Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Immunology and Infection
Click here for the English version

Immunology and Infection

Modellering tuberkulos i Mycobacterium marinum infekterade vuxna zebrafiskar

Published: October 8, 2018 doi: 10.3791/58299
Automatic Translation
1, 1, 1, 1,2
1Faculty of Medicine and Life Sciences, University of Tampere, 2Oral and Maxillofacial Unit, Tampere University Hospital

Summary

Här presenterar vi ett protokoll till modell human tuberkulos i en vuxen zebrafiskar som använder dess naturliga patogen Mycobacterium marinum. Extraherad DNA och RNA från de inre organen av infekterade zebrafiskar kan användas för att avslöja totalen mykobakteriella laster i fisken och värdens immunsvar med qPCR.

Abstract

Mycobacterium tuberculosis är för närvarande den dödligaste mänskliga patogener som orsakar 1,7 miljoner dödsfall och 10,4 miljoner infektioner varje år. Exponering för denna bakterie orsakar ett brett sjukdom spektrum hos människor alltifrån en steriliserad infektion till ett aktivt progredierande dödliga sjukdom. Den vanligaste formen är den latent tuberkulos, som är asymtomatiska, men har potential att återaktivera in en fulminant sjukdom. Adult zebrafiskar och dess naturliga patogen Mycobacterium marinum har nyligen visat sig vara en tillämpliga modell att studera brett sjukdom spectrumen av tuberkulos. Ännu viktigare, kan spontana latens samt reaktivering och adaptiva immunsvaret i samband med mykobakteriella infektioner studeras i denna modell. I den här artikeln beskriver vi metoder för experimentell infektion av vuxen zebrafiskar, insamling av inre organ för utvinning av nukleinsyror för mätning av mykobakteriella laster och värd immunsvar med kvantitativ PCR. Den i egenutvecklade, M. marinum -specifik qPCR-analys är känsligare än de traditionella plätering metoderna som också upptäcker DNA från icke-Division, vilande eller nyligen döda mykobakterier. Som både DNA och RNA extraheras från en och samma individ, är det möjligt att studera relationerna mellan tillståndet sjuka och värd och patogen-genuttrycket. Den vuxna zebrafisk modellen för tuberkulos således presenterar sig som ett starkt gällande, icke däggdjur i vivo -system för att studera värd-patogen interaktioner.

Introduction

Sebrafisken (Danio rerio) är en allmänt använd djurmodell i biomedicinsk forskning och det är en vedertagen modell för gemensamma ryggradsdjur biologi. Zebrafisk har anpassats till många forskningsområden modellering mänskliga sjukdomar och besvär i alltifrån cancer1 och hjärtsjukdom2 till infektion och immunologiska studier av flera bakteriella 3 och virusinfektioner4 , 5. Dessutom ex utero utveckling zebrafiskar embryon har gjort zebrafiskar en populär modell i utvecklingsbiologi6 och toxikologi7,8.

Inom många forskningsområden, inklusive infektionsbiologi, används vanligen optiskt genomskinliga zebrafiskar larverna. De första immuncellerna visas inom 24 h efter befruktning (hpf), när primitiva makrofager är upptäckta9. Neutrofiler är nästa immuncellerna ska visas runt 33 hpf10. Zebrafiskar larver är därmed genomförbara för att studera de tidiga stadierna av infektion och rollen av den medfödda immuniteten i avsaknad av adaptiv immunceller11. Men ger den vuxna zebrafiskar med dess fullt funktionella adaptiva immunsystemet ett extra lager av komplexitet för infektion experiment. T-celler kan upptäckas runt 3 dagar efter befruktning12och B-celler kan producera funktionella antikroppar av 4 veckor efter befruktning13. Den vuxna zebrafisk har alla de viktigaste motposter däggdjur medfödd och adaptiv immunsystemet. De viktigaste skillnaderna mellan immune systems fisk och människor finns i antikropp isotyper samt liksom anatomin av lymfvävnad. Zebrafisk har endast tre antikropp klasserna14, medan människor har fem15. I avsaknad av benmärg och lymfkörtlar, de primära lymfoida organ i fisken är njurarna och bräss16 och mjälten, njurarna och tarmen fungera som sekundära lymfoida organ17. Trots dessa skillnader, med dess fullständiga immun arsenal av medfödd och adaptiv celler, är de vuxna zebrafiskar en starkt gällande, lätt-till-använda, icke däggdjur modell för värd-patogen interaktionsstudier.

Zebrafisk har nyligen etablerat sig som en genomförbar modell för att studera tuberkulos18,19,20,21,22. Tuberkulos är en luftburen sjukdom som orsakas av Mycobacterium tuberculosis. Enligt Världshälsoorganisationen, tuberkulos orsakade1,7 miljoner dödsfall under 2016 och är den ledande dödsorsaken av en enda patogen världen över23. Möss24,25, kaniner26 och icke-mänskliga primater27 är den mest kända djuren modeller i tuberkulos forskning men varje ansikte sina begränsningar. Den icke-mänskliga primater modellen av M. tuberkulosinfektion liknar mänskliga sjukdomen närmast, men med denna modell är begränsad på grund av allvarliga etiska överväganden. Andra djurmodeller hindras av värd-specificitet M. tuberkulos som påverkar sjukdomen patologin. Förmodligen den största frågan i modellering tuberkulos är det breda spektrumet av infektioner och sjukdomar resultat i den mänskliga sjukdomen: tuberkulos är en mycket heterogen sjukdom som alltifrån sterilisering immunitet mot latent, aktiv och återaktiverade infektion28 , vilket kan vara svårt att reproducera och modell experimentellt.

Mycobacterium marinum är en nära släkting till M. tuberkulos med ~ 3000 orthologous proteiner med 85% aminosyra identitet29. M. marinum infekterar naturligt zebrafiskar som producerar granulom, kännetecken för tuberkulos, i dess inre organ19,30. Till skillnad från andra djurmodeller används i tuberkulos forskning, zebrafiskar producerar många avkommor, det kräver bara ett begränsat utrymme och ännu viktigare, det är neurophysiologically minst utvecklade ryggradsdjur tuberkulos modell tillgänglig. Dessutom orsakar M. marinum infektion latent infektion, aktiv sjukdom eller ens sterilisering av mykobakteriella infektioner i vuxen zebrafiskar noga härma spectrumen av sjukdom utfall av human tuberkulos19, 31 , 32. här, vi beskriver metoder för experimentell tuberkulos modellen av vuxen zebrafiskar genom att injicera M. marinum i bukhålan och med kvantitativ PCR för att mäta mykobakteriella laster och immunsvar från zebrafisk vävnadsprover.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Alla zebrafiskar experiment har godkänts av djur Experiment styrelsen i Finland (ESAVI/8245/04.10.07/2015). Metoderna utförs enligt lagen (497/2013) och statsrådets förordning (564/2013) om skydd av djur som används för vetenskapliga ändamål eller undervisningsändamål i Finland.

1. odling av Mycobacterium marinum

Obs: Eftersom Mycobacterium marinum är en patogen som kan orsaka ytliga infektioner hos människor, ta reda på de lokala riktlinjerna för personsäkerhet och biohazard avfallshantering innan du börjar arbeta med denna bakterie.

  1. Kultur M. marinum på en 7 H 10 plattan kompletteras med 10% OADC (oljesyra, albumin, dextros, katalas) berikning och 0,5% v/v glycerol på 29 ° C i minst 5 dagar. Upprätthålla M. marinum kulturer genom att ta färska bakterier från frysen varannan vecka och överföra till en ny platta varannan vecka.
    Obs: M. marinum är en naturlig fisk patogen infekterar vattenlevande arter och det är viktigt att du vidtar inte förorena zebrafiskar bestånd med bakterier. Infekterade zebrafiskar och delar som kontaminerats med bakterier måste hållas åtskilda från avel faciliteter.
  2. Använd en steril 1-µL inympning loop aseptiskt överföra en platinaögla M. marinum bakteriell massa i en cell kultur mätkolv som innehåller 10 mL 7 h 9 medium med 10% ADC (albumin, dextros, katalas) anrikning, 0,2% v/v polysorbat 80 och 0,2% v/v i glycerol. Kultur i 3 – 4 dagar till ungefärligt en OD600 (optisk densitet) av 0,7 vid 29 ° C i mörker utan skakningar. Lämna locket löst, eller använda en filterkåpan, för tillräcklig utbyte av gaser.
    Obs: Polysorbat 80 läggs till medium att förhindra aggregering av bakterier. Dessutom, leder exponering för ljus till fenotypiska förändringar i bakteriekolonier (t.ex., färgen skiftar från vitt till gult). Undvik detta genom att hålla kulturerna i mörkret.
  3. Mäta värdet OD600med en spektrofotometer. Späd flytande kulturen till en OD600 av 0,07 – 0,09 och fortsätta odla under 2 dagar på 29 ° C i mörker utan att skaka. Lämna locket löst.
    Obs: Under dessa två dagar, bakteriesuspensionen når en OD600av ungefärligt 0.5 motsvarar en tidig log-fas.

2. beredning av bakteriell lösning för smitta vuxna zebrafiskar

  1. Överför bakteriesuspensionen till en stor sterila kyvetten eller en 15 mL tub och placera den i mörker vid rumstemperatur i 15 min så att de största klumpar sedimentera.
  2. Överför den översta 5-7 mL av suspensionen till en ren slang eller en kyvetten och mäta OD600. Använd denna topp fas av upphängning för infektioner.
  3. Samla in 1 mL M. marinum kultur i en färsk tub och Centrifugera under 3 minuter vid 10 000 x g. Avlägsna supernatanten och återsuspendera pelleten i 1 mL steril 1 x PBS.
  4. Späd till önskad bakteriell koncentration med hjälp av steril 1 x PBS med 0,3 mg/mL fenolrött som spårämne. Dela den utspädda suspensionen i tre delprover.
    Obs: Använd en förutbestämd OD600 vs CFU (kolonibildande enheter) / µL kurvan att uppskatta spädning krävs för att få det önskade antalet bakterier i de 5 µL injektion volym34. Korrelationen mellan OD600 och koncentrationen av bakteriesuspensionen måste valideras innan du startar de faktiska infektion experiment. Reservera två veckor för denna validering-datainsamling.
  5. Med en 1 mL spruta, långsamt dra suspensionen genom en 27 G nål 3 x. För varje alikvot, utföra det här steget precis före användning.
    Obs: Använd inte samma bakterie lösning för mer än 2 h.

3. experimentell M. marinum infektion med Intraperitoneal injektion

  1. Pipettera en 5 µL droppe av den utspädda bakteriella lösningen på en bit av parafilm film och dra droplet-programmet i en 30 G insulin nål.
  2. Använder 5 – 8-månad-gammal vildtyp och rag1−/−hu1999 mutant fisk för experimentet. Söva vuxen zebrafiskar i tank vatten med 0,02% 3-aminobensoesyra acid ethyl ester (pH 7,0). Placera den fisk ventral Sidan upp i en springa på en fuktig skummad plast.
    Obs: Rag-/- mutant fisk kan inte genomgå somatisk rekombination och producera funktionella T och B celler.
  3. Injicera nålen mellan bäcken fenorna på ett ungefär 45° vinkel. Håll nålen öppningen uppåt för att konstatera att hela öppningen är inne i bukhålan. Injicera långsamt bakteriesuspensionen och ta försiktigt bort nålen.
    Obs: om den röda tracer läcker ut ur fisken vid injektion, utesluta fisk från experimentet.
  4. Omedelbart efter injektion, över fisken till en återhämtning tank med färskt vatten.
  5. Ta prover av bakteriesuspensionen på 7H 10 plattor varje 15 min från bakteriella alikvotens används och inkubera bakterierna på 29 ° C i 5 dagar och verifiera den infektion dosen genom räkning av kolonierna på plattorna.
  6. Regelbundet kontrollera wellen-being av fisken och avliva någon fisk med symtom på infektion med över 0,02% koncentration 3-aminobensoesyra acid ethyl Ester (pH 7,0).
    Obs: Ungefärligt, 7% av den vuxna zebrafiskar smittad med 34 ± 15 CFU och 30% av zebrafisk infekterade med 2029 ± 709 CFU haft symtom av 8 veckor19. Symtomen kan inkludera onormal simning, bristen på svar till touch, flämtar, ödem eller observerbara slösa.
  7. Upprätthålla zebrafiskar enligt de gemensamma standarder35.

4. insamling av inre organ

  1. Avliva zebrafiskar med en överdos av 3-aminobensoesyra acid ethyl ester (över 0,02% koncentration, pH 7,0) i tank vatten.
  2. Infoga en pin posteriort branchiostegal strålar och en annan genom svansen till tackel fisken på plattformen.
  3. Öppna hela bukhålan med en skalpell och samla de inre organen genom att använda en liten sked och sharp-slutade pincett. Börja från hjärtat och arbeta längs ryggraden mot svansen för att lossa alla inre organ i ett block.
    Obs: Glöm inte att samla alla njure vävnad genom att skrapa längs ryggraden med sked.
  4. Slutligen Använd pincett att lossa tarmen bredvid kloaken och överföra organ i ett 1,5 mL homogenisering rör med sex 2,8 mm keramiska pärlor. Placera omedelbart på torr-isen att frysa provet. Provet kan förvaras vid-80 ° C tills homogeniserade.
  5. Skölj instrument med 70% etanol mellan individer.

5. homogenisering och RNA extraktion från en orgel-block.

Obs: Metoden ändras från den Stanford University protokoll36.

  1. Lägga till guanidin kaliumtiocyanat-fenol lösning används för nukleinsyra utvinning (Tabell för material) på toppen av provet till en total volym av 1 500 µL. se till att provet omfattar högst 10% av den totala volymen.
    Varning: Den beräknade volymen av skördade vävnad är 100 µL. guanidin kaliumtiocyanat-fenol lösning innehåller giftiga och irriterande föreningar och kräver skyddskläder, handskar i nitril och arbeta i dragskåp. Blanda inte med blekmedel eftersom detta kommer att orsaka bildandet av giftiga gaser. Läs material säkerhetsdatablad (MSDS) före användning.
  2. Homogenisera prover med en pärla-slog Homogenisatorer 3 gånger för 40 s vid 3200 rpm. Cool på is för 30 s mellan cyklerna. Sonikera de homogeniserade proverna i ett vattenbad för 9 min.
  3. Centrifugera proverna på 12 000 x g i 10 minuter vid 4 ° C och flytta 1000 µL av rensas Homogenatet i ett färskt mikrocentrifug rör.
  4. Tillsätt 200 µL kloroform, omedelbart blanda av vortexa för 15 s och inkubera i 2 min i rumstemperatur.
    FÖRSIKTIGHET: Kloroform är en giftig och irriterande förening vid inandning, förtäring eller kontakt med hud eller ögon. Använd nödvändig säkerhetsutrustning för personligt skydd och arbeta i dragskåp. Läs material säkerhetsdatablad (MSDS) före användning.
  5. Centrifugera vid 12 000 x g i 15 minuter vid 4 ° C till separata vattenfasen och den organiska faser.
  6. Noggrant, överföra 500 µL av den övre fasen till ett färskt rör för att undvika kontaminering av RNA. Ta bort och kassera resten av vattenfasen (~ 100 µL) och lagra interphase och organiska fasen vid 4 ° C för DNA-extraktion.
    Obs: Den övre fasen innehåller RNA.
  7. Tillsätt 500 µL av 2-propanol och omedelbart blanda genom vortexa för 15 s. Inkubera i 10 minuter vid rumstemperatur utfällning RNA.
  8. Centrifugera vid 12 000 x g i 10 minuter vid 4 ° C till pellet RNA. Ta bort supernatanten genom pipettering.
  9. Tillsätt 1 mL av 75% etanol och virvel för 10 s.
    Obs: Protokollet kan pausas här, och proverna hålls över natten vid 4 ° C.
  10. Centrifugera vid 7 500 x g under 5 minuter vid 4 ° C. Ta bort supernatanten genom pipettering.
  11. Upprepa stegen tvätta 5,9 – 5.10. Ta bort supernatanten noggrant genom pipettering och låt pelleten lufttorka i ett dragskåp.
  12. Lös den RNA pelleten i 500 µL nuclease-gratis vatten och hålla proverna på is. Mätning av koncentrationerna med en microvolume spektrofotometer eller med motsvarande utrustning. Store RNA vid-80 ° C.

6. rening av samtidig extraherade zebrafiskar och mykobakteriella DNA

  1. Förbereda en tillbaka-extraktion buffert (BEB) genom upplösning 118,2 g guanidin kaliumtiocyanat (slutlig koncentration 4 M), 3.68 g natriumcitrat (slutlig koncentration 50 mM) och 30.29 g för Tris gratis base (slutlig koncentration 1 M) i 120 mL nuclease-fritt vatten (detta kan ««kräver omrörning över natten). Tillsätt nuclease-fritt vatten till en slutlig total volym 250 mL och filter för att sterilisera lösningen.
    Obs: Denna buffert kan förvaras vid rumstemperatur i upp till 6 månader. Blanda inte BEB med blekmedel som de reagerar för att producera giftiga gaser såsom väteklorid och cyanväte.
  2. Använd interphase och organiska fasen av provet för att extrahera mykobakteriella DNA. Tillsätt 500 μL av BEB i varje rör. Blanda i stor utsträckning för 10 min av inversion i rumstemperatur.
  3. Centrifugera rören på 12 000 x g i 30 min i rumstemperatur och noggrant överföra 500 µL av övre vattenfas som innehåller DNA till en ny tub.
  4. Tillsätt 400 μL av 2-propanol. Blanda genom att vända och inkubera i 10 minuter vid rumstemperatur.
  5. Centrifugera proverna på 12 000 x g i 15 minuter vid 4 ° C. En pellets som innehåller DNA ska synas på denna punkt. Ta försiktigt bort supernatanten genom pipettering.
  6. Tillsätt 800 μL av 70% etanol. Tvätta pelleten genom inversion. Gör inte vortex proverna vid denna punkt, som genomiskt DNA går sönder lätt.
  7. Centrifugera proverna på 12 000 x g i 15 minuter vid 4 ° C och ta bort supernatanten genom pipettering. Upprepa den etanol tvätten (steg 6,6 och 6,7).
  8. Ta bort etanol genom noggrant pipettering. Låt proverna lufttorka för 5 – 10 min. Lös pelleten i 200 μL nuclease-gratis vatten.
  9. Mäter DNA koncentrationer med en microvolume spektrofotometer eller med motsvarande utrustning. DNA kan lagras vid 4 ° C eller vid-20 ° C för långsiktig lagring.

7. kvantitativ PCR för att mäta mykobakteriella laster

  1. Förbereda qPCR reaktionsmixar med no-ROX (karboxi-X-rodamin) mot M. marinum inre transkriberas distanshylsan (ITS) mellan 16S-23S ITS enligt tillverkarens anvisningar med MMITS1 grundfärger (tabell 1). Pipettera en reaktionsblandning och prova utspädningar som dubbletter på en lämplig för qPCR plattan med 96 brunnar. Inkludera en DNA standard utspädning serie en känd mängd bakterier i varje körning.
    Obs: Den förväntade M. marinum Last per fisk kan variera från 0 CFU till 1.000.000 CFU på 4 wpi. QPCR analysen kan också utföras med andra qPCR Kit men glödgning temperaturen för primers måste vara åter optimerad.
  2. Försegla plattan med en optiskt transparent film och centrifugera plattan vid 2000 x g under 2 minuter vid 4 ° C.
  3. Kör programmet qPCR visas i tabell 2.
  4. Användning av standardkurvan, beräkna antalet bakterier i hela fisk provet.

8. DNAS behandling av de RNA-proverna

  1. Ta bort alla eventuella återstående spår av genomisk DNA från RNA, utföra DNAS I behandling. Tina de RNA-proverna på is.
    Obs: Var noga med att använda endast RNase-fri utrustning och lösningar och torka arbetsytor och pipetter med en sanering reagens eliminera RNaser (Tabell för material) innan du börjar arbeta. Bära en långärmad labbrock och handskar för att skydda dina prover.
  2. Förbereda 10 μL DNAS jag reaktionsmixar på is enligt tillverkarens anvisningar. Blanda 1 μL av DNAS I, 1 μL 10 x DNAS buffert och 8 μl av RNA prov varav högst 1 μg RNA.
  3. Blanda reaktionerna (ingen vortexa) försiktigt och inkubera i 30 minuter vid 37 ° C.
  4. Före Värmeinaktivering, tillsätt 1 µL 50 mM EDTA i varje 10 µL prov. Om EDTA inte läggs, ska RNA genomgå kemisk nedbrytning vid upphettning.
  5. Inkubera i 10 min vid 65 ° C värme-inaktivera DNAS I. fortsätta direkt till cDNA syntes eller lagra DNAS-behandlade RNA vid-80 ° C.

9. cDNA syntes

  1. Hålla alla reagenser och prover på is och förbereda reaktionsmixar enligt tillverkarens anvisningar. För en 5 μl reaktion mix, inkluderar 1 μL av omvänd Transkription Master Mix, 3 μL nuclease-gratis vatten och 1 μL av DNAS behandlas RNA.
  2. Blanda försiktigt omvänd Transkription reaktionerna och kort snurra slangen, om det behövs.
  3. Placera prover i en PCR-maskin och använda programmet visas i tabell 3.
  4. Späd cDNA i nuclease-fritt vatten för qPCR till en maximal koncentration av 2,5 ng/μl, om det behövs. cDNA kan förvaras vid-20 ° C.

10. mäta zebrafiskar genuttryck av kvantitativa PCREN

  1. Förbereda en qPCR master mix på is enligt tillverkarens anvisningar och ljuskänsligt. Använda primers infördes i tabell 1.
    Obs: För att beräkna vik av induktion för varje gen, mäta uttrycket också från en poolad baslinjen provet extraheras från 6 friska zebrafiskar.
  2. Förbereda replikat för varje prov och Pipettera reaktionsmixar på qPCR plåt. Försegla plattan med en optiskt transparent film och centrifugera plattan vid 2000 x g i 2 minuter vid 4 ° C innan kör.
  3. Kör qPCR program som visas i tabell 4 med glödgning temperaturen beroende på paret primer används (tabell 1).
  4. Analysera förhållandet gen uttryck jämfört med en städning gen (loopern437) med metoden ΔCt med hjälp av ekvation:
    Equation

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Den naturliga fisk patogenen Mycobacterium marinum infekterar de inre organen av zebrafiskar och producerar en systemisk infektion med histologiskt synliga granulom19. Adult zebrafiskar är infekterad med M. marinum genom en intraperitoneal injektion. Det DNA och RNA extraheras och mykobakteriella belastningen mäts genom kvantitativa polymeras-kedjereaktion (qPCR) med DNA som mall. Skissera av metoden som visas i figur 1.

Det ursprungliga antalet mykobakterier används för infekterar fisken är en kritisk faktor för resultatet av infektion. En hög infektion dos av M. marinum (~ 2 000 CFU) leder till en progressiv sjukdom där mykobakteriella lasterna fortsätta att öka tills den genomsnittliga bakteriehalten når cirka fem miljoner bakterier (figur 2A) slutligen döda fisken. En låg dos (~ 20 – 90 CFU) av M. marinum leder till utvecklingen av en sjukdom spektrumet liknar den som ses i human tuberkulos (figur 2B). Bakteriehalten fortsätter att öka fram till cirka 4 – 7 veckor (figur 2A och figur 3A), varefter i majoriteten av fisken sjukdomen når en steady-state. Figur 2B visar ett exempel på distribution av sjukdom utfall med en låg dos infektion: omkring 7 procent av de infekterade zebrafiskar var inte begränsa bakterietillväxt. Dessa individer utvecklas en primär progressiv sjukdom och de dog inom två månader efter infektionen. Omkring avmarkerad 10% av individerna mykobakteriella infektionen av 4 veckor. Resterande 65% av fiskpopulationen utvecklat en latent mykobakteriella infektioner med stadig bakteriell bördor. Dock mellan 8 och 32 veckor av infektion, i 18%, latenta infektionen spontant aktiveras igen leder till progression av sjukdomen.

Med hjälp av rag-/- mutant fisk, är det möjligt att studera roll adaptiva immunsvar hos den vuxna fisken. Rag-/- mutant fisk kan inte tillräckligt begränsa tillväxten av mykobakterier som leder till högre bakteriell laster (figur 3A) och ökad sjuklighet (figur 3B), visar tydligt vikten av adaptiv immunitet i kontrollerande mykobakteriella infektioner. Vikten av adaptiv svaren i frammana vissa cytokin svar i mykobakteriella infektioner kan också studeras i denna modell. Här visar vi att det adaptiva Svaren krävs för effektiv induktion av interleukin 4 (IL4) (figur 3 c) men är onödigt för induktion av interferon-γ (IFNγ) på 4 wpi (figur 3D). Interferon-γ är ett cytokin som kör svaret mot intracellulära patogener interleukin 4 är en gemensam medlare i det adaptiva immunsvaret mot extracellulära patogener. Betydligt högre uttrycksnivåerna av il4 i gruppen vildtyp jämfört med rag-/- mutant fisk refererar till viktiga adaptiv humorala svar i den mykobakteriella infektionen (figur 3 c).

Figure 1
Figur 1: arbetsflöde för att studera utvecklingen av mykobakteriella laster i den vuxna zebrafiskar. Adult zebrafiskar är infekterade med en intraperitoneal injektion av M. marinum. DNA och RNA utvinns från de inre organen av fisken och M. marinum lasten och värdens immunsvaret är analyseras med kvantitativa polymeras-kedjereaktion (qPCR). Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 2
Figur 2: Injektion av M. marinum i vuxen zebrafiskar orsakar ett spektrum av sjukdomstillstånd. (A) zebrafiskar injicerades med en låg (34 ±15 CFU) eller en hög dos (2029 ±709 CFU) av M. marinum. Genomsnittlig belastning för 5 fiskar (utom 32 veckor hög dos, n = 2) visas med SD. lågdos-statistik: * p < 0,05 jämfört med 1 vecka, ** p < 0,05 jämfört med 1 och 2 i veckan. Hög dos statistik: *** p < 0,05 jämfört med 1, 2, 8, 11 och 20 veckor ¤ lågdos vs högdos p < 0,05. Modifierad från Parikka o.a. 201219. (B) typisk fördelning med sjukdom resultat inom en vildtyp zebrafiskar befolkning smittad med en låg dos av M. marinum. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 3
Figur 3: adaptiv immunitet påverkar kursen av mykobakteriella infektioner i den vuxna zebrafiskar. Adult vildtyp (wt) och rag1 (−/−) zebrafiskar var infekterade med en låg dos (n = 30) av M. marinum. (A) Genomsnittligt mykobakteriella laster mättes av qPCR på 2, 4 och 7 veckor efter infektion (wpi) (n = 10) * P < 0,05. (B) fisken var euthanized vid utveckling av symptom på sjukdomen och överlevnad tomter skapades. (C). vid 4 wpi mättes uttrycksnivåerna av il4 . (D), uttrycket nivåer av IFNγ mättes på 4 wpi. (A och B) modifierad från Parikka et al. 201219. (C och D) Modifierad från Hammarén et al. 201438. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Gene Primer sekvens Glödgning temperatur
MMITS1 F: CACCACGAGAAACACTCCAA 65
16s – 23SITS Locus AB548718 för M. marinum kvantifiering R: ACATCCCGAAACCAACAGAG
loopern4 F: TGAGCTGAAACTTTACAGACACAT 61
Uttryckt repetitiva inslag R: AGACTTTGGTGTCTCCAGAATG
il4 GCAGGAATGGCTTTGAAGGG 59,5
ZDB-GEN-100204-1 GCAGTTTCCAGTCCCGGTAT
ifnγ1-2 F: GGGCGATCAAGGAAAACGACCC, 61
ZDB-GEN-040629-1 R: TAGCCTGCCGTCTCTTGCGT

Tabell 1: Primer sekvenser och glödgning temperaturer. Sekvenserna av primers används och deras optimerad glödgning temperaturer. Primers för M. marinum 16S-23S rRNA avskriften har optimerats för en No-ROX qPCR kit och andra primers för en ROX inklusive qPCR kit.

Steg Tid Temperatur
1 3 min 95 ° C
2 5 s 95 ° C
3 10 s 65 ° C
4 5 s 72 ° C (fluorescens upptäckt)
5 Gå till steg 2. 39 gånger
6 Smältande kurva analys 55-95° C med 0,5 ° C intervall
7 För evigt 4 ° C

Tabell 2: qPCR program för att mäta M. marinum DNA. Ett qPCR protokoll utformade enligt tillverkarens anvisningar och optimerad för att mäta M. marinum DNA från zebrafisk prover.

Tid Temperatur
5 min 25 ° C
30 min 42 ° C
5 min 85 ° C
för evigt 4 ° C

Tabell 3: cDNA syntes program. Protokoll för att syntetisera cDNA från den extraherade RNA av en infekterad zebrafiskar enligt tillverkarens anvisningar.

Steg Tid Temperatur
1 30 s 95 ° C
2 12 s 95 ° C
3 30 s Glödgning ° C
4 Gå till steg 2. för 39 gånger
5 Smältande kurva analys 65 – 95 ° C med 0,5 ° C intervall
6 För evigt 4 ° C

Tabell 4: qPCR program för mätning av värdens genuttryck. Ett qPCR protokoll utformade enligt tillverkarens anvisningar och optimerad för att mäta uttrycket av olika zebrafiskar gener.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Här beskriver vi en qPCR-baserat program för att mäta mykobakteriella laster från DNA extraheras från experimentellt infekterade vuxna zebrafiskar vävnader. Denna ansökan är baserad på primers utformad kring 16S-23S rRNA intern transkriberas spacer sekvens40. Den totala mykobakteriella belastningen i ett fisk-prov uppskattas med hjälp av en standardkurva beredd från DNA extraheras från ett känt antal odlade mykobakterier och förutsatt att en bakterie har ett exemplar av dess arvsmassa vid varje given tidpunkt. Detektionsgränsen för den M. marinum -qPCR är cirka 100 kolonibildande enheter18. En klar fördel av metoden jämfört med traditionella plätering är att både aktiva och icke-dividera vilande bakterier kan upptäckas. Dessutom är ett vanligt problem av kontaminerande tillväxt på kultur plattor från zebrafisk vävnader kringgås genom detta tillvägagångssätt. Eftersom DNA används som mall, är det dock möjligt att några av de kopior som mäts kan härledas DNA från bakterier som har dött helt nyligen. En betydande fördel av nukleinsyrebaserade protokollet är att som DNA och RNA (såväl som proteiner, inte beskrivs här) kan extraheras från en och samma individ, mykobakteriella belastningen av individen kan kombineras med gen uttryck data av båda de värd och bakterier.

Dosering av M. marinum är en kritisk faktor för resultatet av infektion. Den låga M. marinum (~ 20 – 90 CFU) infektion dos producerar ett spektrum av sjukdomstillstånd med latens som är den vanligaste formen. Om infektion dosen är i storleksordningen tusentals, framkallar en mer progressiv sjukdom i majoriteten av individer. Som den naturliga infektiös dos kallas låg i human tuberkulos41, är med en låg dos av M. marinum i zebrafisk modellen sannolikt att producera en mer naturlig infektion. För att nå rätt dos, kontrollera att validera relationen mellan OD600 och kolonibildande enheter före start några experiment. Den normala variationen av pläterad infektion doser är ca 30% och anses inte vara ett problem. Det är dock viktigt att kontrollera att hela 5 µL volymen av bakteriesuspensionen förblir inuti fisken. Läckage av injektionslösningen kommer att orsaka extra variation i infektion dosen. Förutom den infektion dosen, kan stam av bakterier påverka sjukdomsförloppet. Har man visat att virulens av de olika M. marinum stammar kan ändra mellan stammar. De två vanligaste stammarna är ATCC927 (fisk isolerad stam som används i dessa experiment) och M stam. Dessa stammar skiljer sig dock kraftigt i sin virulens. Den mänskliga-isolerade M stammen utvecklar en mer progressiv sjukdom medan fisk-isolerad stam producerar en mildare sjukdom brunn-lämplig för att studera latent form av de mykobakteriella infektioner33. Virulens av bakterierna inom en stam kan också förändra om bakterierna seriellt överförs från en kultur till en annan, som kan förebyggas genom att ta färska mykobakterier från en frys lager tillräckligt ofta.

In vitro odling av långsamt dividera M. marinum utan antibiotika är utsatt för föroreningar. Hantering av bakterier kräver därför strikt aseptisk metod utförs i en LAF. Eventuella föroreningar i kulturen kan upptäckas som för hög en OD600 värde, besynnerliga bakteriesuspensionen eller kolonier. M. marinum kolonier är normalt luddiga kanter, platt och matt vit färg. M. marinum kulturer är känsliga för ljus och de börjar producera gult pigment när det exponeras för ljus. Denna gula pigment kan användas för att skilja M. marinum kolonier från andra bakterier efter infektioner. Föroreningar kan orsaka fisken dö snart efter infektion. De första symtomen på en låg dos infektion visas vanligtvis inte innan 3 veckor efter infektion och någon dödlighet före denna tidpunkt sannolikt på grund av kontaminering i bakteriesuspensionen eller trauma inducerad under injektionen.

Adult zebrafiskar är mycket känsliga för 3-aminobensoesyra acid ethyl ester och överlever inte om exponeringstiden är för lång eller koncentrationen av bedövningsmedlet är för hög. Därför, när infektera, zebrafiskar bör utsättas för bedövningsmedlet endast för minsta möjliga tid för att uppnå bra anestesi (~ 1 – 2 min). Efter infektion, vuxen zebrafiskar hålls i grupper vid vattentemperatur på 26 – 28 ° C. Om temperaturen är högre eller lägre än detta, kan det påverka M. marinum tillväxttakt och kinetik av infektionen. Tank vattenkvaliteten (mikrobiologiska kvalitet, salthalt, pH, syremättnad) är också en viktig del att säkerställa ett lyckat experiment. Hälsoövervakning av fisken behöver utföras dagligen och fisk som visar symtom på infektion behöver tas bort från gruppen och euthanized. Om fisken dör i tanken, kan den andra fisken bli nytt smittade genom tarmen, vilket kommer att påverka utvecklingen av infektion.

Den vanligaste zebrafiskar larval modellen av tuberkulos är tillämplig på studie medfödd immunitet, som styr experiment till en begränsad delmängd av värd-mikrobinteraktioner. Användning av vuxna zebrafiskar gör det möjligt att studera både medfödd och adaptiv immunsvar hos en mångsidig modell18,32,39. Adult zebrafiskar presenterar sig som en bekväm ryggradsdjur modell att studera hela spektrumet av tuberkulos. Med en låg dos exponering av M. marinum, 7% av fiskpopulationen utvecklar primär progressiv sjukdom, 10% är kunna sterilisera infektionen, 65% utveckla latent sjukdom och 18% spontana reaktivering förekommer (figur 2). Sjukdom spektrumet liknar som sett i human tuberkulos, där de allra flesta utveckla en latent sjukdom, ca 4 – 14% producerar primär aktiv infektion inom de första fem åren efter infektion42, 10 – 20% av tungt utsatta personer verkar kunna sterilisera den infektion43 och 5 – 10% av de latenta infektionerna återaktivera44. Skillnader i värdars genetik påverkar mottagligheten för tuberkulos och den sjukdomsprogression45. Detta syns också i zebrafiskar befolkningen som är genetiskt mycket heterogen till skillnad från många andra laboratorium djur46,47. Den naturliga genetiska variationen gör det en mycket tillämpliga modell i sökandet efter optimalt immunsvar hos denna multifaktoriell sjukdom.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Författarna har något att avslöja.

Acknowledgments

Detta arbete har stötts av den finska kulturella Foundation (H.L.), Tammerfors tuberkulos Foundation (H.L., L.-M.V., M.M.H., M.P.), Stiftelsen för Finlands mot tuberkulos (Suomen Tuberkuloosin Vastustamisyhdistyksen Säätiö) (H.L., M.M.H., M.P.), Sigrid Jusélius stiftelse (MP), Emil Aaltonens Foundation (M.M.H.), Jane och Aatos Erkkos stiftelse (MP) och Finlands Akademi (MP). Leena Mäkinen, Hanna-Leena Piippo och Jenna Ilomäki är erkända för sin tekniskt bistånd. Författarna erkänner Tammerfors zebrafiskar laboratoriet för sin tjänst.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Mycobacterium marinum American Type Culture Collection ATCC 927
Middlebrock 7H10 agar BD, Thermo Fisher Scientific 11799042
Middlebrock OADC enrichment BD, Thermo Fisher Scientific 11718173
Middlebrock 7H9 medium BD, Thermo Fisher Scientific 11753473
Middlebrock ADC enrichment BD, Thermo Fisher Scientific 11718173
Tween 80 Sigma-Aldrich P1754
Glycerol Sigma-Aldrich G5516-500ML
GENESYS20 Spectrophotometer Thermo Fisher Scientific
Phosphate buffered saline tablets (PBS) Sigma-Aldrich P4417-50TAB
Phenol red Sigma-Aldrich P3532
27 G needle Henke Sass Wolf 4710004020
1 mL syringe Henke Sass Wolf 4010.200V0
Omnican 100 30 G insulin needle Braun 9151133
3-aminobenzoic acid ethyl ester (pH 7.0) Sigma-Aldrich A5040
1.5 mL homogenization tube Qiagen 13119-1000
2.8 mm ceramic beads Qiagen 13114-325
Ethanol, ETAX Aa Altia
2-propanol Sigma-Aldrich 278475
Chloroform VWR 22711.290
Guanidine thiocyanate Sigma-Aldrich G9277 FW 118.2 g/mol
Sodium citrate Sigma-Aldrich 1613859 FW 294.1 g/mol
Tris (free base) Sigma-Aldrich TRIS-RO FW 121.14 g/mol
TRI reagent Molecular Research Center TR118 Guanidine thiocyanate-phenol solution
PowerLyzer24 homogenizator Qiagen
Sonicator m08 Finnsonic
Nanodrop 2000 Thermo Fisher Scientific
SENSIFAST No-ROX SYBR, Green Master Mix Bioline BIO-98005
qPCR 96-well plate BioRad HSP9601
Optically transparent film BioRad MSB1001
C1000 Thermal cycler with CFX96 real-time system BioRad
RNase AWAY Thermo Fisher Scientific 10666421 decontamination reagent eliminating RNases
DNase I Thermo Fisher Scientific EN0525
Reverse Transcription Master Mix Fluidigm 100-6298
SsoFast Eva Green master mix BioRad 172-5211

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Zhao, S., Huang, J., Ye, J. A fresh look at zebrafish from the perspective of cancer research. Journal of Experimental & Clinical Cancer Research. 34, 80 (2015).
  2. Bournele, D., Beis, D. Zebrafish models of cardiovascular disease. Heart failure reviews. 21 (6), 803-813 (2016).
  3. Torraca, V., Mostowy, S. Zebrafish Infection: From Pathogenesis to Cell Biology. Trends in cell biology. 28 (2), 143-156 (2018).
  4. Varela, M., Figueras, A., Novoa, B. Modelling viral infections using zebrafish: Innate immune response and antiviral research. Antiviral Research. 139, 59-68 (2017).
  5. Goody, M. F., Sullivan, C., Kim, C. H. Studying the immune response to human viral infections using zebrafish. Developmental and comparative immunology. 46 (1), 84-95 (2014).
  6. Thisse, C., Zon, L. I. Organogenesis--heart and blood formation from the zebrafish point of view. Science. 295 (5554), 457-462 (2002).
  7. Eimon, P. M., Rubinstein, A. L. The use of in vivo zebrafish assays in drug toxicity screening. Expert Opinion on Drug Metabolism & Toxicology. 5 (4), 393-401 (2009).
  8. Sukardi, H., Chng, H. T., Chan, E. C. Y., Gong, Z., Lam, S. H. Zebrafish for drug toxicity screening: bridging the in vitro cell-based models and in vivo mammalian models. Expert Opinion on Drug Metabolism & Toxicology. 7 (5), 579-589 (2011).
  9. Wittamer, V., Bertrand, J. Y., Gutschow, P. W., Traver, D. Characterization of the mononuclear phagocyte system in zebrafish. Blood. 117 (26), 7126-7135 (2011).
  10. Harvie, E. A., Huttenlocher, A. Neutrophils in host defense: new insights from zebrafish. Journal of leukocyte biology. 98 (4), 523-537 (2015).
  11. Yoshida, N., Frickel, E., Mostowy, S. Macrophage-Microbe interactions: Lessons from the Zebrafish Model. Frontiers in Immunology. 8, 1703 (2017).
  12. Langenau, D. M., et al. In vivo tracking of T cell development, ablation, and engraftment in transgenic zebrafish. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 101 (19), 7369-7374 (2004).
  13. Lewis, K. L., Del Cid, N., Traver, D. Perspectives on antigen presenting cells in zebrafish. Developmental and comparative immunology. 46 (1), 63-73 (2014).
  14. Hu, Y., Xiang, L., Shao, J. Identification and characterization of a novel immunoglobulin Z isotype in zebrafish: Implications for a distinct B cell receptor in lower vertebrates. Molecular immunology. 47 (4), 738-746 (2010).
  15. Danilova, N., Bussmann, J., Jekosch, K., Steiner, L. A. The immunoglobulin heavy-chain locus in zebrafish: identification and expression of a previously unknown isotype, immunoglobulin Z. Nature immunology. 6 (3), 295-302 (2005).
  16. Zapata, A., Diez, B., Cejalvo, T., Frias, C. G., Cortes, A. Ontogeny of the immune system of fish. Fish & shellfish. 20 (2), 126-136 (2006).
  17. Traver, D., Paw, B. H., Poss, K. D., Penberthy, W. T., Lin, S., Zon, L. I. Transplantation and in vivo imaging of multilineage engraftment in zebrafish bloodless mutants. Nature immunology. 4 (12), 1238-1246 (2003).
  18. Hammaren, M. M., et al. Adequate Th2-Type Response Associates with Restricted Bacterial Growth in Latent Mycobacterial Infection of Zebrafish. Plos Pathogens. 10 (6), e1004190 (2014).
  19. Parikka, M., et al. Mycobacterium marinum Causes a Latent Infection that Can Be Reactivated by Gamma Irradiation in Adult Zebrafish. PLoS Pathog. 8 (9), 1-14 (2012).
  20. Tobin, D. M., et al. Host Genotype-Specific Therapies Can Optimize the Inflammatory Response to Mycobacterial Infections. Cell. 148 (3), 434-446 (2012).
  21. Lesley, R., Ramakrishnan, L. Insights into early mycobacterial pathogenesis from the zebrafish. Current opinion in microbiology. 11 (3), 277-283 (2008).
  22. Berg, R. D., Ramakrishnan, L. Insights into tuberculosis from the zebrafish model. Trends in molecular medicine. 18 (12), 689-690 (2012).
  23. World Health Organization. WHO Global tuberculosis report 2017. , Available from: http://www.who.int/tb/publications/global_report/en/ (2017).
  24. Ordonez, A. A., et al. Mouse model of pulmonary cavitary tuberculosis and expression of matrix metalloproteinase-9. Disease Models & Mechanisms. 9 (7), 779-788 (2016).
  25. Kramnik, I., Beamer, G. Mouse models of human TB pathology: roles in the analysis of necrosis and the development of host-directed therapies. Seminars in Immunopathology. 38 (2), 221-237 (2016).
  26. Manabe, Y. C., et al. The aerosol rabbit model of TB latency, reactivation and immune reconstitution inflammatory syndrome. Tuberculosis. 88 (3), 187-196 (2008).
  27. Pena, J. C., Ho, W. Monkey Models of Tuberculosis: Lessons Learned. Infection and immunity. 83 (3), 852-862 (2015).
  28. Cadena, A. M., Fortune, S. M., Flynn, J. L. Heterogeneity in tuberculosis. Nature Reviews Immunology. 17 (11), 691-702 (2017).
  29. Stinear, T. P., et al. Insights from the complete genome sequence of Mycobacterium marinum on the evolution of Mycobacterium tuberculosis. Genome research. 18 (5), 729-741 (2008).
  30. Swaim, L. E., Connolly, L. E., Volkman, H. E., Humbert, O., Born, D. E., Ramakrishnan, L. Mycobacterium marinum infection of adult zebrafish causes caseating granulomatous tuberculosis and is moderated by adaptive immunity. Infection and immunity. 74 (11), 6108-6117 (2006).
  31. Myllymaki, H., Bauerlein, C. A., Ramet, M. The Zebrafish Breathes new Life into the Study of Tuberculosis. Frontiers in Immunology. 7, 196 (2016).
  32. Luukinen, H., et al. Priming of Innate Antimycobacterial Immunity by Heat-killed Listeria monocytogenes Induces Sterilizing Response in Adult Zebrafish Tuberculosis Model. Disease Models and Mechanisms. 11, (2018).
  33. Sar, A. M., Abdallah, A. M., Sparrius, M., Reinders, E., Vandenbroucke-Grauls, C., Bitter, W. Mycobacterium marinum strains can be divided into two distinct types based on genetic diversity and virulence. Infection and immunity. 72 (11), 6306-6312 (2004).
  34. Madigan, M., Martinko, J. Brock Biology of Microorganisms. , (2016).
  35. Nüsslein-Volhard, C., Dahm, R. Zebrafish:a practical approach. , Oxford University Press. Oxford. (2002).
  36. Anonymous Stanford University Protocols. , Available from: http://med.stanford.edu/labs/vanderijn-west/Protocols.html (2018).
  37. Vanhauwaert, S., et al. Expressed Repeat Elements Improve RT-qPCR Normalization across a Wide Range of Zebrafish Gene Expression Studies. Plos One. 9 (10), e109091 (2014).
  38. Hammaren, M. M., et al. Adequate Th2-Type Response Associates with Restricted Bacterial Growth in Latent Mycobacterial Infection of Zebrafish. Plos Pathogens. 10 (6), e1004190 (2014).
  39. Oksanen, K. E., et al. An adult zebrafish model for preclinical tuberculosis vaccine development. Vaccine. 31 (45), 5202-5209 (2013).
  40. Roth, A., Fischer, M., Hamid, M. E., Michalke, S., Ludwig, W., Mauch, H. Differentiation of phylogenetically related slowly growing mycobacteria based on 16S-23S rRNA gene internal transcribed spacer sequences. Journal of clinical microbiology. 36 (1), 139-147 (1998).
  41. Rajararna, M. V. S., Ni, B., Dodd, C. E., Schlesinger, L. S. Macrophage immunoregulatory pathways in tuberculosis. Seminars in immunology. 26 (6), 471-485 (2014).
  42. Vynnycky, E., Fine, P. The natural history of tuberculosis: the implications of age-dependent risks of disease and the role of reinfection. Epidemiology and infection. 119 (2), 183-201 (1997).
  43. Cobat, A., et al. Two loci control tuberculin skin test reactivity in an area hyperendemic for tuberculosis. Journal of Experimental Medicine. 206 (12), 2583-2591 (2009).
  44. Delogu, G., Goletti, D. The Spectrum of Tuberculosis Infection: New Perspectives in the Era of Biologics. Journal of Rheumatology. 41, 11-16 (2014).
  45. Abel, L., et al. Genetics of human susceptibility to active and latent tuberculosis: present knowledge and future perspectives. Lancet Infectious Diseases. 18 (3), E75 (2018).
  46. Guryev, V., et al. Genetic variation in the zebrafish. Genome research. 16 (4), 491-497 (2006).
  47. Brown, K. H., et al. Extensive genetic diversity and substructuring among zebrafish strains revealed through copy number variant analysis. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109 (2), 529-534 (2012).

Tags

Immunologi och infektion fråga 140 zebrafiskar tuberkulos Mycobacterium tuberculosis qPCR mykobakteriella infektioner Mycobacterium marinum immunsystemet
Modellering tuberkulos i <em>Mycobacterium marinum</em> infekterade vuxna zebrafiskar
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Luukinen, H., Hammarén, M. M.,… More

Luukinen, H., Hammarén, M. M., Vanha-aho, L. M., Parikka, M. Modeling Tuberculosis in Mycobacterium marinum Infected Adult Zebrafish. J. Vis. Exp. (140), e58299, doi:10.3791/58299 (2018).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter