Summary
우리의 림프 구 정량 위상 이미징 및 기계 학습 알고리즘을 사용 하 여 레이블 없는 식별 프로토콜을 설명 합니다. 림프 톨의 3 차원 굴절률 tomograms의 측정 3D 형태학 및 생화학 정보 개별 셀에 대 한 다음 종류의 식별을 위한 기계 학습 알고리즘으로 분석을 제시.
Abstract
여기의 림프 구 정량 위상 이미징 및 기계 학습을 사용 하 여 레이블 없는 식별 프로토콜을 설명 합니다. 림프 톨의 식별 진단 면역학의 연구 및 다양 한 질병의 치료에 대 한 중요 하다. 현재, 항 원-항 체 반응을 통해 특정 막 단백질을 라벨에 의존 하는 림프 구 종류를 분류 하기 위한 표준 방법. 그러나, 이러한 라벨 기술을 세포 기능 변경의 잠재적인 위험. 여기에 설명 된 프로토콜 3D 양적 위상 이미징 및 기계 학습 알고리즘에 의해 측정 하는 내장 광학 대조를 이용 하 여 이러한 문제를 극복 한다. 림프 톨의 3 차원 굴절률 (RI) tomograms의 측정 3 차원 형태 및 개별 셀의 고기에 대 한 정량적 인 정보를 제공합니다. 측정 된 3D 리 tomograms에서 추출 생물 매개 변수는 양적 단일 세포 수준에서 림프 구 종류의 식별 라벨 무료 사용 기계 학습 알고리즘으로 분석 됩니다. 우리는 B, T CD4 + 및 CD8 + T 림프 톨의 3D RI tomograms를 측정 하 고 80% 이상으로 그들의 세포 유형 식별 정확도. 이 프로토콜에서 우리는 림프 구 분리, 3D 양적 위상 이미징 및 림프 구 종류를 식별 하기 위한 기계 학습에 대 한 자세한 단계를 설명 합니다.
Introduction
림프 톨 B, 도우미 (CD4 +) T, 세포 독성 (CD8 +) T, 및 T는 규제를 포함 한 다양 한 하위 유형으로 분류 될 수 있다 세포. 각 림프 구 종류는 다른 역할 적응 면역 체계; 예를 들어 B 림프 톨 생성 항 체, T 림프 톨 특정 항을 검색 하 고 비정상 세포를 제거 하 고, B 림프 톨을 규제 하는 반면. 림프 구 기능 및 규정은 밀접 하 게 의해 제어 되며 암1,2, 자가 면역 질환 및 바이러스 감염3를 포함 하 여 다양 한 질병에 관련 된. 따라서, 림프 구 종류의 식별은 같은 질병에 immunotherapy 클리닉에 대 한 그들의 병 태 생리 역할을 이해 하는 것이 중요.
현재, 림프 구 종류를 분류 하기 위한 방법 특정 표면 막 단백질 또는 표면 마커4를 대상으로 항 원-항 체 반응에 의존 합니다. 표면 마커를 대상으로 림프 구 종류를 결정 하는 정확 하 고 정확한 방법입니다. 그러나, 그것은 비싼 시 약 및 시간이 걸리는 절차를 요구 한다. 또한, 그것은 막 단백질 구조의 수정 및 세포 기능 변경의 위험을 운반합니다.
이러한 문제를 해결 하려면 여기에 설명 된 프로토콜 레이블 없는 신분의 림프 구 종류 (QPI) 이미징 3D 양적 단계5를 학습 하는 기계를 사용 하 여 소개 합니다. 이 메서드는 개별 세포의 레이블 없는 3D 영상에서 추출한 형태학 정보에 따라 단일 셀 수준에서 림프 구 종류의 분류를 수 있습니다. 기존의 형광 현미경 검사 법 기술, 달리 QPI 광학 대조6,7굴절률 (RI) 배포판 (라이브 세포 및 조직의 기본 광학 속성)를 사용합니다. 개별 세포의 RI tomograms 세포의 특정 하위 phenotypic 정보를 나타냅니다. 이 경우에, 개별 세포의 3D RI tomograms를 체계적으로 활용 하는 감독된 기계 학습 알고리즘은 이용 되었다.
다양 한 QPI 기술을 사용 하 여, 셀의 3D RI tomograms 적극적으로 사용 되었습니다 셀 이상의 연구에 대 한 레이블-무료, 제공 하기 때문에 양적 이미징 기능8,,910, 11,,1213. 또한, 개별 셀의 3D 리 배포판 형태학, 생화학, 및 biomechanical 셀에 대 한 정보를 제공할 수 있습니다. 3D RI tomograms 이전 혈액학14,15,,1617, 전염병18,19, 의 분야에 이용 되었습니다 20,21면역학, 세포 생물학22,23, 염증24, 암25, 신경 과학26,27, 개발 생물학28, 독극물 29, 그리고 미생물학12,30,,3132.
3D RI tomograms 셀의 자세한 형태학 및 생화학 정보 제공, 림프 구 하위 분류 단순히 3D RI tomograms5을 이미징 하 여 달성 하기 어렵습니다. 체계적으로 그리고 양이 많게 측정된 3D RI tomograms 셀 유형 분류에 대 한 악용, 우리는 기계 학습 알고리즘을 활용. 최근, 여러 작품 보고 되었습니다 어떤 양적 단계에서 셀의 이미지 분석 되었다 다양 한 기계 학습 알고리즘33, 미생물34, 세균성 속35 의 분류의 탐지를 포함 하 여 , 36, 탄 저 균 포자37, 신속 하 고 레이블 없는 감지 자동 정자 세포38의 분석, 암 세포39,40, 분석 및 대 식 세포 활성화41의 검출.
이 프로토콜 3D QPI 및 기계 학습을 사용 하 여 개별 셀 수준에서 림프 구 종류의 레이블 없는 식별을 수행 하는 자세한 단계를 제공 합니다. 이것은 포함 한다: 1) 림프 구 분리 마우스 혈액, 림프 구 2) 3D 리 tomograms에서 흐름 cytometry, 3) 3D QPI, 4) 양적 특징 추출 통해 정렬 및 림프 구 종류를 식별 하는 데 5) 감독된 학습에서.
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Protocol
동물 관리 및 실험 절차는 기관 동물 관리 및 사용 위원회의 한국 과학 기술원 (KA2010-21, KA2014-01, 및 KA2015-03)의 승인 아래 수행 했다. 이 연구에서 모든 실험 승인된 지침에 따라 실시 했다.
1. 림프 구 별개로 마우스 피
- C57BL/6J 마우스는 CO2 흡입을 통해 안락사는, 일단 마우스 마음에 26 G 바늘을 삽입 하 고 0.3 mL의 혈액을 수집. 직접 넣어 혈액 튜브 100 U/mL 헤 파 린 솔루션 인산 염 버퍼 식 염 수 (PBS)의 1 mL로 희석.
참고: 또는, 비장에서 세포 수 고립. - 4 ° c.에서 5 분에 대 한 400 x g에서 관을 원심
- 관에 염화 염화 칼륨 lysing 버퍼의 0.5 mL를 추가 하 고 부드럽게 반전 그것을 몇 번 솔루션을 혼합.
- 5 분 동안 실내 온도 (RT)에 튜브를 품 어.
- 4.5 mL PBS의 추가 하 고 두 번 4 ° C에서 5 분에 대 한 400 x g에서 centrifuging 여 세포를 씻어.
- 상쾌한을 제거 하 고 10% 태아 둔감 한 혈 청 (FBS)와 신선한 RPMI 1640 매체의 100 µ L에서 셀 펠 릿 resuspend.
- 차단에 대 한 튜브를 CD16/32 (2.4G2) 항 체의 0.1 µ g을 추가 합니다.
- 얼음에 튜브를 유지.
2. flow Cytometry 및 림프 톨의 정렬
참고: 지상 진리 (즉, 올바른) 셀을 설정 하기 위한 필수적 이다 림프 톨 세포 유형에 따라 정렬 훈련 하 고 감독된 학습에서 셀 유형 분류자를 테스트 레이블을 입력. Cytometry, 골드 표준 방법 림프 톨42분리를 식별 하는 데 사용 됩니다.
- 표면 마커 얼룩 신선한 RPMI 1640 매체의 100 µ L에 항 체의 혼합물을 만들기 [10 %FBS, CD3e의 0.1 µ g (17A2), CD8a (53-6.7), CD19 (1 일 3), CD45R (B220, RA3-6B2), 및 NK1.1 (PK136)]와 대상 B, CD4 + T, 및 CD8 + T CD4 (GK1.5) 항 체의 0.25 µ g 림프 톨입니다.
- (단계 1.8에서에서 얻은) 세포 현 탁 액에 항 체 혼합물의 100 µ L를 추가 합니다.
- 얼음에 25 분 동안 품 어.
- PBS의 5 mL을 추가 하 고 두 번 4 ° C에서 5 분에 대 한 400 x g에서 centrifuging 여 세포를 씻어.
- 셀 펠 릿 10 신선한 RPMI 1640 매체의 5 ml에서 resuspend %FBS DAPI (4', 6-diamidino-2-phenylindole)의 2.5 µ g.
- Cytometry 위에서 설명한 마커의 형광 레벨을 사용 하 여와 별도로 각 림프 구 종류를 수집 합니다. 동시에 제외 죽은 세포 DAPI 신호를 사용 하 여.
참고:42흐름 있다 cytometry 기반 셀 정렬에 관한 상세한 프로토콜 기술 이전.
3. 3D 양적 위상 이미징
- 세포 손상 및 생 화 확 적인 변경 방지 하기 (마우스에서 림프 구 분리) 이후 5 h 내에서 완료 해야 하는 이미징 절차에 걸쳐 얼음에 정렬 된 세포를 유지.
- (B, T CD4 + 및 CD8 + T 림프 톨) 가운데 정렬된 셀 형식을 선택 하 고 샘플 (단계 2.6에서에서 얻은) 최적의 이미징 조건 (즉, 단일 보기 필드 당 하나의 셀)에 대 한 RPMI 매체와 180 셀 / µ L을 희석.
- 천천히 주입 하 여 희석된 샘플의 120 μ 이미징 챔버를 로드. 샘플 영상 실에서 거품의 존재에 철저 하 게 확인 하십시오. 거품이 있다면 신중 하 게 제거, 그들은 측정의 품질을 타협 것입니다.
- 상업적인 3D 양적 위상 현미경, 또는 holotomography, 및 이미징 소프트웨어를 사용 하 여 3D RI tomograms를 취득 합니다.
참고: 실험 설정에 대 한 자세한 내용은 원래 원고5에서 찾을 수 있습니다.- 현미경의 대물 렌즈 위에 증류수 한 방울을 놓습니다.
- 현미경의 번역 단계에 샘플 영상 챔버를 놓고 샘플 맞춥니다 대물 렌즈의 위치를 조정 합니다.
- 이미징 소프트웨어의 "현미경" 관점의 "보정" 탭에 각각, 초점 및 표면를 클릭 하 여 객관적이 고 콘덴서 렌즈의 축 위치를 조정 합니다.
- 자동 모드를 클릭 하 여 객관적이 고 콘덴서 렌즈를 맞춥니다. 또는, 스캔 모드 를 사용 하 고 수동으로 조정 렌즈 조명 패턴 보기의 필드의 중앙 지역에서 지역화 됩니다.
- 정상 모드로 돌아갑니다 고 보기 필드에서에서 셀을 찾으려면 번역 단계를 조정 합니다.
- 대물 렌즈의 축 위치를 조정 하 여 초점면을 찾아. 완벽 한 집중 하면 화면에서 시각화 샘플 경계 거의 보이지 않습니다.
- 셀 없이 위치를 찾을 번역 단계를 조정 합니다.
- 다양 한 조명 각도와 여러 2D 홀로그램 측정을 보정 을 클릭 합니다.
- 보기의 필드의 중앙에는 셀을 찾을 번역 단계를 조정 합니다.
- "수집" 탭으로 이동 하 고 3D 스냅숏 단계 3.4.8에서에서 다 동일한 조명 각도와 셀의 홀로그램을 측정 하기 위해 클릭.
- 수집 된 데이터는 "데이터 관리" 패널에 표시 됩니다, 수집 된 데이터를 마우스 오른쪽 단추로 클릭 고 과정 재구성 단계 3.4.8 3.4.10, 회절 단층 촬영 알고리즘을 사용 하 여 측정 하는 홀로그램에서 3D RI tomogram를 클릭 9 , 10 이미징 소프트웨어에 구현입니다.
- 기계 학습에 대 한 통계적 인 힘을 위해 100 개 이상의 셀을 측정 하는 단계 3.4.5-3.4.11를 반복 합니다.
- 3.4.11 단계를 통해 처리 되는 이미지에 대 한 모든. 구상 될 수 있다. "데이터 관리" 패널에서 데이터를 마우스 오른쪽 단추로 클릭 하 고 데이터를 시각화 하려면 열기를 클릭 합니다. "데이터 매니저" 패널에 RI Tomogram를 클릭 합니다. "미리 설정" 탭에서 로드를 클릭 하 고 "lymphocyte.xml"은 3D RI 배포판에 따라 tomogram를 시각화 하기 위해 이미징 소프트웨어에 의해 제공 된 미리 정의 된 전송 기능을 두 번 클릭 합니다.
- 3.2-3.4 모든 림프 톨의 3D RI tomograms 측정을 단계를 반복 합니다.
4. 양적 형태학 및 생화학 기능 3D 리 Tomograms에서 추출
- 단일 폴더에 위에 측정 모든 단층 촬영 데이터를 배치 합니다. 이 폴더의 하위 폴더에 셀 형식 분할 합니다. 각 tomogram는 단일 .mat 파일을 준비 합니다.
- 보조 파일 1 -기능 추출 (이미지 프로세싱 소프트웨어에 대 한 서 면)를 엽니다.
- 편집 라인 14 단계 4.1에서 tomogram 폴더를 지정 합니다.
- 편집 라인 15 추출된 기능 데이터를 저장 하는 폴더를 지정 합니다.
- 필요에 따라 편집 라인 기능 추출에 대 한 RI 임계값 매개 변수를 조정 17. 기본 옵션은 앞에서 설명한50.002의 증가 함께 1.340 1.378에서 20 리 임계값입니다.
- 코드를 실행 합니다. 데이터 집합에 있는 모든 tomogram에 대 한 코드 계산 5 특징: 표면 영역 (SA), 세포 볼륨 (CV), 구형 (SI), 단백질 밀도 (PD), 건조 질량 (DM), RI 임계값 당. 기능 추출에 대 한 자세한 알고리즘은 설명 되어5.
- 모니터링 기능 추출 하기 위하여 실행 하는 동안 시각화 RI 임계값 기반 셀 분할 화면에서 확인 합니다.
- 4.4 단계에서 지정 하는 폴더에 저장 하는 tomogram 당 .mat 파일 추출된 기능 데이터에 확인 하십시오.
5. 감독 학습 및 식별
- 임의로 별도 폴더와 훈련 (70%) 및 테스트 (30%)에 4.8 단계 집합에서 가져온 기능 데이터 분할.
- 오픈 보조 파일 2 -기차 (이미지 프로세싱 소프트웨어에 대 한 서 면).
- 편집 라인 14 단계 5.1에서에서 준비 학습 집합을 지정 합니다.
- 편집 라인 훈련된 분류자를 저장 하는 폴더를 지정 하는 16.
- 편집 라인 17 분류자에 대 한 파일 이름을 설정 합니다.
- 필요에 따라 선 훈련에 대 한 기능을 선택 하려면 19 편집. 기본 옵션 지정 이전5, 아래의 대표적인 결과 얻기 위해 사용 되었다.
- 코드를 실행 합니다. 학습 집합의 선택 된 기능을 사용 하 여 코드 열차 k분류자-가장 가까운 이웃 알고리즘 (k-NN; k = 4) 다음 (단계 5.5에서에서 이름)으로 하는 분류자 단계 5.4에서에서 지정 하는 폴더에 저장.
- 분류자 성능 및 교차 유효성 검사 정확도 시각화 화면에서 확인 합니다.
- 필요한 경우, 단계 5.5-5.7를 반복 하 여 다른 기능 조합으로 여러 개의 분류자를 기차. 다음 가장 높은 교차 유효성 검사 정확도 분류자를 선택 합니다.
- 보조 파일 3 -테스트를 열고 (이미지 프로세싱 소프트웨어에 대 한 서 면).
- 편집 라인 14-15 테스트 훈련 된 분류자를 지정 합니다.
- 편집 라인 17 단계 5.1에서에서 준비 된 테스트 집합을 지정 합니다.
- 코드를 실행 합니다. 위에서 설명한 분류자는 테스트 집합에 개별 세포의 세포 유형 식별 합니다.
- 식별 및 테스트 정확도 시각화 화면에서 확인 합니다.
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Representative Results
그림 1 전체 프로토콜의 구조 과정을 보여 줍니다. 여기에 제시 된 절차를 사용 하 여, 우리 B 고립 (n = 149), CD4 + T (n = 95), 및 CD8 + T (n = 112) 림프 톨. 다양 한 각도에서 조명의 위상 및 진폭 정보를 얻으려면 각 림프 톨의 여러 2D 홀로그램 (60 °-60 °)에서 조명의 각도 변경 하 여 측정 되었다. 일반적으로, 50 홀로그램 3D RI tomogram 재구성을 사용할 수 있습니다 하지만 이미징 속도 품질을 고려 하 고 2D 홀로그램의 수를 조정할 수 있습니다. 푸리에 변환43,44에 따라 필드 검색 알고리즘을 사용 하 여 측정 된 홀로그램의 진폭 및 위상 정보를 검색 합니다. 각 림프 톨의 3D RI tomogram 여러 2D 검색된 위상 및 진폭 정보에서 다양 한 각도에서 조명 광학 회절 단층 촬영 알고리즘을 사용 하 여 개축 되었다. 이미지 프로세스 및 3D RI tomogram 재건 방법의 자세한 내용은 다른 곳에서21,45찾을 수 있습니다.
그림 2 A-2_C 이미징 소프트웨어를 통해 RI 값에 따라 서로 다른 색 구성표를 할당 하 여 B, T CD4 + 및 CD8 + T 림프 톨의 대표 3D 렌더링 된 RI tomograms를 보여 줍니다. RI 값, 양적에서 형태학 (SA, CV와 SI) 생화학 (PD 및 DM) 기능을 계산 했다 (그림 2A-2_C). 이 결과 명확 하 게 3D 리 유통 세포의 형태학 상으로 생 화 학적 정보의 정량 분석을 수 있습니다 보여 줍니다.
감독된 기계 학습 단일 세포 수준에서 림프 구 종류를 식별 하기 위해 악용 했다. 측정 된 3D RI tomograms 했다 무작위로 분할 훈련 (b: 104, CD4 + t는: 66, 및 CD8 + t: 77) 및 테스트 (b: 45, CD4 + t는: 29, 및 CD8 + t: 35)의 30%와 70%로 데이터 집합, 각각. 우리는 극대로 기능 공간에서 인코딩된 셀 형식 관련 지문을 활용 하는 분류자를 최적화. (사실 부정적인) 총 정확도, 감도 (진정한 양성), 및 특이성 분류자 예측 결과 지상 진실 셀 형식을 비교 하 여 계산 했다.
제안 된 프로토콜의 증거의 개념을 설명 하기 위하여 우리는 세 가지 다른 경우에 감독된 기계 학습을 수행: (i) B 및 T 세포 (CD4 + 및 CD8 +), (ii) 2 T 림프 구 하위 및 (iii) 다중의 이진 분류 모든 림프 구 종류의 분류입니다.
그림 3 교육 및 테스트 단계에 대 한 최적화 된 분류자의 식별 성능을 보여줍니다. T와 B 림프 구 분류의 정확도 되었고 93.15% 교육 및 테스트 사례에 대 한 89.81% 각각. CD4 + 및 CD8 + T 림프 톨 통계적으로 분류 되었다, 그리고 정확도 각각 87.41%, 교육 및 테스트 집합에 대 한 84.38% 있었다. 마지막으로, multiclass 셀 유형 분류자의 정확도 되었고 80.65% 75.93% 학습 및 테스트 단계를 위해 각각.
그림 1 : 악용 하는 림프 구 종류의 레이블 없는 식별의 도식 다이어그램 3 D 양적 위상 이미징 및 기계 학습. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 2 : 대표 3 D 렌더링의 각 림프 구 세포 양적 형태학 및 생화학 기능 RI tomograms. (B 셀 A), (B) CD4 + T 세포, 그리고 (C) CD8 + T 세포 눈금 막대 = 2 µ m. SA, 영역; 이력서, 세포 볼륨; SI, 구형; PD, 단백질 밀도; DM, 건조 질량 이 그림5권한 수정 됩니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 3 : 감독된 기계 학습을 통해 개별 림프 톨의 유형 (B 및 T 세포, CD4 + 및 CD8 + T 세포의 (B) 이진 분류 및 모든 3 개의 림프 구 세포 유형의; (C) multiclass 분류의 A) 이진 분류 대 한 교육 및 테스트 설정 합니다. 교육 및 테스트 사례를 제안 하는 설립된 분류자의 좋은 일반화의 작은 차이 note 각 셀 형식의 이름 아래 숫자 사용 하는 셀의 수를 나타냅니다. 이 그림5권한 수정 됩니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
보조 파일 1: 기능을 추출 코드. 각 tomogram의 RI 임계값 기반 분할 후 기능 (SA, CV, SI, PD, 그리고 DM)를 추출. 이미지 처리 소프트웨어에서에서 구현. 이 파일을 다운로드 하려면 여기를 클릭 하십시오.
보조 파일 2: 훈련 코드. K-NN 분류자 훈련 선택한 기능에 따라 훈련. 이미지 처리 소프트웨어에서에서 구현. 이 파일을 다운로드 하려면 여기를 클릭 하십시오.
보조 파일 3: 테스트 코드. 새 데이터 집합에 대 한 훈련을 받은 k-NN 분류자 테스트 (즉., 테스트 세트). 이미지 처리 소프트웨어에서에서 구현. 이 파일을 다운로드 하려면 여기를 클릭 하십시오.
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Discussion
선물이 3D 양적 위상 이미징 및 기계 학습을 이용 하는 림프 구 종류의 레이블 없는 식별을 가능 하 게 하는 프로토콜. 이 프로토콜의 중요 한 단계는 양적 위상 이미징 및 기능을 선택 합니다. 최적의 홀로그램 영상에 대 한 위에 설명 된 대로 셀의 밀도 제어 한다. 셀의 기계적 안정성도 부동 또는 진동 세포 움직임 조명 각도 변화에 따라 홀로그램 측정을 방해 하기 때문에 정확한 3D RI 분포를 얻기 위해 중요 하다. 우리는, 따라서 샘플 된 안정적이 고 정적 이미징 챔버에 홀로그램을 측정 하기 전에 때까지 몇 분 정도 기다렸다. 홀로그램 공기와 샘플; 사이 리 차이 측정할 때 마지막으로, 이미징 챔버 내부 거품 문제가 있다 따라서, 샘플 영상 실로 신중 하 게 적재 되어야 한다.
특징 추출 및 선택 분류자의 식별 성능을 확인할. 5 양적 형태학 (CV, SA, SI) 계산 및 생화학 (PD, DM) 20 다른 RI 임계값 값; 3D 리 유통에서 기능 따라서, 우리는 총 100 기능을 추출. 우리는 철저 하 게 최고의 교차 유효성 검사 정확도 선택 되었습니다 최적의 기능과 분류자 조합 검색. 우리 테스트 6 다른 기계 학습 알고리즘을 포함 하 여 k-NN (k 4와 k = = 6), 선형 판별 분석, 이차 차별 분석, naïve Bayes, 그리고 결정 트리, 그리고 우리를 발견 그 k-NN (k = 4 ) 최고의 식별 성능을 보였다. 그러나, 학습 방법, 지원 벡터 기계와 신경 네트워크를 포함 하 여 다른 컴퓨터를 사용 하 여 인식 정확도 개선 하는 기회가 있다.
이 프로토콜 측정 3D 양적 위상 이미징 림프 구 종류; 식별을 통해 기본 광학 속성 따라서, 형광 또는 자석 구슬 기반 셀 정렬 기법, 막 단백질 구조를 수정 하 여 세포 기능을 변경의 위험에서 사용 하는 항 원-항 체 반응에 따라 라벨 프로세스는 필요 하지 않습니다. 또한, 현재 방법 3D 리 유통 고 단일-샷 홀로 그래피 방법46;에 의해 얻을 수 없는 셀에 대 한 3D 형태학 및 생화학 적인 정보를 제공 합니다. 따라서, 프로토콜의 식별 성능을 높은 차원 정보로 인해 더 정확 하다.
이 프로토콜의 사소한 제한 수동 샘플 단계 조정 이며 감독된 기계 학습에 대 한 프로세스를 표시 하는 데 필요한. 우리는 수동 변환 단계와 측정 된 홀로그램, 가장 시간이 많이 걸리는 단계를 조정 하 여 한 림프 구 검색. 이 제한 자동된 전동된 스테이지 또는 미세 채널 장치를 채용 하 여 향상 될 것 이다. 감독된 학습에 관한 알려진된 림프 구 종류는 최적의 분류자;을 설정 하는 데 필요한 따라서, 우리가 첫 번째 분리 했다 하 고 항 원-항 체 기반 정렬 기법에 따라 림프 구 세포 유형 식별 합니다. 그럼에도 불구 하 고,이 프로토콜은 lymphocytes, 본질적인 광학 대조에 여전히 사용 하 고 항 체를 지정 하는 데 사용 하는 라벨 에이전트 측정된 3D RI 신호에 영향을 무시할 수 있다. 따라서, 설립된 분류자 레이블 없는 방식으로 세포를 식별 하는 데 사용할 수 있습니다.
이 프로토콜은 주로 개별 셀의 3D RI tomograms를 측정 하 여 세포의 고기를 활용, 비록 이러한 3D RI 데이터 또한 사용할 수 있습니다 결합에서 다른 modalities genotypes 또는 proteomic 정보의 더 나은 분류에 대 한 해결 하위입니다. 최근에, 형광 이미징 및 QPI를 결합 하 여 상호 현미경 기법 도입된47,,4849왔다. 이 프로토콜에서 제시 하는 접근은 또한 이러한 상호 이미징 방법에 확장할 수 있습니다.
림프 구 종류의 식별 레이블 없는 이상 공부 하거나 비정상적인 세포 또는 림프 구 종류 중에서 비율을 감지 하 여 질병 진단에 적용할 수 있습니다. 또한,이 프로토콜은 적혈구, 혈소판, 백혈구를 포함 하 여 다양 한 셀을 식별 하 여 전체 혈액 분석에 적용할 수 있습니다.
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Disclosures
Y. 박 교수, 당 조, 텍와 S. 리 Tomocube, Inc., 광학 회절 단층 촬영 및 양적 위상 이미징 기기를 상품화 하는 작품의 스폰서 중 하나입니다 회사에에서 금융 관심 있다.
Acknowledgments
이 작품은 KAIST BK21 + 프로그램, Tomocube, Inc., 및 연구 재단의 국립 (2015R1A3A2066550, 2017M3C1A3013923, 2018 K 000396)에 의해 지원 되었다. Y. 조 KAIST 대통령 친목 및 아산 재단 생물 의학 과학 장학금 지원을 인정합니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Mouse | Daehan Biolink | C57BL/6J mice | gender and age-matched, 6 – 8 weeks |
| Falcon conical centrifuge tube | ThermoFisher Scientific | 14-959-53A | 15 mL |
| Phosphate-buffered saline | Sigma-Aldrich | 806544-500ML | |
| Ammonium-chloride-potassium lysing buffer | ThermoFisher Scientific | A1049201 | |
| RPMI-1640 medium | Sigma-Aldrich | R8758 | |
| Fetal bovine serum | ThermoFisher Scientific | 10438018 | |
| Antibody | BD Biosciences | 553140 (RRID:AB_394655) | CD16/32 (clone 2.4G2) |
| Antibody | BD Biosciences | 555275 (RRID:AB_395699) | CD3ε (clone 17A2) |
| Antibody | Biolegnd | 100734 (RRID:AB_2075238) | CD8α (clone 53-6.7) |
| Antibody | BD Biosciences | 557655 (RRID:AB_396770) | CD19 (clone 1D3) |
| Antibody | BD Biosciences | 557683 (RRID:AB_396793) | CD45R/B220 (clone RA3-6B2) |
| Antibody | BD Biosciences | 552878 (RRID:AB_394507) | NK1.1 (clone PK136) |
| Antibody | eBioscience | 11-0041-85 (RRID:AB_464893) | CD4 (clone GK1.5) |
| DAPI | Roche | 10236276001 | 4,6-diamidino-2-phenylindole |
| Flow cytometry | BD Biosciences | Aria II or III | |
| Imaging chamber | Tomocube, Inc. | TomoDish | |
| Holotomography | Tomocube, Inc. | HT-1H | |
| Holotomography imaging software | Tomocube, Inc. | TomoStudio | |
| Image professing software | MathWorks | Matlab R2017b |
References
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