TChIP-Seq: Celle-Type-specifikke Epigenome profilering

Summary

Vi beskriver en trinvis protokol for tandem kromatin immunoprecipitation-sekventering (tChIP-FF.), der giver mulighed for analyse af celle-type-specifikke genome-wide Histon ændring.

Abstract

Epigenetiske regulering spiller centrale roller i genekspression. Da Histon ændring blev opdaget i 1960 ' erne, er dens fysiologiske og patologiske funktioner blevet grundigt undersøgt. Faktisk, fremkomsten af næste generations dybe sekvensering og kromatin immunoprecipitation (ChIP) via specifikke Histon ændring antistoffer har revolutioneret vores opfattelse af epigenetisk regulering på tværs af genomet. Omvendt, væv består typisk af forskellige celletyper, og deres komplekse blanding giver analytiske udfordringer til at undersøge epigenome i en bestemt celletype. For at løse den celle typespecifikke kromatin stat i en genome-wide måde, udviklet vi for nylig tandem kromatin immunoprecipitation sekventering (tChIP-FF.), som er baseret på en selektiv rensning af kromatin af mærket core Histon proteiner fra celle typer af interesse, efterfulgt af ChIP-FF. Målet med denne protokol er indførelsen af bedste praksis for tChIP-FF. Denne teknik giver et alsidigt værktøj til væv-specifikke epigenome undersøgelse i forskellige Histon ændringer og modelorganismer.

Introduction

Væv af dyr består af forskellige celletyper. RIBOREGULATION i hver celle definerer celletype. Kromatin ændringer - DNA methylering og Histon ændring - ligge til grund for celletype specificiteten af genekspression. Derfor, måling af epigenetisk regulering i hver celletype har været ønsket, men det har været en teknisk udfordring.

For at undersøge Epigenetik i en bestemt celletype, var tandem kromatin immunoprecipitation sekventering (tChIP-Seq) nyligt udviklede ()figur 1)¹. TChIP, er epitop-tagged core histoneprotein H2B udtrykt fra en celle-type-specifikke promotor. Denne funktion giver mulighed for isolation af chromatins fra cellerne i interesse, selv om materialet, der starter fra en blanding af forskellige celletyper. Følgende ChIP-FF. — kromatin rensning via en modificeret Histon mark og næste generations dybe sekventering af isoleret DNA — vi kan overvåge den målrettede celletype epigenetiske status i en genome-wide måde.

Brug af denne teknik, vi for nylig undersøgt neuron-specifik trimethylation af Histon H3 protein på lysin 4 (H3K4me3) mærker. I denne undersøgelse udviklede vi en knock-i mus i hvilken C-terminalt FLAG-tagged H2B protein blev udtrykt ved Cre-medieret rekombination (Rosa26^{CAG floxed-pA H2B-FLAG}). Ved krydsning med en mus, som besidder Cre-endoplasmic reticulum (ER) gen under for CamK2a kontrol, induceret linjen opnåede mus H2B-FLAG i aktive neuroner ved tamoxifen injektion (Camk2a^H2B-FLAG)¹. Startende fra hjernen af den etablerede mus linje, udførte vi tChIP-Seq med anti-H3K4me3 antistoffer. Da H3K4me3 mærker ofte svarer til initiativtageren regioner, kunne vi Opdag hundredvis af mRNAs specifikt udtrykt i neuroner¹.

Her, beskriver vi en typisk tChIP-Seq metode, der dækker skridt fra væv dissektion bibliotek konstruktion ()figur 1). Det endelige mål med denne protokol er at dele vores bedste praksis for udførelsen af tChIP-FF. og den fremtidige anvendelse af denne metode til andre celletyper og Histon ændringer.

Protocol

Alle metoder, der beskrives heri er blevet godkendt af sikkerhed division af RIKEN (H27-EP071) og udført med relevante retningslinjer og forordninger.

1. væv dissektion

1. Dissekere væv af interesse i små stykker (ca < 3 mm²) ved hjælp af fine foråret saks.
   Bemærk: Større væv fragmenter tage længere tid at fryse, og mindre stykker vil bære over større mængder af buffer, som begge kan påvirke resultaterne.
2. Tilføje dissekeret væv fragmenter til en ren beholder fyldt med flydende kvælstof og samle dem i 2 mL rør (1 stykke pr tube) fyldt med flydende kvælstof.
   Note: Rør med en hydrofil overflade anbefales til dette trin.
3. Sted rør ved-80 ° C for > 5 min med hætte åben til at fordampe de resterende flydende kvælstof.
   Bemærk: Efter lukning af fælles landbrugspolitik, væv fragmenter kan opbevares ved-80 ° C i en måned før brug.

2. celle fiksation

Bemærk: Vi brugte en handy kryogene grinder til dette trin. En alternativ apparater kan bruges.

1. Plads til 2 mL-protein lave bindende rør indeholdende vævsprøver på en metal is rack kølet i flydende kvælstof.
2. Placere en metal kugle i en 1,5 mL-rør og chill med flydende kvælstof. Placer den på metal is rack.
3. Åbn den 2 mL-rør og placere den prechilled metal kugle ind i røret. Luk hætten og sat 2-mL-rør i rør indehaveren af en handy kryogene grinder straks dyppe forsamlede tube indehaveren i flydende nitrogen for 1 min.
4. Indsæt indehaveren af frosne rør i den ydre kassette af handy kryogene vinkelsliberen og rystes kraftigt 60 gange for 30 s.
5. Adskille tube indehaveren, fjerne metal kugle og plads til 2 mL-rør på en stikprøve køligere prechilled ved-20 ° C.
6. Prøven anbringes køligere ved-20 ° C i 15 min at forhindre frysning af fiksativ i næste trin.
7. Bringe prøven køler til bænken, åbne låget af glasset, og straks drop 900 µL af 1% formaldehyd i det. Efter pipettering flere gange, overføres suspensionen i nyt 2 mL-rør indeholdende 900 µL af 1% formaldehyd og fix i 10 min med blide rotation i en inkubator, indstillet på 23 ° C.
   Forsigtig: Formaldehyd er giftige og skadelige.
8. For at stoppe optagelsen reaktion, tilføje 100 µL af 2,5 M Glycin til hver tube og centrifugeres i 5 min på 3.000 x g ved 4 ° C. Supernatanten.
9. Der tilsættes 1 mL iskold fosfatbufferet saltopløsning (PBS), centrifugeres i 5 min på 3.000 x g ved 4 ° C, og supernatanten. Gentag dette trin to gange (3 vasker i alt).
   Bemærk: Fast prøver kan være flash-frosset af flydende kvælstof og opbevares ved-80 ° C.
10. Tilsættes 500 µL af Lysis Buffer 1 (50 mM 4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic syre (HEPES)-KOH (pH 7,5), 140 mM NaCl, 1 mM ethylendiamintetra syre (EDTA) (pH 8.0), 10% w/v glycerol, 0,5% w/v NP-40, 0,25% w/v Triton X-100 og 0,1 x protease hæmmer cocktail) til pellet, afpipetteres flere gange, og Roter i 10 min. ved 4 ° C.
    Bemærk: Lysisbuffer 1 bør være filtreret og opbevares ved 4 ° C før brug.
11. Der centrifugeres i 5 min på 3.000 x g ved 4 ° C, og supernatanten.
12. Der tilsættes 1 mL af Lysis Buffer 2 (10 mM Tris-HCl (pH 8.0), 200 mM NaCl, 1 mM EDTA (pH 8.0), 0,5 mM EGTA, og 0,1 x protease hæmmer cocktail) til pellet, vortex, og Roter i 10 min. ved 4 ° C.
    Bemærk: Lysisbuffer 2 bør være filtreret og opbevares ved 4 ° C før brug.
13. Der centrifugeres i 5 min på 3.000 x g ved 4 ° C, og supernatanten.
14. Tilføje 800 µL af radioimmunoprecipitation-analysebuffer (RIPA) med 1 x protease hæmmer cocktail til pellet og resuspenderes af pipettering.
15. Der centrifugeres i 5 min på 3.000 x g ved 4 ° C, og supernatanten.
16. Tilsættes 500 µL af RIPA buffer med 1 x protease hæmmer cocktail.
17. Der centrifugeres i 5 min på 3.000 x g ved 4 ° C, og supernatanten.
18. Der tilsættes 1 mL af RIPA buffer med 1 x protease hæmmer cocktail. Straks gå videre til næste trin.

3. kromatin klipning

1. Overførsel af lysate til en sonikator rør og Læg røret på en ultrasonicator.
2. Vride kromatin med følgende indstillinger: temperatur: 4 ° C; spidseffekt hændelse: 175 W; pligt faktor: 10%; cykler/burst: 200; og tid: 2.400 s.
3. Overføre prøven til et 1,5 mL-protein lave bindende tube og centrifugeres i 5 min på 20.000 x g ved 4 ° C.
4. Indsamle supernatanten ind i et nyt protein lave bindende rør.
   Bemærk: Prøven kan være flash-frosset i flydende nitrogen og opbevares ved-80 ° C.

4. kvalitet check af DNA (Reverse Crosslinking)

1. Mix 20 µL af den lysate og 180 µL af ChIP eluering Buffer (10 mM Tris-HCl (pH 8.0), 300 mM NaCl, 5 mM EDTA (pH 8,0) og 1% w/v natriumsulfat dodecylbenzensulfonsyremethylester (SDS)) i en polymerase kædereaktion (PCR) tube. Inkuber prøve ved 65 ° C i en termisk cycler for 6 h med termisk cycler låg åbent. Holde låget af den termiske cycler åbne til at undgå overdreven denaturering.
   Bemærk: ChIP eluering Buffer bør være filtreret og opbevares ved stuetemperatur før anvendelse. Denne inkubation kan udvides til natten.
2. Tilføj 1 µL af 10 mg/mL RNase A, vortex, og der inkuberes ved 37 ° C i 30 min.
3. Tilføje 6,5 µL af 15 mg/mL proteinase K, vortex, og der inkuberes ved 55 ° C i 60 min.
4. Overføre reaktion på et DNA lave bindende rør, tilføje 4 µL af 5 mg/mL glykogen og vortex. Derefter tilføje 200 µL chloroform-phenol-isoamyl alkohol (25:24:1) og centrifugeres i 5 min på 18.000 x g ved stuetemperatur.
5. Overføre supernatanten til en ny DNA lave bindende tube. Tilføje 200 µL af Tris-EDTA-NaCl buffer (10 mM Tris-HCl (pH 8.0), 1 mM EDTA (pH 8,0) og 200 mM NaCl) til de resterende fenol/chloroform/isoamyl alkoholopløsning og centrifugeres i 5 min på 18.000 x g ved stuetemperatur. Indsamle supernatanten og blandes med den første supernatanten.
6. Tilføje 900 µL af iskold ethanol og Inkuber i 1 time ved-20 ° C.
   Bemærk: Denne inkubation kan udvides til 4 - 6 h.
7. Der centrifugeres i 30 min. ved 18.000 x g ved 4 ° C.
8. Supernatanten. Tilsæt 1 mL iskold 75% ethanol til pellet og centrifugeres i 30 min. ved 18.000 x g ved 4 ° C. Gentag dette trin (to skylninger i alt).
9. Supernatanten grundigt og lufttørre i 1 minut ved stuetemperatur.
10. Tilsæt 50 µL af Tris-EDTA (TE) buffer og opløse DNA ved at inkubere det ved stuetemperatur i 30 min. eller ved 4 ° C natten over. Undgå vortexing eller pipettering. Holde denne DNA som "input" og bruge det til biblioteket forberedelse, hvis nødvendigt.
11. Måle DNA-koncentrationen med en fluorometer ifølge fabrikantens anvisninger (Se tabel af materialer) og kontrollere størrelse fordeling med en mikrofluid elektroforese maskine (Se repræsentative data vist i figur 2a). Brug 10 ng eller mindre DNA til dette assay.
    Bemærk: Fragmenter af 100-500 basepar (bp) bør udgør 50% eller mere af DNA.

5. affinitet rensning af anti-FLAG antistof

Bemærk: For neuron tChIP-FF., hjernen væv fra 8 mus bruges typisk til en stikprøve af tChIP-Seq for at forberede 2 ng af oprenset DNA af tandem immun-rensning (Se trin 7.1). I vores hænder, 0,1 ng af DNA stadig leveres høj kvalitet DNA biblioteker for ChIP-Seq (Kadota, upubliceret). Således, i teorien, et enkelt museklik kan være tilstrækkelige til at udføre neuron tChIP-FF. Det krævede beløb skal være optimeret til vævs- og typen af interesse. For den negative kontrol af imumuno-rensning eksperiment, bør hjernevæv lysate fra mus uden nogen H2B-FLAG udtryk fremstilles og anvendes.

1. Tilsæt 200 µL af de magnetiske perler konjugeret til får anti-mus immunoglobulin G (IgG) i et protein lave bindende rør.
2. Glasset anbringes på en magnetisk stå og vente på 1 min til supernatanten at blive klar. Supernatanten, tilsættes 1 mL iskold PBS og vortex. Gentag dette trin (to skylninger i alt).
3. Tilføj 20 µL 1 mg/mL anti-FLAG antistof og rotere for 5 h ved 4 ° C.
   Bemærk: Denne inkubation kan udvides til natten.
4. Vaske perlerne efter trin 5.2. Læg perlerne i en 15 mL tube.
5. Resuspend perlerne i 1110 µL af RIPA buffer og derefter tilføje 900 µL af 10 x blokering reagens, 180 µL af 50 x Denhardts løsning, 10 µL af 100 x protease hæmmer cocktail og 6,8 mL af den lysate udarbejdet i trin 3. Opdele denne blanding i 5 protein lave bindende rør. Rotere i 6 timer ved 4 ° C.
   Bemærk: Denne inkubation kan udvides til natten.
6. Placer røret på den magnetiske stå og vente på 1 min til supernatanten at blive klar. Supernatanten, tilsættes 1 mL af RIPA buffer, og bland forsigtigt. Gentag dette trin 5 gange (6 vasker i alt). Samle alle perlerne i en enkelt protein lave bindende tube.
7. Tilføje 200 µL af ChIP eluering Buffer og rotere i 15 min. ved stuetemperatur. Kontrollere kvaliteten af DNA, som beskrevet i trin 4.11 (Se repræsentative data vist i figur 2B og C). Straks gå videre til næste trin.

6. affinitet rensning af Anti-H3K4me3 antistoffer og omvendt Crosslinking

Bemærk: Den følgende perle forberedelse trin (6.1-6.4) bør udføres før trin 5.7.

1. Der afpipetteres 40 µL af magnetiske perler konjugeret til får anti-mus IgG i et 2 mL-protein lave bindende rør.
2. Placer røret på den magnetiske stå og vente på 1 min til supernatanten at blive klar. Supernatanten, tilsættes 1 mL iskold PBS, og bland forsigtigt. Gentag dette trin (to skylninger i alt).
3. Tilføj 4 µL af 1 mg/mL anti-H3K4me3 antistoffer og rotere i 6 timer ved 4 ° C.
4. Vaske perlerne efter trin 6.2. Læg perlerne i en 2 mL-protein lave bindende tube.
5. Resuspend perlerne i 1558 µL af RIPA buffer og derefter tilføje 200 µL af 10 x blokering reagens, 40 µL af 50 x Denhardts løsning, 2 µL af 100 x protease hæmmer cocktail og 200 µL af eluatet forberedt i trin 5.7. Rotere natten over ved 4 ° C.
   Bemærk: SDS i ChIP eluering buffer var fortyndet mere end 10 gange i denne inkubation.
6. Placer røret på den magnetiske stå og vente på 1 min til supernatanten at blive klar. Supernatanten, tilsættes 1 mL af RIPA buffer, og bland forsigtigt. Gentag dette trin 4 gange (5 vasker i alt). Efter den sidste vask, overføre perlerne i en DNA lave bindende rør, og supernatanten.
7. Tilføje 200 µL af ChIP eluering Buffer og rotere i 15 min. ved stuetemperatur. Overføre eluatet til en ny DNA lav bindingTube.
   Bemærk: Eluatet kan opbevares ved-80 ° C.
8. Følg trin 4 for decrosslinking af DNA. Resuspend oprenset DNA i 20 µL af TE buffer.
9. Kontrollere kvaliteten af DNA, som beskrevet i trin 4.11 (Se repræsentative data vist i figur 2D). (valgfrit) Udføre berigelse analyse af kvantitativ PCR som beskrevet tidligere². Billeddetaljerne eller større berigelse skal overholdes.

7. bibliotek opbygning

1. For hvert input og ChIP DNA-prøve, beregnes andelen af DNA i regionen 100-500-bp bruger funktionen smøre analyse af softwaren for mikrofluid elektroforese maskine. Anslå den sample volumen kræves for at opnå 2 ng af 100-500 bp DNA. Bruge 20 ng DNA i området 100-500-bp som eksemplet "input".
2. Afpipetteres DNA-prøver i 8-strip PCR rør og tilføje H₂O at bringe den samlede mængde til 10 µL. (valgfrit) Hvis DNA, overstiger 10 µL, forholdsmæssigt skala-up følgende reaktion ved udgangen-reparation og størrelse udvælgelse.
3. Forberede ende-reparation master mix (Se Tabel af materialer). Tilføj 4 µL af ende-reparation master mix til DNA og Inkuber i 30 min. ved 20 ° C.
4. Tilføje 36 µL af 10 mM Tris-Cl, pH 8,5 og 0,6 x volumen (30 µL) af fast fase reversible immobilisering (SPRI) magnetiske perler og Inkuber i 5 min ved stuetemperatur.
5. Røret anbringes på en magnetisk stå og vente, indtil supernatanten bliver klart.
6. Overføre supernatanten til en ny tube, tilføje 1,2 x diskenheder (60 µL) af SPRI magnetisk perler, og Inkuber 5 min ved stuetemperatur.
7. Røret anbringes på en magnetisk stå og vente, indtil supernatanten bliver klart.
8. Vaske perlerne to gange med 200 µL 80% EtOH, holde røret stadig på magneten.
9. Kort centrifugeres i røret for at indsamle de resterende EtOH i bunden og læg den tilbage på magneten. Fjern de resterende EtOH grundigt.
10. Forlade tube låget åbent for 1-2 min til at tillade EtOH til at fordampe.
11. Luk låget og holde røret på is.
    Bemærk: Nu har du fået størrelse-udvalgte DNA af 100-500 bp på perlerne. Yderligere oplysninger om valg af dobbelt størrelse kan findes på producentens hjemmeside (www.beckman.com).
12. Forberede A-hale master mix (Se Tabel af materialer).
13. Resuspend perler (fra trin 7.10) med 10 µL af A-hale master mix og Inkuber i 30 min. ved 30 ° C.
14. Tilføje 1,8 x volumen (18 µL) med polyethylenglycol (PEG) / NaCl opløsning og inkuberes i 5 min ved stuetemperatur.
15. Følg trin 7,7-7.11 for at rense DNA.
16. Forberede ligatur buffer mix (Se Tabel af materialer).
17. Afpipetteres 8 µL af ligatur buffer mix på perler (fra trin 7.14) og tilføje 1 µL af 1 µM adapter resuspend perlerne. Brug 1 µL af 5 µM adapter for input prøven. Overvej at bruge forskellige adaptere for hver prøve for multiplexing.
18. Tilføj 1 µL af DNA Ligase og Inkuber i 15 min. ved 20 ° C.
19. Tilføje 1,0 x volumen (10 µL) PIND/NaCl-opløsning, resuspend perlerne og Inkuber i 5 min ved stuetemperatur.
20. Følg trin 7,7-7.10 for at rense DNA.
21. Med pipette overfoeres 25 µL af 10 mM Tris-Cl, pH 8,5 ind i røret og resuspend perlerne.
22. Tilføje 1,0 x rumfang (25 µL) PIND/NaCl-opløsning og inkuberes i 5 min ved stuetemperatur.
23. Følg trin 7,7-7.10 for at rense DNA.
24. Afpipetteres 11 µL af 10 mM Tris-Cl, pH 8,5 ind i røret og resuspend perlerne.
25. Røret anbringes på en magnetisk stå og vente, indtil supernatanten bliver klart.
26. Indsamle supernatanten ind i en ny 8-strip PCR rør.
27. Forberede real-time PCR master mix (Se materialer for detaljer).
28. Afpipetteres 8,5 µL af real-time PCR master mix i en 384-godt kvantitativ PCR (qPCR) plade og tilføje 1,5 µL af adapteren forbundet DNA (fra trin 7.26).
29. Tilsæt 10 µL af hver fluorescerende standard i tomme brønde.
30. Udfør real-time PCR med de følgende programm: (98 ° C til 45 s) x 1 cyklus, (98 ° C i 15 s, 60 ° C i 30 s, 72 ° C i 30 s) x 20 cyklusser, og (72 ° C i 60 s) x 1 cyklus.
31. Bestem antallet af PCR cyklusser skulle nå fluorescens-intensiteten af den fluorescerende Standard 2.
32. Forberede PCR master mix (Se Tabel af materialer).
33. Afpipetteres 11,5 µL PCR master mix i de resterende adapter-forbundet DNA (fra trin 7.26) og udføre PCR, som angivet i trin 7,30 med PCR cyklusser bestemmes i trin 7.31.
34. Tilføje 1,0 x rumfang (20 µL) PIND/NaCl-opløsning og inkuberes i 5 min ved stuetemperatur.
35. Følg trin 7,7-7.10 for at rense DNA.
36. Med pipette overfoeres 20 µL af 10 mM Tris-Cl, pH 8,5 ind i røret og resuspend perlerne.
37. Røret anbringes på en magnetisk stå og vente, indtil supernatanten bliver klart.
38. Indsamle supernatanten ind i en ny 1,5 mL-DNA lave bindende rør.
39. Kontrollere kvaliteten af biblioteket, som beskrevet i trin 4.11 (Se repræsentative data vist i figur 2E og F). Brug 1 µL af bibliotek DNA-prøve. (valgfrit) Udføre berigelse analyse af qPCR som beskrevet tidligere ². Billeddetaljerne eller større berigelse skal overholdes.

8. sekventering

1. Sekvens biblioteker i et næste-generations sequenceren (Se repræsentative data vist i figur 3).
   Bemærk: Sekvens dybde nok til dataanalyse vil variere afhængigt af genom størrelsen af organismens³. For mennesker og mus, anbefaler vi at opnå mindst 20-40 millioner single-ende læser. Ifølge udbytte af læser kan multiplexing være omkostningseffektiv.

Representative Results

Her beskriver vi væv dissektion, fiksering, celle lysis, tandem rensning af kromatin og DNA bibliotek forberedelse til næste generation sequencere. Under procedurerne, kan man teste kvaliteten af DNA, som er nøglen til vellykket sekvensering på flere trin (figur 2). Da en enkelt nucleosome er typisk omgivet af 147 bp DNA ⁴, bør afrevne DNA ikke være kortere end denne størrelse. Umiddelbart efter ultralydbehandling, blev DNA isoleret og køre på en mikrofluid elektroforese maskine (figur 2A). På trods af vores bedste indsats for at optimere størrelsesområde, havde vi stadig en befolkning af DNA (ca 2 kbp), forblev unsheared. På dette trin bør brøkdel af DNA spænder fra 100-500 bp 50% eller derover af befolkningen. Efter affinitet rensning af anti-FLAG antistof (figur 2B) og derefter anti-H3K4me3 antistof (figur 2D), blev kvaliteten af den isolerede DNA tjekket igen ved hjælp af mikrofluid elektroforese maskine, og mængden af DNA fra 100-500 bp blev anslået. Selv om vi ofte observeret en stærkere bias i retning af 2 kbp fragmenter på dette trin, fjernet dobbelt størrelse udvælgelse af SPRI magnetisk perler denne fraktion.

Specificiteten af immun-oprensning af DNA på H2B-FLAG blev bekræftet med de negative kontrolprøver, i hvilken lysate fra mus uden H2B-FLAG hjerne udtryk blev brugt (figur 2 c). Vi typisk opdaget ubetydelige mængder af DNA fra negative kontrolprøverne.

Efter A-hale, adapter ligatur og PCR, kvaliteten af sekventering bibliotek blev efterprøvet (figur 2E). Typisk 250-600 bp DNA blev opnået. Vellykket regelmæssig ChIP og tChIP blev dokumenteret af berigelse analyse med qPCR² ved hjælp af primere målretning promotor region af GAPDH gen (figur 2F).

Repræsentant læse distributioner langs neuron gener (Camk2a, Slc17a7 og Gria1) af genom-browser er vist i figur 3. Berigelse af læser for 5 ' enden af gener af neuron tChIP-Seq over hele hjernen tChIP-Seq blev observeret.

Figur 1: skematisk fremstilling af tChIP-FF. Dette tal er blevet ændret fra Mito, M. mfl. ¹. venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figur 2: DNA kvalitetstjek. (A, B, Dog E) Elektroferogrammet fremstillet ved hjælp af en mikrofluid elektroforese maskine for afrevne kromatin DNA (A), DNA renset med anti-FLAG antistof (B) og derefter anti-H3K4me3 antistof (C), og den endelige bibliotek (D). Toppene fremhævet med grøn og lilla tal repræsenterer interne størrelse standarder. Blå stiplede linjer angiver regionerne DNA størrelse anses for downstream analyse. FU: fluorescens enheder.
(C) mængden af DNA inddrives af anti-FLAG immun-rensning. Hvert punkt repræsenterer en uafhængig replikeres. (F) berigelse analyse af qPCR målretning GAPDH. Hvert punkt repræsenterer en uafhængig replikeres. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figur 3: Læs udlodninger i neuron tChIP-FF. (A-C) Læs distributioner langs repræsentative neuron gener i neuron tChIP-FF. og kontrol hele hjernen tChIP-Seq er vist. RPM: læser per million læser. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Discussion

Vores protokol var optimeret til neuroner i mus hjernen, som udtryk for FLAG-tagged H2B er foranlediget af tamoxifen injektion. Initiativtagere til H2B udtryk, væv råvarer og mængden af væv er afgørende parametre for vellykket tChIP-FF. Derfor, optimering af disse faktorer bør betragtes for hver celletype af interesse.

Et kritisk trin blandt de anvendte fremgangsmåder i denne protokol er DNA klipning for at opnå en kromatin længde på 100-500 bp⁵. I almindelighed, standardisering af trinnet ultralydbehandling udfordrende da det stærkt afhænger af en række faktorer; fiksering betingelser, væv bruges, udstyr anvendes til ultra-ultralydbehandling og udstyr indstilling, blandt andre. Trial-and-error optimering af dette DNA klipning trin vil derfor kræves for individuelle eksperimenter. Ultra-sonikering, skal micrococcal nukleasen behandling være en mulighed for at isolere enkelt nucleosome mellemstore DNA, som anvendes i den naive ChIP metode⁶. Selv om den homogen størrelse fordeling af DNA er ideelle, forskydes kan DNAs vise flere befolkninger, som vist i figur 2A. Dobbelt størrelse udvalg af Sprinkler magnetiske perler, som beskrevet ovenfor, hjælper med at fjerne den længere-størrelse af DNA-fragmenter.

Typisk, bibliotek forberedelse kræver 1 ng af 100-500 bp DNA. Baseret på dette krav, skaleret vi op det oprindelige materiale af hjernevæv til neuroner. Men denne procedure kan være udfordrende for meget små prøver fra sjældne celletyper. I sådanne tilfælde kan ChIP førelse, der er baseret på Tn5 transposase i stedet for ligase, og kræver mindre materiale⁷være bedre alternativ.

Denne aktuelle protokol er dog begrænset til de store celletyper i materialet. I vores hænder forudsat 10% belægning af målrettede celler i den oprindelige celle befolkning fair rensning af kromatin fra target celler¹. Dog hvis endnu mere sjældne celletyper er målrettet, vil derefter finere optimering af immunoprecipitation af epitop tag være berettiget til at skelne den isolerede DNA fra forurenede DNA fra ikke-målrettede celler. Bedste praksis for dataanalyse anbefales det kraftigt, sammenligne data til kontrol tChIP-Seq analyse fra hele væv bruges til at påbegynde eksperimentet. Da vi fandt væsentlige afvigelser fra eksogent udtrykt H2B-FLAG protein, bør analysen sammenlignet og analyseret af berigelse (eller udtynding) til baggrunden¹. For denne kontrol, vi faktisk oprettet en mus linje med allestedsnærværende udtrykt H2B-FLAG (Rosa^H2B-FLAG) og udført tChIP-Seq¹. En mere detaljeret fortolkning af data har været drøftet tidligere¹.

Baseret på vores analyse, H3K4me3 tChIP-Seq fra neuroner fastsat sammenlignelige og/eller bedre påvisning af kendte neuron-specifikke gener end RNA-Seq fra FACS-sorteret neuroner⁸ og oversætte ribosomet affinitet rensning (FÆLDE)-Seq⁹. For eksempel blev kendt axon/dendrit-lokaliseret gener effektivt genoprettet ved hjælp af neuron tChIP-Seq¹. Bemærkelsesværdigt, vores tChIP-Seq er ikke begrænset til varemærket promotor-associerede Histon men gælder også for andre forskellige Histon ændringer¹⁰ hvis antistofferne er til rådighed. Derudover kan strategi isolering kromatin af mærket core Histon proteiner bruges i andre modelorganismer. Selvom her vi brugt FLAG epitop tagge core histoneprotein, kan andre koder anvendes. Da formaldehyd fiksering til DNA opstår oftest på lysin rester af et protein¹¹, bør et tag med mange lysin undgås for at eliminere bias af epitop tagging. TChIP-Seq tilgang bør således alsidige i forskellige væv langs mange slags sammenhænge i epigenetiske undersøgelser.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Protein LoBind tube, 2 mL	Eppendorf	No. 0030108132	For cell lysis
Protein LoBind tube, 1.5 mL	Eppendorf	No. 0030108116	For ChIP and library preparation
DNA LoBind tube, 1.5 mL	Eppendorf	No. 0030108051	For ChIP and library preparation
8-strip PCR tube	BIO-BIK	3247-00	For ChIP and library preparation
SK Mill	TOKKEN	SK-200	Handy cryogenic grinder to make cell powder for fixation
Metal bullet	TOKKEN	SK-100-DLC10	Accessory of SK Mill
2 mL stainless steel tube	TOKKEN	TK-AM5-SUS	An option for cell lysis
2 mL stainless steel tube holder	TOKKEN	SK-100-TL	An option for cell lysis
16% formaldehyde (w/v), methanol-free	Pierce	28906	To fix cells. Prepare 1% solution before use.
Glycine	Nacalai Tesque	17109-35	Prepare 2.5 M stock
D-PBS (-)(1x)	Nacalai Tesque	14249-24	For washing lysate and purified DNA
HEPES	Nacalai Tesque	02443-05	For Lysis buffer 1. Prepare 1 M, pH 7.5 stock.
5 M NaCl, molecular biology grade	Nacalai Tesque	06900-14	For Lysis buffer 1, Lysis buffer 2, ChIP Elution Buffer, and Tris-EDTA-NaCl Buffer
0.5 M EDTA, molecular biology grade	Wako Pure Chemical Industries, Ltd.	311-90075	For Lysis buffer 1, Lysis buffer 2, ChIP Elution Buffer, and Tris-EDTA-NaCl Buffer
Glycerol	Wako Pure Chemical Industries, Ltd.	072-04945	For lysis buffer 1
NP-40	Nacalai Tesque	25223-75	For lysis buffer 1
Triton X-100, molecular biology grade	Nacalai Tesque	12967-32	For Lysis buffer 1
Tris	Nacalai Tesque	35406-91	For Lysis buffer 2, ChIP Elution Buffer, and Tris-EDTA-NaCl Buffer. Prepare 1 M, pH 8.0 stock.
0.1 M EGTA pH neutral	Nacalai Tesque	08947-35	For Lysis Buffer 2
Protease inhibitor cocktail (100x)	Nacalai Tesque	25955-24	To block degradation of protein
RIPA buffer	Thermo Fisher Scientific	89900	For cell lysis and washing
milliTUBE 1 mL AFA Fiber	Covaris	520130	Sonicator tube. Accessory of Focused-ultrasonicator
Focused-ultrasonicator	Covaris	S220 or E220	To digest DNA into adequate size for ChIP-Seq
UltraPure 10% SDS	Thermo Fisher Scientific	15553-027	For ChIP Elution Buffer
RNase A	Nacalai Tesque	30141-14	To purify DNA from lysate
Proteinase K, recombinant, PCR Grade	Sigma-Aldrich	3115887001	To purify DNA from lysate
Ethanol	Wako Pure Chemical Industries, Ltd.	054-07225	Make 70% solution
Monoclonal anti-FLAG M2 antibody produced in mouse	Sigma-Aldrich	F1804	To purify chromatin expressed in cells of interest
Dynabead M-280 Sheep Anti-Mouse IgG	Thermo Fisher Scientific	11201D	This can be used for anti-FLAG IP and anti-H3K4me3 IP
Anti-tri-methyl histone H3 (K4), mouse monoclonal antibody	Wako Pure Chemical Industries, Ltd.	301-34811	Any other antibody that works for ChIP analysis will work
10x Blocking Reagent	Sigma-Aldrich	11096176001	For blocking during affinity purification
Denhardt’s solution	Nacalai Tesque	10727-74	For blocking during affinity purification
Glycogen (5 mg/ml)	Thermo Fisher Scientific	AM9510	To purify DNA from lysate
Qubit 2.0 Fluorometer	Thermo Fisher Scientific	Q32866	For quantification of isolated DNA
Qubit dsDNA HS Assay Kit	Thermo Fisher Scientific	Q32851	For quantification of isolated DNA
0.5 mL tube	Axygen	10011-830	For quantification by Qubit
Phenol/chloroform/isoamyl alcohol (25:24:1)	Nacalai Tesque	25970-56	To purify DNA from lysate
AMPure XP beads	Beckman Coulter	A63881	SPRI magnetic beads for library preparation
Metal ice rack	Funakoshi	IR-1	To keep the cell lysate frozen
Sample Cooler	New England Biolabs	T7771S	Helps fix cells with minimal damage
2100 Bioanalyzer	Agilent Technologies	G2939BA	To check the quality of isolated DNA fragments. Another fragment analyzer can be used.
Bioanalyzer 2100 Expert Software	Agilent Technologies	G2946CA	Supplied with the Bioanalyzer
High Sensitivity DNA Kit	Agilent Technologies	5067-4626	To check the quality of the isolated DNA fragments
KAPA LTP Library Preparation Kit	Roche	07961898001	Supplied with 10x KAPA End Repair Buffer, KAPA End Repair Enzyme Mix, KAPA A-Tailing Buffer, KAPA A-Tailing Enzyme, KAPA Ligation Buffer, KAPA DNA Ligase, and PEG/NaCl solution
NEXTflex DNA Barcodes	BIOO Scientific	NOVA-514101	Adapter for library preparation. Supplied with DNA Barcode Adapters and Primer Mix.
KAPA Real-Time Library Amplification Kit	Roche	07959028001	Supplied with 2x KAPA HiFi HS real-time PCR Master Mix, PCR Primer Mix, and Fluorescent Standards
2x KAPA HiFi HotStart ReadyMix	Roche	KM2602	For library preparation. Additionally, this enzyme may be required for the KAPA Real-Time Library Amplification Kit
Buffer EB	Qiagen	19086	10 mM Tris-Cl, pH 8.5 for elution of DNA
386-well qPCR plate	Thermo Fisher Scientific	4309849	For real-time PCR
QuantStudio 7 Flex Real-Time PCR System	Thermo Fisher Scientific	4485701	To quantify DNA
MicroAmp Optical Adhesive Film	Thermo Fisher Scientific	4311971	For real-time PCR
MicroAmp Clear Adhesive Film	Thermo Fisher Scientific	4306311	For plate sealing
End-repair master mix			Combine 1.4 µL of 10x KAPA End Repair Buffer, 1 µL of KAPA End Repair Enzyme Mix, and 1.6 µL of H2O
A-taling master mix			Combine 1 µL of KAPA A-Tailing Buffer, 0.6 µL of KAPA A-Tailing Enzyme, and 8.4 µL of H2O
Ligation buffer mix			Combine 2 µL of KAPA ligation buffer and 6 µL of H2O
Real-time PCR master mix			Combine 5 µL of 2x KAPA HiFi HS real-time PCR Master Mix, 0.35 µL of PCR Primer Mix (10 µM each of forward primer AATGATACGGCGACCACCGAG and reverse primer CAAGCAGAAGACGGCATACGAG), and 3.15 µL of H2O
PCR master mix			Combine 10 µL of 2x KAPA HiFi Ready Mix, 0.9 µL of PCR Primer Mix, and 0.6 µL of H2O
Integrative Genomics Viewer	Broad Institute	IGV_2.3.88	Genome browser to visualize sequencing data
DNA olgionucleotide: 5′-GCCTACGCAGGTCTTGCTGAC-3′	Eurofins Genomics		A primer to amplify the promoter region of GAPDH
DNA olgionucleotide: 5′-CGAGCGCTGACCTTGAGGTC-3′	Eurofins Genomics		A primer to amplify the promoter region of GAPDH
SYBR Premix Ex Taq	Takara	RR420L	To quantify the DNA corresponding to the GADPH promoter region
Thermal Cycler Dice	Takara	TP870	To quantify the DNA corresponding to the GADPH promoter region