Summary
Beschrijven we een protocol voor de identificatie van label-vrij van lymfocyt subtypen met behulp van kwantitatieve fase beeldvorming en een machinaal leren algoritme. Metingen van 3D refractive index tomograms van lymfocyten 3D morfologische en biochemische informatie voor individuele cellen, die vervolgens wordt geanalyseerd met een machine-leren algoritme voor de identificatie van celtypes presenteren.
Abstract
Hier beschrijven we een protocol voor de identificatie van label-vrij van lymfocyt subtypen met behulp van kwantitatieve fase beeldvorming en machinaal leren. Identificatie van lymfocyt subtypen is belangrijk voor de studie van zowel immunologie als diagnose en behandeling van verschillende ziekten. Op dit moment afhankelijk standaardmethoden voor het classificeren van lymfocyt typen etikettering van specifieke membraaneiwitten via antigeen-antilichaam reacties. Echter, deze labeling technieken dragen de potentiële risico's voor het wijzigen van de cellulaire functies. Het protocol beschreven hier overwint deze uitdagingen door te profiteren van de intrinsieke optische contrasten gemeten door 3D kwantitatieve fase beeldvorming en een machinaal leren algoritme. Meting van 3D brekingsindex (RI) tomograms van lymfocyten bevat kwantitatieve gegevens over 3D morfologie en fenotypes van afzonderlijke cellen. De biofysische parameters geëxtraheerd uit de gemeten 3D RI tomograms worden vervolgens kwantitatief geanalyseerd met een machine leren algoritme, label-vrije identificatie op het niveau van een eencellige soorten lymfocyt inschakelen. We meten de 3D RI tomograms van B, CD4 + T en CD8 + T lymfocyten en hun celtypes geïdentificeerd met meer dan 80% nauwkeurigheid. In dit protocol beschrijven we de gedetailleerde stappen voor lymfocyt isolatie, 3D kwantitatieve fase imaging en machinaal leren voor het identificeren van de lymfocyt typen.
Introduction
Lymfocyten kunnen worden ingedeeld in verschillende subtypen met inbegrip van B, helper (CD4 +) T, cytotoxisch (CD8 +) T en regelgevende T cellen. Elk type lymfocyt heeft een andere rol in het adaptieve immuunsysteem; bijvoorbeeld, produceren B-lymfocyten antilichamen, overwegende dat T lymfocyten detecteren van specifieke antigenen, elimineren van abnormale cellen en reguleren van B-lymfocyten. Lymfocyt functie en regulering is strak bestuurd door en gerelateerd aan verschillende ziekten waaronder kanker1, auto-immune ziekten2en virale infecties3. De identificatie van lymfocyt typen is dus belangrijk om te begrijpen hun pathofysiologische rol in dergelijke ziekten en voor de immunotherapie in klinieken.
Op dit moment afhankelijk methoden voor het classificeren van lymfocyt typen antigeen-antilichaam reacties op richten op specifieke oppervlakte membraaneiwitten of oppervlakte markeringen4. Oppervlakte markeringen richten is een precieze en accurate methode om te bepalen van de lymfocyt typen. Nochtans, vereist het dure reagentia en tijdrovende procedures. Bovendien draagt het risico's van de wijziging van membraan eiwit structuren en de wijziging van cellulaire functies.
Om deze uitdagingen te overwinnen, introduceert het protocol beschreven hier de label-vrije identificatie van lymfocyt typen met behulp van 3D kwantitatieve fase imaging (QPI) en machine leren5. Deze methode kan de indeling van de lymfocyt soorten op een niveau van de eencellige gebaseerd op morfologische informatie etiket-gratis 3D beeldvorming van individuele lymfocyten is onttrokken. In tegenstelling tot conventionele fluorescentie microscopie technieken, QPI maakt gebruik van brekingsindex (RI) distributies (intrinsieke optische eigenschappen van levende cellen en weefsels) als optische contrast6,7. De RI tomograms van individuele lymfocyten vertegenwoordigen fenotypische informatie specifiek voor subtypen van lymfocyten. In dit geval voor het systemisch gebruik van 3D RI tomograms van individuele lymfocyten, werd een gecontroleerde machine leren algoritme gebruikt.
Met behulp van verschillende QPI technieken, de 3D RI tomograms van cellen zijn actief gebruikt voor de studie van cel pathofysiologie omdat ze een label-vrij bieden, kwantitatieve imaging vermogen8,9,10, 11,12,13. Ook kunnen de 3D RI distributies van afzonderlijke cellen informeren morfologische, biochemische en biomechanische over cellen. 3D RI tomograms hebben eerder gebruikt op het gebied van hematologie14,15,16,17, infectieziekten18,19, 20, immunologie,21,22,23van de biologie van de cel, ontsteking24, kanker25, neurowetenschappen26,27, ontwikkelingsbiologie28, toxicologie 29en microbiologie12,30,31,32.
Hoewel 3D RI tomograms gedetailleerde informatie van de morfologische en biochemische van cellen bieden, is de indeling van de lymfocyt subtypen moeilijk te bereiken door simpelweg imaging 3D RI tomograms5. Systematisch en kwantitatief misbruiken de gemeten 3D RI-tomograms voor de cel type indeling, we een machine leren algoritme gebruikt. Onlangs, verscheidene werken zijn gemeld in welke kwantitatieve fase beelden van cellen werden geanalyseerd met verschillende machine leren algoritmen33, met inbegrip van de opsporing van micro-organismen34, classificatie van bacteriële geslacht35 , 36, snelle en label-vrije detectie van miltvuur sporen37, geautomatiseerde analyse van zaadcellen38, analyse van kanker cellen39,40, en detectie van macrofaag activering41.
Dit protocol biedt gedetailleerde stapsgewijze instructies voor het uitvoeren van label-vrije identificatie op het niveau van de individuele cellen met behulp van 3D QPI en machinaal leren typen lymfocyten. Dit omvat: 1) lymfocyt isolatie van muis bloed, 2) lymfocyt sorteren via stroom cytometry, 3) 3D QPI, 4) kwantitatieve functie extractie van 3D RI tomograms en 5) begeleid leren voor het identificeren van de lymfocyt typen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Verzorging van de dieren en experimentele procedures werden uitgevoerd onder de goedkeuring van de institutionele zorg van het dier en gebruik Comité van KAIST (KA2010-21 KA2014-01 en KA2015-03). Alle experimenten in deze studie werden uitgevoerd overeenkomstig de goedgekeurde richtsnoeren.
1. lymfocyt isolatie uit bloed van de muis
- Zodra een muis C57BL/6J is euthanized via inademing van CO2 , invoegen van een 26-G naald in het hart van de muis en verzamelen van 0.3 mL bloed. Zet direct bloed in een buis met 100 U/mL heparine verdund met 1 mL-fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS).
Opmerking: U kunt ook lymfocyten van de milt kunnen worden geïsoleerd. - Centrifugeer de buis bij 400 x g gedurende 5 min bij 4 ° C.
- Voeg 0,5 mL ammonium-chloride-kalium lysing buffer aan de buis en voorzichtig omkeren het een paar keer te mengen van de oplossing.
- Incubeer de buis bij kamertemperatuur (RT) gedurende 5 minuten.
- De cellen door toevoeging van 4.5 mL PBS en centrifugeren bij 400 x g gedurende 5 min bij 4 ° C, twee keer wassen.
- Verwijder het supernatant en resuspendeer de pellet cel in 100 µL van verse RPMI-1640 medium met 10% foetale runderserum (FBS).
- 0,1 µg CD16/32 (2.4G2) antilichaam aan de buis voor het blokkeren van toevoegen.
- Houd de buis op ijs.
2. Stroom Cytometry en sortering van lymfocyt Subtypes
Opmerking: Het sorteren van lymfocyten afhankelijk van het celtype is essentieel voor de vaststelling van de grond-waarheid (dat wil zeggen, juiste) cel Typ labels te trainen en testen van een cel type-classificatie in begeleid leren. Stroom cytometry, een gouden standaard methode, wordt gebruikt om te identificeren en te scheiden van lymfocyten42.
- Maak een mengsel van oppervlakte marker kleuring van antilichamen in 100 µL van verse RPMI-1640 medium [met 10% FBS, 0,1 µg voor CD3e (17A2), CD8a (53-6,7), CD19 (1D 3), CD45R (B220, RA3-6B2) en NK1.1 (PK136)] en 0,25 µg CD4 (GK1.5) antilichamen tegen doel B, CD4 + T en CD8 + T lymfocyten.
- Voeg 100 µL van het mengsel van antilichaam aan de celsuspensie (verkregen in stap 1.8).
- Incubeer gedurende 25 min op ijs.
- De cellen door toevoeging van 5 mL PBS en centrifugeren bij 400 x g gedurende 5 min bij 4 ° C, twee keer wassen.
- Resuspendeer de pellet cel in 5 mL verse RPMI-1640 medium met 10% FBS en 2,5 µg DAPI (4', 6-diamidino-2-phenylindole).
- Verzamelen van elk type lymfocyt afzonderlijk met cytometry van de stroom met behulp van de niveaus van de fluorescentie van de markers die hierboven beschreven. Gelijktijdig uitsluiten dode cellen met behulp van de DAPI-signalen.
Opmerking: Gedetailleerde protocollen met betrekking tot stroom cytometry gebaseerde cel Sorteren geweest eerder beschreven42.
3. 3D kwantitatieve fase Imaging
- Houd de gesorteerde lymfocyten op ijs in de beeldvormende procedures, die moeten worden voltooid binnen 5 uur (sinds lymfocyt los van de muis) te voorkomen celbeschadiging en biochemische veranderingen.
- Selecteer een gesorteerde celtype (onder B, CD4 + T en CD8 + T lymfocyten) en Verdun het monster (verkregen in stap 2.6) tot 180 cellen/µL met RPMI medium voor optimale imaging conditie (dat wil zeggen, één cel per één veld-of-view).
- Laden 120 μL van de verdunde monster in een imaging kamer door langzame injectie. Grondig controleren op de aanwezigheid van bellen in de beeldvorming zaal met het monster. Als er belletjes, zorgvuldig verwijderen, als ze de kwaliteit van de metingen in gevaar zal brengen.
- Verwerven van 3D RI tomograms met behulp van een commerciële 3D kwantitatieve fase Microscoop, of holotomography, en de beeldbewerkingssoftware.
Opmerking: Gedetailleerde informatie over de experimentele opstelling kan gevonden worden in de originele manuscript5.- Breng een druppel gedestilleerd water op de top van het objectief van de Microscoop.
- Plaats de imaging zaal met het monster in het werkgebied van de vertaling van de Microscoop en de locatie aan te passen zodat het monster wordt uitgelijnd met het objectief.
- De axiale posities van de objectieve en condensor lenzen door te klikken op Focus en oppervlak, respectievelijk op het tabblad van de "Kalibratie" van het perspectief van de "Microscoop" van de denkbaar software aanpassen.
- De doelstelling en condensor lenzen uitlijnen door te klikken op Auto-modus. Alternatief, gebruik van de Modus scannen en de lenzen handmatig aanpassen zodat de verlichting patronen zijn gelokaliseerd in de regio van het midden van het gebied-van-weergave.
- Terugkeren naar de Normale modus en de fase van de vertaling om te zoeken van een cel in het gebied-van-weergave aan te passen.
- Zoek het brandvlak van het aanpassen van de axiale positie van het objectief. Perfect gericht, wordt de grens van de steekproef gevisualiseerd in het scherm bijna onzichtbaar.
- De fase van de vertaling om te zoeken naar een locatie zonder een cel aanpassen.
- Klik op kalibreren voor het meten van meerdere 2D hologrammen met verschillende hoeken van de verlichting.
- De fase van de vertaling om te zoeken van een cel in het midden van het gebied-van-weergave aanpassen.
- Verplaats naar het tabblad "Overname" en klik van 3D momentopname voor het meten van de hologrammen van de cel met de identieke verlichting hoeken zoals gedaan in stap 3.4.8.
- Als de opgehaalde gegevens wordt gepresenteerd op de "Data Management"-paneel, klik met de rechtermuisknop op de verworven gegevens en klik op proces om te reconstrueren van een 3D RI tomogram van de hologrammen gemeten in stappen 3.4.8 en 3.4.10, met behulp van de diffractie tomografie algoritme 9 , 10 ten uitvoer gelegd in de beeldbewerkingssoftware.
- Herhaal de stappen 3.4.5-3.4.11 voor het meten van meer dan 100 cellen zodat statistisch onderscheidingsvermogen voor machinaal leren.
- Alle afbeeldingen die worden verwerkt door de stap 3.4.11. kunnen worden gevisualiseerd. Het deelvenster "Data Management" met de rechtermuisknop op de gegevens en klik op openen om te visualiseren van de gegevens. Klik op RI Tomogram op de "Data Manager" paneel. Op het tabblad "Preset" klikt u op laden en dubbelklik op "lymphocyte.xml", die een vooraf gedefinieerde overdrachtsfunctie geboden door de replicatiesoftware is te visualiseren de tomogram volgens de 3D RI-distributies.
- Herhaal stap 3.2-3.4 op maat 3D RI tomograms van alle lymfocyt subtypen.
4. kwantitatieve functie van de morfologische en biochemische extractie van 3D RI Tomograms
- Plaats alle tomografische gegevens boven in één map gemeten. Het splitsen van de celtypes in de submappen van deze map. Bereiden elke tomogram als een enkele .mat bestand.
- Open aanvullende bestand 1 - functie extractie (geschreven voor een beeld processing software).
- Lijn 14 aan te wijzen van de map van de tomogram bereid in stap 4.1 bewerken.
- Bewerken van lijn 15 naar een map naar de uitgepakte functie gegevens opslaan.
- Bewerk eventueel regel 17 aan te passen de RI drempel parameters voor functie extractie. De standaardoptie is 20 RI drempels van 1.340-1.378, met een toename van 0.002 zoals eerder beschreven5.
- Het uitvoeren van de code. Voor elke tomogram in de dataset, de code berekent vijf functies: oppervlakte (SA), cellulaire volume (CV), bolvorm (SI), eiwit dichtheid (PD), en de droge massa (DM), per RI drempel. De gedetailleerde algoritmen voor functie extractie worden elders beschreven5.
- Om te controleren de winning van functie, tijdens de controle van de uitvoering op het scherm visualiseren RI drempel gebaseerde cel segmentatie.
- Controleer op de uitgepakte functie gegevens, als .mat -bestand per tomogram, opgeslagen in de map die is gedefinieerd in stap 4.4.
5. begeleid leren en identificatie
- Willekeurig verdeeld de functie gegevens in stap 4.8 tot opleiding (70%) en test (30%) sets met afzonderlijke mappen.
- Open aanvullende File 2 - trein (geschreven voor een beeld processing software).
- Lijn 14 aan te wijzen van de opleiding set bereid in stap 5.1 bewerken.
- Bewerk de regel 16 naar een map op te slaan van de opgeleide classificatie.
- Bewerk de regel 17 tot en met de naam van een bestand voor de classificatie instellen.
- Bewerk eventueel lijn 19 om de onderdelen voor opleiding te selecteren. De standaardoptie, werd zoals eerder hebt opgegeven5, gebruikt om de representatieve resultaten hieronder te verkrijgen.
- Het uitvoeren van de code. Met behulp van de geselecteerde onderdelen van de opleiding set, de code treinen een classificatie met de k-nearest neighbor-algoritme (k -NN; k = 4) en wordt vervolgens de classificatie (zoals genoemd in stap 5.5) opgeslagen in de map die is gedefinieerd in stap 5.4.
- Controleer op het scherm visualiseren van de classificatie-prestaties en de nauwkeurigheid van de Kruis-validatie.
- Optioneel, trainen meerdere classificaties met verschillende functie combinaties door herhalende 5.5-5.7 stappen. Kies de classificatie met de hoogste nauwkeurigheid van de Kruis-validatie.
- Openen van aanvullende bestand 3 - Test (geschreven voor een beeld processing software).
- Bewerken van lijnen 14-15 aan te wijzen van de opgeleide classificatie te beproeven.
- Bewerk de regel 17 aan te wijzen van de test set bereid in stap 5.1.
- Het uitvoeren van de code. De bovenstaande classificatie identificeert de celtypes van het individuele lymfocyten in het test-set.
- Controleer op het scherm visualiseren van de prestaties van de identificatie en de nauwkeurigheid van de test.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Figuur 1 toont de schematische proces van het gehele protocol. Met behulp van de procedure die hier gepresenteerd, we geïsoleerd B (n = 149), CD4 + T (n = 95), en CD8 + T (n = 112) lymfocyten. Fase en amplitude om informatie te verkrijgen onder verschillende hoeken van de verlichtingssterkte, werden meerdere 2D hologrammen van elke lymfocyt gemeten door het veranderen van de hoek van de verlichtingssterkte (-60 ° tot 60 °). Meestal 50 hologrammen te reconstrueren van een 3D RI tomogram kunnen worden gebruikt, maar het aantal 2D hologrammen kan worden aangepast gezien de imaging snelheid en kwaliteit. Amplitude en fase informatie van de gemeten hologrammen worden opgehaald met behulp van een veld ophalen algoritme op basis van Fourier transform43,44. De 3D RI tomogram van elke lymfocyt werd gereconstrueerd uit meerdere 2D opgehaalde fase en amplitude informatie onder verschillende hoeken van verlichting met behulp van optische diffractie tomografie algoritme. Details voor de installatiekopie en 3D RI tomogram wederopbouw methode kunnen worden gevonden elders21,45.
Figuur 2 A-2_C toont representatieve 3D gesmolten RI tomograms van CD8 + T B en CD4 + T-lymfocyten door verschillende kleurenschema's volgens RI waarden via de denkbaar software toe te wijzen. Uit de waarden van de RI, kwantitatieve morfologische (SA, CV, en SI) en biochemische (PD en DM) functies werden berekend (Figuur 2A-2_C). Dit resultaat laat duidelijk zien dat 3D RI distributie maakt een kwantitatieve analyse van morfologische, alsmede biochemische informatie van lymfocyten.
Gecontroleerde machinaal leren werd benut om het identificeren van lymfocyt typen op het niveau van een eencellige. De gemeten 3D RI tomograms willekeurig speelden in 70% en 30% van de opleiding (B: 104 CD4 + T: 66 en CD8 + T: 77) en test (B: 45, CD4 + T: 29 en CD8 + T: 35) datasets, respectievelijk. Wij de classificaties voor maximaal gebruik van de vingerafdrukken van de cel-type-specifieke gecodeerd in de functie ruimte geoptimaliseerd. De totale nauwkeurigheid gevoeligheid (ware positief) en specificiteit (waar negatieve) werden berekend door vergelijking van de classificatie-voorspelde resultaten en grond-waarheid celtypes.
Om aan te tonen van proof-of-concept van het voorgestelde protocol, wij onder toezicht machinaal leren uitgevoerd op drie verschillende gevallen: binaire indeling van (i) B- en T-lymfocyten en (ii) twee T lymfocyten subtypen (CD4 +- en CD8 +), en (iii) multiclass classificatie van allerlei lymfocyt.
Figuur 3 toont prestaties van de identificatie van geoptimaliseerde classificaties voor opleiding en test fases. De nauwkeurigheid van de T- en B-lymfocyt classificatie was 93.15% en 89.81% voor de opleiding en de proefprocessen, respectievelijk. De CD4 +- en CD8 + T lymfocyten waren statistisch ingedeeld, en de nauwkeurigheid was 87.41% en 84.38% voor de opleiding en de test sets, respectievelijk. Tot slot, de nauwkeurigheid van de multiclass cel type classificatie was 80.65% en 75.93% voor de opleiding en de test fase, respectievelijk.
Figuur 1 : Schema's van de identificatie van label-vrije soorten lymfocyt exploitatie 3 D kwantitatieve fase beeldvorming en machinaal leren. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 2 : Representatief 3 D RI tomograms van elk type cel lymfocyt met kwantitatieve morfologische en biochemische eigenschappen weergegeven. (A) B-cel, (B) CD4 + T cel en (C) CD8 + T cel. Schaal bar = 2 µm. SA, oppervlakte; CV, cellulaire volume; SI, bolvorm; PD, eiwit dichtheid; DM, drooggewicht. Dit cijfer is bewerkt met toestemming5. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 3 : Identificatie van individuele lymfocyt typen via gecontroleerde machinaal leren (A) de binaire indeling van B en T cellen, (B) de binaire indeling van CD4 +- en CD8 + T cellen en (C) multiclass classificatie van alle drie lymfocyt celtypes; voor zowel de opleiding als de test sets. Opmerking het kleine verschil tussen de opleiding en de proefprocessen, suggereren leuke veralgemening van de gevestigde classificaties. De nummers onder de namen van elk celtype geven het aantal cellen die worden gebruikt. Dit cijfer is bewerkt met toestemming5. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Aanvullende bestand 1: voorzien van extractie code. Functies (SA, CV, SI, PD en DM) na RI drempel gebaseerde segmentatie van elke tomogram uitpakken. Uitgevoerd in een beeld processing software. Klik hier om dit bestand te downloaden.
Aanvullende File 2: Training code. Opleiding een k -NN classificatie opleiding op basis van geselecteerde functies. Uitgevoerd in een beeld processing software. Klik hier om dit bestand te downloaden.
Aanvullende bestand 3: testen code. Testen van een opgeleide k- NN classificatie voor een nieuwe dataset (dwz., test set). Uitgevoerd in een beeld processing software. Klik hier om dit bestand te downloaden.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
We presenteren een protocol waarmee de identificatie van label-vrije soorten lymfocyt 3D kwantitatieve fase beeldvorming en machinaal leren benutten. Kritische stappen van dit protocol zijn kwantitatieve fase beeldvorming en functie selectie. Voor de optimale holografische beeldvorming, moet de dichtheid van de cellen controleerbaar zijn zoals hierboven beschreven. Mechanische stabiliteit van de cellen is ook belangrijk te verkrijgen van een exacte 3D RI verdeling, omdat zwevende of vibrationele cellulaire moties hologram metingen op verlichting hoek veranderingen zal verstoren. Wij, wachtte daarom enkele minuten totdat het monster werd stabiel en statische in de beeldvorming zaal voor het meten van hologrammen. Tot slot, bubbels binnen de imaging kamer problematisch zijn bij het meten van hologrammen te wijten aan RI verschillen tussen lucht en het monster; Dus, het monster moet zorgvuldig worden geladen aan de beeldvorming kamer.
Functie extractie en selectie helpen bepalen de prestaties van de identificatie van de classificatie. We 5 kwantitatieve morfologische (CV, SA, SI) berekend en biochemische (PD, DM) functies van 3D RI distributie op 20 verschillende RI drempelwaarden; Dus, we hebben een totaal van 100 functies opgehaald. We hebben doorzocht uitvoerig optimale functie en classificatie combinaties, waaruit blijkt dat de beste cross-validatie nauwkeurigheid werd geselecteerd. We testten 6 andere machine leren algoritmen, waaronder k -NN (k = 4 en k = 6), lineaire discriminatie analyse, analyse van de kwadratische discriminatie naïef Bayes, en besluit boom en we gevonden dat k -NN (k = 4 ) bleek de beste prestaties van de identificatie. Er is echter een kans om de nauwkeurigheid van de identificatie met behulp van andere machine leermethoden, met inbegrip van ondersteuning vector machine en neuronale netwerken te verbeteren.
Dit protocol maatregelen intrinsieke optische eigenschappen via 3D kwantitatieve fase imaging teneinde lymfocyt typen; het hoeft dus niet een labeling proces op basis van reacties van de antigeen-antilichaam gebruikt in fluorescentie- of magnetische kraal gebaseerde cel-Sorteren technieken, die risico's voor het wijzigen van cellulaire functie door aanpassing van de membraan eiwit structuren. Bovendien, de huidige methode maatregelen 3D RI distributie en biedt 3D morfologische en biochemische informatie over de cel, die niet kan worden verkregen door een single-shot holografie methode46; de prestaties van de identificatie van het protocol is daarom nauwkeuriger te wijten aan hoge-dimensionale informatie.
Een kleine beperking van dit protocol is het handmatig aanpassen van de monster-fase en verplicht labeling proces voor gecontroleerde machinaal leren. We hebben doorzocht een lymfocyt door de handmatige translationeel fase en gemeten hologrammen, die de meest tijdrovende stappen aan te passen. Deze beperking zou worden verbeterd door gebruik te maken van een geautomatiseerde gemotoriseerde stadium of microfluidic channel-apparaten. Met betrekking tot onder toezicht leren zijn de bekende lymfocyt typen verplicht te stellen van de optimale classificatie; dus we moesten eerste isolaat en identificeren van lymfocyt celtypes gebaseerd op de antigeen-antilichaam-gebaseerde sorteren techniek. Echter dit protocol gebruikt nog steeds het intrinsieke optische contrast van lymfocyten en de labeling agenten gebruikt om op te geven van antilichamen te verwaarlozen effecten hebben op de gemeten 3D RI-signaal. Derhalve mogen de gevestigde classificatie worden gebruikt voor het identificeren van lymfocyten in een label-vrije manier.
Hoewel dit protocol maakt voornamelijk gebruik van fenotypes van lymfocyten door het meten van 3D RI tomograms van afzonderlijke cellen, kan deze 3D-RI-gegevens ook worden gebruikt in combinatie met andere modaliteiten adressering genotypen of proteomic informatie voor betere classificatie van subtypen. Oereenstemming microscopie technieken combineren fluorescentie beeldvorming en QPI hebben onlangs geïntroduceerde47,48,49. De in dit protocol gekozen benadering kan ook worden uitgebreid tot deze oereenstemming beeldvormende methoden.
Label-vrije identificatie van lymfocyt typen kan worden toegepast op pathofysiologie studeren of diagnose van de ziekte door het detecteren van abnormale lymfocyten of verhoudingen tussen lymfocyt typen. Bovendien kan dit protocol worden toegepast op volbloed analyse door het identificeren van de verschillende cellen, met inbegrip van rode bloedcellen, witte bloedcellen en bloedplaatjes.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Prof. Y. Park, Y. Jo, Y. S. Kim en S. Lee hebben financiële belangen in Tomocube, Inc., een bedrijf dat commercialiseert optische diffractie tomografie en kwantitatieve fase imaging instrumenten en is één van de sponsors van het werk.
Acknowledgments
Dit werk werd gesteund door de KAIST BK21 + programma, Tomocube, Inc., en de nationale onderzoek Stichting Korea (2015R1A3A2066550, 2017M3C1A3013923, 2018K 000396). Y. Jo erkent steun van het KAIST Presidential Fellowship en Asan Stichting biomedische wetenschap beurs.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Mouse | Daehan Biolink | C57BL/6J mice | gender and age-matched, 6 – 8 weeks |
| Falcon conical centrifuge tube | ThermoFisher Scientific | 14-959-53A | 15 mL |
| Phosphate-buffered saline | Sigma-Aldrich | 806544-500ML | |
| Ammonium-chloride-potassium lysing buffer | ThermoFisher Scientific | A1049201 | |
| RPMI-1640 medium | Sigma-Aldrich | R8758 | |
| Fetal bovine serum | ThermoFisher Scientific | 10438018 | |
| Antibody | BD Biosciences | 553140 (RRID:AB_394655) | CD16/32 (clone 2.4G2) |
| Antibody | BD Biosciences | 555275 (RRID:AB_395699) | CD3ε (clone 17A2) |
| Antibody | Biolegnd | 100734 (RRID:AB_2075238) | CD8α (clone 53-6.7) |
| Antibody | BD Biosciences | 557655 (RRID:AB_396770) | CD19 (clone 1D3) |
| Antibody | BD Biosciences | 557683 (RRID:AB_396793) | CD45R/B220 (clone RA3-6B2) |
| Antibody | BD Biosciences | 552878 (RRID:AB_394507) | NK1.1 (clone PK136) |
| Antibody | eBioscience | 11-0041-85 (RRID:AB_464893) | CD4 (clone GK1.5) |
| DAPI | Roche | 10236276001 | 4,6-diamidino-2-phenylindole |
| Flow cytometry | BD Biosciences | Aria II or III | |
| Imaging chamber | Tomocube, Inc. | TomoDish | |
| Holotomography | Tomocube, Inc. | HT-1H | |
| Holotomography imaging software | Tomocube, Inc. | TomoStudio | |
| Image professing software | MathWorks | Matlab R2017b |
References
- Alizadeh, A. A., et al. Distinct types of diffuse large B-cell lymphoma identified by gene expression profiling. Nature. 403 (6769), 503 (2000).
- Von Boehmer, H., Melchers, F. Checkpoints in lymphocyte development and autoimmune disease. Nature Immunology. 11 (1), 14 (2010).
- Sáez-Cirión, A., et al. HIV controllers exhibit potent CD8 T cell capacity to suppress HIV infection ex vivo and peculiar cytotoxic T lymphocyte activation phenotype. Proceedings of the National Academy of Sciences. 104 (16), 6776-6781 (2007).
- Fischer, K., et al. Isolation and characterization of human antigen-specific TCRαβ+ CD4-CD8-double-negative regulatory T cells. Blood. 105 (7), 2828-2835 (2005).
- Yoon, J., et al. Identification of non-activated lymphocytes using three-dimensional refractive index tomography and machine learning. Scientific Reports. 7 (1), 6654 (2017).
- Popescu, G. Quantitative phase imaging of cells and tissues. , McGraw Hill Professional. (2011).
- Lee, K., et al. Quantitative phase imaging techniques for the study of cell pathophysiology: from principles to applications. Sensors. 13 (4), 4170-4191 (2013).
- Kim, D., et al. Refractive index as an intrinsic imaging contrast for 3-D label-free live cell imaging. bioRxiv. , 106328 (2017).
- Kim, K., et al. Optical diffraction tomography techniques for the study of cell pathophysiology. Journal of Biomedical Photonics & Engineering. 2 (2), (2016).
- Wolf, E. Three-dimensional structure determination of semi-transparent objects from holographic data. Optics Communications. 1 (4), 153-156 (1969).
- Kus, A., Dudek, M., Kemper, B., Kujawinska, M., Vollmer, A. Tomographic phase microscopy of living three-dimensional cell cultures. Journal of Biomedical Optics. 19 (4), 046009 (2014).
- Kim, T., et al. White-light diffraction tomography of unlabelled live cells. Nature Photonics. 8 (3), 256 (2014).
- Simon, B., et al. Tomographic diffractive microscopy with isotropic resolution. Optica. 4 (4), 460-463 (2017).
- Kim, Y., et al. Profiling individual human red blood cells using common-path diffraction optical tomography. Scientific Reports. 4, (2014).
- Park, H., et al. Measuring cell surface area and deformability of individual human red blood cells over blood storage using quantitative phase imaging. Scientific Reports. 6, (2016).
- Lee, S., et al. Refractive index tomograms and dynamic membrane fluctuations of red blood cells from patients with diabetes mellitus. Scientific Reports. 7, (2017).
- Merola, F., et al. Tomographic flow cytometry by digital holography. Light-Science & Applications. 6, (2017).
- Park, Y., et al. Refractive index maps and membrane dynamics of human red blood cells parasitized by Plasmodium falciparum. Proceedings of the National Academy of Sciences. 105, 13730-13735 (2008).
- Park, H., et al. Characterizations of individual mouse red blood cells parasitized by Babesia microti using 3-D holographic microscopy. Scientific Reports. 5, 10827 (2015).
- Chandramohanadas, R., et al. Biophysics of malarial parasite exit from infected erythrocytes. Public Library of Science ONE. 6 (6), 20869 (2011).
- Yoon, J., et al. Label-free characterization of white blood cells by measuring 3D refractive index maps. Biomedical Optics Express. 6 (10), 3865-3875 (2015).
- Kim, K., et al. Three-dimensional label-free imaging and quantification of lipid droplets in live hepatocytes. Scientific Reports. 6, 36815 (2016).
- Kim, D., et al. Label-free high-resolution 3-D imaging of gold nanoparticles inside live cells using optical diffraction tomography. Methods. , (2017).
- Lenz, P., et al. Multimodal Quantitative Phase Imaging with Digital Holographic Microscopy Accurately Assesses Intestinal Inflammation and Epithelial Wound Healing. Journal of Visualized Experiments. (115), (2016).
- Huang, J., Guo, P., Moses, M. A. A Time-lapse, Label-free, Quantitative Phase Imaging Study of Dormant and Active Human Cancer Cells. Journal of Visualized Experiments. (132), (2018).
- Yang, S. A., Yoon, J., Kim, K., Park, Y. Measurements of morphological and biochemical alterations in individual neuron cells associated with early neurotoxic effects in Parkinson's disease. Cytometry Part A. 91 (5), 510-518 (2017).
- Cotte, Y., et al. Marker-free phase nanoscopy. Nature Photonics. 7 (2), 113-117 (2013).
- Nguyen, T. H., Kandel, M. E., Rubessa, M., Wheeler, M. B., Popescu, G. Gradient light interference microscopy for 3D imaging of unlabeled specimens. Nature Communications. 8 (1), 210 (2017).
- Kwon, S., et al. Mitochondria-targeting indolizino [3, 2-c] quinolines as novel class of photosensitizers for photodynamic anticancer activity. European Journal of Medicinal Chemistry. 148, 116-127 (2018).
- Bennet, M., Gur, D., Yoon, J., Park, Y., Faivre, D. A Bacteria-Based Remotely Tunable Photonic Device. Advanced Optical Materials. , (2016).
- Kim, T. I., et al. Antibacterial Activities of Graphene Oxide-Molybdenum Disulfide Nanocomposite Films. ACS Applied Materials & Interfaces. 9 (9), 7908-7917 (2017).
- Bedrossian, M., Barr, C., Lindensmith, C. A., Nealson, K., Nadeau, J. L. Quantifying Microorganisms at Low Concentrations Using Digital Holographic Microscopy (DHM). Journal of Visualized Experiments. (129), (2017).
- Jo, Y., et al. Quantitative Phase Imaging and Artificial Intelligence: A Review. arXiv preprint. , arXiv:1806.03982 (2018).
- Javidi, B., Moon, I., Yeom, S., Carapezza, E. Three-dimensional imaging and recognition of microorganism using single-exposure on-line (SEOL) digital holography. Optics Express. 13 (12), 4492-4506 (2005).
- Jo, Y., et al. Label-free identification of individual bacteria using Fourier transform light scattering. Optics Express. 23 (12), 15792-15805 (2015).
- Jo, Y., et al. Angle-resolved light scattering of individual rod-shaped bacteria based on Fourier transform light scattering. Scientific Reports. 4, 5090 (2014).
- Jo, Y., et al. Holographic deep learning for rapid optical screening of anthrax spores. Science Advances. 3 (8), 1700606 (2017).
- Mirsky, S. K., Barnea, I., Levi, M., Greenspan, H., Shaked, N. T. Automated analysis of individual sperm cells using stain-free interferometric phase microscopy and machine learning. Cytometry Part A. 91 (9), 893-900 (2017).
- Roitshtain, D., et al. Quantitative phase microscopy spatial signatures of cancer cells. Cytometry Part A. 91 (5), 482-493 (2017).
- Lam, V. K., Nguyen, T. C., Chung, B. M., Nehmetallah, G., Raub, C. B. Quantitative assessment of cancer cell morphology and motility using telecentric digital holographic microscopy and machine learning. Cytometry Part A. , (2017).
- Pavillon, N., Hobro, A. J., Akira, S., Smith, N. I. Noninvasive detection of macrophage activation with single-cell resolution through machine learning. Proceedings of the National Academy of Sciences. , (2018).
- Basu, S., Campbell, H. M., Dittel, B. N., Ray, A. Purification of Specific Cell Population by Fluorescence Activated Cell Sorting (FACS). Journal of Visualized Experiments. (41), e1546 (2010).
- Takeda, M., Ina, H., Kobayashi, S. Fourier-transform method of fringe-pattern analysis for computer-based topography and interferometry. Journal of the Optical Society of America. 72 (1), 156-160 (1982).
- Debnath, S. K., Park, Y. Real-time quantitative phase imaging with a spatial phase-shifting algorithm. Optics Letters. 36 (23), 4677-4679 (2011).
- Kim, K., et al. High-resolution three-dimensional imaging of red blood cells parasitized by Plasmodium falciparum and in situ hemozoin crystals using optical diffraction tomography. Journal of Biomedical Optics. 19 (1), 011005 (2013).
- Vercruysse, D., et al. Three-part differential of unlabeled leukocytes with a compact lens-free imaging flow cytometer. Lab on a Chip. 15 (4), 1123-1132 (2015).
- Kim, K., et al. Correlative three-dimensional fluorescence and refractive index tomography: bridging the gap between molecular specificity and quantitative bioimaging. Biomedical Optics Express. 8 (12), 5688-5697 (2017).
- Shin, S., Kim, D., Kim, K., Park, Y. Super-resolution three-dimensional fluorescence and optical diffraction tomography of live cells using structured illumination generated by a digital micromirror device. arXiv preprint. , arXiv:1801.00854 (2018).
- Chowdhury, S., Eldridge, W. J., Wax, A., Izatt, J. A. Structured illumination multimodal 3D-resolved quantitative phase and fluorescence sub-diffraction microscopy. Biomedical Optics Express. 8 (5), 2496-2518 (2017).
