Summary
整个胰腺组织工程是一个挑战, 因为它的外分泌和内分泌功能。我们展示了一个完整的猪胰的解剖方法和成功的去细胞的过程中, 清洁剂海卫 X-100, 钠脱氧和脱氧核糖核酸酶的灌注。
Abstract
全胰腺组织工程可以改善目前糖尿病的治疗方法。最终目的是组织工程师胰腺从同种异体或异种来源的人细胞。对猪胰腺进行有效的解剖、去细胞和 recellularization 的方法的论证, 可能有益于该领域。与人类胰腺类似, 猪胰腺有一个特殊的解剖安排与三裂片 (脾脏, 十二指肠和连接) 圆形的十二指肠和小肠。胰十二指肠叶由几个小血管连接到十二指肠。胰腺组织工程因其外分泌和内分泌特性而复杂化。本文给出了在保存其结构和部分细胞外基质成分的同时, 对全猪胰腺进行解剖和 decellularize 的详细协议。为实现完全灌注, 选择主动脉作为入口和门静脉作为出口。其他血管 (肝动脉、脾静脉、脾动脉、肠系膜动脉、静脉树) 和胆管均结扎。为防止血栓形成, 猪血气, 并在解剖后立即用冷肝素冲洗器官。为了抑制外分泌酶的作用, 胰腺去细胞设置在4摄氏度。去细胞是由海卫 X-100, 脱氧钠和脱氧核糖核酸酶的灌注, 间歇性和最终的广泛洗涤进行。与成功的去细胞, 胰腺出现白色, 和苏木精和伊红组织学评价显示, 没有细胞核与保存细胞外基质结构。因此, 该方法可用于成功解剖和 decellularize 全猪胰腺。
Introduction
糖尿病的特点是血液中葡萄糖含量增加。在大多数国家, 它被认为是一个重大的公共卫生挑战1。高水平的血糖会影响血管和神经系统, 造成眼睛、心脏、肾脏和肢体缺血的损伤。传统的治疗方法包括注射外源性胰岛素、药物和生活方式的改变。在某些情况下, 对疾病的治疗, 在某些情况下, 现有的治疗无法维持胰岛素在治疗水平, 导致高血糖。虽然胰岛或整个胰腺的移植消除了这种疾病, 但由于缺乏适当的供体器官, 而且由于免疫抑制和封装2所涉及的风险和困难, 一般不做这种手术。
目前组织工程和再生医学领域的改进具有为这些问题提供解决办法的能力。随着去细胞技术的发展, 人类或动物捐献者的细胞材料可以被去除, 而重要的细胞外基质 (ECM) 蛋白、生长因子和信号分子则保留在支架中。这种支架可以移植, 而不需要免疫抑制, 恢复器官功能后, recellularization 与接受者自己的非免疫干细胞3,4。同种异体或异种来源的组织工程器官可用于临床移植, 因为主要的细胞外基质蛋白在物种间保存, 在移植5后可能不会被拒绝。
去细胞是一种探索性很好的方法, 包括在生理环境中最佳地使用物理力、化学洗涤剂和酶, 从组织或器官中去除细胞和核材料。Recellularization 是一种将细胞播种回脱细胞器官的过程。这是一个智力上艰难的过程, 需要大量的细胞, 最佳的细胞播种策略, 和生物反应器系统的文化, 在生理上可接受的条件, 如温度, 压力和气体6。
由于其外分泌和内分泌能力, 胰腺可以被认为是组织工程的一个具有挑战性的组织。外分泌组织分泌几种消化酶, 而内分泌部分分泌荷尔蒙, 包括胰岛素。用酶 (胰蛋白酶、脱氧核糖核酸酶 [DNase]) 和非离子 (海卫去细胞) 和离子洗涤剂 (胰腺) 报告了小鼠7、8、人类9和猪10的完整的。脱氧钠和月桂酸钠 [SDS])。然而, 在发布的协议之后, 我们在维护 ECM 结构的同时, 在成功的解剖和完整的灌注和去细胞中挣扎。我们推测, 应用洗涤剂在去细胞导致细胞的溶解, 从而释放消化酶入器官。释放的酶会对 ECM 支架造成不可逆转的破坏, 并使去细胞和 recellularization 效率低下。在抑制消化酶作用的同时有效 decellularizes 胰腺的方法可以解决这一问题。我们选择了 Peloso 等的策略, 去细胞的胰腺在寒冷的温度, 虽然他们没有报告为什么使用冷温度9。同时, 我们设计了一个解剖策略, 从泰勒等人的修改, 选择主动脉作为一个灌注入口的腹腔主干 (CT) 和肠系膜上动脉 (SMA)11。
在最近发表的文章12中, 我们展示了一个有效的分离和去细胞的猪胰腺, 同时保留一些 ECM 成分的方法。在本文中, 我们详细描述了如何解剖一个完整的猪胰腺包含脾脏, 十二指肠和连接裂片, 并提出了一个逐步的协议, 成功的去细胞。
Protocol
猪胰腺的解剖和去细胞程序这里提出遵循哥德堡大学的道德准则。
1. 去细胞的准备工作
- 使用 3 x 5 毫米硅胶管, 连接在系列洗涤剂进口容器到 peristalic 泵, 然后到胰腺在器官室通过degasser (见图 1)。将雄性鲁尔连接到器官室中管的游离端。
- 使用另一 3 x 5 毫米硅管,通过蠕动泵将风琴室连接到洗涤剂出口容器, 收集所灌洗的洗涤剂。
- 将2毫升未标记的吸管连接到洗涤剂入口容器和洗涤剂出口 cointainer 管的游离端。
- 保持整个设置在4摄氏度。
图 1: 灌注设置的准备.使用 3 x 5 毫米硅胶管, 如安装中所示, 连接在系列洗涤剂进口容器的蠕动泵, degasser 和器官室。黑色箭头显示从洗涤剂入口容器到器官室的流动方向。对于洗涤剂出口, 使用另 3 x 5 毫米硅胶管和连接的器官室通过蠕动泵到洗涤剂出口容器。红色箭头显示从器官室到洗涤剂出口容器的流动方向。请单击此处查看此图的较大版本.
2. 去细胞溶液的制备
- 解决方案 1 (磷酸盐缓冲盐水 [PBS]): 添加8克 (137 毫米) 氯化钠, 0.2 克 (2.7 毫米) 氯化钾, 1.44 克 (10 毫米) 磷酸磷酸钠, 0.24 克 (1.8 毫米) 磷酸钾到1升的超纯水, 搅拌直至溶解。用盐酸 (HCl) 将 pH 值调整为7.4。总共需要此解决方案的 3.2 L。
- 解决方案 2 (PBS + 肝素): 到1升的溶液 1, 添加3.4 毫升的肝素 (17 国际单位 [IU]/毫升)。准备这个解决方案新鲜, 并保持在冰, 直到它变得寒冷。总共需要此解决方案的 1.2 L。
- 溶液 3 (超纯水 + 叠氮化钠 + 乙二胺四乙酸钠 [EDTA]): 对1升的超纯水, 添加1.86 克 (5 毫米) EDTA 和200毫克 (0.02%) 叠氮化钠。搅拌直到盐溶解。在使用前冷却溶液到4摄氏度。总共需要此解决方案的 22 L。
- 溶液 4 (PBS + 叠氮化钠 + EDTA): 对溶液1的1升, 加入200毫克 (0.02%) 叠氮化钠和1.86 克 (5 毫米) EDTA。搅拌直到盐溶解。在使用前冷却溶液到4摄氏度。总共需要此解决方案的 1 L。
- 溶液 5 (超纯水 + 叠氮化钠): 到1升的超纯水, 添加200毫克 (0.02%) 叠氮化钠。搅拌直到盐溶解。在使用前冷却溶液到4摄氏度。总共需要此解决方案的 260 L。
注: EDTA 与该方法形成沉淀, 被排除在溶液5中, 因为它将被用于直接洗涤之前和之后的治疗。 - 解决方案 6 (X-100): 到940毫升的超纯水, 添加40克 (4%)60毫升 (6%)海卫 X-100, 200 毫克 (0.02%) 叠氮化钠, 69.6 毫克 (0.4 毫米) phenylmethylsulfonyl 氟化物 (PMSF)。搅拌直至溶解。在使用前冷却溶液到4摄氏度。使用前添加 PMSF。总共需要此解决方案的 9.6 L。
- 解决方案 7 (DNase): 添加 1万 Kunitz 单位的 DNase 250 毫升 (40 Kunitz 单位/毫升) Dulbecco 的 PBS 包含 CaCl2和氯化镁2。准备新鲜, 立即使用。在使用前将溶液预热至37摄氏度。
- 溶液 8 (PBS + 叠氮化钠): 到溶液1的1升, 加入200毫克 (0.02%) 叠氮化钠。搅拌直到盐溶解。在使用前冷却溶液到4摄氏度。总共需要此解决方案的 1 L。
3. 猪胰的解剖
注: 在本研究中, 猪胰腺是从安乐死中解剖的, 血气 (400 磅/千克) 雌性猪从一个农场重达45公斤。
- 将猪放在仰卧位的解剖桌上。
- 用手术刀将 xiphoidal 过程中的中线切口切开至耻骨 (大约40厘米), 露出所有的腹部器官。
- 找到脾脏、十二指肠和连接裂片。
- 用两个单独的缝合线定位十二指肠突的水平 , 并结扎从该部位口服十二指肠。
- 结扎下食道用两个单独缝合, 并在连字与剪刀之间切开以取出胃。
- 将结缔组织从结肠分开, 到达小肠。
- 把附着在胰脾叶上的结肠结缔组织分开。
- 结扎动脉后从小肠中取出结肠。
- 发现下肠系膜静脉和下肠系膜动脉树和结扎与一缝合在那里他们出现 caudally 胰腺。
- 结扎脾动脉和静脉与一缝合, 接近脾脏, 在脐, 并削减远端用剪刀去除脾脏。
- 遵循十二指肠, 直到十二指肠和连接裂片被清除和结扎十二指肠在末端用两个单独缝合。
- 解剖门静脉, 结扎它与一个缝合, 以防止任何血液泄漏从肝脏和削减下部结扎。门静脉在去细胞中充当一个插座。
- 用两条缝线解剖和结扎胆管和肝动脉。切远端缝合。
- 在肾静脉下找到主动脉, 并将其从肌肉和结缔组织组织的颅内解剖, 直至到达胰区。
- 轻轻翻转胰腺, 解剖主动脉, 保持 SMA 和 ct 的完好, 并将主动脉切开至 ct, 低于 SMA。
- 用剪刀切开剩余的周围组织, 取出胰腺。
- 使用50毫升注射器连接到4毫米 arteriotomy 套管, 通过主动脉2冲洗器官, 直到它 perfuses 整个器官或直到整个器官变冷。
4. 去细胞猪胰的制备
- 在整个过程中保持胰腺在4摄氏度或冰上。
- 用剪刀切开十二指肠缝线, 用25毫升的吸管冲洗 50-150 毫升的超纯水, 然后用缝线结扎。
- 结扎主动脉的一端和除 SMA 和 CT 的所有分支, 以防止渗漏。
- 从主动脉的另一端插入一个4毫米 arteriotomy 套管, 并用缝线结扎。
- 使用去细胞设置, 以20毫升/分钟的灌注溶液3为1小时的胰腺。
注: 预先填充泵管与溶液 3, 使无气泡进入胰腺。寻找任何从器官的两侧漏出和结扎所有开放的血管分支与缝合, 除了门静脉。 - 在溶液4中将胰腺冷冻-20 摄氏度, 直到去细胞开始。
5. 猪胰腺的去细胞
- 将胰腺解冻4摄氏度。
- 运行的蠕动泵在去细胞设置与解决方案3在20毫升/分钟, 直到没有气泡在洗涤剂入口管看到。
- 将胰腺放在去细胞容器中, 将洗涤剂入口管连接到胰主动脉。以20毫升/分钟4摄氏度, 用溶液3夜间冲洗器官。
- 把溶液倒入器官室。
- 将解决方案3替换为解决方案 5, 并将胰腺灌注为30分钟, 以20毫升/分钟为4摄氏度。在风琴室里倒出溶液。
- 添加解决方案6和灌注胰腺8小时20毫升/分钟在4摄氏度。在风琴室里倒出溶液。
- 用溶液5为96小时, 在4摄氏度时用20毫升/分钟冲洗器官。在风琴室里倒出溶液。
- 用500毫升的 Dulbecco 的 PBS DNase 治疗胰腺, 在37摄氏度时含有 CaCl2和氯化镁2 30 分钟。在风琴室里倒出溶液。
- 添加250毫升溶液7和灌注胰腺4小时在20毫升/分钟37摄氏度。在风琴室里倒出溶液。
- 用溶液5为120小时, 在4摄氏度时用20毫升/分钟冲洗器官。
- 将该器官贮存在溶液中 8, 在4摄氏度, 短时间内或-20 摄氏度长时间。
6. 去细胞的核查
- 使用剪刀, 从胰腺的所有裂片切开3到10毫米活检, 并在室温下将其固定在甲醛中48小时。
- 用超纯水清洗这些碎片15分钟, 按照标准协议在组织处理器中处理它们, 然后将它们嵌入石蜡中。
- 切割 5-µm 的部分使用切片和染色他们由迈耶的苏木精和0.2% 酒精性的 (他) 遵循标准协议。
- 查看在光显微镜下的幻灯片, 以检查核的损失。
注意: 用同样的方法处理的新鲜组织中的一块可以作为一个控制来检查细胞核是否存在。
Representative Results
典型的猪胰腺解剖图片, 可以帮助定位和解剖下肠系膜动脉和静脉树, 门静脉, 肝动脉, 胆管, 和主动脉分支到 CT 和 SMA, 如图 2A所示,2B和2C (黄色箭头) 分别。图 3A显示正常胰腺的毛形态, 呈浅粉红色, 含有脾脏、连接和十二指肠裂片。去细胞后, 粉红色的颜色消失, 瓣膜的胰腺看起来苍白白色的颜色。图 3B显示了瓣膜胰腺脾脏、连接和十二指肠裂片的大体形态学图。图 3C显示了一个正常的胰腺中有许多蓝色细胞核的存在, 与他染色。在瓣膜胰腺中, he 染色显示细胞核丢失, 因为没有看到蓝色细胞核 (图 3D)。
图 2: 猪胰腺解剖的图片.(A) 肠系膜下动脉和静脉树的位置 (黄色箭头)。(B) 结扎门静脉、肝动脉和胆管 (黄色箭头)。(C) 主动脉分支到腹腔主干和肠系膜上动脉 (黄色箭头)。请单击此处查看此图的较大版本.
图 3: 正常和瓣膜胰腺的毛形态和染色.正常胰腺的总形态学。(B) 瓣膜胰腺的毛形态。(C) he 染色显示正常胰腺中存在蓝色细胞核。(D) 染色显示瓣膜胰腺中没有蓝色细胞核。请单击此处查看此图的较大版本.
Discussion
该协议在4°c 的情况下, 使用 X-100 和海卫的灌注, 将成功 decellularize 全猪胰腺。这项技术的挑战是解剖完整的胰腺包含所有三裂片, 而不损害实质及其补给血管, 以及结扎的其他血管分支的标本, 以灌注器官没有渗漏。与人类胰腺相比, 猪胰腺有不同的解剖。它包括三个裂片并且停留在接近的联络与小肠由部分围拢它。我们解剖十二指肠与胰腺, 因为几个小血管从胰腺连接肠道。在优化研究中, 这些血管的钝切割显示出渗漏和不完全灌注的溶液。
由于主动脉通过腹腔和肠系膜上动脉连接到胰腺, 我们选择了主动脉作为一个入口来保持灌注简单, 只有使用一个套管, 因此, 一个入口。在我们的经验中, 结扎的主动脉在 CT 和 SMA 以下将减少解剖时间, 并减少损害的任何两个血管的风险。除了血气猪外, 我们还注意到, 在解剖后立即通过主动脉灌注冷肝素有助于在整个器官中实现溶液的灌注。我们推测这种情况是否通过防止血管中的血块形成而发生。分离后的超纯水胰腺的初始灌注将溶解红细胞, 清除器官中的残余血液, 从而防止血栓形成。这一时期也可以用来发现任何 unligated 小分支的静脉和动脉, 因为血液流动可以很容易地注意到以上的背景。
我们选择保持整个去细胞程序在寒冷的温度 (4 摄氏度), 因为这将阻碍分泌酶的作用, 释放从外分泌细胞的胰腺。外分泌酶, 如果不被抑制, 可能会对细胞和 ECM 造成有害影响, 因为它们可以消化细胞膜和蛋白质12。由于冰冻和解冻可以有效地爆裂细胞, 我们包括一个冻结/解冻步骤, 最初甚至在4,13洗涤剂的灌注之前。解冻后的初始洗涤将消除细胞爆裂的残余。我们使用的洗涤剂处理是一种混合的 X-100 和海卫一在异常高浓度和高灌注速度。我们选择这种方法来通过去除破坏 ECM 的外分泌细胞来实现更快的去细胞。我们推测, 一个硬的和快速的协议是有益的胰腺去细胞, 因为更少的时间将用于胰腺酶与 ECM 互动, 从而保持良好的 ecm 成分。为了保持 ECM 组件, 我们还添加了丝氨酸蛋白酶抑制剂 (PMSF) 的洗涤剂解决方案, 因为这将抑制活化酶释放从外分泌细胞14。叠氮化钠被添加到所有去细胞溶液中, 因为它作为一种抑菌剂, 从而抑制细菌污染的几率15。
根据该协议的胰腺瓣膜显示了 ecm 结构和 ecm 蛋白胶原蛋白和弹性蛋白的保存。然而, 在瓣膜胰腺中发现了明显的多糖损失。这种方式的胰腺瓣膜也显示了对人胎儿胰腺干细胞的附着和 recellularized 中外分泌和内分泌标志物的表达的承诺14天12。然而, 为了产生一个完整的和功能性的胰腺, 需要进一步的研究, 以评估正确的细胞来源, 细胞类型, 细胞播种策略, 和生物反应器的文化。
Disclosures
S.S.H. 持有 Verigraft 的股份, 该公司拥有授权的血管组织工程技术。其他作者没有什么可透露的。
Acknowledgments
这项研究是由瑞典政府 S.S.H. 的赠款资助的。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 4mm DLP arteriotomy cannula | Medtronic | 31104 | |
| 2ml Unlabelled pipette | vWR | 612-3720 | |
| Degasser | Biotech AB | 0001-6484 | |
| DNase-I | Worthington | LS0020007 | |
| Dulbecco's PBS with CaCl2 and MgCl2 | Sigma Aldrich | D8662 | |
| EDTA disodium salt dihydrate | AlfaAesar | A15161.OB | |
| Heparin | Leo | 387107 | |
| Luer Male with 1/8" ID Barb | Oina | LM-2PP-QC | For 3X5mm silicon tube |
| Peristaltic pump | Oina | SP-1X4 | |
| PMSF | Roche | 10837091001 | Unstable in aqueous solution. Should be added fresh before perfusion. |
| Potassium chloride | Sigma Aldrich | P5405 | |
| Potassium hydrogen phosphate | Sigma Aldrich | P9791 | |
| SDC | Sigma Aldrich | 30970 | |
| Silicon tube 3X5mm | VWR | 2280706 | |
| Sodium Azide | Sigma Aldrich | 71290 | |
| Sodium chloride | Sigma Aldrich | 13423 | |
| Sodium hydrogen phosphate | Merck | 71640-M | |
| Suture | Vömel | 14817 | |
| Syrringe 50mL | Becton Dickinson | 300137 | |
| Triton-X-100 | AlfaAesar | A16046.OF |
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