Summary
Vi beskriver ett stegvisa protokoll för tandem kromatin immunoprecipitation sekvensering (tChIP-Seq) som möjliggör analys av cell-typspecifika genome-wide Histon modifiering.
Abstract
Epigenetisk reglering spelar centrala roller i genuttryck. Sedan Histon modifiering upptäcktes på 1960-talet, har dess fysiologiska och patologiska funktioner studerats. Faktiskt, tillkomsten av nästa generations djupsekvensering och kromatin immunoprecipitation (ChIP) via specifika Histon modifiering antikroppar har revolutionerat vår syn på epigenetisk reglering över hela genomet. Omvänt, vävnader består vanligtvis av olika celltyper och deras komplex blandning analytiska utmaningar att utreda epigenomet i en viss celltyp. För att lösa cell typspecifika kromatin staten på ett sätt som genome-wide, utvecklat vi nyligen tandem kromatin immunoprecipitation sekvensering (tChIP-Seq), som bygger på Selektiv rening av kromatin av märkta core Histon proteiner från cell typer av intresse, följt av ChIP-följande punkter Målet med detta protokoll är införandet av bästa praxis för tChIP-följande punkter Denna teknik är ett mångsidigt verktyg för vävnadsspecifika epigenomet utredning i olika Histon modifieringar och modellorganismer.
Introduction
Vävnader av djur består av olika celltyper. Genreglering i varje cell definierar celltypen. Kromatin ändringar - DNA metylering och Histon ändring - ligger bakom celltyp specificitet av genuttryck. Således, mätning av epigenetisk reglering i varje celltyp har varit önskat, men det har varit en teknisk utmaning.
För att undersöka epigenetiken i en viss celltyp, var tandem kromatin immunoprecipitation sekvensering (tChIP-Seq) nyligen utvecklade ()figur 1)1. I tChIP uttrycks epitop-taggade core Histon protein H2B från en-typ-specifika promotorn. Denna funktion kan isolering av Chromatinsen från cellerna av intresse, även om materialet börjar från en blandning av olika celltyper. Följande ChIP-Seq — kromatin rening via en modified-histonglykoprotein mark och nästa generations djupsekvensering av isolerad DNA — vi kan övervaka epigenetiska status för den rikta Celltypen i genome-wide sätt.
Med denna teknik, vi nyligen undersökt neuron-specifika trimethylation av Histon H3 protein på lysin 4 (H3K4me3) märken. I denna studie har utvecklat vi en inpressning mus i vilken C-obotligt flagga-taggade H2B protein uttrycktes på Cre-medierad rekombination (Rosa26CAG floxed-pA H2B-flagga). Genom korsning med en mus som har genen Cre-endoplasmic reticulum (ER) under kontroll av CamK2a promotorn, inducerad raden erhållna mus H2B-flagga i aktiva nervceller vid tamoxifen injektion (Camk2aH2B-flaggan)1. Start från hjärnan av raden etablerade mus, utfört vi tChIP-Seq med anti-H3K4me3 antikropp. Eftersom H3K4me3 märken ofta motsvarar arrangören regioner, kan vi upptäcka hundratals mRNA specifikt uttryckt i nervceller1.
Här, beskriver vi en typisk tChIP-Seq metod som omfattar stegen från vävnad dissektion till biblioteket konstruktion ()figur 1). Det slutliga målet med detta protokoll är att dela våra bästa metoder för utförandet av tChIP-Seq och den framtida tillämpningen av denna metod till andra celltyper och Histon ändringar.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alla metoder som beskrivs häri har godkänts av RIKEN (H27-EP071)-avdelningen säkerhet och utförts med relevanta riktlinjer och förordningar.
1. vävnad dissektion
- Dissekera vävnader av intresse i små bitar (cirka < 3 mm2) med fina våren sax.
Obs: Större vävnad fragment tar längre tid att frysa, och mindre bitar kommer att föra över större volymer av buffert, som båda kan påverka resultaten. - Lägga till dissekerade vävnad fragment i en ren behållare fylld med flytande kväve och samla dem i 2 mL rör (1 bit per rör) fyllda med flytande kväve.
Obs: Rör med en hydrofil yta rekommenderas för det här steget. - Placera rören vid-80 ° C för > 5 min med locket öppet avdunsta det återstående flytande kvävgasen.
Obs: Efter stängning locket, vävnad fragment kan lagras vid-80 ° C för en månad före användning.
2. cellen fixering
Obs: Vi använde en händig kryogen kvarn för detta steg. En alternativt apparatur kan användas.
- Plats 2 mL-proteinbindning låg rör som innehåller vävnadsproverna på en metall is rack kyld i flytande kväve.
- Placera en metall kula i en 1,5 mL-tub och chill med flytande kväve. Placera den på metal is racket.
- Öppna 2 mL-röret och placera prechilled metall kula i röret. Stäng locket, ställa in de 2 mL-rör i rör innehavaren av en händig kryogen kvarn och omedelbart doppa monterade röret innehavaren i flytande kväve för 1 min.
- Sätt frysta tube korthållaren i yttre kassett av händig kryogen kvarnen och skaka kraftigt 60 gånger 30 s.
- Demontera hållaren tube, ta bort metall kula och plats 2 mL-röret på ett prov som är svalare prechilled vid-20 ° C.
- Placera provet svalare vid-20 ° C i 15 min att förhindra frysning av fixeringsvätskan i nästa steg.
- Ta provet svalare till bänken, öppna locket på röret och omedelbart droppa 900 µL av 1% formaldehyd i den. Efter pipettering flera gånger, över till ny 2 mL-tub som innehåller 900 µL av 1% formaldehyd och fixa under 10 minuter med varsam rotering i en inkubator inställd på 23 ° C.
Varning: Formaldehyd är giftiga och skadliga. - För att stoppa fixering reaktionen, tillsätt 100 µL av 2,5 M glycin i varje rör och Centrifugera under 5 minuter vid 3000 x g vid 4 ° C. Kassera supernatanten.
- Tillsätt 1 mL iskallt fosfatbuffrad koksaltlösning (PBS), Centrifugera under 5 minuter vid 3000 x g vid 4 ° C, och kasta bort supernatanten. Upprepa detta steg två gånger (3 tvättar sammanlagt).
Obs: Fasta prover kan vara flash-frusen av flytande kväve och lagras vid-80 ° C. - Tillsätt 500 µL Lysis buffert 1 (50 mM 4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic syra (HEPES)-KOH (pH 7,5), 140 mM NaCl, 1 mM etylendiamintetraättiksyra syra (EDTA) (pH 8,0), 10% w/v glycerol, 0,5% w/v NP-40, 0,25% w/v Triton X-100 och 0.1 x proteashämmare cocktail) att pelleten, Pipettera flera gånger, och rotera under 10 minuter vid 4 ° C.
Obs: Lyseringsbuffert 1 bör filtreras och lagras vid 4 ° C före användning. - Centrifugera under 5 minuter vid 3000 x g vid 4 ° C och kasta bort supernatanten.
- Tillsätt 1 mL Lysis buffert 2 (10 mM Tris-HCl (pH 8,0), 200 mM NaCl, 1 mM EDTA (pH 8,0), 0,5 mM EGTA, och 0,1 x proteashämmare cocktail) att pelleten, vortex, och rotera under 10 minuter vid 4 ° C.
Obs: Lyseringsbuffert 2 bör filtreras och lagras vid 4 ° C före användning. - Centrifugera under 5 minuter vid 3000 x g vid 4 ° C och kasta bort supernatanten.
- Tillsätt 800 µL radioimmunoprecipitation analysbuffert (RIPA) med 1 x proteashämmare cocktail i pelleten och återsuspendera pelleten genom pipettering.
- Centrifugera under 5 minuter vid 3000 x g vid 4 ° C och kasta bort supernatanten.
- Tillsätt 500 µL av RIPA bufferten med 1 x proteashämmare cocktail.
- Centrifugera under 5 minuter vid 3000 x g vid 4 ° C och kasta bort supernatanten.
- Tillsätt 1 mL av RIPA bufferten med 1 x proteashämmare cocktail. Genast fortsätta till nästa steg.
3. kromatin klippning
- Överföra den lysate till en någon sonikator tube och placera sedan tuben på en ultrasonicator.
- Skeva kromatinet med följande inställningar: temperatur: 4 ° C; infallande toppeffekt: 175 W; Duty faktor: 10%; cykler/burst: 200; och tiden: 2 400 s.
- Överför provet till en 1,5 mL-protein låg bindande tub och Centrifugera under 5 minuter vid 20 000 x g vid 4 ° C.
- Samla in supernatanten i en ny protein låg bindande tub.
Obs: Provet kan flash-frysta i flytande kväve och lagras vid-80 ° C.
4. kvalitetskontroll av DNA (omvänd Crosslinking)
- Blanda 20 µL av den lysate och 180 µL av ChIP eluering buffert (10 mM Tris-HCl (pH 8,0), 300 mM NaCl, 5 mM EDTA (pH 8,0) och 1% w/v sodium dodecyl sulfate (SDS)) i ett polymeras-kedjereaktion (PCR) rör. Inkubera provet vid 65 ° C i en termocykel för 6 h med termocykel locket öppet. Behåll locket på termocykel öppna att undvika överdriven denaturering.
Obs: ChIP eluering bufferten bör filtreras och lagras i rumstemperatur före användning. Denna inkubation kan utvidgas över natten. - Tillsätt 1 µL 10 mg/ml RNase, vortex, och inkubera vid 37 ° C i 30 min.
- Tillsätt 6,5 µL av 15 mg/mL proteinas K, vortex, och inkubera vid 55 ° C i 60 min.
- Överföra reaktionen till en låg DNA-bindning tube, tillsätt 4 µL av 5 mg/mL glykogen och vortex. Lägg sedan till 200 µL av fenol/kloroform/isopentanol (25:24:1) och Centrifugera under 5 minuter vid 18.000 x g vid rumstemperatur.
- Överför supernatanten till en ny DNA låg bindande tub. Tillsätt 200 µL buffert Tris-EDTA-NaCl (10 mM Tris-HCl (pH 8,0), 1 mM EDTA (pH 8,0) och 200 mM NaCl) till återstående fenol/kloroform/isopentanol lösning och Centrifugera under 5 minuter vid 18.000 x g vid rumstemperatur. Samla in supernatanten och blanda med första supernatanten.
- Tillsätt 900 µL av iskall etanol och inkubera i 1 h vid-20 ° C.
Obs: Denna inkubation kan utökas till 4 - 6 h. - Centrifugera under 30 minuter vid 18.000 x g vid 4 ° C.
- Kassera supernatanten. Tillsätt 1 mL iskallt 75% etanol till pellet och Centrifugera under 30 minuter vid 18.000 x g vid 4 ° C. Upprepa detta steg (två tvättar sammanlagt).
- Avlägsna supernatanten grundligt och lufttorka för 1 min i rumstemperatur.
- Tillsätt 50 µL av Tris-EDTA (TE) buffert och lös upp DNA genom inkubation det i rumstemperatur i 30 min eller vid 4 ° C över natten. Undvika vortexa eller pipettering. Hålla detta DNA som ”ingång” och använda det för bibliotek förberedelse vid behov.
- Mätning av DNA-koncentrationen med en fluorometer enligt tillverkarens anvisning (se tabell av material) och kontrollera storleksfördelning med en mikroflödessystem elektrofores maskin (se representativa data visas i figur 2a). Använd 10 ng eller mindre DNA för denna analys.
Obs: Fragment av 100 – 500 baspar (bp) bör göra upp 50% eller mer av DNA.
5. affinitet rening av anti-Flag antikropp
Obs: För neuron tChIP-Seq, hjärnans vävnader från 8 möss används vanligtvis för ett prov av tChIP-Seq för att förbereda 2 ng av renade DNA genom tandem immun-rening (se steg 7.1). I våra händer, 0,1 ng DNA fortfarande tillhandahålls högkvalitativa DNA bibliotek för ChIP-Seq (Kadota, opublicerad). I teorin, kan ett enda musklick således vara tillräckligt att utföra neuron tChIP-följande punkter Det erforderliga beloppet bör optimeras för vävnads- och typen av intresse. För den negativa kontrollen av imumuno-rening experiment, bör hjärnvävnad lysat från möss utan någon H2B-flaggan uttryck förberedas och används.
- Pipettera 200 µL av magnetiska pärlor konjugerat till fåren antimus immunglobulin G (IgG) till en låg proteinbindning rör.
- Placera röret på en magnetisk stå och vänta i 1 min för supernatanten blir tydlig. Tag bort supernatanten, tillsätt 1 mL iskallt PBS och vortex. Upprepa detta steg (två tvättar sammanlagt).
- Tillsätt 20 µL av 1 mg/mL anti-Flag antikropp och rotera i 5 h vid 4 ° C.
Obs: Denna inkubation kan utvidgas över natten. - Tvätta pärlor efter steg 5.2. Placera pärlorna i en 15 mL tub.
- Återsuspendera pärlorna i 1110 µL av RIPA bufferten och Lägg sedan till 900 µL 10 x blockerar reagens, 180 µL 50 x Denhardts lösning, 10 µL 100 x proteashämmare cocktail och 6,8 mL den lysate beredd i steg 3. Dela upp blandningen i 5 protein låg bindande rör. Rotera för 6 h vid 4 ° C.
Obs: Denna inkubation kan utvidgas över natten. - Placera röret på den magnetisk stå och vänta i 1 min för supernatanten blir tydlig. Tag bort supernatanten, tillsätt 1 mL av RIPA bufferten och blanda försiktigt. Upprepa detta 5 gånger (6 tvättar sammanlagt). Samla alla pärlor i ett enda protein låg bindande rör.
- Tillsätt 200 µL av ChIP eluering buffert och rotera i 15 min i rumstemperatur. Kontrollera kvaliteten på DNA som beskrivs i steg 4.11 (se representativa data som visas i figur 2B och C). Genast fortsätta till nästa steg.
6. affinitet rening av Anti-H3K4me3 antikropp och omvänd Crosslinking
Obs: Följande pärla beredning steg (6,1 – 6,4) bör utföras innan steg 5,7.
- Pipettera 40 µL av magnetiska pärlor konjugerat till fåren antimus IgG i en 2 mL-låg proteinbindning röret.
- Placera röret på den magnetisk stå och vänta i 1 min för supernatanten blir tydlig. Tag bort supernatanten, tillsätt 1 mL iskallt PBS och blanda försiktigt. Upprepa detta steg (två tvättar sammanlagt).
- Tillsätt 4 µL av 1 mg/mL anti-H3K4me3 antikropp och rotera för 6 h vid 4 ° C.
- Tvätta pärlor efter steg 6,2. Placera pärlorna i en 2 mL-låg bindning tube.
- Återsuspendera pärlorna i 1558 µL av RIPA bufferten och sedan tillsätt 200 µL 10 x blockerar reagens, 40 µL 50 x Denhardts lösning, 2 µL av 100 x proteashämmare cocktail och 200 µL eluatet beredd i steg 5.7. Rotera över natten vid 4 ° C.
Obs: SDS i ChIP eluering bufferten var utspädd mer än 10 gånger i denna inkubation. - Placera röret på den magnetisk stå och vänta i 1 min för supernatanten blir tydlig. Tag bort supernatanten, tillsätt 1 mL av RIPA bufferten och blanda försiktigt. Upprepa detta 4 gånger (5 tvättar sammanlagt). Efter den sista tvättningen, överföra pärlorna i ett DNA låg bindande rör, och kasta bort supernatanten.
- Tillsätt 200 µL av ChIP eluering buffert och rotera i 15 min i rumstemperatur. Överföra eluatet till en ny DNA låg bindingTube.
Obs: Eluatet kan lagras vid-80 ° C. - Följ Steg4 för decrosslinking av DNA. Återsuspendera renade DNA i 20 µL av TE buffert.
- Kontrollera kvaliteten på DNA som beskrivs i steg 4.11 (se representativa data som visas i figur 2D). (valfritt) Utföra anrikning analys av kvantitativ PCR som beskrivs tidigare2. Tiofaldig eller större berikning bör observeras.
7. bibliotek konstruktion
- För varje ingång och ChIP DNA-prov, beräkna andelen DNA i regionen 100 – 500-bp med funktionen utstryk analys av programvaran för mikroflödessystem elektrofores maskinen. Uppskatta den provvolymen som krävs för att erhålla 2 ng av 100 – 500 bp DNA. Använda 20 ng DNA i intervallet 100 – 500-bp som ”input” provet.
- Pipettera DNA-prover i 8-strip PCR-rören och Lägg till H2O att få den totala volymen till 10 µL. (valfritt) om volymen av DNA överstiger 10 µL, proportionellt skala upp följande slut-reparation reaktion och storlek urval.
- Förbereda slutet-reparation master mix (se Tabell för material). Tillsätt 4 µL av slut-reparation master mix av DNA och inkubera i 30 minuter vid 20 ° C.
- Tillsätt 36 µL 10 mm Tris-Cl, pH 8.5 och 0.6 x volym (30 µL) av fast fas reversibel immobilisering (SPRI) magnetiska pärlor och inkubera i 5 min i rumstemperatur.
- Placera röret på en magnetisk stå och vänta tills supernatanten blir tydligt.
- Överför supernatanten till en ny tub, lägga till 1,2 x-volymer (60 µL) av SPRI magnetiska pärlor och inkubera 5 min i rumstemperatur.
- Placera röret på en magnetisk stå och vänta tills supernatanten blir tydligt.
- Tvätta pärlorna två gånger med 200 µL av 80% EtOH, hålla röret fortfarande på magneten.
- Kort Centrifugera röret för att samla in de återstående EtOH längst ned och placera den tillbaka på magneten. Ta bort de kvarvarande EtOH grundligt.
- Låt röret locket öppet för 1-2 min till tillåta EtOH avdunsta.
- Stäng locket och håll röret på is.
Obs: Nu har du fått stoleken DNA av 100 – 500 bp på pärlor. Ytterligare detaljer om dubbel storlek urval kan hittas på tillverkarens hemsida (www.beckman.com). - Förbereda A-tailing master mix (se Tabell för material).
- Omsuspendera pärlorna (från steg 7.10) med 10 µL av A-tailing master mix och inkubera i 30 min vid 30 ° C.
- Lägg till 1,8 x volym (18 µL) av polyetylenglykol (PEG) / NaCl-lösning och inkubera i 5 min i rumstemperatur.
- Följ steg 7,7-7.11 för att rena DNA.
- Förbereda ligering buffert mix (se Tabell för material).
- Pipettera 8 µL av ligering buffert mix på pärlorna (från steg 7.14), tillsätt 1 µL av 1 µM adapter och resuspendera pärlorna. Använd 1 µL 5 µM adapter för ingång provet. Överväg att använda olika adaptrar för varje prov för multiplexing.
- Tillsätt 1 µL av DNA-Ligase och inkubera i 15 min vid 20 ° C.
- Tillsätt 1,0 x volym (10 µL) PEG/NaCl-lösning, Omsuspendera pärlorna och inkubera i 5 min i rumstemperatur.
- Följ steg 7,7-7.10 för att rena DNA.
- Pipettera 25 µL 10 mm Tris-Cl, pH 8.5 i röret och resuspendera pärlorna.
- Tillsätt 1,0 x volym (25 µL) av PEG/NaCl-lösning och inkubera i 5 min i rumstemperatur.
- Följ steg 7,7-7.10 för att rena DNA.
- Pipettera 11 µL 10 mm Tris-Cl, pH 8.5 i röret och resuspendera pärlorna.
- Placera röret på en magnetisk stå och vänta tills supernatanten blir tydligt.
- Samla in supernatanten i en ny 8-strip PCR-röret.
- Förbereda realtids PCR master mix (se material för detaljer).
- Pipettera 8,5 µL för realtids PCR master mix i en 384-väl kvantitativ PCR (qPCR) plattan och tillsätt 1,5 µL av adaptern sammanskrivna DNA (från steg 7,26).
- Pipettera 10 µL av varje fluorescerande standard i tomma brunnar.
- Utföra realtids-PCR med följande programm: (98 ° C för 45 s) x 1 cykel, (98 ° C under 15 s, 60 ° C under 30 s, 72 ° C under 30 s) x 20 cykler, och (72 ° C för 60 s) x 1 cykel.
- Bestämma antalet PCR cykler behövs för att nå fluorescensintensiteten hos den fluorescerande Standard 2.
- Förbered PCR master mix (se Tabell för material).
- Pipettera 11,5 µL av PCR huvudmixen i återstående adapter-sammanskrivna DNA (från steg 7,26) och utför PCR som anges i steg 7.30 med PCR cykler bestäms i steg 7,31.
- Tillsätt 1,0 x volym (20 µL) av PEG/NaCl-lösning och inkubera i 5 min i rumstemperatur.
- Följ steg 7,7-7.10 för att rena DNA.
- Överför med pipett 20 µL av 10 mM Tris-Cl, pH 8.5 i röret och resuspendera pärlorna.
- Placera röret på en magnetisk stå och vänta tills supernatanten blir tydligt.
- Samla in supernatanten i 1,5 mL-DNA låg bindande reservrör.
- Kontrollera kvaliteten på biblioteket som beskrivs i steg 4.11 (se representativa data som visas i figur 2E och F). Använd 1 µL bibliotek DNA-provet. (valfritt) Utföra anrikning analys av qPCR som beskrivs tidigare 2. Tiofaldig eller större berikning bör observeras.
8. sekvensering
- Sekvensera biblioteken i en nästa generations sequencer (se representativa data visas i figur 3).
Obs: Sekvens djupet räcker för dataanalys varierar beroende på den organism3genomet storlek. För människa och mus, rekommenderar vi att erhålla minst 20-40 miljoner single-end läsningar. Enligt avkastningen av läser, kan det vara kostnadseffektivt att multiplexing.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Här beskriver vi den vävnad dissektion, fixering, cellys, tandem rening av kromatin och DNA bibliotek förberedelse för nästa generations sequencers. Under förfarandena, kan man testa kvaliteten på DNA, vilket är nyckeln till framgångsrik sekvensering, på flera steg (figur 2). Eftersom en enda nukleosomens är oftast omgiven av 147 bp DNA 4, bör klippt DNA inte vara kortare än den storleken. Omedelbart efter ultraljud, DNA isolerades och köra på en mikroflödessystem elektrofores maskin (figur 2A). Trots våra bästa ansträngningar att optimera storleksintervall, hade vi fortfarande en befolkning av DNA (cirka 2 kbp) som förblev unsheared. I detta steg bör del av DNA från 100-500 bp 50% eller mer av befolkningen. Efter affinitet rening av anti-Flag antikropp (figur 2B) och sedan anti-H3K4me3 antikropp (figur 2D), var kvaliteten på isolerade DNA kontrolleras igen med mikroflödessystem elektrofores maskinen, och mängden DNA alltifrån 100-500 bp uppskattades. Även om vi ofta observeras en starkare inriktning mot 2 kbp fragment i detta steg, bort dubbel storlek urvalet av SPRI magnetiska pärlor denna fraktion.
Specificiteten av immun-rening av DNA på H2B-flagga bekräftades med de negativa kontrollprover, som hjärnan lysat från möss utan H2B-flagga användes uttrycket (figur 2 c). Vi upptäckt vanligtvis försumbara mängder DNA från de negativa kontrollproverna.
Efter A-tailing adapter ligering och PCR, kvaliteten på sekvensering biblioteket verifierades (figur 2E). Vanligtvis 250-600 bp DNA erhölls. Den framgångsrika regelbundna ChIP och tChIP var framgår av anrikning analysen med qPCR2 använda primers inriktning promotor regionen av genen GAPDH (figur 2F).
Representant Läs distributioner längs neuron gener (Camk2a, Slc17a7 och Gria1) av genomet-webbläsare visas i figur 3. Anrikningen av läsningar i slutet av gener av neuron tChIP-Seq över hela hjärnan tChIP-Seq 5′ observerades.
Figur 1: Schematisk bild av tChIP-följande punkter Denna siffra har ändrats från Mito, M. et al. 1. vänligen klicka här för att visa en större version av denna siffra.
Figur 2: DNA kvalitetskontroll. (A, B, Doch E) Elektroferogram erhålls använder en mikroflödessystem elektrofores maskin för klippt kromatin DNA (A), DNA renas med anti-Flag antikropp (B) och sedan anti-H3K4me3 antikropp (C), och det slutliga biblioteket (D). De toppar som markeras med gröna och lila siffror representerar inre storlek standarder. Blå streckade visar linjer DNA storlek regionerna ansåg för efterföljande analys. FU: fluorescens enheter.
(C) mängden DNA återkrävas av anti-Flag immun-rening. Varje punkt representerar en oberoende replikat. (F) berikning analys av qPCR inriktning GAPDH. Varje punkt representerar en oberoende replikat. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 3: Läs distributioner i neuron tChIP-följande punkter (A-C) Läs distributioner längs representativa neuron gener i neuron tChIP-Seq och kontroll hela hjärnan tChIP-Seq visas. RPM: läsningar per miljon läsningar. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Våra protokoll var optimerad för nervceller i hjärnans mus, där uttrycket av flagg-märkta H2B framkallas av tamoxifen injektion. Initiativtagare som används för H2B uttryck, vävnad utgångsmaterial och beloppet av vävnaderna är avgörande parametrar för framgångsrika tChIP-följande punkter Således, optimering av dessa faktorer övervägas för varje celltyp av intresse.
Ett kritiskt steg bland de förfaranden som används i detta protokoll är DNA klippning för att uppnå en kromatin längd 100-500 bp5. I allmänhet, är standardisering av ultraljud steget utmanande eftersom den beror på en mängd faktorer. fixering villkor, de vävnader som används, den utrustning som används för ultra-ultraljudsbehandling och utrustningen miljö, bland andra. Trial-and-error optimering av detta DNA klippning steg kommer därför krävs för enskilda experiment. I stället för ultra-ultraljudsbehandling, måste micrococcal nukleotid vara ett alternativ att isolera enstaka nukleosomens och medelstora DNA, som används i den naiva ChIP metod6. Även om den homogen storlek distribution av DNA är perfekt, klippt kan DNAs Visa flera befolkningarna, som visas i figur 2A. Dubbel storlek urvalet av SPRI magnetiska pärlor, som beskrivits ovan, hjälper till att avlägsna den längre storlek av DNA-fragment.
Vanligtvis bibliotek beredning kräver 1 ng av 100-500 bp DNA. Baserat på detta krav, skalas vi upp ursprungliga materialet i hjärnvävnaden för nervceller. Men kan proceduren vara utmanande för extremt små prover från sällsynta celltyper. I sådana fall kan ChIP förandet, som är baserad på Tn5 transposase istället för ligase och kräver mindre material7, vara bättre alternativ.
Detta nuvarande protokoll är dock begränsad till de stora celltyper i materialet. I våra händer förutsatt 10% beläggning av riktade celler i den ursprungliga cell befolkningen rättvis rening av kromatin från målet celler1. Dock om ännu mer sällsynta celltyper är riktade, kommer sedan finare optimering av immunoprecipitation med taggen epitop vara befogat för att skilja isolerad DNA från förorenade DNA från icke öronmärkt celler. För bästa praxis för dataanalys rekommenderar vi att du jämför data till kontroll tChIP-Seq analysen från hela vävnaden används för att initiera experimentet. Eftersom vi hittade betydande fördomar från exogent uttryckt H2B-flaggan protein, bör analysen jämföras och analyseras av anrikning (eller utarmning) till bakgrunden1. För denna kontroll, vi verkligen skapat en mus linje med ubiquitously uttryckt H2B-flagga (RosaH2B-flaggan) och utförs tChIP-Seq1. En mer detaljerad tolkning av data har tidigare diskuterats1.
Utifrån vår analys, den H3K4me3 tChIP-Seq från nervceller som jämförbara eller bättre identifiering av kända neuron-specifika gener än RNA-Seq från FACS-sorterade nervceller8 och översätta ribosom affinitet rening (TRAP)-Seq9. Exempelvis återfanns effektivt kända axon/dendrite-lokaliserad generna använder neuron tChIP-Seq1. Anmärkningsvärt, vår tChIP-Seq begränsas inte för arrangören-associerade Histon märket men gäller även för andra olika Histon ändringar10 om antikropparna är tillgängliga. Strategin att isolera kromatin av märkta core Histon proteiner kan dessutom användas i andra modellorganismer. Även här använde vi den flaggan epitop tagga proteinet core Histon, kan andra taggar tillämpas. Eftersom formaldehyd fixering till DNA uppstår oftast på lysin rester av ett protein11, bör en tagg med många lysin undvikas för att undanröja fördomar av epitop märkning. Metoden tChIP-Seq bör således vara mångsidig i olika vävnader längs många typer av sammanhang i epigenetiska studier.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna har något att avslöja.
Acknowledgments
Vi tackar alla medlemmar i Iwasaki lab för kritisk läsning av manuskriptet. Detta arbete var stöds delvis av ett bidrag för vetenskaplig forskning på innovativa områden (nr 26113005 att S.N. och JP17H05679 till S.I.); ett bidrag för unga forskare (A) (JP17H04998 till S.I.) från ministeriet för utbildning, vetenskap, sport och kultur i Japan (MEXT); och banbrytande projekt ”cellulära Evolution” och alla RIKEN projektet ”sjukdom och epigenomet” från RIKEN (till S.N. och S.I.).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Protein LoBind tube, 2 mL | Eppendorf | No. 0030108132 | For cell lysis |
| Protein LoBind tube, 1.5 mL | Eppendorf | No. 0030108116 | For ChIP and library preparation |
| DNA LoBind tube, 1.5 mL | Eppendorf | No. 0030108051 | For ChIP and library preparation |
| 8-strip PCR tube | BIO-BIK | 3247-00 | For ChIP and library preparation |
| SK Mill | TOKKEN | SK-200 | Handy cryogenic grinder to make cell powder for fixation |
| Metal bullet | TOKKEN | SK-100-DLC10 | Accessory of SK Mill |
| 2 mL stainless steel tube | TOKKEN | TK-AM5-SUS | An option for cell lysis |
| 2 mL stainless steel tube holder | TOKKEN | SK-100-TL | An option for cell lysis |
| 16% formaldehyde (w/v), methanol-free | Pierce | 28906 | To fix cells. Prepare 1% solution before use. |
| Glycine | Nacalai Tesque | 17109-35 | Prepare 2.5 M stock |
| D-PBS (-)(1x) | Nacalai Tesque | 14249-24 | For washing lysate and purified DNA |
| HEPES | Nacalai Tesque | 02443-05 | For Lysis buffer 1. Prepare 1 M, pH 7.5 stock. |
| 5 M NaCl, molecular biology grade | Nacalai Tesque | 06900-14 | For Lysis buffer 1, Lysis buffer 2, ChIP Elution Buffer, and Tris-EDTA-NaCl Buffer |
| 0.5 M EDTA, molecular biology grade | Wako Pure Chemical Industries, Ltd. | 311-90075 | For Lysis buffer 1, Lysis buffer 2, ChIP Elution Buffer, and Tris-EDTA-NaCl Buffer |
| Glycerol | Wako Pure Chemical Industries, Ltd. | 072-04945 | For lysis buffer 1 |
| NP-40 | Nacalai Tesque | 25223-75 | For lysis buffer 1 |
| Triton X-100, molecular biology grade | Nacalai Tesque | 12967-32 | For Lysis buffer 1 |
| Tris | Nacalai Tesque | 35406-91 | For Lysis buffer 2, ChIP Elution Buffer, and Tris-EDTA-NaCl Buffer. Prepare 1 M, pH 8.0 stock. |
| 0.1 M EGTA pH neutral | Nacalai Tesque | 08947-35 | For Lysis Buffer 2 |
| Protease inhibitor cocktail (100x) | Nacalai Tesque | 25955-24 | To block degradation of protein |
| RIPA buffer | Thermo Fisher Scientific | 89900 | For cell lysis and washing |
| milliTUBE 1 mL AFA Fiber | Covaris | 520130 | Sonicator tube. Accessory of Focused-ultrasonicator |
| Focused-ultrasonicator | Covaris | S220 or E220 | To digest DNA into adequate size for ChIP-Seq |
| UltraPure 10% SDS | Thermo Fisher Scientific | 15553-027 | For ChIP Elution Buffer |
| RNase A | Nacalai Tesque | 30141-14 | To purify DNA from lysate |
| Proteinase K, recombinant, PCR Grade | Sigma-Aldrich | 3115887001 | To purify DNA from lysate |
| Ethanol | Wako Pure Chemical Industries, Ltd. | 054-07225 | Make 70% solution |
| Monoclonal anti-FLAG M2 antibody produced in mouse | Sigma-Aldrich | F1804 | To purify chromatin expressed in cells of interest |
| Dynabead M-280 Sheep Anti-Mouse IgG | Thermo Fisher Scientific | 11201D | This can be used for anti-FLAG IP and anti-H3K4me3 IP |
| Anti-tri-methyl histone H3 (K4), mouse monoclonal antibody | Wako Pure Chemical Industries, Ltd. | 301-34811 | Any other antibody that works for ChIP analysis will work |
| 10x Blocking Reagent | Sigma-Aldrich | 11096176001 | For blocking during affinity purification |
| Denhardt’s solution | Nacalai Tesque | 10727-74 | For blocking during affinity purification |
| Glycogen (5 mg/ml) | Thermo Fisher Scientific | AM9510 | To purify DNA from lysate |
| Qubit 2.0 Fluorometer | Thermo Fisher Scientific | Q32866 | For quantification of isolated DNA |
| Qubit dsDNA HS Assay Kit | Thermo Fisher Scientific | Q32851 | For quantification of isolated DNA |
| 0.5 mL tube | Axygen | 10011-830 | For quantification by Qubit |
| Phenol/chloroform/isoamyl alcohol (25:24:1) | Nacalai Tesque | 25970-56 | To purify DNA from lysate |
| AMPure XP beads | Beckman Coulter | A63881 | SPRI magnetic beads for library preparation |
| Metal ice rack | Funakoshi | IR-1 | To keep the cell lysate frozen |
| Sample Cooler | New England Biolabs | T7771S | Helps fix cells with minimal damage |
| 2100 Bioanalyzer | Agilent Technologies | G2939BA | To check the quality of isolated DNA fragments. Another fragment analyzer can be used. |
| Bioanalyzer 2100 Expert Software | Agilent Technologies | G2946CA | Supplied with the Bioanalyzer |
| High Sensitivity DNA Kit | Agilent Technologies | 5067-4626 | To check the quality of the isolated DNA fragments |
| KAPA LTP Library Preparation Kit | Roche | 07961898001 | Supplied with 10x KAPA End Repair Buffer, KAPA End Repair Enzyme Mix, KAPA A-Tailing Buffer, KAPA A-Tailing Enzyme, KAPA Ligation Buffer, KAPA DNA Ligase, and PEG/NaCl solution |
| NEXTflex DNA Barcodes | BIOO Scientific | NOVA-514101 | Adapter for library preparation. Supplied with DNA Barcode Adapters and Primer Mix. |
| KAPA Real-Time Library Amplification Kit | Roche | 07959028001 | Supplied with 2x KAPA HiFi HS real-time PCR Master Mix, PCR Primer Mix, and Fluorescent Standards |
| 2x KAPA HiFi HotStart ReadyMix | Roche | KM2602 | For library preparation. Additionally, this enzyme may be required for the KAPA Real-Time Library Amplification Kit |
| Buffer EB | Qiagen | 19086 | 10 mM Tris-Cl, pH 8.5 for elution of DNA |
| 386-well qPCR plate | Thermo Fisher Scientific | 4309849 | For real-time PCR |
| QuantStudio 7 Flex Real-Time PCR System | Thermo Fisher Scientific | 4485701 | To quantify DNA |
| MicroAmp Optical Adhesive Film | Thermo Fisher Scientific | 4311971 | For real-time PCR |
| MicroAmp Clear Adhesive Film | Thermo Fisher Scientific | 4306311 | For plate sealing |
| End-repair master mix | Combine 1.4 µL of 10x KAPA End Repair Buffer, 1 µL of KAPA End Repair Enzyme Mix, and 1.6 µL of H2O | ||
| A-taling master mix | Combine 1 µL of KAPA A-Tailing Buffer, 0.6 µL of KAPA A-Tailing Enzyme, and 8.4 µL of H2O | ||
| Ligation buffer mix | Combine 2 µL of KAPA ligation buffer and 6 µL of H2O | ||
| Real-time PCR master mix | Combine 5 µL of 2x KAPA HiFi HS real-time PCR Master Mix, 0.35 µL of PCR Primer Mix (10 µM each of forward primer AATGATACGGCGACCACCGAG and reverse primer CAAGCAGAAGACGGCATACGAG), and 3.15 µL of H2O | ||
| PCR master mix | Combine 10 µL of 2x KAPA HiFi Ready Mix, 0.9 µL of PCR Primer Mix, and 0.6 µL of H2O | ||
| Integrative Genomics Viewer | Broad Institute | IGV_2.3.88 | Genome browser to visualize sequencing data |
| DNA olgionucleotide: 5′-GCCTACGCAGGTCTTGCTGAC-3′ | Eurofins Genomics | A primer to amplify the promoter region of GAPDH | |
| DNA olgionucleotide: 5′-CGAGCGCTGACCTTGAGGTC-3′ | Eurofins Genomics | A primer to amplify the promoter region of GAPDH | |
| SYBR Premix Ex Taq | Takara | RR420L | To quantify the DNA corresponding to the GADPH promoter region |
| Thermal Cycler Dice | Takara | TP870 | To quantify the DNA corresponding to the GADPH promoter region |
References
- Mito, M., et al. Cell type-specific survey of epigenetic modifications by tandem chromatin immunoprecipitation sequencing. Scientific Reports. 8 (1), 1143 (2018).
- Kadota, M., et al. CTCF binding landscape in jawless fish with reference to Hox cluster evolution. Scientific Reports. 7 (1), 4957 (2017).
- Jung, Y. L., et al. Impact of sequencing depth in ChIP-seq experiments. Nucleic Acids Research. 42 (9), (2014).
- Becker, P. B., Workman, J. L. Nucleosome remodeling and epigenetics. Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 5 (9), a017905 (2013).
- Kidder, B. L., Zhao, K. Efficient library preparation for next-generation sequencing analysis of genome-wide epigenetic and transcriptional landscapes in embryonic stem cells. Methods in Molecular Biology. , 3-20 (2014).
- Gilfillan, G. D., et al. Limitations and possibilities of low cell number ChIP-seq. BMC Genomics. 13, 645 (2012).
- Schmidl, C., Rendeiro, A. F., Sheffield, N. C., Bock, C. ChIPmentation: fast, robust, low-input ChIP-seq for histones and transcription factors. Nature Methods. 12 (10), 963-965 (2015).
- Zhang, Y., et al. An RNA-sequencing transcriptome and splicing database of glia, neurons, and vascular cells of the cerebral cortex. Journal of Neuroscience. 34 (36), 11929-11947 (2014).
- Hornstein, N., et al. Ligation-free ribosome profiling of cell type-specific translation in the brain. Genome Biology. 17 (1), 149 (2016).
- Zhao, Y., Garcia, B. A. Comprehensive catalog of currently documented histone modifications. Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 7 (9), a025064 (2015).
- Hoffman, E. A., Frey, B. L., Smith, L. M., Auble, D. T. Formaldehyde crosslinking: a tool for the study of chromatin complexes. The Journal of Biological Chemistry. 290 (44), 26404-26411 (2015).
