Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Immunology and Infection
Click here for the English version

Immunology and Infection

Etiket içermeyen lenfosit alt türlerinden üç boyutlu nicel faz Imaging'i kullanma tanımlaması ve öğrenme makine

Published: November 19, 2018 doi: 10.3791/58305
Automatic Translation
1, 2,3,4,7, 3,4,5, 2,3, 6, 4, 2,3, 2,3,4
1Department of Physics, University of Cambridge, 2Department of Physics, Korea Advanced Institute of Science and Technology, 3KAIST Institute for Health Science and Technology, Korea Advanced Institute of Science and Technology, 4Tomocube, Inc., 5Department of Chemical and Biomolecular Engineering, Korea Advanced Institute of Science and Technology, 6Department of Biological Sciences, Korea Advanced Institute of Science and Technology, 7Department of Applied Physics, Stanford University

Summary

Biz lenfosit alt türlerinden nicel faz görüntüleme ve bir makine öğrenimi algoritması kullanarak etiket içermeyen tanımlaması için bir iletişim kuralı tanımlamak. 3D kırılma indisi tomograms lenfositlerin ölçümleri sonra hücre tiplerinin tanımlanması için bir makine-öğrenme algoritması ile analiz edilir 3D morfolojik ve biyokimyasal bilgilerini tek tek hücreler, mevcut.

Abstract

Biz burada nicel faz görüntüleme ve makine öğrenimi kullanarak lenfosit alt etiket içermeyen tanımlaması için bir iletişim kuralı tanımlamak. Kimlik lenfosit alt türlerinden İmmünoloji yanı sıra tanı, çalışma ve çeşitli hastalıkların tedavisi için önemlidir. Şu anda, standart yöntemlerini lenfosit türleri sınıflandırmak için belirli zar proteinleri antijen-antikor reaksiyonlar ile etiketleme güveniyor. Ancak, bu etiketleme teknikleri hücresel işlevlerini değiştirme potansiyel riskleri taşır. Burada açıklanan protokol 3D nicel faz görüntüleme ve bir makine öğrenimi algoritması tarafından ölçülen içsel optik tezat sömürerek bu zorlukların üstesinden gelir. 3D kırılma indisi (RI) tomograms lenfositlerin ölçümü 3D Morfoloji ve tek tek hücreler fenotipleri hakkında kantitatif bilgi sağlar. Ölçülen 3D RI tomograms çıkarılan biyofiziksel parametreleri kantitatif etiket içermeyen tanımlaması lenfosit türleri bir tek hücre düzeyinde etkinleştirme bir makine öğrenme algoritması ile incelenir. Biz 3D RI tomograms B, T CD4 + ve CD8 + T lenfositler ölçmek ve onların hücre tipleri ile % 80'den fazla tespit doğruluk. Bu protokol için lenfosit yalıtım, 3D nicel faz görüntüleme ve lenfosit türlerini tanımlamak için makine öğrenimi için ayrıntılı adımlar açıklanmaktadır.

Introduction

Lenfositler B, yardımcı (CD4 +) T, sitotoksik (CD8 +) T ve düzenleyici T de dahil olmak üzere çeşitli alt türleri gizli hücreleri. Lenfosit türlerinin farklı bir rol içinde edinilmiş bağışıklık sistemi vardır; Örneğin, T lenfositler belirli antijenleri tespit etmek, anormal hücreler ortadan kaldırmak ve B lenfositler düzenleyen oysa B lenfositler antikor, üretmek. Lenfosit fonksiyon ve yönetmelik sıkıca tarafından kontrol ve kanser1, otoimmün hastalıklar2ve viral enfeksiyonlar3de dahil olmak üzere çeşitli hastalıklar ile ilgili. Böylece, lenfosit türleri tanımlaması gibi hastalıklar ve immünoterapi kliniklerde patofizyolojik rollerini anlamak önemlidir.

Şu anda, yöntemlerini lenfosit türleri sınıflandırmak için belirli yüzey membran proteinlerinin veya yüzey işaretleyicileri4hedefleyerek antijen-antikor reaksiyonlar güveniyor. Yüzey işaretleyicileri hedefleme lenfosit türlerini belirlemek için kesin ve doğru bir yöntemdir. Ancak, pahalı reaktifler ve zaman alıcı yordamlara ihtiyaç duyar. Ayrıca, membran protein yapıları değişiklik ve tadilat hücresel fonksiyonların riskleri taşır.

Bu zorlukları aşmak için burada açıklanan protokol lenfosit türleri (QPI) düşsel 3D nicel faz ve5öğrenme makine kullanarak etiket içermeyen tanımlaması tanıtır. Bu yöntem, bireysel lenfositler etiket ücretsiz 3D görüntüleme dan çıkarılan morfolojik bilgilere dayanarak bir tek hücre düzeyinde lenfosit türleri sınıflandırılması sağlar. Geleneksel floresan mikroskopi teknikleri QPI kırılma indisi (RI) dağılımları (canlı hücre ve dokuların Iç optik özellikleri) optik kontrast6,7olarak kullanır. RI tomograms bireysel lenfositlerin lenfosit alt türleri için özel fenotipik bilgileri temsil eder. Bu durumda, sistemik 3D RI tomograms bireysel lenfositlerin yararlanmak için denetimli makine öğrenme algoritması kullanılmıştır.

Etiket içermeyen, sağladıkları çeşitli QPI teknikler kullanarak, 3D RI tomograms hücre aktif hücre patofizyolojisi çalışma için kullanılmış olan sayısal görüntüleme yeteneği8,9,10, 11,12,13. Ayrıca, tek tek hücreleri 3D RI dağılımları morfolojik, biyokimyasal ve biyomekanik hücreler hakkında bilgi sağlar. 3D RI tomograms daha önce kullanılan alanların Hematoloji14,15,16,17, bulaşıcı hastalıklar18,19, 20, immünoloji21, hücre biyolojisi22,23, iltihap24, kanser25, nörolojik26,27, gelişim biyolojisi28, toksikoloji 29ve Mikrobiyoloji12,30,31,32.

3D RI tomograms detaylı morfolojik ve biyokimyasal bilgilerini hücre sağlasa, sınıflandırma lenfosit alt türlerinden sadece 3D RI tomograms5Imaging tarafından elde etmek zordur. Sistematik ve kantitatif ölçülen 3D RI tomograms Cep tipi sınıflandırma için yararlanmak için bir makine öğrenme algoritması kullanılmıştır. Son zamanlarda, çeşitli eserler nicel hangi aşamada hücreleri görüntülerini analiz edildi öğrenme algoritmaları33mikroorganizmaların34, bakteriyel cins35 sınıflandırılması tespiti de dahil olmak üzere, çeşitli makine ile bildirilmiştir , 36, şarbon sporları37, hızlı ve etiket içermeyen tespiti otomatik analizi sperm hücresi38, kanser hücreleri39,40Analizi ve tespiti makrofaj harekete geçirmek41.

Bu iletişim kuralı etiket içermeyen tanımlaması lenfosit türleri, 3D QPI ve makine öğrenimi kullanılarak tek tek hücre düzeyinde uygulanacak ayrıntılı adımları sağlar. Bu içerir: 1) lenfosit yalıtım fare kan, 2) lenfosit akış sitometresi, 3) 3D QPI, 4) kantitatif Özellik çekme--dan 3D RI tomograms üzerinden sıralama ve lenfosit türlerini tanımlamak için 5) denetimli öğrenme.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Hayvan bakımı ve deneysel prosedürler kurumsal hayvan bakım ve kullanım KAIST Komitesi (KA2010-21, KA2014-01 ve KA2015-03) onay altında yapıldı. Bu çalışmada tüm deneylerin onaylı kılavuzlarınıza uygun olarak gerçekleştirilmiştir.

1. lenfosit izolasyon fare kan

  1. C57BL/6J fare CO2 inhalasyon yolu ile ötenazi, 26-G iğne fare kalp içine yerleştirin ve 0.3 mL kan toplamak. Doğrudan kan fosfat tamponlu tuz (PBS) ile 1 mL sulandırılmış 100 U/mL heparin çözüm ile bir tüpün içine koymak.
    Not: Alternatif olarak, lenfositler dalak üzerinden ayrılmış olabilir.
  2. Tüp 4 ° C'de 5 min için 400 x g, santrifüj kapasitesi
  3. Amonyum klorür potasyum lysing arabellek 0.5 mL tüp ekleyin ve yavaşça tersine çevirin onu birkaç kez çözüm karıştırmak için.
  4. Tüp, oda sıcaklığında (RT) 5 min için kuluçkaya.
  5. Hücreleri yıkama PBS 4.5 mL ekleme ve 400 x g 4 ° C'de 5 min için de iki kez centrifuging.
  6. Süpernatant kaldırmak ve taze RPMI-1640 orta % 10 fetal Sığır serum (FBS) ile 100 µL hücre Pelet resuspend.
  7. CD16/32 (2.4G2) antikor 0.1 µg engelleme için tüp ekleyin.
  8. Tüp buz üzerinde tutun.

2. Akış Sitometresi ve lenfosit alt türlerinden sıralama

Not: lenfosit hücre türüne bağlı olarak sıralama zemin-gerçek (Yani, doğru) hücre oluşturmak için esastır tren ve hücre türü sınıflandırıcının denetimli öğrenmede sınamak için etiketleri yazın. Akış Sitometresi, bir altın standart yöntem tanımlamak ve lenfositler42ayırmak için kullanılır.

  1. Taze RPMI-1640 orta 100 µL antikor boyama yüzey marker karışımı yapmak [% 10 ile FBS, 0.1 µg CD3e (17A2), CD8a (53-6,7), CD19 (1D 3), CD45R (B220, RA3-6B2) ve NK1.1 (PK136)] ve hedef B, T CD4 + ve CD8 + T CD4 (GK1.5) antikorların 0,25 µg lenfositler.
  2. (1.8. adımda elde) hücre süspansiyon için 100 µL antikor karışımı ekleyin.
  3. Buz üzerinde 25 min için kuluçkaya.
  4. Hücreleri yıkama 5 mL PBS de ekleyerek ve 400 x g 4 ° C'de 5 min için de iki kez centrifuging.
  5. 5 ml taze RPMI-1640 orta 10 ile hücre Pelet resuspend % FBS ve 2,5 µg DAPI (4', 6-diamidino-2-phenylindole).
  6. Lenfosit türlerinin ayrı olarak yukarıda açıklanan veri işaretleyicilerini floresans Düzeyler'i kullanarak akış sitometresi ile toplamak. DAPI sinyallerini kullanarak aynı anda dışlama ölü hücreleri.
    Not: Detaylı protokolleri ile ilgili akış sitometresi tabanlı cep sıralama-si olmak be daha önce42açıklanan.

3. 3D nicel faz görüntüleme

  1. Buz içinde 5 h (beri lenfosit yalıtım fareden) hücre hasarı ve biyokimyasal değişiklikler önlemek için tamamlanması gereken görüntüleme yordamları boyunca sıralanmış lenfositler tutun.
  2. Sıralanan hücre tipi (arasında B, T CD4 + ve CD8 + T lenfositler) seçin ve (2.6. adımda elde) örnek RPMI orta için en uygun görüntüleme durumu (Örneğin, bir hücre başına tek alan manzaralı) ile 180 hücre/µL için sulandırmak.
  3. 120 μL seyreltilmiş örnek bir görüntüleme odasına yavaş iğne ile yükleyin. Kabarcıklar örnekle görüntüleme odasında varlığı üzerinde iyice kontrol edin. Orada kabarcıklar, ölçümleri kalitesini uzlaşma olacak gibi dikkatle onları, kaldırın.
  4. 3D RI tomograms bir ticari 3D nicel faz mikroskop ya da holotomography ve görüntüleme yazılımı kullanarak elde.
    Not: Orijinal el yazması5' te deneysel kurulumu hakkında detaylı bilgi bulunabilir.
    1. Bir damla distile su üstünde tepe-in mikroskop objektif lens yerleştirin.
    2. Görüntüleme odası örnek ile mikroskop çeviri sahnesinde yerini ve örnek objektif lens ile hizalar konumu ayarlayın.
    3. Objektif ve kondansatör lenslerin Aksiyel pozisyonlar odak ve yüzey, sırasıyla, düşsel bilgisayar yazılımı "Mikroskop" bakış "Kalibrasyon" sekmesini tıklayarak ayarlayın.
    4. Objektif ve kondansatör lensler Otomatik Modu'nutıklatarak hizalayın. Alternatif olarak, Tarama modunu kullanın ve el ile aydınlatma modelleri görünümü alan Merkez Bölgesi yerelleştirilmiş lensler ayarlayın.
    5. Normal mod dönmek ve bir hücre alan bakış açısı içinde bulmak için çeviri sahne ayarlayın.
    6. Odak düzlemi objektif lens Aksiyel konumunu ayarlayarak bulma. Mükemmel odaklama ekran görüntülenir örnek sınır neredeyse görünmez yapar.
    7. Bir hücre olmayan bir konum bulmak için çeviri sahne ayarlayın.
    8. Değişen aydınlatma açıları ile birden fazla 2D hologramlar ölçmek için Ayarla ' yı tıklatın.
    9. Bir hücre görünümü alan merkezi bulmak için çeviri sahne ayarlayın.
    10. "Satın alma" sekmesine taşımak ve aynı aydınlatma açıları hücresiyle hologram adım 3.4.8 tamamlandý olarak ölçmek için 3D anlık görüntü ' ı tıklatın.
    11. Alınan verileri "Veri yönetimi" panelde sunulduğunda, alınan veriler üzerinde sağ tıklatın ve bir 3D RI tomogram kimden adım 3.4.8 ve 3.4.10, kırınım tomografi algoritması kullanılarak ölçülen hologram birleştirmeye işlemi ' ı tıklatın 9 , görüntüleme yazılımı uygulanan 10 .
    12. Adımları 3.4.5-3.4.11 makine istatistiksel güç sağlamak için 100'den fazla hücreleri ölçmek için yineleyin.
    13. Adım 3.4.11 işlenen tüm görüntüleri. görüntülenmeyecektir. "Veri yönetimi" panel veri sağ tıklatın ve verileri görselleştirmek için Aç'ı tıklatın. RI Tomogram "veri Yöneticisi" Masası'nı tıklatın. "Önceden" sekmesinde Yükle'yi tıklatın ve çift tıklayın "lymphocyte.xml" tomogram 3D RI dağıtımları göre görselleştirmek için görüntüleme yazılımı tarafından sağlanan önceden tanımlanmış transfer fonksiyonu olan.
  5. 3D RI tomograms tüm lenfosit alt türlerinden ölçmek için 3.2-3.4 adımları yineleyin.

4. kantitatif morfolojik ve biyokimyasal özelliği çekme--dan 3D RI Tomograms

  1. Yukarıda tek bir klasörde ölçülen tomografik veri yerleştirin. Bu klasörün alt klasörlerdeki hücre tipleri bölme. Bir tek .mat dosyası gibi her tomogram hazırlayın.
  2. Ek dosya 1 - özellik çıkarma (bir görüntü işleme yazılımı için yazılı) açın.
  3. 4.1. adımda hazırlanan tomogram klasörünü belirlemek için 14 satırı düzenleyin.
  4. İçini kaplamak 15 ayıklanan özelliği veri kaydetmek için bir klasör belirlemek için düzenleyin.
  5. İsteğe bağlı olarak, satır özellik çıkarma RI eşik parametrelerini ayarlamak için 17 düzenleyin. 20 RI eşikleri 1.340-1.378,5daha önce açıklandığı gibi 0,002 bir artışı ile gelen varsayılan seçenektir.
  6. Kod yürütebilir. Veri kümesi içinde her tomogram için kod beş özellikleri hesaplar: yüzey alanı (SA), hücresel birim (MF), Küresellik (sı), protein yoğunluğu (PD) ve kuru kitle (DM), RI eşik. Özellik çıkarma için ayrıntılı algoritmaları başka bir bölümünde5.
  7. Özellik çıkarma yürütme denetimi ekrandaki RI hücre eşik tabanlı segmentasyon görüntülenmesi sırasında izlemek için.
  8. Her adımda 4.4 belirlenmiş klasöre kaydedilmesini tomogram, .mat dosyası olarak ayıklanan Özellik verilere denetleyin.

5. öğrenme ve kimlik denetlenir

  1. Rastgele adıma 4.8, eğitim (% 70) ve test (% 30) kümeleri ayrı klasörlerle elde özelliği veri bölme.
  2. Açık ek dosya 2 - tren (bir görüntü işleme yazılımı için yazılı).
  3. 5.1. adımda hazırlanan eğitim seti belirtmek için 14 satırı düzenleyin.
  4. Satırı eğitimli Sınıflandırıcısı kaydetmek için bir klasör belirlemek için 16 düzenleyin.
  5. Satırı 17 Sınıflandırıcısı için bir dosya adı ayarlamak için düzenleyin.
  6. İsteğe bağlı olarak, satır için eğitim özellikleri seçin-19 düzenleyin. Varsayılan seçenek, aşağıdaki temsilcisi sonuçları elde etmek için daha önce5, belirttiğiniz gibi kullanıldı.
  7. Kod yürütebilir. Eğitim kümesi seçili özelliklerini kullanarak, kodun bir Sınıflandırıcısı kile trenler-en yakın komşu algoritması (k -NN; k = 4) ve sonra adım 5,4 belirlenmiş Klasör Sınıflandırıcısı (adım 5.5'te adlandırdığınız gibi) kaydeder.
  8. Sınıflandırıcısı performans ve çapraz doğrulama doğruluk görselleştirme ekranında işaretleyin.
  9. İsteğe bağlı olarak, farklı özellik kombinasyonları ile birden çok sınıflandırıcı adımları 5.5-5.7 yineleyerek tren. Daha sonra en yüksek çapraz doğrulama doğruluk ile Sınıflandırıcısı seçin.
  10. Ek dosya 3 - Test açın (bir görüntü işleme yazılımı için yazılı).
  11. Satırlarını test edilmesi için eğitimli Sınıflandırıcısı belirlemek için 14-15 düzenleyin.
  12. 5.1. adımda hazırlanan test seti belirtmek için 17 satırı düzenleyin.
  13. Kod yürütebilir. Yukarıda açıklanan Sınıflandırıcısı sınama kümesi bireysel lenfosit hücre türleri tanımlar.
  14. Kimlik performans ve test doğruluğu görselleştirme ekranında işaretleyin.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Şekil 1 tüm iletişim kuralı şematik süreci gösterir. Burada sunulan yordamını kullanarak B izole (n = 149), CD4 + T (n 95 =) ve CD8 + T (n = 112) lenfositler. Aydınlatma çeşitli açılarda faz ve genlik bilgilerini elde etmek için her lenfosit birden fazla 2D hologramlar (den-60 ° ile 60 °) aydınlatma açısını değiştirerek ölçüldü. Genelde 50 hologramlar 3D RI tomogram yeniden oluşturmak için kullanılan, ancak görüntüleme hızı ve kalitesi göz önünde bulundurarak 2D hologramlar sayısı ayarlanabilir. Ölçülen hologram genlik ve faz bilgi alındı Fourier dönüşümü43,44üzerinde temel alan alma algoritmasını kullanarak. Her lenfosit 3D RI tomogram birden fazla 2D tarihinde erişilmiştir faz ve genlik bilgilerinden optik kırınım tomografi algoritması kullanılarak aydınlatma çeşitli açılarda yeniden. Görüntü işlemi ve 3D RI tomogram yeniden yapılanma yöntemi ayrıntılarını21,45başka bir yerde bulunabilir.

Resim 2 A-2_C farklı renk şemaları görüntüleme yazılımı ile RI değerlere göre ayırarak temsilcisi 3D render RI tomograms B, T CD4 + ve CD8 + T lenfositler gösterir. RI değerlerinden nicel morfolojik (SA, CV ve SI) ve biyokimyasal (PD ve DM) Özellikleri (Şekil 2A-2_C). Bu sonuç 3D RI dağıtım kantitatif analiz lenfositlerin morfolojik hem de biyokimyasal bilgilerini sağlar açıkça göstermektedir.

Denetimli makine öğrenimi bir tek hücre düzeyinde lenfosit türlerini belirlemek üzere istismar edildi. Ölçülen 3D RI tomograms rastgele % 70 ve eğitim (B: 104, T: 66 CD4 + ve CD8 + t: 77) ve test (B: 45, T: 29 CD4 + ve CD8 + t: 35) % 30'u veri kümeleri, anılan sıraya göre ayrılmış. Sınıflandırıcı sonuna kadar özellik uzayda kodlanmış hücre türüne özgü parmak kullanmak için en iyi duruma getirilmiş. (Negatif gerçek) Toplam doğruluğu, (gerçek pozitif) duyarlılık ve özgüllük Sınıflandırıcısı tahmin sonuçları ve zemin-gerçek hücre tipleri karşılaştırma tarafından hesaplanır.

Önerilen iletişim kuralının prototip olarak göstermek için biz gerçekleştirilen denetimli makine öğrenimi üç farklı durumlarda: (i) B ve T lenfositler ve (ii) iki T lenfosit alt türlerinden (CD4 + ve CD8 +) ve (III) multiclass ikili sınıflandırılması Tüm lenfosit türleri sınıflandırılması.

Şekil 3 eğitim ve test aşamaları için en iyi duruma getirilmiş sınıflandırıcı kimlik performansını gösterir. T ve B lenfosit sınıflandırma doğruluğu %93.15 ve %89.81 için eğitim ve test durumları, sırasıyla idi. CD4 + ve CD8 + T lenfositler istatistiksel olarak sınıflandırılmış ve doğruluğu %87.41 ve %84.38 için eğitim ve test setleri, sırasıyla oldu. Son olarak, multiclass hücre türü Sınıflandırıcısı doğruluğunu %80.65 ve %75.93 sırasıyla için eğitim ve test aşamalarını, idi.

Figure 1
Resim 1 : İstismar lenfosit türleri etiket içermeyen tanımlaması şematik diyagramların 3 D nicel faz görüntüleme ve makine öğrenimi. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Figure 2
Resim 2 : Temsilcisi 3 D işlenen nicel morfolojik ve biyokimyasal özellikleri ile her lenfosit hücre türünün RI tomograms. (A) B hücresi, (B) CD4 + T hücre ve (C) CD8 + T hücre. Ölçek çubuğu 2 µm. SA, yüzey alanı; = CV, hücresel birim; SI, Küresellik; PD, protein yoğunluğu; DM, Kuru kitle. Bu rakam izni5ile değiştirilir. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Figure 3
Şekil 3 : Bireysel lenfosit tanımlaması türleri denetimli makine öğrenme yolu ile (A) B ve T hücreleri, CD4 + ve CD8 + T hücreleri (B) ikili sınıflandırılması ve (C) multiclass tüm üç lenfosit hücre türleri sınıflandırılması ikili sınıflandırılması; Eğitim ve test setleri için. Eğitim ve test durumları, kurulan sınıflandırıcı güzel genelleme düşündüren arasındaki küçük farka dikkat edin. Adları aşağıdaki sayıları her hücre türü kullanılan hücre sayısını belirleyin. Bu rakam izni5ile değiştirilir. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Supplementary File 1
Ek dosya 1: özelliği ayıklama kodu. Özellikler (SA, CV, SI, PD ve DM) RI eşik tabanlı segmentasyon her tomogram sonra ayıklanıyor. Bir görüntü işleme yazılımı uygulanan. Bu dosyayı indirmek için buraya tıklayınız.

Supplementary File 2
Ek dosya 2: eğitim kod. Seçili özelliklerini temel alarak bir k -NN Sınıflandırıcısı eğitim eğitim. Bir görüntü işleme yazılımı uygulanan. Bu dosyayı indirmek için buraya tıklayınız.

Supplementary File 3
Ek dosya 3: kodu test. Eğitimli k- NN sınıflandırıcının yeni bir veri kümesi için test (i.e., test kümesi). Bir görüntü işleme yazılımı uygulanan. Bu dosyayı indirmek için buraya tıklayınız.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Biz mevcut 3D nicel faz görüntüleme ve makine öğrenimi istismar lenfosit türleri etiket içermeyen tanımlaması etkinleştiren bir iletişim kuralıdır. Bu protokol kritik adım nicel faz görüntüleme ve Özellik seçimi vardır. En iyi holografik görüntüleme için hücre yoğunluğu yukarıda açıklandığı gibi kontrol edilmesi gerekmektedir. Hücrelerin mekanik sağlamlık da yüzen veya titreşim hücresel hareketleri aydınlatma açısı değişiklikleri üzerine hologram ölçümleri rahatsız etmeyecek çünkü kesin bir 3D RI dağılımı elde etmek önemlidir. Biz, bu nedenle örnek görüntüleme odasında hologramlar ölçme önce istikrarlı ve statik olana kadar birkaç dakika bekledi. Son olarak, hologram RI hava ve örnek arasındaki farklar nedeniyle ölçerken sorunlu kabarcıklar içinde görüntüleme odası; Böylece, örnek dikkatle görüntüleme odasına yüklü olmalıdır.

Özellik çıkarma ve seçim Sınıflandırıcısı kimlik performansını belirlemeye yardımcı olur. Biz 5 nicel morfolojik (CV, SA, sı) hesaplanır ve biyokimyasal (PD, DM) şekil--dan 3D RI dağıtım 20 farklı RI eşik değerleri; Böylece, toplam 100 özellikleri ayıklanır. Etraflıca en iyi çapraz doğrulama doğruluk seçildi göstermek en iyi özelliği ve Sınıflandırıcısı kombinasyonlarını aradık. Biz k -NN dahil olmak üzere 6 farklı makine öğrenimi algoritmaları test (k = 4 ve k = 6), doğrusal ayrımcılık analizi, ikinci dereceden ayrımcılık analiz, saf Bayes ve karar ağacı ve biz bulundu o k -NN (k = 4 ) en iyi kimlik performans gösterdi. Ancak, öğrenme yöntemleri destek vektör makine ve nöronal ağları da dahil olmak üzere, diğer makine kullanarak kimlik doğruluğunu geliştirmek için bir şans var.

Bu iletişim kuralı lenfosit türlerini belirlemek için 3D nicel faz Imaging ile içsel optik özellikleri önlemler; Böylece, floresan veya membran protein yapıları değiştirerek hücresel fonksiyon değiştirme riskleri var manyetik boncuk tabanlı cep-ayırma teknikleri, kullanılan antijen-antikor reaksiyonlar dayalı bir etiketleme işlemi gerektirmez. Ayrıca, mevcut Yöntem 3D RI dağıtım ölçer ve 3B morfolojik ve biyokimyasal bilgilerini bir tek-shot holografi yöntemi46tarafından alınamıyor hücre hakkında sağlar; Bu nedenle, iletişim kuralı kimliği performans nedeniyle yüksek boyutlu bilgi daha doğru olur.

Bu protokol küçük bir sınırlama örneği Sahne Alanı'nın manuel ayar ve etiketleme işlemi denetimli makine öğrenimi için gerekli. Manuel translasyonel sahne ve en zaman alıcı belgili tanımlık merdiven are ölçülen hologramlar ayarlayarak bir lenfosit aradık. Bu sınırlama bir otomatik motorlu sahne veya mikrosıvısal Kanal aygıtları istihdam ederek geliştirilmiş olacaktır. Denetimli öğrenme ile ilgili bilinen lenfosit türleri en iyi Sınıflandırıcısı kurmak için gereklidir; Bu sayede ilk izole etmek için vardı ve antijen-antikor-based sıralama tekniğine dayalı lenfosit hücre tipleri tanımlamak. Yine de, bu protokol hâlâ lenfositlerin içsel optik kontrast kullanır ve antikorlar belirtmek için kullanılan etiketleme aracıları üzerinde ölçülen 3D RI sinyal ihmal edilebilir etkileri vardır. Bu nedenle, kurulan Sınıflandırıcısı lenfositler etiket içermeyen bir şekilde tanımlamak için kullanılabilir.

Her ne kadar bu protokolü esas olarak kullanır fenotipleri lenfositlerin 3D RI tomograms bireysel hücrelerin ölçerek, bu 3D RI verileri de birlikte genotip ya da proteomik bilgi daha iyi sınıflandırılması için adresleme diğer yöntemleri ile kullanılabilir alt türlerinden. Son zamanlarda, bağdaşık mikroskobu teknikleri birleştirerek floresans görüntüleme ve QPI tanıtılan47,48,49olmuştur. Bu protokol için sunulan yaklaşım aynı zamanda bu bağdaşık görüntüleme yöntemleri için genişletilebilir.

Etiket içermeyen tanımlaması lenfosit türleri patofizyolojisi okuyan veya anormal lenfositler veya oranları lenfosit türleri arasında algılayarak hastalığı teşhis için uygulanabilir. Ayrıca, bu iletişim kuralı tam kan analizi için kırmızı kan hücreleri, trombosit ve beyaz kan hücreleri de dahil olmak üzere çeşitli hücreleri tanımlayarak uygulanabilir.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Prof. Y. Park, Y. Jo, Y. S. Kim ve S. Lee Tomocube, Inc, optik kırınım tomografi ve nicel faz aletleri Imaging commercializes ve bir çalışmanın sponsoru olduğu bir şirket mali çıkarları var.

Acknowledgments

Bu eser KAIST BK21 + Program, Tomocube, Inc ve Ulusal Araştırma Vakfı Kore (2015R1A3A2066550, 2017M3C1A3013923, 2018 K 000396) tarafından desteklenmiştir. Y. Jo KAIST başkanlık Bursu ve Asan Vakfı Biyomedikal Bilim bursu destek kabul eder.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Mouse Daehan Biolink C57BL/6J mice  gender and age-matched, 6 – 8 weeks
Falcon conical centrifuge tube ThermoFisher Scientific 14-959-53A 15 mL
Phosphate-buffered saline  Sigma-Aldrich 806544-500ML
Ammonium-chloride-potassium lysing buffer  ThermoFisher Scientific A1049201
RPMI-1640 medium Sigma-Aldrich R8758
Fetal bovine serum ThermoFisher Scientific 10438018
Antibody BD Biosciences 553140 (RRID:AB_394655) CD16/32 (clone 2.4G2)
Antibody BD Biosciences 555275 (RRID:AB_395699) CD3ε (clone 17A2)
Antibody Biolegnd 100734 (RRID:AB_2075238) CD8α (clone 53-6.7)
Antibody BD Biosciences 557655 (RRID:AB_396770) CD19 (clone 1D3)
Antibody BD Biosciences 557683 (RRID:AB_396793) CD45R/B220 (clone RA3-6B2)
Antibody BD Biosciences 552878 (RRID:AB_394507) NK1.1 (clone PK136)
Antibody eBioscience 11-0041-85 (RRID:AB_464893) CD4 (clone GK1.5)
DAPI  Roche 10236276001 4,6-diamidino-2-phenylindole
Flow cytometry  BD Biosciences Aria II or III 
Imaging chamber Tomocube, Inc. TomoDish
Holotomography Tomocube, Inc. HT-1H
Holotomography imaging software Tomocube, Inc. TomoStudio
Image professing software MathWorks Matlab R2017b

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Alizadeh, A. A., et al. Distinct types of diffuse large B-cell lymphoma identified by gene expression profiling. Nature. 403 (6769), 503 (2000).
  2. Von Boehmer, H., Melchers, F. Checkpoints in lymphocyte development and autoimmune disease. Nature Immunology. 11 (1), 14 (2010).
  3. Sáez-Cirión, A., et al. HIV controllers exhibit potent CD8 T cell capacity to suppress HIV infection ex vivo and peculiar cytotoxic T lymphocyte activation phenotype. Proceedings of the National Academy of Sciences. 104 (16), 6776-6781 (2007).
  4. Fischer, K., et al. Isolation and characterization of human antigen-specific TCRαβ+ CD4-CD8-double-negative regulatory T cells. Blood. 105 (7), 2828-2835 (2005).
  5. Yoon, J., et al. Identification of non-activated lymphocytes using three-dimensional refractive index tomography and machine learning. Scientific Reports. 7 (1), 6654 (2017).
  6. Popescu, G. Quantitative phase imaging of cells and tissues. , McGraw Hill Professional. (2011).
  7. Lee, K., et al. Quantitative phase imaging techniques for the study of cell pathophysiology: from principles to applications. Sensors. 13 (4), 4170-4191 (2013).
  8. Kim, D., et al. Refractive index as an intrinsic imaging contrast for 3-D label-free live cell imaging. bioRxiv. , 106328 (2017).
  9. Kim, K., et al. Optical diffraction tomography techniques for the study of cell pathophysiology. Journal of Biomedical Photonics & Engineering. 2 (2), (2016).
  10. Wolf, E. Three-dimensional structure determination of semi-transparent objects from holographic data. Optics Communications. 1 (4), 153-156 (1969).
  11. Kus, A., Dudek, M., Kemper, B., Kujawinska, M., Vollmer, A. Tomographic phase microscopy of living three-dimensional cell cultures. Journal of Biomedical Optics. 19 (4), 046009 (2014).
  12. Kim, T., et al. White-light diffraction tomography of unlabelled live cells. Nature Photonics. 8 (3), 256 (2014).
  13. Simon, B., et al. Tomographic diffractive microscopy with isotropic resolution. Optica. 4 (4), 460-463 (2017).
  14. Kim, Y., et al. Profiling individual human red blood cells using common-path diffraction optical tomography. Scientific Reports. 4, (2014).
  15. Park, H., et al. Measuring cell surface area and deformability of individual human red blood cells over blood storage using quantitative phase imaging. Scientific Reports. 6, (2016).
  16. Lee, S., et al. Refractive index tomograms and dynamic membrane fluctuations of red blood cells from patients with diabetes mellitus. Scientific Reports. 7, (2017).
  17. Merola, F., et al. Tomographic flow cytometry by digital holography. Light-Science & Applications. 6, (2017).
  18. Park, Y., et al. Refractive index maps and membrane dynamics of human red blood cells parasitized by Plasmodium falciparum. Proceedings of the National Academy of Sciences. 105, 13730-13735 (2008).
  19. Park, H., et al. Characterizations of individual mouse red blood cells parasitized by Babesia microti using 3-D holographic microscopy. Scientific Reports. 5, 10827 (2015).
  20. Chandramohanadas, R., et al. Biophysics of malarial parasite exit from infected erythrocytes. Public Library of Science ONE. 6 (6), 20869 (2011).
  21. Yoon, J., et al. Label-free characterization of white blood cells by measuring 3D refractive index maps. Biomedical Optics Express. 6 (10), 3865-3875 (2015).
  22. Kim, K., et al. Three-dimensional label-free imaging and quantification of lipid droplets in live hepatocytes. Scientific Reports. 6, 36815 (2016).
  23. Kim, D., et al. Label-free high-resolution 3-D imaging of gold nanoparticles inside live cells using optical diffraction tomography. Methods. , (2017).
  24. Lenz, P., et al. Multimodal Quantitative Phase Imaging with Digital Holographic Microscopy Accurately Assesses Intestinal Inflammation and Epithelial Wound Healing. Journal of Visualized Experiments. (115), (2016).
  25. Huang, J., Guo, P., Moses, M. A. A Time-lapse, Label-free, Quantitative Phase Imaging Study of Dormant and Active Human Cancer Cells. Journal of Visualized Experiments. (132), (2018).
  26. Yang, S. A., Yoon, J., Kim, K., Park, Y. Measurements of morphological and biochemical alterations in individual neuron cells associated with early neurotoxic effects in Parkinson's disease. Cytometry Part A. 91 (5), 510-518 (2017).
  27. Cotte, Y., et al. Marker-free phase nanoscopy. Nature Photonics. 7 (2), 113-117 (2013).
  28. Nguyen, T. H., Kandel, M. E., Rubessa, M., Wheeler, M. B., Popescu, G. Gradient light interference microscopy for 3D imaging of unlabeled specimens. Nature Communications. 8 (1), 210 (2017).
  29. Kwon, S., et al. Mitochondria-targeting indolizino [3, 2-c] quinolines as novel class of photosensitizers for photodynamic anticancer activity. European Journal of Medicinal Chemistry. 148, 116-127 (2018).
  30. Bennet, M., Gur, D., Yoon, J., Park, Y., Faivre, D. A Bacteria-Based Remotely Tunable Photonic Device. Advanced Optical Materials. , (2016).
  31. Kim, T. I., et al. Antibacterial Activities of Graphene Oxide-Molybdenum Disulfide Nanocomposite Films. ACS Applied Materials & Interfaces. 9 (9), 7908-7917 (2017).
  32. Bedrossian, M., Barr, C., Lindensmith, C. A., Nealson, K., Nadeau, J. L. Quantifying Microorganisms at Low Concentrations Using Digital Holographic Microscopy (DHM). Journal of Visualized Experiments. (129), (2017).
  33. Jo, Y., et al. Quantitative Phase Imaging and Artificial Intelligence: A Review. arXiv preprint. , arXiv:1806.03982 (2018).
  34. Javidi, B., Moon, I., Yeom, S., Carapezza, E. Three-dimensional imaging and recognition of microorganism using single-exposure on-line (SEOL) digital holography. Optics Express. 13 (12), 4492-4506 (2005).
  35. Jo, Y., et al. Label-free identification of individual bacteria using Fourier transform light scattering. Optics Express. 23 (12), 15792-15805 (2015).
  36. Jo, Y., et al. Angle-resolved light scattering of individual rod-shaped bacteria based on Fourier transform light scattering. Scientific Reports. 4, 5090 (2014).
  37. Jo, Y., et al. Holographic deep learning for rapid optical screening of anthrax spores. Science Advances. 3 (8), 1700606 (2017).
  38. Mirsky, S. K., Barnea, I., Levi, M., Greenspan, H., Shaked, N. T. Automated analysis of individual sperm cells using stain-free interferometric phase microscopy and machine learning. Cytometry Part A. 91 (9), 893-900 (2017).
  39. Roitshtain, D., et al. Quantitative phase microscopy spatial signatures of cancer cells. Cytometry Part A. 91 (5), 482-493 (2017).
  40. Lam, V. K., Nguyen, T. C., Chung, B. M., Nehmetallah, G., Raub, C. B. Quantitative assessment of cancer cell morphology and motility using telecentric digital holographic microscopy and machine learning. Cytometry Part A. , (2017).
  41. Pavillon, N., Hobro, A. J., Akira, S., Smith, N. I. Noninvasive detection of macrophage activation with single-cell resolution through machine learning. Proceedings of the National Academy of Sciences. , (2018).
  42. Basu, S., Campbell, H. M., Dittel, B. N., Ray, A. Purification of Specific Cell Population by Fluorescence Activated Cell Sorting (FACS). Journal of Visualized Experiments. (41), e1546 (2010).
  43. Takeda, M., Ina, H., Kobayashi, S. Fourier-transform method of fringe-pattern analysis for computer-based topography and interferometry. Journal of the Optical Society of America. 72 (1), 156-160 (1982).
  44. Debnath, S. K., Park, Y. Real-time quantitative phase imaging with a spatial phase-shifting algorithm. Optics Letters. 36 (23), 4677-4679 (2011).
  45. Kim, K., et al. High-resolution three-dimensional imaging of red blood cells parasitized by Plasmodium falciparum and in situ hemozoin crystals using optical diffraction tomography. Journal of Biomedical Optics. 19 (1), 011005 (2013).
  46. Vercruysse, D., et al. Three-part differential of unlabeled leukocytes with a compact lens-free imaging flow cytometer. Lab on a Chip. 15 (4), 1123-1132 (2015).
  47. Kim, K., et al. Correlative three-dimensional fluorescence and refractive index tomography: bridging the gap between molecular specificity and quantitative bioimaging. Biomedical Optics Express. 8 (12), 5688-5697 (2017).
  48. Shin, S., Kim, D., Kim, K., Park, Y. Super-resolution three-dimensional fluorescence and optical diffraction tomography of live cells using structured illumination generated by a digital micromirror device. arXiv preprint. , arXiv:1801.00854 (2018).
  49. Chowdhury, S., Eldridge, W. J., Wax, A., Izatt, J. A. Structured illumination multimodal 3D-resolved quantitative phase and fluorescence sub-diffraction microscopy. Biomedical Optics Express. 8 (5), 2496-2518 (2017).

Tags

İmmünoloji ve enfeksiyon sayı: 141 nicel faz görüntüleme optik kırınım tomografi holotomography holografik mikroskobu lenfosit kimlik bağışıklık hücre immünoloji makine öğrenimi etiket içermeyen görüntüleme
Etiket içermeyen lenfosit alt türlerinden üç boyutlu nicel faz Imaging'i kullanma tanımlaması ve öğrenme makine
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Yoon, J., Jo, Y., Kim, Y. S., Yu,… More

Yoon, J., Jo, Y., Kim, Y. S., Yu, Y., Park, J., Lee, S., Park, W. S., Park, Y. Label-Free Identification of Lymphocyte Subtypes Using Three-Dimensional Quantitative Phase Imaging and Machine Learning. J. Vis. Exp. (141), e58305, doi:10.3791/58305 (2018).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter