बाद कई बार, 1% formaldehyde के ९०० µ एल युक्त नए 2 मिलीलीटर ट्यूब में निलंबन हस्तांतरण और एक मशीन में कोमल रोटेशन के साथ 10 मिनट के लिए तय 23 डिग्री सेल्सियस पर सेट ।
चेतावनी: Formaldehyde विषाक्त और हानिकारक है । - निर्धारण प्रतिक्रिया रोकने के लिए, प्रत्येक ट्यूब के लिए २.५ मीटर glycine के १०० µ एल जोड़ें और 4 डिग्री सेल्सियस पर ३,००० x जी में 5 मिनट के लिए केंद्रापसारक । supernatant को त्यागें ।
- बर्फ के 1 मिलीलीटर-ठंडा फॉस्फेट-खारा (पंजाब) जोड़ें, 4 ° c पर ३,००० x g पर 5 मिनट के लिए केंद्रापसारक, और supernatant त्यागें । दोहराएं इस कदम दो बार (कुल में 3 बहाकर) ।
नोट: फिक्स्ड नमूने तरल नाइट्रोजन द्वारा फ्लैश-जमे हुए और-८० डिग्री सेल्सियस पर संग्रहित किया जा सकता है । - जोड़ें ५०० µ एल के Lysis बफर 1 (५० मिमी 4-(2-hydroxyethyl) -1-piperazineethanesulfonic एसिड (HEPES)-कोह (पीएच ७.५), १४० मिमी NaCl, 1 मिमी ethylenediaminetetraacetic एसिड (EDTA) (पीएच ८.०), 10% डब्ल्यू/वी ग्लिसरॉल, ०.५% डब्ल्यू/वी एनपी-४०, ०.२५% डब्ल्यू/वी ट्राइटन एक्स-१००, और 0.1 x चिढ़ाना अवरोध करनेवाला कॉकटेल) गोली करने के लिए, कई बार प्लास्टिक, और 4 डिग्री सेल्सियस पर 10 मिनट के लिए घुमाएगी ।
नोट: Lysis बफ़र 1 फ़िल्टर और उपयोग करने से पहले 4 ° c पर संग्रहीत किया जाना चाहिए । - 4 डिग्री सेल्सियस पर ३,००० x g पर 5 मिनट के लिए केंद्रापसारक और supernatant त्यागें ।
- Lysis बफर 2 के 1 मिलीलीटर जोड़ें (10 मिमी Tris-एचसीएल (पीएच ८.०), २०० मिमी NaCl, 1 मिमी EDTA (पीएच ८.०), ०.५ मिमी EGTA, और 0.1 एक्स चिढ़ाने के कॉकटेल) गोली, भंवर करने के लिए, और 4 डिग्री सेल्सियस पर 10 मिनट के लिए घुमाएगी ।
नोट: Lysis बफर 2 फ़िल्टर और उपयोग करने से पहले 4 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहीत किया जाना चाहिए । - 4 डिग्री सेल्सियस पर ३,००० x g पर 5 मिनट के लिए केंद्रापसारक और supernatant त्यागें ।
- जोड़ें ८०० µ के radioimmunoprecipitation परख (RIPA) बफर के लिए 1x चिढ़ाना अवरोधक कॉकटेल के साथ गोली और pipetting द्वारा गोली resuspend ।
- 4 डिग्री सेल्सियस पर ३,००० x g पर 5 मिनट के लिए केंद्रापसारक और supernatant त्यागें ।
- RIPA बफर के ५०० µ एल जोड़ें 1x छेड़ने अवरोधक कॉकटेल के साथ ।
- 4 डिग्री सेल्सियस पर ३,००० x g पर 5 मिनट के लिए केंद्रापसारक और supernatant त्यागें ।
- 1x को छेड़ो अवरोधक कॉकटेल के साथ RIPA बफर की 1 मिलीलीटर जोड़ें । तुरंत अगले चरण पर आगे बढ़ें ।
३. क्रोमेटिन कतरनी
- एक sonicator ट्यूब के लिए lysate स्थानांतरण और फिर एक ultrasonicator पर ट्यूब जगह है ।
- कतरनी निम्नलिखित सेटिंग्स के साथ क्रोमेटिन: तापमान: 4 ° c; पीक घटना शक्ति: १७५ W; कर्तव्य फैक्टर: 10%; चक्र/फट: २००; और समय: २,४०० s ।
- एक १.५ मिलीलीटर प्रोटीन कम बाध्यकारी ट्यूब के लिए नमूना स्थानांतरण और 4 ° c पर २०,००० x g पर 5 मिनट के लिए केंद्रापसारक ।
- एक नया प्रोटीन कम बाध्यकारी ट्यूब में supernatant लीजिए ।
नोट: नमूना तरल नाइट्रोजन में फ्लैश-जमे हुए और-८० डिग्री सेल्सियस पर संग्रहित किया जा सकता है ।
4. डीएनए की गुणवत्ता की जांच (रिवर्स Crosslinking)
- चिप रेफरेंस बफर के lysate और १८० µ एल के 20 µ एल मिक्स (10 एमएम Tris-एचसीएल (pH ८.०), ३०० मिमी NaCl, 5 मिमी EDTA (पीएच ८.०), और एक पोलीमरेज़ श्रृंखला प्रतिक्रिया (पीसीआर) ट्यूब में 1% डब्ल्यू/वी सोडियम dodecyl सल्फेट (एसडीएस)) । थर्मल साइकिल चालक ढक्कन खुला के साथ 6 एच के लिए एक थर्मल साइकिल चालक में ६५ डिग्री सेल्सियस पर नमूना मशीन । से अधिक विकार से बचने के लिए खुला थर्मल साइकिल चालक के ढक्कन रखें ।
नोट: चिप रेफरेंस बफर फ़िल्टर किया जाना चाहिए और उपयोग करने से पहले कमरे के तापमान पर संग्रहीत । इस मशीन को रात भर के लिए बढ़ाया जा सकता है । - 30 मिनट के लिए ३७ डिग्री सेल्सियस पर 10 मिलीग्राम/एमएल RNase एक, भंवर, और मशीन के 1 µ एल जोड़ें ।
- ६० मिनट के लिए ५५ डिग्री सेल्सियस पर 15 मिलीग्राम/एमएल proteinase कश्मीर, भंवर, और मशीन के ६.५ µ एल जोड़ें ।
- एक डीएनए कम बाध्यकारी ट्यूब के लिए प्रतिक्रिया स्थानांतरण, 5 मिलीग्राम/एमएल ग्लाइकोजन, और भंवर के 4 µ एल जोड़ें । फिर, phenol/क्लोरोफॉर्म/isoamyl शराब (25:24:1) के २०० µ एल जोड़ें और कमरे के तापमान पर १८,००० x जी में 5 मिनट के लिए केंद्रापसारक ।
- एक नया डीएनए कम बाध्यकारी ट्यूब करने के लिए supernatant स्थानांतरण । Tris-EDTA-NaCl बफर के २०० µ एल जोड़ें (10 मिमी Tris-एचसीएल (पीएच ८.०), 1 मिमी EDTA (पीएच ८.०), और २०० मिमी NaCl) शेष phenol के लिए/क्लोरोफॉर्म/isoamyl शराब समाधान और 5 मिनट के लिए केंद्रापसारक कमरे के तापमान पर १८,००० x जी में । supernatant को पहले supernatant के साथ मिला लीजिए ।
- बर्फ के ९०० µ एल जोड़ें-ठंड इथेनॉल और 1 ज के लिए मशीन-20 डिग्री सेल्सियस ।
नोट: यह मशीन 4-6 ज करने के लिए बढ़ाया जा सकता है । - 4 डिग्री सेल्सियस पर १८,००० x g पर 30 मिनट के लिए केंद्रापसारक ।
- supernatant को त्यागें । बर्फ की 1 मिलीलीटर-ठंडा गोली को ७५% इथेनॉल जोड़ें और 4 डिग्री सेल्सियस पर १८,००० x g पर 30 मिनट के लिए केंद्रापसारक । इस चरण को दोहराएँ (कुल में दो बहाकर).
- कमरे के तापमान पर 1 मिनट के लिए supernatant अच्छी तरह से और हवा सूखी त्यागें ।
- जोड़ें ५० µ एल के Tris-EDTA (ते) बफर और यह कमरे के तापमान पर 30 मिनट के लिए या 4 डिग्री सेल्सियस रात भर में यह मशीन द्वारा डीएनए भंग । भंवर या pipetting से बचें । "इनपुट" के रूप में इस डीएनए रखें और यदि आवश्यक हो तो पुस्तकालय की तैयारी के लिए इसका इस्तेमाल करते हैं ।
- एक fluorometer के साथ डीएनए एकाग्रता उपाय निर्माता के निर्देश के अनुसार ( सामग्री की तालिका देखें) और एक microfluidic ट्रो मशीन के साथ आकार वितरण की जांच (देखें प्रतिनिधि आंकड़ा में दिखाया डेटा 2a). इस परख के लिए 10 एनजी या कम डीएनए का प्रयोग करें ।
नोट: 100 के टुकड़े-500 आधार जोड़े (बीपी) डीएनए के ५०% या अधिक करना चाहिए ।
5. विरोधी फ्लैग एंटीबॉडी द्वारा अपनत्व शुद्धि
नोट: के लिए ंयूरॉन tChIP-Seq, मस्तिष्क के ऊतकों से 8 चूहों आमतौर पर tChIP के एक नमूने के लिए उपयोग किया जाता है-Seq तैयार करने के लिए 2 द्वारा शुद्ध डीएनए के एनजी मिलकर प्रतिरक्षा-शुद्धि (७.१ कदम देखें) । हमारे हाथ में, ०.१ डीएनए के एनजी अभी भी चिप के लिए उच्च गुणवत्ता वाले डीएनए पुस्तकालयों प्रदान-Seq (Kadota, अप्रकाशित) । इस प्रकार, सिद्धांत रूप में, एक ही माउस को ंयूरॉन tChIP-Seq प्रदर्शन पर्याप्त हो सकता है । आवश्यक राशि ऊतक और ब्याज की कोशिका प्रकार के लिए अनुकूलित किया जाना चाहिए । imumuno-शुद्धि प्रयोग के नकारात्मक नियंत्रण के लिए बिना किसी H2B-फ्लैग एक्सप्रेशन के चूहों से ब्रेन टिशू lysate तैयार और इस्तेमाल किया जाना चाहिए ।
- पिपेट २०० चुंबकीय मोतियों की µ एल संयुग्मित भेड़ विरोधी माउस immunoglobulin जी (आईजीजी) एक प्रोटीन कम बाध्यकारी ट्यूब में ।
- एक चुंबकीय स्टैंड पर ट्यूब प्लेस और supernatant के लिए 1 मिनट के लिए प्रतीक्षा करने के लिए स्पष्ट हो । supernatant को छोड़ें, बर्फ के 1 मिलीलीटर-ठंडे पंजाबियों, और भंवर जोड़ें । इस चरण को दोहराएँ (कुल में दो बहाकर).
- 1 मिलीग्राम/मिलीलीटर विरोधी झंडा एंटीबॉडी के 20 µ एल जोड़ें और 4 डिग्री सेल्सियस पर 5 घंटे के लिए बारी ।
नोट: यह गर्मी रात भर के लिए बढ़ाया जा सकता है । - चरण ५.२ के बाद मोती धो लें । एक 15 मिलीलीटर ट्यूब में मोतियों की जगह ।
- RIPA बफर के १११० µ एल में मोती resuspend और फिर 10x अवरुद्ध एजेंट के ९०० µ एल जोड़ने के लिए, 50x Denhardt के समाधान के १८० µ एल, µ के 10 100x के एल, और चरण 3 में तैयार lysate के ६.८ मिलीलीटर । इस मिश्रण को 5 प्रोटीन कम बाइंडिंग ट्यूबों में विभाजित करें । 4 ° c पर 6 घंटे के लिए घुमाएँ ।
नोट: यह गर्मी रात भर के लिए बढ़ाया जा सकता है । - चुंबकीय स्टैंड पर ट्यूब प्लेस और supernatant के लिए 1 मिनट के लिए प्रतीक्षा करने के लिए स्पष्ट हो गया है । supernatant को छोड़ें, RIPA बफ़र की 1 मिलीलीटर जोड़ें, और धीरे से मिलाएं । इस चरण को दोहराएँ 5 बार (कुल में 6 बहाकर). एक एकल प्रोटीन कम बाध्यकारी ट्यूब में सभी मोती पूल ।
- चिप रेफरेंस बफर के २०० µ एल जोड़ें और कमरे के तापमान पर 15 मिनट के लिए घुमाएगी । डीएनए की गुणवत्ता की जांच के रूप में चरण ४.११ में वर्णित (देखें प्रतिनिधि आंकड़ा b और Cमें दिखाया गया डेटा) । तुरंत अगले चरण पर आगे बढ़ें ।
6. विरोधी H3K4me3 एंटीबॉडी और रिवर्स Crosslinking द्वारा अपनत्व शुद्धि
नोट: निंनलिखित मनका तैयारी कदम (6.1 – 6.4) ५.७ कदम से पहले किया जाना चाहिए ।
- पिपेट ४० एक 2 मिलीलीटर प्रोटीन कम बाध्यकारी ट्यूब में भेड़ विरोधी माउस आईजीजी को संयुग्मित चुंबकीय मोतियों की µ एल ।
- चुंबकीय स्टैंड पर ट्यूब प्लेस और supernatant के लिए 1 मिनट के लिए प्रतीक्षा करने के लिए स्पष्ट हो गया है । supernatant को छोड़ दें, बर्फ के 1 मिलीलीटर-ठंडे पंजाबियों जोड़ें, और धीरे से मिश्रण । इस चरण को दोहराएँ (कुल में दो बहाकर).
- 1 मिलीग्राम/एमएल एंटी H3K4me3 एंटीबॉडी के 4 µ एल जोड़ें और 4 ° c पर 6 घंटे के लिए घुमाएँ ।
- चरण ६.२ के बाद मोती धो लें । एक 2 मिलीलीटर प्रोटीन कम बाध्यकारी ट्यूब में मोती प्लेस ।
- RIPA बफर के १५५८ µ एल में मोती resuspend और फिर २०० µ एल जोड़ने के 10x ब्लॉकिंग रिएजेंट, ४० µ एल के 50x Denhardt समाधान, 2 µ के एल 100x का टीज़र कॉकटेल, और २०० µ चरण ५.७ में तैयार की एल eluate । 4 ° c पर रात भर घुमाएं ।
नोट: चिप रेफरेंस बफर में एसडीएस इस मशीन में 10 से अधिक बार पतला था । - चुंबकीय स्टैंड पर ट्यूब प्लेस और supernatant के लिए 1 मिनट के लिए प्रतीक्षा करने के लिए स्पष्ट हो गया है । supernatant को छोड़ें, RIPA बफ़र की 1 मिलीलीटर जोड़ें, और धीरे से मिलाएं । इस चरण को 4 बार दोहराएं (कुल में 5 बहाकर) । पिछले धोने के बाद, एक डीएनए कम बाध्यकारी ट्यूब में मोती स्थानांतरण, और supernatant त्यागें ।
- चिप रेफरेंस बफर के २०० µ एल जोड़ें और कमरे के तापमान पर 15 मिनट के लिए घुमाएगी । eluate को एक नए DNA कम bindingTube पर ट्रांसफर करें ।
नोट: eluate-८० ° c पर संग्रहित किया जा सकता है । - डीएनए के decrosslinking के लिए चरण 4 का पालन करें । के 20 µ में शुद्ध डीएनए resuspend ते बफर की l.
- चरण ४.११ में बताए गए अनुसार डीएनए की गुणवत्ता की जांच करें ( चित्र 2dमें दिखाया गया प्रतिनिधि डेटा देखें) । वैकल्पिक मात्रात्मक पीसीआर द्वारा संवर्धन विश्लेषण प्रदर्शन के रूप में पहले वर्णित2। दस गुना या अधिक से अधिक संवर्धन मनाया जाना चाहिए ।
7. पुस्तकालय निर्माण
- प्रत्येक इनपुट और चिप डीएनए नमूने के लिए, microfluidic ट्रो मशीन के लिए सॉफ्टवेयर के धब्बा विश्लेषण समारोह का उपयोग 100-500-बीपी क्षेत्र में डीएनए के अनुपात की गणना । 100-500 बीपी डीएनए के 2 एनजी प्राप्त करने के लिए आवश्यक नमूना मात्रा का अनुमान लगाएं । "इनपुट" नमूना के रूप में 100-500-bp श्रेणी में 20 एनजी डीएनए का उपयोग करें ।
- 8 पट्टी पीसीआर ट्यूबों में पिपेट डीएनए नमूने और 10 µ एल के लिए कुल मात्रा लाने के लिए एच2ओ जोड़ें (वैकल्पिक) यदि डीएनए की मात्रा 10 µ एल से अधिक है, आनुपातिक स्केल-अप निम्न अंत मरम्मत प्रतिक्रिया और आकार चयन.
- अंतिम-मरंमत मास्टर मिक्स तैयार ( सामग्री की तालिकादेखें) । डीएनए के लिए अंत की मरंमत मास्टर मिश्रण के 4 µ एल जोड़ें और 20 डिग्री सेल्सियस पर 30 मिनट के लिए मशीन ।
- 10 मिमी Tris-सीएल, पीएच ८.५ और 0.6 x मात्रा (30 µ एल) के ठोस चरण प्रतिवर्ती स्थिरीकरण (SPRI) चुंबकीय मोती के ३६ µ एल जोड़ें और कमरे के तापमान पर 5 मिनट के लिए मशीन ।
- एक चुंबकीय स्टैंड पर ट्यूब प्लेस और supernatant जब तक इंतजार स्पष्ट हो जाता है ।
- एक नई ट्यूब के लिए supernatant स्थानांतरण, 1.2 x मात्रा (६० µ l) SPRI चुंबकीय मोतियों की जोड़ें, और कमरे के तापमान पर 5 मिनट की मशीन ।
- एक चुंबकीय स्टैंड पर ट्यूब प्लेस और supernatant जब तक इंतजार स्पष्ट हो जाता है ।
- ८०% ेतोः के २०० µ एल के साथ दो बार मोतियों को धो लो, अभी भी चुंबक पर ट्यूब पकड़े ।
- संक्षेप में ट्यूब के तल पर अवशिष्ट ेतोः इकट्ठा करने के लिए और यह चुंबक पर वापस जगह । अवशिष्ट ेतोः को अच्छी तरह से निकाल लें ।
- ेतोः भाप से मुक्त करने के लिए अनुमति देने के लिए ट्यूब ढक्कन 1-2 मिनट के लिए खुला छोड़ दें ।
- ढक्कन बंद करें और बर्फ पर ट्यूब रखें ।
नोट: अब आप आकार प्राप्त किया है-चयनित डीएनए के 100-500 के मोतियों पर बीपी. डबल आकार चयन के बारे में अधिक जानकारी के निर्माता की वेबसाइट पर पाया जा सकता है (www.beckman.com) । - एक-पूंछ मास्टर मिश्रण तैयार ( सामग्री की तालिकादेखें) ।
- एक-पूंछ मास्टर मिश्रण और 30 डिग्री सेल्सियस पर 30 मिनट के लिए गर्मी के 10 µ एल के साथ (७.१० कदम से) मोतियों को फिर से स्थगित ।
- जोड़ें 1.8 एक्स मात्रा (18 µ एल) की पॉलीथीन ग्लाइकोल (खूंटी)/NaCl समाधान और कमरे के तापमान पर 5 मिनट के लिए मशीन ।
- चरणों का पालन करें 7.7-7.11 डीएनए शुद्ध करने के लिए ।
- बंधाव बफर मिश्रण तैयार ( सामग्री की तालिकादेखें) ।
- पिपेट 8 µ एल बंधाव बफर मिश्रण के मोतियों पर (७.१४ कदम से), 1 µ एम अनुकूलक के 1 µ एल जोड़ने के लिए, और मोतियों resuspend । इनपुट नमूने के लिए 5 µ m एडेप्टर का 1 µ l का उपयोग करें । मल्टीप्लेक्स के लिए प्रत्येक नमूने के लिए अलग एडेप्टर का उपयोग करने पर विचार करें ।
- डीएनए Ligase के 1 µ एल जोड़ें और 20 डिग्री सेल्सियस पर 15 मिनट के लिए मशीन ।
- जोड़ें 1.0 x मात्रा (10 µ एल) के खूंटी/NaCl समाधान, मोतियों resuspend, और कमरे के तापमान पर 5 मिनट के लिए मशीन ।
- चरण 7.7-7.10 डीएनए शुद्ध करने के लिए का पालन करें ।
- 10 मिमी Tris के 25 µ एल पिपेट-सीएल, ट्यूब में पीएच ८.५ और मोतियों को फिर से सस्पेंड ।
- जोड़ें 1.0 x मात्रा (25 µ l) के खूंटी/NaCl समाधान और कमरे के तापमान पर 5 मिनट के लिए मशीन ।
- चरण 7.7-7.10 डीएनए शुद्ध करने के लिए का पालन करें ।
- पिपेट 11 µ एल के 10 मिमी Tris-सीएल, पीएच ८.५ ट्यूब में और मोतियों को पुनः निलंबित ।
- एक चुंबकीय स्टैंड पर ट्यूब प्लेस और supernatant जब तक इंतजार स्पष्ट हो जाता है ।
- एक नई 8 पट्टी पीसीआर ट्यूब में supernatant लीजिए ।
- वास्तविक समय पीसीआर मास्टर मिश्रण तैयार (विवरण के लिए सामग्री देखें) ।
- पिपेट ८.५ एक ३८४-well मात्रात्मक पीसीआर (qPCR) प्लेट में वास्तविक समय पीसीआर मास्टर मिक्स की µ एल और अनुकूलक ligated डीएनए के १.५ µ एल जोड़ें (से कदम ७.२६) ।
- पिपेट खाली कुओं में प्रत्येक फ्लोरोसेंट मानक के 10 µ एल ।
- निंनलिखित programm के साथ वास्तविक समय पीसीआर प्रदर्शन: (४५ s के लिए ९८ ° c) x 1 चक्र, (९८ ° c के लिए 15 s, ६० ° c 30 s के लिए, ७२ ° c 30 s के लिए) x 20 चक्र, और (७२ ° c ६० s के लिए) x 1 चक्र ।
- प्रतिदीप्ति फ्लोरोसेंट मानक 2 की तीव्रता तक पहुंचने के लिए आवश्यक पीसीआर चक्र की संख्या का निर्धारण ।
- पीसीआर मास्टर मिक्स ( सामग्री की तालिकादेखें) तैयार करते हैं ।
- पिपेट ११.५ पीसीआर मास्टर मिश्रण की µ l शेष एडाप्टर में-ligated डीएनए (चरण ७.२६ से) और पीसीआर चरण ७.३१ में निर्धारित पीसीआर चक्र के साथ चरण ७.३० में संकेत के रूप में करते हैं ।
- 1.0 x volume (20 µ l) खूंटी/NaCl समाधान और कमरे के तापमान पर 5 मिनट के लिए मशीन जोड़ें ।
- चरण 7.7-7.10 डीएनए शुद्ध करने के लिए का पालन करें ।
- पिपेट 20 µ एल के 10 मिमी Tris-सीएल, पीएच ८.५ ट्यूब में और मोतियों को पुनः निलंबित ।
- एक चुंबकीय स्टैंड पर ट्यूब प्लेस और supernatant जब तक इंतजार स्पष्ट हो जाता है ।
- एक नया १.५ मिलीलीटर-डीएनए कम बाध्यकारी ट्यूब में supernatant लीजिए ।
- चरण ४.११ में वर्णित लायब्रेरी की गुणवत्ता की जांच करें ( चित्र 2E और Fमें दिखाए गए प्रतिनिधि डेटा देखें) । पुस्तकालय डीएनए नमूने के 1 µ एल का उपयोग करें । वैकल्पिक qPCR द्वारा संवर्धन विश्लेषण प्रदर्शन के रूप में पहले 2वर्णित है । दस गुना या अधिक से अधिक संवर्धन मनाया जाना चाहिए ।
8. अनुक्रमण
- अनुक्रम एक अगली पीढ़ी sequencer में पुस्तकालयों ( चित्र 3में दिखाया गया प्रतिनिधि डेटा देखें).
नोट: अनुक्रम डेटा विश्लेषण के लिए पर्याप्त गहराई जीव3के जीनोम के आकार के आधार पर भिंन होगा । मानव और माउस के लिए, हम कम से 20-40 मिलियन एकल अंत प्राप्त करने की सिफारिश पढ़ता है । पढ़ता की उपज के अनुसार, मल्टीप्लेक्स लागत प्रभावी हो सकता है ।
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Representative Results
यहां, हम ऊतक विच्छेदन, निर्धारण, सेल lysis, क्रोमेटिन के मिलकर शुद्धि, और अगली पीढ़ी के sequencers के लिए डीएनए पुस्तकालय तैयारी का वर्णन । प्रक्रियाओं के दौरान, एक डीएनए है, जो सफल अनुक्रमण के लिए महत्वपूर्ण है की गुणवत्ता का परीक्षण कर सकते हैं, कई चरणों में (चित्रा 2). के बाद से एक एकल nucleosome आम तौर पर १४७ बीपी डीएनए 4से घिरा हुआ है, बाल काटना डीएनए कि आकार से कम नहीं होना चाहिए । तुरंत अल्ट्रासोनिकेशन के बाद, डीएनए अलग और एक microfluidic ट्रो मशीन (चित्रा 2a) पर चला गया था । हमारे सबसे अच्छा आकार सीमा का अनुकूलन प्रयासों के बावजूद, हम अभी भी डीएनए की आबादी थी (लगभग 2 kbp) कि unshearी बनी रही । इस कदम पर 100-500 बीपी से लेकर डीएनए के अंश की आबादी का ५०% या उससे अधिक होना चाहिए । विरोधी द्वारा अपनत्व शोधन के बाद झंडा एंटीबॉडी (चित्रा 2 बी) और फिर विरोधी H3K4me3 एंटीबॉडी (चित्रा 2d), अलग डीएनए की गुणवत्ता फिर से जांच की गई microfluidic ट्रो मशीन का उपयोग कर, और डीएनए की राशि से लेकर 100-500 बीपी का अनुमान था । यद्यपि हम अक्सर इस कदम पर 2 kbp टुकड़े की दिशा में एक मजबूत पूर्वाग्रह मनाया, SPRI चुंबकीय मोतियों द्वारा आकार चयन डबल इस अंश हटा दिया ।
H2B पर डीएनए के प्रतिरक्षा-शुद्धिकरण की विशिष्टता-ध्वजा को नकारात्मक नियंत्रण नमूनों से पुष्ट किया गया, जिसमें H2B-ध्वज अभिव्यक्ति के बिना चूहों से मस्तिष्क lysate का प्रयोग किया गया (चित्रा 2c). हम आम तौर पर नकारात्मक नियंत्रण के नमूनों से डीएनए की नगण्य मात्रा का पता चला ।
A-पुच्छ, एडेप्टर बंधाव, और पीसीआर के बाद, sequencing लायब्रेरी की गुणवत्ता (आरेख 2E) सत्यापित किया गया था । सामान्यतया, 250-600 bp डीएनए प्राप्त किया गया था । सफल नियमित चिप और tChIP qPCR2 GAPDH जीन (चित्रा 2F) के प्रवर्तक क्षेत्र लक्ष्यीकरण का उपयोग कर के साथ संवर्धन विश्लेषण द्वारा सबूत थे ।
प्रतिनिधि के साथ पढ़ा वितरण ंयूरॉन जीन (Camk2a, Slc17a7, और Gria1) द्वारा जीनोम-ब्राउज़र चित्रा 3में दिखाया गया है । पूरे मस्तिष्क tChIP-Seq पर tChIP-Seq द्वारा जीन की 5 ' अंत में पढ़ता है की समृद्ध को मनाया गया ।
चित्रा 1: tChIP-Seq के योजनाबद्ध प्रतिनिधित्व । यह आंकड़ा मिळो, एम. एट अलसे संशोधित किया गया है । 1. कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।
चित्रा 2: डीएनए गुणवत्ता की जांच करें । (A, B, D, and E) Electropherogram कतरनी क्रोमेटिन डीएनए के लिए एक microfluidic ट्रो मशीन का उपयोग कर प्राप्त (ए), डीएनए विरोधी झंडा एंटीबॉडी के साथ शुद्ध (ख) और फिर विरोधी H3K4me3 एंटीबॉडी (सी), और अंतिम पुस्तकालय (डी) । हरी और बैंगनी संख्याओं के साथ हाइलाइट की गई चोटियों में आंतरिक आकार मानकों का प्रतिनिधित्व है । नीली डैश्ड रेखाएं बहाव विश्लेषण के लिए माने जाने वाले डीएनए आकार क्षेत्रों को इंगित करती हैं । फू: प्रतिदीप्ति इकाइयों ।
(ग) विरोधी ध्वज प्रतिरक्षा-शुद्धि द्वारा बरामद डीएनए की मात्रा. प्रत्येक बिंदु एक स्वतंत्र दोहराने का प्रतिनिधित्व करता है । (च) qPCR लक्ष्यीकरण GAPDH द्वारा संवर्धन विश्लेषण. प्रत्येक बिंदु एक स्वतंत्र दोहराने का प्रतिनिधित्व करता है । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।
चित्रा 3: ंयूरॉन tChIP में वितरण पढ़ें-Seq । (A-C) पढ़ें वितरण के साथ प्रतिनिधि ंयूरॉन जीन में ंयूरॉन tChIP-Seq और नियंत्रण पूरे मस्तिष्क tChIP-Seq दिखाया जाता है । RPM: प्रति लाख पढ़ता पढ़ता है । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।
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Discussion
हमारे प्रोटोकॉल माउस मस्तिष्क के ंयूरॉंस के लिए अनुकूलित किया गया था, जिसमें झंडा-टैग H2B की अभिव्यक्ति tamoxifen इंजेक्शन द्वारा प्रेरित है । प्रमोटरों H2B अभिव्यक्ति के लिए इस्तेमाल किया, ऊतक सामग्री शुरू करने, और ऊतकों की राशि सफल tChIP-Seq के लिए निर्णायक मापदंडों हैं । इस प्रकार, इन कारकों के अनुकूलन के हित के प्रत्येक कोशिका प्रकार के लिए विचार किया जाना चाहिए ।
इस प्रोटोकॉल में इस्तेमाल किया प्रक्रियाओं के बीच एक महत्वपूर्ण कदम डीएनए बाल काटना 100-500 बीपी5की एक क्रोमेटिन लंबाई प्राप्त करने के लिए है । सामान्य तौर पर, अल्ट्रासोनिक कदम के मानकीकरण चुनौतीपूर्ण है क्योंकि यह अत्यधिक कारकों की एक किस्म पर निर्भर करता है; निर्धारण की स्थिति, ऊतकों का इस्तेमाल किया, अल्ट्रा sonication के लिए इस्तेमाल उपकरण, और उपकरणों की स्थापना, दूसरों के बीच में । इसलिए, इस डीएनए कतरनी कदम के परीक्षण और त्रुटि अनुकूलन व्यक्तिगत प्रयोगों के लिए आवश्यक हो जाएगा । इसके बजाय अल्ट्रा sonication के, micrococcal nuclease उपचार एक nucleosome-आकार डीएनए को अलग करने के लिए एक विकल्प होना चाहिए, के रूप में भोली चिप विधि6में इस्तेमाल किया । हालांकि डीएनए के समरूप आकार वितरण आदर्श है, कतरनी DNAs कई आबादी दिखा सकते हैं, के रूप में चित्र 2aमें दिखाया गया है । SPRI चुंबकीय मोतियों की डबल आकार चयन, जैसा कि ऊपर वर्णित है, अब डीएनए टुकड़े के आकार को दूर करने में मदद करता है ।
आम तौर पर, पुस्तकालय की तैयारी 100-500 बीपी डीएनए के 1 एनजी की आवश्यकता है । इस आवश्यकता के आधार पर, हम न्यूरॉन्स के लिए मस्तिष्क के ऊतकों के प्रारंभिक सामग्री को बढ़ाया. हालांकि, इस प्रक्रिया दुर्लभ सेल प्रकार से अत्यंत छोटे नमूनों के लिए चुनौतीपूर्ण हो सकता है । ऐसे मामलों में, चिप जाहिर है, जो ligase के बजाय Tn5 transposase पर आधारित है और कम सामग्री7की आवश्यकता है, बेहतर विकल्प हो सकता है ।
फिर भी, इस वर्तमान प्रोटोकॉल सामग्री में प्रमुख कोशिका प्रकार तक ही सीमित है । हमारे हाथ में, लक्षित कोशिकाओं की मूल कोशिका जनसंख्या में 10% अधिभोग लक्ष्य कोशिकाओं1से क्रोमेटिन की साफ शुद्धि प्रदान की है । हालांकि, अगर और भी दुर्लभ कोशिका प्रकार लक्षित कर रहे हैं, तो epitope टैग द्वारा immunoprecipitation के महीन अनुकूलन गैर लक्षित कोशिकाओं से दूषित डीएनए से अलग डीएनए भेद वारंट किया जाएगा । डेटा विश्लेषण के सर्वोत्तम प्रथाओं के लिए, हम दृढ़ता से प्रयोग शुरू करने के लिए इस्तेमाल किया पूरे ऊतक से नियंत्रण tChIP-Seq विश्लेषण करने के लिए डेटा की तुलना की सिफारिश । जब से हम exogenously से महत्वपूर्ण पूर्वाग्रहों H2B-झंडा प्रोटीन व्यक्त पाया, विश्लेषण की तुलना में और संवर्धन द्वारा विश्लेषण किया जाना चाहिए (या घट)1पृष्ठभूमि के लिए । इस नियंत्रण के लिए, हम वास्तव में बैरे के साथ एक माउस लाइन बनाया H2B-झंडा (रोजाH2B-झंडा) और प्रदर्शन किया tChIP-Seq1। डेटा की एक अधिक विस्तृत व्याख्या पहले1पर चर्चा की गई है ।
हमारे विश्लेषण के आधार पर, H3K4me3 tChIP-Seq ंयूरॉंस से तुलनीय और/या आरएनए-Seq से FACS-सॉर्ट किए गए न्यूरॉन्स की तुलना में ज्ञात ंयूरॉन विशिष्ट जीन का बेहतर पता लगाने के लिए8 और अनुवाद ribosome संबध शुद्धि (TRAP)-Seq9. उदाहरण के लिए, ज्ञात axon/dendrite-स्थानीयकृत जीन कुशलतापूर्वक ंयूरॉन tChIP-Seq1का उपयोग कर बरामद किया गया । उल्लेखनीय है, हमारे tChIP-Seq प्रवर्तक-संबद्ध हिस्टोन चिह्न के लिए सीमित नहीं है, लेकिन यह भी अन्य विभिन्न हिस्टोन संशोधनों के लिए लागू है10 अगर एंटीबॉडी उपलब्ध हैं. इसके अलावा, टैग कोर हिस्टोन प्रोटीन द्वारा क्रोमेटिन अलग की रणनीति अंय मॉडल जीवों में इस्तेमाल किया जा सकता है । हालांकि यहां हम झंडा epitope इस्तेमाल के लिए कोर हिस्टोन प्रोटीन टैग, अंय टैग लागू किया जा सकता है । डीएनए के लिए formaldehyde निर्धारण के बाद से सबसे अधिक एक प्रोटीन11के lysine अवशेषों पर होता है, कई lysine के साथ एक टैग epitope टैगिंग द्वारा पूर्वाग्रहों को खत्म करने के लिए बचा जाना चाहिए । इस प्रकार, tChIP-Seq दृष्टिकोण epigenetic अध्ययन में संदर्भों के कई प्रकार के साथ विविध ऊतकों में बहुमुखी होना चाहिए ।
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Disclosures
लेखकों का खुलासा करने के लिए कुछ नहीं है ।
Acknowledgments
हम पांडुलिपि के महत्वपूर्ण पढ़ने के लिए Iwasaki लैब के सभी सदस्यों को धंयवाद । इस काम के भाग में एक अनुदान के द्वारा समर्थित किया गया था पर वैज्ञानिक अनुसंधान के लिए सहायता में अभिनव क्षेत्रों (#26113005 करने के लिए S.N. और JP17H05679 करने के लिए S.I.); युवा वैज्ञानिकों के लिए एक अनुदान में सहायता (ए) (JP17H04998 to S.I.) शिक्षा मंत्रालय से, विज्ञान, खेल, और जापान की संस्कृति (MEXT); और अग्रणी परियोजनाओं "सेलुलर विकास" और सभी आरआईकेईएन परियोजना "रोग और Epigenome" आरआईकेईएन से (S.N. और S.I. के लिए).
Materials
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Protein LoBind tube, 2 mL | Eppendorf | No. 0030108132 | For cell lysis |
Protein LoBind tube, 1.5 mL | Eppendorf | No. 0030108116 | For ChIP and library preparation |
DNA LoBind tube, 1.5 mL | Eppendorf | No. 0030108051 | For ChIP and library preparation |
8-strip PCR tube | BIO-BIK | 3247-00 | For ChIP and library preparation |
SK Mill | TOKKEN | SK-200 | Handy cryogenic grinder to make cell powder for fixation |
Metal bullet | TOKKEN | SK-100-DLC10 | Accessory of SK Mill |
2 mL stainless steel tube | TOKKEN | TK-AM5-SUS | An option for cell lysis |
2 mL stainless steel tube holder | TOKKEN | SK-100-TL | An option for cell lysis |
16% formaldehyde (w/v), methanol-free | Pierce | 28906 | To fix cells. Prepare 1% solution before use. |
Glycine | Nacalai Tesque | 17109-35 | Prepare 2.5 M stock |
D-PBS (-)(1x) | Nacalai Tesque | 14249-24 | For washing lysate and purified DNA |
HEPES | Nacalai Tesque | 02443-05 | For Lysis buffer 1. Prepare 1 M, pH 7.5 stock. |
5 M NaCl, molecular biology grade | Nacalai Tesque | 06900-14 | For Lysis buffer 1, Lysis buffer 2, ChIP Elution Buffer, and Tris-EDTA-NaCl Buffer |
0.5 M EDTA, molecular biology grade | Wako Pure Chemical Industries, Ltd. | 311-90075 | For Lysis buffer 1, Lysis buffer 2, ChIP Elution Buffer, and Tris-EDTA-NaCl Buffer |
Glycerol | Wako Pure Chemical Industries, Ltd. | 072-04945 | For lysis buffer 1 |
NP-40 | Nacalai Tesque | 25223-75 | For lysis buffer 1 |
Triton X-100, molecular biology grade | Nacalai Tesque | 12967-32 | For Lysis buffer 1 |
Tris | Nacalai Tesque | 35406-91 | For Lysis buffer 2, ChIP Elution Buffer, and Tris-EDTA-NaCl Buffer. Prepare 1 M, pH 8.0 stock. |
0.1 M EGTA pH neutral | Nacalai Tesque | 08947-35 | For Lysis Buffer 2 |
Protease inhibitor cocktail (100x) | Nacalai Tesque | 25955-24 | To block degradation of protein |
RIPA buffer | Thermo Fisher Scientific | 89900 | For cell lysis and washing |
milliTUBE 1 mL AFA Fiber | Covaris | 520130 | Sonicator tube. Accessory of Focused-ultrasonicator |
Focused-ultrasonicator | Covaris | S220 or E220 | To digest DNA into adequate size for ChIP-Seq |
UltraPure 10% SDS | Thermo Fisher Scientific | 15553-027 | For ChIP Elution Buffer |
RNase A | Nacalai Tesque | 30141-14 | To purify DNA from lysate |
Proteinase K, recombinant, PCR Grade | Sigma-Aldrich | 3115887001 | To purify DNA from lysate |
Ethanol | Wako Pure Chemical Industries, Ltd. | 054-07225 | Make 70% solution |
Monoclonal anti-FLAG M2 antibody produced in mouse | Sigma-Aldrich | F1804 | To purify chromatin expressed in cells of interest |
Dynabead M-280 Sheep Anti-Mouse IgG | Thermo Fisher Scientific | 11201D | This can be used for anti-FLAG IP and anti-H3K4me3 IP |
Anti-tri-methyl histone H3 (K4), mouse monoclonal antibody | Wako Pure Chemical Industries, Ltd. | 301-34811 | Any other antibody that works for ChIP analysis will work |
10x Blocking Reagent | Sigma-Aldrich | 11096176001 | For blocking during affinity purification |
Denhardt’s solution | Nacalai Tesque | 10727-74 | For blocking during affinity purification |
Glycogen (5 mg/ml) | Thermo Fisher Scientific | AM9510 | To purify DNA from lysate |
Qubit 2.0 Fluorometer | Thermo Fisher Scientific | Q32866 | For quantification of isolated DNA |
Qubit dsDNA HS Assay Kit | Thermo Fisher Scientific | Q32851 | For quantification of isolated DNA |
0.5 mL tube | Axygen | 10011-830 | For quantification by Qubit |
Phenol/chloroform/isoamyl alcohol (25:24:1) | Nacalai Tesque | 25970-56 | To purify DNA from lysate |
AMPure XP beads | Beckman Coulter | A63881 | SPRI magnetic beads for library preparation |
Metal ice rack | Funakoshi | IR-1 | To keep the cell lysate frozen |
Sample Cooler | New England Biolabs | T7771S | Helps fix cells with minimal damage |
2100 Bioanalyzer | Agilent Technologies | G2939BA | To check the quality of isolated DNA fragments. Another fragment analyzer can be used. |
Bioanalyzer 2100 Expert Software | Agilent Technologies | G2946CA | Supplied with the Bioanalyzer |
High Sensitivity DNA Kit | Agilent Technologies | 5067-4626 | To check the quality of the isolated DNA fragments |
KAPA LTP Library Preparation Kit | Roche | 07961898001 | Supplied with 10x KAPA End Repair Buffer, KAPA End Repair Enzyme Mix, KAPA A-Tailing Buffer, KAPA A-Tailing Enzyme, KAPA Ligation Buffer, KAPA DNA Ligase, and PEG/NaCl solution |
NEXTflex DNA Barcodes | BIOO Scientific | NOVA-514101 | Adapter for library preparation. Supplied with DNA Barcode Adapters and Primer Mix. |
KAPA Real-Time Library Amplification Kit | Roche | 07959028001 | Supplied with 2x KAPA HiFi HS real-time PCR Master Mix, PCR Primer Mix, and Fluorescent Standards |
2x KAPA HiFi HotStart ReadyMix | Roche | KM2602 | For library preparation. Additionally, this enzyme may be required for the KAPA Real-Time Library Amplification Kit |
Buffer EB | Qiagen | 19086 | 10 mM Tris-Cl, pH 8.5 for elution of DNA |
386-well qPCR plate | Thermo Fisher Scientific | 4309849 | For real-time PCR |
QuantStudio 7 Flex Real-Time PCR System | Thermo Fisher Scientific | 4485701 | To quantify DNA |
MicroAmp Optical Adhesive Film | Thermo Fisher Scientific | 4311971 | For real-time PCR |
MicroAmp Clear Adhesive Film | Thermo Fisher Scientific | 4306311 | For plate sealing |
End-repair master mix | Combine 1.4 µL of 10x KAPA End Repair Buffer, 1 µL of KAPA End Repair Enzyme Mix, and 1.6 µL of H2O | ||
A-taling master mix | Combine 1 µL of KAPA A-Tailing Buffer, 0.6 µL of KAPA A-Tailing Enzyme, and 8.4 µL of H2O | ||
Ligation buffer mix | Combine 2 µL of KAPA ligation buffer and 6 µL of H2O | ||
Real-time PCR master mix | Combine 5 µL of 2x KAPA HiFi HS real-time PCR Master Mix, 0.35 µL of PCR Primer Mix (10 µM each of forward primer AATGATACGGCGACCACCGAG and reverse primer CAAGCAGAAGACGGCATACGAG), and 3.15 µL of H2O | ||
PCR master mix | Combine 10 µL of 2x KAPA HiFi Ready Mix, 0.9 µL of PCR Primer Mix, and 0.6 µL of H2O | ||
Integrative Genomics Viewer | Broad Institute | IGV_2.3.88 | Genome browser to visualize sequencing data |
DNA olgionucleotide: 5′-GCCTACGCAGGTCTTGCTGAC-3′ | Eurofins Genomics | A primer to amplify the promoter region of GAPDH | |
DNA olgionucleotide: 5′-CGAGCGCTGACCTTGAGGTC-3′ | Eurofins Genomics | A primer to amplify the promoter region of GAPDH | |
SYBR Premix Ex Taq | Takara | RR420L | To quantify the DNA corresponding to the GADPH promoter region |
Thermal Cycler Dice | Takara | TP870 | To quantify the DNA corresponding to the GADPH promoter region |
References
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- Jung, Y. L., et al. Impact of sequencing depth in ChIP-seq experiments. Nucleic Acids Research. 42 (9), (2014).
- Becker, P. B., Workman, J. L. Nucleosome remodeling and epigenetics. Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 5 (9), a017905 (2013).
- Kidder, B. L., Zhao, K. Efficient library preparation for next-generation sequencing analysis of genome-wide epigenetic and transcriptional landscapes in embryonic stem cells. Methods in Molecular Biology. , 3-20 (2014).
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- Zhang, Y., et al. An RNA-sequencing transcriptome and splicing database of glia, neurons, and vascular cells of the cerebral cortex. Journal of Neuroscience. 34 (36), 11929-11947 (2014).
- Hornstein, N., et al. Ligation-free ribosome profiling of cell type-specific translation in the brain. Genome Biology. 17 (1), 149 (2016).
- Zhao, Y., Garcia, B. A. Comprehensive catalog of currently documented histone modifications. Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 7 (9), a025064 (2015).
- Hoffman, E. A., Frey, B. L., Smith, L. M., Auble, D. T. Formaldehyde crosslinking: a tool for the study of chromatin complexes. The Journal of Biological Chemistry. 290 (44), 26404-26411 (2015).