Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Biology

TChIP-Seq: Cellen spesifikk Epigenome profilering

Published: January 23, 2019 doi: 10.3791/58298

Summary

Vi beskriver en trinnvis protokoll for tandem chromatin immunoprecipitation sekvenser (tChIP-Seq) som gjør analysen av cellen spesifikk genomet hele histone modifisering.

Abstract

Epigenetic regulering spiller sentrale roller i genuttrykk. Siden histone endring ble oppdaget i 1960, har fysiologiske og patologiske funksjonene vært grundig studert. Faktisk har bruk av neste generasjons dyp sekvensering og chromatin immunoprecipitation (ChIP) via bestemte histone endring antistoffer revolusjonert vårt syn på epigenetic regulering over genomet. Derimot vev vanligvis består av forskjellige celletyper, og deres kompleks blanding utgjør analytiske utfordringer for å undersøke epigenome i en bestemt celle type. For å løse celle type-spesifikk chromatin staten i en genome-bred måte, utviklet vi nylig tandem chromatin immunoprecipitation sekvenser (tChIP-Seq), som er basert på selektiv rensing av chromatin av merket kjernen histone proteiner fra celle typer av interesse, etterfulgt av ChIP-Seq. Målet med denne protokollen er innføring av beste praksis for tChIP-Seq. Denne teknikken gir et allsidig verktøy for vev-spesifikke epigenome undersøkelse i ulike histone modifikasjoner og modell organismer.

Introduction

Vev av dyr består av forskjellige celletyper. Gene regulering i hver celle angir hvilke cellen. Chromatin modifikasjoner - DNA metylering og histone endring - populasjonsgjennomsnittet celle-type spesifisitet av genuttrykk. Dermed måling av epigenetic regulering i hver celle type har vært ønsket, men det har vært en teknisk utfordring.

Undersøke epigenetics i en bestemt celle, ble tandem chromatin immunoprecipitation sekvenser (tChIP-Seq) nylig utviklede ()figur 1)1. TChIP uttrykkes epitope-merket kjernen histone protein H2B fra en celle spesifikk promoter. Denne funksjonen gir isolasjon av chromatins fra cellene rundt, selv om materialet starter fra en blanding av ulike celletyper. Følgende ChIP-Seq-chromatin rensing via en endret histone merke og neste generasjons dyp sekvensering av isolert DNA-vi kan overvåke statusen epigenetic typen målrettet celle i en genome-bred måte.

Bruker denne teknikken, vi nylig undersøkt Nevron-spesifikke trimethylation av histone H3 proteiner til lysin 4 (H3K4me3) merker. I denne studien utviklet vi en knock-i mus som C-terminalt flagg-merket H2B protein ble uttrykt ved grobunn-mediert rekombinasjon (Rosa26CAG floxed-pA H2B flagg). Ved krysset med musen besitter grobunn-endoplasmic retikulum (ER) genet under kontroll av CamK2a arrangøren, indusert innhentet musen linjen H2B flagg i aktive neurons på tamoxifen injeksjon (Camk2aH2B flagg)1. Fra hjernen til etablerte musen linjen, utført vi tChIP-Seq med anti-H3K4me3 antistoff. Siden H3K4me3 merker ofte tilsvarer promoter regioner, kan vi finne hundrevis av mRNAs spesielt uttrykt i neurons1.

Her beskriver vi en typisk tChIP-Seq metode som dekker trinnene vev disseksjon biblioteket bygging ()figur 1). Det endelige målet i denne protokollen er å dele våre beste praksis for ytelsen til tChIP-Seq og fremtidig bruk av denne metoden for andre celletyper og histone modifikasjoner.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Alle metodene som er beskrevet her er godkjent av sikkerhet delingen av RIKEN (H27-EP071) og gjennomført med relevante retningslinjer og regler.

1. vev disseksjon

  1. Dissekere vev rundt i små biter (ca < 3 mm2) med fin våren saks.
    Merk: Større vev fragmenter tar lengre tid å fryse, og mindre stykker vil bære over større mengder buffer, begge kan påvirke resultatene.
  2. Legg dissekert vev fragmenter til en ren beholder fylt med flytende nitrogen og samle dem i 2 mL rør (1 stykke per tube) fylt med flytende nitrogen.
    Merk: Rør med en hydrofile overflate er anbefalt for dette trinnet.
  3. Plass rør ved-80 ° C i > 5 min med cap åpen fordampe gjenværende flytende nitrogen.
    Merk: Etter inndragelse lokket, vev fragmenter kan lagres ved-80 ° C i en måned før bruk.

2. celle fiksering

Merk: Vi brukte en hendig kryogene jeksel for dette trinnet. Et alternativ apparat kan brukes.

  1. Sted 2 mL-protein lav bindende rør som inneholder vevsprøver på en metall is rack kjølt i flytende nitrogen.
  2. Plass en kuleformede i en 1,5 mL-rør og chill med flytende nitrogen. Plass den på metall is stativet.
  3. Åpne 2 mL-røret og plasser den prechilled kuleformede i røret. Lukk lokket, sette 2 mL-rør i rør innehaver av en hendig kryogene jeksel og umiddelbart dukkert montert tube abonnenten i flytende nitrogen for 1 min.
  4. Innehaveren av frosne rør inn ytre kassetten av hendig kryogene vinkelsliperen og rist kraftig 60 ganger for 30 s.
  5. Demontere tube innehaveren, fjerne kuleformede og sted 2 mL-rør på et utvalg kjøligere prechilled på 20 ° C.
  6. Plass prøven kjøligere på 20 ° C i 15 min å hindre frysing av bindemiddel i neste trinn.
  7. Ta prøven kjøligere til benken, åpner lokket på røret, og umiddelbart dryppe 900 µL av 1% formaldehyd i den. Etter pipettering flere ganger, overføre suspensjon til nye 2 mL-rør som inneholder 900 µL av 1% formaldehyd og fastsette for 10 min med mild rotasjon i en inkubator satt på 23 ° C.
    FORSIKTIG: Formaldehyd er toksisk og skadelig.
  8. For å stoppe fiksering reaksjonen, legge 100 µL av 2.5 M glysin til hver rør og sentrifuge for 5 min på 3000 x g på 4 ° C. Kast nedbryting.
  9. Legg 1 mL av iskalde fosfat-bufret saltvann (PBS), sentrifuge for 5 min på 3000 x g ved 4 ° C, og forkaste nedbryting. Gjenta dette trinnet to ganger (3 vasker totalt).
    Merk: Fast prøver kan flash-frosne av flytende nitrogen og lagret på-80 ° C.
  10. Legge til 500 µL Lysis Buffer 1 (50 mM 4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic syre (HEPES)-KOH (pH 7.5), 140 mM NaCl, 1 mM ethylenediaminetetraacetic syre (EDTA) (pH 8.0), 10% w/v glyserol, 0,5% w/v-NP-40, 0,25% w/v Triton X-100 og 0,1 x protease hemmer cocktail) til pellets, Pipetter flere ganger, og roter i 10 min på 4 ° C.
    Merk: Lyseringsbuffer 1 bør filtreres og lagres på 4 ° C før bruk.
  11. Sentrifuge for 5 min på 3000 x g på 4 ° C og kast nedbryting.
  12. Legge 1 mL av Lysis Buffer 2 (10 mM Tris-HCl (pH 8.0), 200 mM NaCl, 1 mM EDTA (pH 8.0), 0,5 mM EGTA, og 0,1 x protease hemmer cocktail) til pellets, vortex, og roter i 10 min på 4 ° C.
    Merk: Lyseringsbuffer 2 skal filtreres og lagres på 4 ° C før bruk.
  13. Sentrifuge for 5 min på 3000 x g på 4 ° C og kast nedbryting.
  14. Legge til 800 µL av radioimmunoprecipitation-analysebuffer (RIPA) med 1 x protease hemmer cocktail i pellet og resuspend pellet av pipettering.
  15. Sentrifuge for 5 min på 3000 x g på 4 ° C og kast nedbryting.
  16. Legg til 500 µL av RIPA buffer med 1 x protease hemmer cocktail.
  17. Sentrifuge for 5 min på 3000 x g på 4 ° C og kast nedbryting.
  18. Legg 1 mL av RIPA buffer med 1 x protease hemmer cocktail. Umiddelbart videre til neste trinn.

3. chromatin skjæring

  1. Overføre til lysate til et sonicator rør og deretter plassere røret på en ultrasonicator.
  2. Skjær til chromatin med følgende innstillinger: temperatur: 4 ° C; Peak hendelsen strøm: 175 W; plikt faktor: 10%. sykluser/burst: 200; og tid: 2400 s.
  3. Overføre prøven til en 1,5 mL-protein lav bindende rør og sentrifuge for 5 min på 20.000 x g på 4 ° C.
  4. Samle nedbryting i en ny protein lav bindende tube.
    Merk: Utvalget kan flash-frosne i flytende nitrogen og lagret på-80 ° C.

4. kvaliteten av DNA (Reverse Crosslinking)

  1. Mix 20 µL av den lysate og 180 µL av ChIP elueringsbufferen (10 mM Tris-HCl (pH 8.0), 300 mM NaCl, 5 mM EDTA (pH 8.0) og 1% w/v natrium dodecyl sulfate (SDS)) i et utvalg kjedereaksjon (PCR) rør. Inkuber prøven på 65 ° C i en termisk cycler 6 h med termisk cycler lokk åpent. Holde termisk cycler åpen å unngå over rødsprit.
    Merk: ChIP elueringsrør bufferen skal filtreres og oppbevares ved romtemperatur før bruk. Denne inkubasjon kan utvides slik over natten.
  2. Legge 1 µL av 10 mg/mL RNase, dragsug, og Inkuber på 37 ° C i 30 min.
  3. Legge til 6.5 µL av 15 mg/mL proteinasen K, vortex, og Inkuber ved 55 ° C for 60 min.
  4. Overføre reaksjonen slik DNA lav binding, legger 4 µL av 5 mg/mL glykogen og vortex. Legg deretter til 200 µL av fenol/kloroform/isoamyl alkohol (25:24:1) og sentrifuge for 5 min på 18 000 x g ved romtemperatur.
  5. Overføre nedbryting til en ny DNA lav bindende tube. Legge til 200 µL Tris-EDTA-NaCl bufferen (10 mM Tris-HCl (pH 8.0), 1 mM EDTA (pH 8.0) og 200 mM NaCl) til gjenværende fenol/kloroform/isoamyl alkohol-løsning og sentrifuge for 5 min på 18 000 x g ved romtemperatur. Samle nedbryting og bland med første nedbryting.
  6. Legge til 900 µL av iskalde etanol og ruge 1t på 20 ° C.
    Merk: Denne inkubasjon kan utvides til 4 - 6 h.
  7. Sentrifuger i 30 min 18.000 x g på 4 ° C.
  8. Kast nedbryting. Legg til 1 mL av iskalde 75% etanol pellets og sentrifuge for 30 min 18.000 x g på 4 ° C. Gjenta dette trinnet (to vasker totalt).
  9. Forkast nedbryting grundig og air-dry i 1 min i romtemperatur.
  10. Legg til 50 µL Tris-EDTA (TE) bufferen og oppløse DNA av rugende det ved romtemperatur for 30 min eller 4 ° C over natten. Unngå vortexing eller pipettering. Holde denne DNA som "input" og bruke den for biblioteket forberedelser hvis nødvendig.
  11. Måle DNA konsentrasjonen med en fluorometer i henhold til produsentens instruksjoner (se tabell over materialer) og sjekk størrelsesDistribusjon med en microfluidic geleelektroforese maskin (se representant dataene som vises i figur 2a). Bruk 10 ng eller mindre DNA for denne analysen.
    Merk: Fragmenter av 100-500 base parene (bp) bør gjøre opp 50% eller mer av DNA.

5. affinitet rensing av anti-flagg antistoff

Merk: For Nevron tChIP-Seq, hjernen vev fra 8 mus brukes vanligvis for ett eksempel på tChIP-Seq for å forberede 2 ng renset DNA av tandem immun-rensing (se trinn 7.1). I våre hender, 0.1 ng DNA fortsatt gitt høy kvalitet DNA biblioteker for ChIP-Seq (Kadota, upublisert). Således, i teorien, et enkelt museklikk kan være tilstrekkelig å utføre neuron tChIP-Seq. Den nødvendige mengden skal være optimalisert for vev og celle type interesse. For negative kontrollen av imumuno-rensing eksperimentet bør hjernevev lysate fra mus uten alle H2B flagg uttrykk være forberedt og brukes.

  1. Pipetter 200 µL av magnetiske perler konjugert til sau anti-musen immunglobulin G (IgG) inn i et protein lav bindende rør.
  2. Sett røret på en magnetisk stå og vente 1 min for nedbryting å bli klare. Forkaste nedbryting, Legg 1 mL av iskalde PBS og vortex. Gjenta dette trinnet (to vasker totalt).
  3. Legge til 20 µL 1 mg/mL anti-flagg antistoff og rotere for 5 h på 4 ° C.
    Merk: Denne inkubasjon kan utvides slik over natten.
  4. Vask perler etter trinn 5.2. Plass perler i en 15-mL tube.
  5. Resuspend perler i 1110 µL RIPA bufferen og legger 900 µL av 10 x blokkerer reagens, 180 µL av 50 x Denhardts løsning, 10 µL av 100 x protease hemmer cocktail og 6.8 mL av lysate i trinn 3. Dele denne blandingen i 5 protein lav bindende rør. Rotere for 6 h 4 ° C.
    Merk: Denne inkubasjon kan utvides slik over natten.
  6. Sett røret på magnetiske stå og vente 1 min for nedbryting å bli klare. Forkaste nedbryting, Legg 1 mL av RIPA buffer, og bland forsiktig. Gjenta dette trinnet 5 ganger (6 vasker totalt). Samle alle perler inn i et enkelt protein lav bindende rør.
  7. Legg til 200 µL av ChIP elueringsbufferen og rotere i 15 min ved romtemperatur. Sjekk kvaliteten på DNA som beskrevet i trinn 4.11 (se representant dataene som vises i figur 2B og C). Umiddelbart videre til neste trinn.

6. affinitet rensing av Anti-H3K4me3 antistoffer og omvendt Crosslinking

Merk: Følgende perle forberedelsene trinnene (6.1-6.4) bør utføres før trinn 5.7.

  1. Pipetter 40 µL av magnetiske perler konjugert til sau anti-mus IgG i en 2 mL-protein lav bindende rør.
  2. Sett røret på magnetiske stå og vente 1 min for nedbryting å bli klare. Forkaste nedbryting, Legg 1 mL av iskalde PBS, og bland forsiktig. Gjenta dette trinnet (to vasker totalt).
  3. Legge til 4 µL 1 mg/mL anti-H3K4me3 antistoff og rotere for 6 h 4 ° C.
  4. Vask perler etter trinn 6.2. Plass perler i en 2 mL-protein lav bindende rør.
  5. Resuspend perler i 1558 µL RIPA bufferen og deretter legge 200 µL av 10 x blokkerer reagens, 40 µL av 50 x Denhardts løsning, 2 µL av 100 x protease hemmer cocktail og 200 µL av eluate i trinn 5.7. Roter overnatting på 4 ° C.
    Merk: SDS i ChIP elueringsrør bufferen ble utvannet mer enn 10 ganger i denne inkubasjon.
  6. Sett røret på magnetiske stå og vente 1 min for nedbryting å bli klare. Forkaste nedbryting, Legg 1 mL av RIPA buffer, og bland forsiktig. Gjenta dette trinnet 4 ganger (5 vasker totalt). Etter siste vask, overføre perler til en DNA lav bindende rør og forkaste nedbryting.
  7. Legg til 200 µL av ChIP elueringsbufferen og rotere i 15 min ved romtemperatur. Overføring av eluate til en ny DNA lav bindingTube.
    Merk: Eluate kan lagres på-80 ° C.
  8. Følg trinn 4 for decrosslinking av DNA. Resuspend renset DNA i 20 µL TE bufferen.
  9. Sjekk kvaliteten på DNA som beskrevet i trinn 4.11 (se representant dataene som vises i figur 2D). (valgfritt) Utføre berikelse analyse av kvantitative PCR som beskrevet tidligere2. Ti ganger eller større berikelse observeres.

7. biblioteket konstruksjon

  1. For hver input og ChIP DNA-prøve, beregne andelen av DNA i regionen 100-500-bp funksjonen smøre analyse av programvaren for microfluidic geleelektroforese maskinen. Beregne utvalg volumet må få 2 ng av 100-500 bp DNA. Bruk 20 ng DNA i 100-500-bp området som "input" prøven.
  2. Pipetter DNA-prøver i 8-stripen PCR rør og legge H2O å bringe det totale volumet til 10 µL. (valgfritt) Hvis volumet av DNA overstiger 10 µL, proporsjonalt skalere opp følgende slutten-reparasjon reaksjon og størrelse utvalget.
  3. Forberede slutten-reparasjon master mix (se Tabell for materiale). Legge til 4 µL slutten-reparasjon master Mix DNA og ruge i 30 min på 20 ° C.
  4. Legg til 36 µL av 10 mM Tris-Cl, pH 8.5 og 0,6 x volum (30 µL) av solid fase reversibel immobilisering (SPRI) magnetiske perler og ruge i 5 minutter ved romtemperatur.
  5. Sett røret på en magnetisk stå og vente til nedbryting blir klart.
  6. Overføre nedbryting til en ny tube, legge 1.2 x volumer (60 µL) av SPRI magnetiske perler og ruge 5 min ved romtemperatur.
  7. Sett røret på en magnetisk stå og vente til nedbryting blir klart.
  8. Vask perlene to ganger med 200 µL av 80% EtOH, holde røret fortsatt på magneten.
  9. Kort sentrifuge røret for å samle de gjenværende EtOH nederst og legg den tilbake på magneten. Fjerne de gjenværende EtOH grundig.
  10. La røret lokket åpen for 1-2 min tillate EtOH til å fordampe.
  11. Lukk dekslet og holde røret på is.
    Merk: Nå har du fått størrelse valgt DNA av 100-500 bp på perlene. Ytterligere detaljer om dobbel størrelse finner på produsentens hjemmeside (www.beckman.com).
  12. Forbered A tailing master blande (se Tabell for materiale).
  13. Resuspend perler (fra trinn 7.10) med 10 µL A tailing master mix og Inkuber i 30 min på 30 ° C.
  14. Legg til 1,8 x volum (18 µL) på polyetylenglykol (PEG) / NaCl løsning og Inkuber i 5 minutter ved romtemperatur.
  15. Følg trinnene 7.7-7.11 å rense DNA.
  16. Klargjør ligation buffer blandingen (se Tabell for materiale).
  17. Pipetter 8 µL av hemorroider buffer på perlene (fra trinn 7.14), legge til 1 µL 1 µM adapter og resuspend perler. Bruk 1 µL av 5 µM-kort for input prøven. Vurder å bruke forskjellige adaptere for hver prøve for multiplexing.
  18. Legg 1 µL av DNA Ligase og ruge i 15 min på 20 ° C.
  19. Legge til 1,0 x-volum (10 µL) PEG/NaCl løsning, resuspend perler og ruge i 5 minutter ved romtemperatur.
  20. Følg trinnene 7.7-7.10 å rense DNA.
  21. Pipetter 25 µL av 10 mM Tris-Cl, pH 8.5 inn i røret og resuspend perler.
  22. Legg til 1,0 x-volum (25 µL) PEG/NaCl løsning og ruge i 5 minutter ved romtemperatur.
  23. Følg trinnene 7.7-7.10 å rense DNA.
  24. Pipetter 11 µL av 10 mM Tris-Cl, pH 8.5 inn i røret og resuspend perler.
  25. Sett røret på en magnetisk stå og vente til nedbryting blir klart.
  26. Samle nedbryting i en ny 8-stripen PCR tube.
  27. Forberede sanntid PCR master mix (se materialer for detaljer).
  28. Pipetter 8,5 µL sanntid PCR master mix i en 384-og kvantitative PCR (qPCR)-plate, og Legg til 1,5 µL av kortet samskrevet DNA (fra trinn 7.26).
  29. Pipetter 10 µL av hver fluorescerende standard i Tom brønner.
  30. Utføre sanntid PCR med det følgende programmerbar: (98 ° C i 45 s) x 1 syklus (98 ° C i 15 s, 60 ° C for 30 s, 72 ° C for 30 s) x 20 sykluser, og (72 ° C for 60 s) x 1 syklus.
  31. Bestemme antall PCR sykluser nødvendig nå fluorescens intensiteten av fluorescerende Standard 2.
  32. Forberede PCR master blande (se Tabell for materiale).
  33. Pipetter 11,5 µL av PCR master mix i gjenværende kort-samskrevet DNA (fra trinn 7.26) og utføre PCR som angitt i trinn 7,30 med PCR sykluser i trinn 7.31.
  34. Legg til 1,0 x-volum (20 µL) PEG/NaCl løsning og ruge i 5 minutter ved romtemperatur.
  35. Følg trinnene 7.7-7.10 å rense DNA.
  36. Pipetter 20 µL av 10 mM Tris-Cl, pH 8.5 inn i røret og resuspend perler.
  37. Sett røret på en magnetisk stå og vente til nedbryting blir klart.
  38. Samle nedbryting i en ny 1,5 mL-DNA lav bindende tube.
  39. Sjekk kvaliteten på biblioteket som beskrevet i trinn 4.11 (se representant dataene som vises i figur 2E og F). Bruk 1 µL av biblioteket DNA-prøve. (valgfritt) Utføre berikelse analyse av qPCR som beskrevet tidligere 2. Ti ganger eller større berikelse observeres.

8. sekvensering

  1. Sekvens bibliotekene i en neste generasjons sequencer (se representant dataene som vises i Figur 3).
    Merk: Sekvens dybden tilstrekkelig for dataanalyse vil variere avhengig genomet av organismen3. For menneske og mus, anbefaler vi å få minst 20-40 millioner single-end leser. Ifølge avkastningen av leser, kan multipleksing være kostnadseffektive.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Her beskriver vi vev disseksjon, fiksering, celle lysis, tandem rensing av chromatin, og DNA biblioteket forberedelser for neste generasjons sequencere. Under prosedyrene, kan man teste kvaliteten på DNA, som er nøkkelen til vellykkede sekvensering, flere skritt (figur 2). Siden en enkelt nucleosome er vanligvis omgitt av 147 bp DNA 4, være skråstilte DNA ikke kortere enn størrelsen. Umiddelbart etter ultrasonication, ble DNA isolert og kjøre på en microfluidic geleelektroforese maskin (figur 2A). Til tross for våre beste anstrengelser å optimalisere størrelsen området, hadde vi fortsatt en befolkning på DNA (ca 2 kbp) som unsheared. I dette trinnet skal brøkdel av DNA fra 100-500 bp 50% eller mer av befolkningen. Etter affinitet rensing av anti-flagg antistoff (figur 2B) og anti-H3K4me3 antistoff (figur 2D), ble kvaliteten på isolerte DNA sjekket igjen med microfluidic geleelektroforese maskinen, og mengden av DNA fra 100-500 bp ble anslått. Selv om vi ofte observert en sterkere bias mot 2 kbp fragmenter på dette trinnet, fjernet dobbel størrelse valget ved SPRI magnetiske perler denne fraksjonen.

Spesifisiteten av immun-rensing av DNA på H2B-FLAGGET ble bekreftet med negativ kontroll eksemplene, som hjernen lysate fra mus uten H2B flagg uttrykket ble brukt (figur 2C). Vi oppdaget vanligvis ubetydelige mengder DNA fra negativ kontroll prøvene.

Etter A tailing kortet ligatur og PCR, kvaliteten på sekvensering biblioteket ble bekreftet (figur 2E). Vanligvis 250-600 bp DNA ble oppnådd. Vellykket vanlige ChIP og tChIP ble dokumentert av berikelse analyse med qPCR2 bruke primere målretting promoter regionen av GAPDH genet (figur 2F).

Representant lese distribusjoner langs Nevron gener (Camk2a, Slc17a7 og Gria1) av genomet-nettleser er vist i Figur 3. Anriking av leser på 5 ' slutten av gener av neuron tChIP-Seq over hele hjernen tChIP-Seq ble observert.

Figure 1
Figur 1: skjematisk fremstilling av tChIP-Seq. Dette tallet har blitt endret fra Mito, M., et al. 1. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 2
Figur 2: DNA kvalitetskontroll. (A, B, Dog E) Electropherogram får en microfluidic geleelektroforese maskin for skråstilte chromatin DNA (A), DNA renset med anti-flagg antistoff (B) og anti-H3K4me3 antistoff (C), og det endelige biblioteket (D). Toppene markert med grønt og lilla representerer interne størrelse standarder. Blå stiplede linjer viser DNA størrelse områdene vurdert for nedstrøms. FU: fluorescens enheter.
(C) mengden DNA av anti-flagg immun-rensing. Hvert punkt representerer en uavhengig duplisere. (F) berikelse analyse av qPCR rettet mot GAPDH. Hvert punkt representerer en uavhengig duplisere. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 3
Figur 3: lese distribusjoner i neuron tChIP-Seq. (A-C) Les distribusjoner langs representant Nevron gener i neuron tChIP-Seq og kontroll hele hjernen tChIP-Seq vises. RPM: leser per million leser. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Våre protokollen var optimalisert for nervecellene i musen hjernen, som uttrykk for flagg-merket H2B er indusert av tamoxifen injeksjon. Arrangører for H2B uttrykk, start vev materialer og mengden vev er avgjørende parametere for vellykket tChIP-Seq. Dermed bør optimalisering av disse faktorene vurderes for hver celle av interesse.

En kritisk trinn blant prosedyrene brukes i denne protokollen er DNA klipping for å oppnå en chromatin lengde på 100-500 bp-5. Generelt, er standardisering av ultrasonication trinnet utfordrende siden det er svært avhengig av en rekke faktorer; fiksering forhold, vev brukes, utstyret brukes til ultra-sonication og utstyret innstilling, blant andre. Derfor vil prøving og feiling optimalisering av denne DNA klipping trinn være nødvendig for personlige eksperimenter. I stedet for ultra-sonication, må micrococcal nuclease behandling være et alternativ å isolere enkelt nucleosome størrelse DNA, som brukes i naiv ChIP metode6. Selv om den homogen størrelsesDistribusjon av DNA er ideell, skråstilles kan DNAs vise flere befolkningen, som vist i figur 2A. Dobbelt valg av SPRI magnetiske perler, bidrar som beskrevet ovenfor, til å fjerne den lengre størrelse av DNA.

Vanligvis biblioteket forberedelse krever 1 ng av 100-500 bp DNA. Basert på dette kravet, skalert vi opp den opprinnelige materialet av hjernevev for neurons. Denne fremgangsmåten kan imidlertid være utfordrende for svært små fra sjeldne celletyper. I slike tilfeller være ChIP implementering, som er basert på Tn5 transposase i stedet for ligase og krever mindre materiale7, bedre alternativ.

Likevel er denne gjeldende protokollen begrenset til de store celletyper i materialet. I våre hender gitt 10% bruk av målrettet celler i den opprinnelige celle befolkningen god rensing av chromatin fra målet celler1. Men hvis enda mer sjeldne celletyper målrettes, vil deretter finere optimalisering av immunoprecipitation av epitope koden være garantert for å skille isolert DNA fra forurenset DNA fra ikke-målrettede celler. For beste praksis for dataanalyse anbefaler vi sammenligne dataene til kontrollen tChIP-Seq analyse fra hele vev brukes til å starte eksperimentet. Siden vi fant betydelige skjevheter fra exogenously uttrykt H2B flagg protein, bør analysen forhold og analyseres av berikelse (eller uttømming) til bakgrunnen1. For denne kontrollen, vi faktisk laget en mus linje med overalt uttrykt H2B flagg (RosaH2B flagg) og utføres tChIP-Seq1. En mer detaljert tolkning av data har vært omtalt tidligere1.

Basert på vår analyse, H3K4me3 tChIP-Seq fra neurons gitt sammenlignbare og/eller bedre gjenkjenning av kjente Nevron-spesifikke gener enn RNA-Seq fra FACS-sortert neurons8 og oversette ribosom affinitet rensing (TRAP)-Seq9. For eksempel gjenvunnet kjente axon/dendrite-lokalisert gener effektivt bruker neuron tChIP-Seq1. Bemerkelsesverdig, våre tChIP-Seq er ikke begrenset for arrangøren-assosiert histone merket men gjelder også for andre ulike histone modifikasjoner10 hvis antistoffer er tilgjengelige. Strategien for å isolere chromatin av merket kjernen histone proteiner kan i tillegg brukes i andre modellen organismer. Men her vi brukte flagg epitope merke kjernen histone protein, kan andre koder brukes. Siden formaldehyd fiksering DNA oppstår som oftest på lysin rester av en protein11, bør en kode med mange lysin unngås for å eliminere biases av epitope merking. Dermed skal tChIP-Seq tilnærmingen allsidig i ulike vev sammen mange typer sammenhenger i epigenetic studier.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne ikke avsløre.

Acknowledgments

Vi takker alle medlemmer av laboratoriet Iwasaki kritisk lesning av manuskriptet. Dette arbeidet var støttes delvis av en Grant-in-Aid for vitenskapelig forskning på nyskapende områder (#26113005 sn og JP17H05679 å si); en Grant-in-Aid for yngre forskere (A) (JP17H04998 å si) fra departementet for utdanning, vitenskap, sport og kultur i Japan (MEXT); og innovativ prosjekter "Cellulære evolusjon" og alle RIKEN prosjektet "Sykdom og Epigenome" fra RIKEN (til SN og si).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Protein LoBind tube, 2 mL Eppendorf No. 0030108132 For cell lysis
Protein LoBind tube, 1.5 mL Eppendorf No. 0030108116 For ChIP and library preparation
DNA LoBind tube, 1.5 mL Eppendorf No. 0030108051 For ChIP and library preparation
8-strip PCR tube BIO-BIK 3247-00 For ChIP and library preparation
SK Mill TOKKEN SK-200 Handy cryogenic grinder to make cell powder for fixation
Metal bullet TOKKEN SK-100-DLC10 Accessory of SK Mill
2 mL stainless steel tube TOKKEN TK-AM5-SUS An option for cell lysis
2 mL stainless steel tube holder TOKKEN SK-100-TL An option for cell lysis
16% formaldehyde (w/v), methanol-free Pierce 28906 To fix cells. Prepare 1% solution before use.
Glycine Nacalai Tesque 17109-35 Prepare 2.5 M stock
D-PBS (-)(1x) Nacalai Tesque 14249-24 For washing lysate and purified DNA
HEPES Nacalai Tesque 02443-05 For Lysis buffer 1. Prepare 1 M, pH 7.5 stock.
5 M NaCl, molecular biology grade Nacalai Tesque 06900-14 For Lysis buffer 1, Lysis buffer 2, ChIP Elution Buffer, and Tris-EDTA-NaCl Buffer
0.5 M EDTA, molecular biology grade Wako Pure Chemical Industries, Ltd. 311-90075 For Lysis buffer 1, Lysis buffer 2, ChIP Elution Buffer, and Tris-EDTA-NaCl Buffer
Glycerol Wako Pure Chemical Industries, Ltd. 072-04945 For lysis buffer 1
NP-40 Nacalai Tesque 25223-75 For lysis buffer 1
Triton X-100, molecular biology grade Nacalai Tesque 12967-32 For Lysis buffer 1
Tris Nacalai Tesque 35406-91 For Lysis buffer 2, ChIP Elution Buffer, and Tris-EDTA-NaCl Buffer. Prepare 1 M, pH 8.0 stock.
0.1 M EGTA pH neutral Nacalai Tesque 08947-35 For Lysis Buffer 2
Protease inhibitor cocktail (100x) Nacalai Tesque 25955-24 To block degradation of protein
RIPA buffer Thermo Fisher Scientific 89900 For cell lysis and washing
milliTUBE 1 mL AFA Fiber Covaris 520130 Sonicator tube. Accessory of Focused-ultrasonicator
Focused-ultrasonicator Covaris S220 or E220 To digest DNA into adequate size for ChIP-Seq
UltraPure 10% SDS Thermo Fisher Scientific 15553-027 For ChIP Elution Buffer
RNase A Nacalai Tesque 30141-14 To purify DNA from lysate
Proteinase K, recombinant, PCR Grade Sigma-Aldrich 3115887001 To purify DNA from lysate
Ethanol Wako Pure Chemical Industries, Ltd. 054-07225 Make 70% solution
Monoclonal anti-FLAG M2 antibody produced in mouse Sigma-Aldrich F1804 To purify chromatin expressed in cells of interest
Dynabead M-280 Sheep Anti-Mouse IgG Thermo Fisher Scientific 11201D This can be used for anti-FLAG IP and anti-H3K4me3 IP
Anti-tri-methyl histone H3 (K4), mouse monoclonal antibody Wako Pure Chemical Industries, Ltd. 301-34811 Any other antibody that works for ChIP analysis will work
10x Blocking Reagent Sigma-Aldrich 11096176001 For blocking during affinity purification
Denhardt’s solution Nacalai Tesque 10727-74 For blocking during affinity purification
Glycogen (5 mg/ml) Thermo Fisher Scientific AM9510 To purify DNA from lysate
Qubit 2.0 Fluorometer Thermo Fisher Scientific Q32866 For quantification of isolated DNA
Qubit dsDNA HS Assay Kit Thermo Fisher Scientific Q32851 For quantification of isolated DNA
0.5 mL tube Axygen 10011-830 For quantification by Qubit
Phenol/chloroform/isoamyl alcohol (25:24:1) Nacalai Tesque 25970-56 To purify DNA from lysate
AMPure XP beads Beckman Coulter A63881 SPRI magnetic beads for library preparation
Metal ice rack Funakoshi IR-1 To keep the cell lysate frozen
Sample Cooler New England Biolabs T7771S Helps fix cells with minimal damage
2100 Bioanalyzer Agilent Technologies G2939BA To check the quality of isolated DNA fragments. Another fragment analyzer can be used.
Bioanalyzer 2100 Expert Software Agilent Technologies G2946CA Supplied with the Bioanalyzer
High Sensitivity DNA Kit Agilent Technologies 5067-4626 To check the quality of the isolated DNA fragments
KAPA LTP Library Preparation Kit Roche 07961898001 Supplied with 10x KAPA End Repair Buffer, KAPA End Repair Enzyme Mix, KAPA A-Tailing Buffer, KAPA A-Tailing Enzyme, KAPA Ligation Buffer, KAPA DNA Ligase, and PEG/NaCl solution
NEXTflex DNA Barcodes BIOO Scientific NOVA-514101 Adapter for library preparation. Supplied with DNA Barcode Adapters and Primer Mix.
KAPA Real-Time Library Amplification Kit Roche 07959028001 Supplied with 2x KAPA HiFi HS real-time PCR Master Mix, PCR Primer Mix, and Fluorescent Standards
2x KAPA HiFi HotStart ReadyMix Roche KM2602 For library preparation. Additionally, this enzyme may be required for the KAPA Real-Time Library Amplification Kit
Buffer EB Qiagen 19086 10 mM Tris-Cl, pH 8.5 for elution of DNA
386-well qPCR plate Thermo Fisher Scientific 4309849 For real-time PCR
QuantStudio 7 Flex Real-Time PCR System Thermo Fisher Scientific 4485701 To quantify DNA
MicroAmp Optical Adhesive Film Thermo Fisher Scientific 4311971 For real-time PCR
MicroAmp Clear Adhesive Film Thermo Fisher Scientific 4306311 For plate sealing
End-repair master mix Combine 1.4 µL of 10x KAPA End Repair Buffer, 1 µL of KAPA End Repair Enzyme Mix, and 1.6 µL of H2O
A-taling master mix Combine 1 µL of KAPA A-Tailing Buffer, 0.6 µL of KAPA A-Tailing Enzyme, and 8.4 µL of H2O
Ligation buffer mix Combine 2 µL of KAPA ligation buffer and 6 µL of H2O
Real-time PCR master mix Combine 5 µL of 2x KAPA HiFi HS real-time PCR Master Mix, 0.35 µL of PCR Primer Mix (10 µM each of forward primer AATGATACGGCGACCACCGAG and reverse primer CAAGCAGAAGACGGCATACGAG), and 3.15 µL of H2O
PCR master mix Combine 10 µL of 2x KAPA HiFi Ready Mix, 0.9 µL of PCR Primer Mix, and 0.6 µL of H2O
Integrative Genomics Viewer Broad Institute IGV_2.3.88 Genome browser to visualize sequencing data
DNA olgionucleotide: 5′-GCCTACGCAGGTCTTGCTGAC-3′ Eurofins Genomics A primer to amplify the promoter region of GAPDH
DNA olgionucleotide: 5′-CGAGCGCTGACCTTGAGGTC-3′ Eurofins Genomics A primer to amplify the promoter region of GAPDH
SYBR Premix Ex Taq Takara RR420L To quantify the DNA corresponding to the GADPH promoter region
Thermal Cycler Dice Takara TP870 To quantify the DNA corresponding to the GADPH promoter region

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Mito, M., et al. Cell type-specific survey of epigenetic modifications by tandem chromatin immunoprecipitation sequencing. Scientific Reports. 8 (1), 1143 (2018).
  2. Kadota, M., et al. CTCF binding landscape in jawless fish with reference to Hox cluster evolution. Scientific Reports. 7 (1), 4957 (2017).
  3. Jung, Y. L., et al. Impact of sequencing depth in ChIP-seq experiments. Nucleic Acids Research. 42 (9), (2014).
  4. Becker, P. B., Workman, J. L. Nucleosome remodeling and epigenetics. Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 5 (9), a017905 (2013).
  5. Kidder, B. L., Zhao, K. Efficient library preparation for next-generation sequencing analysis of genome-wide epigenetic and transcriptional landscapes in embryonic stem cells. Methods in Molecular Biology. , 3-20 (2014).
  6. Gilfillan, G. D., et al. Limitations and possibilities of low cell number ChIP-seq. BMC Genomics. 13, 645 (2012).
  7. Schmidl, C., Rendeiro, A. F., Sheffield, N. C., Bock, C. ChIPmentation: fast, robust, low-input ChIP-seq for histones and transcription factors. Nature Methods. 12 (10), 963-965 (2015).
  8. Zhang, Y., et al. An RNA-sequencing transcriptome and splicing database of glia, neurons, and vascular cells of the cerebral cortex. Journal of Neuroscience. 34 (36), 11929-11947 (2014).
  9. Hornstein, N., et al. Ligation-free ribosome profiling of cell type-specific translation in the brain. Genome Biology. 17 (1), 149 (2016).
  10. Zhao, Y., Garcia, B. A. Comprehensive catalog of currently documented histone modifications. Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 7 (9), a025064 (2015).
  11. Hoffman, E. A., Frey, B. L., Smith, L. M., Auble, D. T. Formaldehyde crosslinking: a tool for the study of chromatin complexes. The Journal of Biological Chemistry. 290 (44), 26404-26411 (2015).

Tags

Biologi problemet 143 ChIP-Seq celle spesifikk genuttrykk epigenetics histone modifisering neste generasjons sekvensering histone H2B
TChIP-Seq: Cellen spesifikk Epigenome profilering
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Mito, M., Kadota, M., Nakagawa, S.,More

Mito, M., Kadota, M., Nakagawa, S., Iwasaki, S. TChIP-Seq: Cell-Type-Specific Epigenome Profiling. J. Vis. Exp. (143), e58298, doi:10.3791/58298 (2019).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter