Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Immunology and Infection

تحديد أنواع فرعية اللمفاويات باستخدام التصوير ثلاثي الأبعاد الكمية المرحلة خالية من التسمية وآله التعلم

doi: 10.3791/58305 Published: November 19, 2018

Summary

يمكننا وصف بروتوكول لتحديد الأنواع الفرعية اللمفاويات باستخدام تصوير المرحلة الكمية وخوارزميه تعلم آلة خالية من التسمية. قياسات توموجرامس 3D الانكسار من الخلايا الليمفاوية يقدم معلومات ثلاثية الأبعاد المورفولوجية والبيوكيميائية للخلايا الفردية، التي ثم يتم تحليل خوارزمية التعلم الآلي للتعرف على أنواع الخلايا.

Abstract

يصف لنا هنا بروتوكولا لتحديد الأنواع الفرعية اللمفاويات باستخدام تصوير المرحلة الكمية وآله التعلم خالية من التسمية. تحديد أنواع فرعية اللمفاويات مهم لدراسة علم المناعة، فضلا عن تشخيص وعلاج الأمراض المختلفة. حاليا، تعتمد الأساليب القياسية لتصنيف أنواع اللمفاويات على وسم البروتينات الغشاء محددة عن طريق التفاعلات ضد مستضد. ومع ذلك، هذه التقنيات وصفها تحمل المخاطر المحتملة لتغيير الوظائف الخلوية. البروتوكول هو موضح هنا يتغلب على هذه التحديات عن طريق استغلال التناقضات البصرية الجوهرية تقاس بتصوير ثلاثي الأبعاد الكمية المرحلة وخوارزميه آلة تعلم. قياس الانكسار 3D (RI) توموجرامس من الخلايا الليمفاوية معلومات كمية عن مورفولوجيا 3D وتعمل الخلايا الفردية. ثم يتم تحليل البارامترات الفيزيائية المستخرجة من توموجرامس ري 3D قياس كمي مع خوارزمية تعلم جهاز، مما يتيح تحديد أنواع اللمفاويات على مستوى خلية واحدة خالية من التسمية. قياس توموجرامس ري 3D من الخلايا اللمفية CD4 + T ب و CD8 + T، والتعرف على أنواع الخلايا مع أكثر من 80% الدقة. في هذا البروتوكول، يصف لنا الخطوات التفصيلية لعزل الخلايا اللمفاوية، وتصوير ثلاثي الأبعاد الكمية المرحلة، وآله التعلم لتحديد أنواع اللمفاويات.

Introduction

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

ويمكن تصنيف الخلايا الليمفاوية إلى أنواع فرعية مختلفة بما في ذلك ب، مساعد التائية (CD4 +) والسامة للخلايا (CD8 +) تي تي التنظيمية الخلايا. يحتوي كل نوع اللمفاويات على دوراً مختلفاً في النظام المناعي التكيفي؛ على سبيل المثال، تنتج الخلايا الليمفاوية ب الأجسام المضادة، بينما لمفاوية T كشف المستضدات محددة والقضاء على الخلايا غير الطبيعية، وتنظيم الخلايا الليمفاوية ب. وظيفة اللمفاويات وتنظيم محكم يسيطر عليها والمتعلقة بمختلف الأمراض بما فيها السرطان1،2من أمراض المناعة الذاتية، والعدوى الفيروسية3. وبالتالي، من المهم تحديد أنواع اللمفاويات على فهم أدوارهم الفيزيولوجية المرضية في مثل هذه الأمراض والعلاج المناعي في العيادات.

حاليا، تعتمد أساليب لتصنيف أنواع اللمفاويات على التفاعلات ضد مستضد باستهداف البروتينات الغشاء السطحي محددة أو علامات السطح4. استهداف علامات السطحية طريقة دقيقة ودقيقة لتحديد أنواع اللمفاويات. ومع ذلك، فإنه يتطلب الكواشف باهظة الثمن وإجراءات تستغرق وقتاً طويلاً. وعلاوة على ذلك، فإنه ينطوي على مخاطر تعديل الهياكل بروتين الغشاء وتحوير الوظائف الخلوية.

للتغلب على هذه التحديات، يدخل البروتوكول الموصوفة هنا تحديد أنواع اللمفاويات باستخدام المرحلة الكمية 3D التصوير (كبي) وآله التعلم5خالية من التسمية. هذا الأسلوب يتيح لتصنيف أنواع اللمفاويات على مستوى خلية واحدة استناداً إلى الخصائص المورفولوجية المعلومات المستخرجة من تصوير 3D تسمية خالية من الخلايا الليمفاوية الفردية. خلافا لتقنيات الفحص المجهري الفلورية التقليدية، يستخدم قبي الانكسار (RI) توزيعات (الخصائص البصرية الأصيلة للخلايا الحية والأنسجة) كالتباين الضوئي6،7. وتمثل توموجرامس ري من الخلايا الليمفاوية الفردية المظهرية معلومات محددة لأنواع فرعية من الخلايا الليمفاوية. وفي هذه الحالة، عناصره استخدام 3D توموجرامس ري من الخلايا الليمفاوية الفردية، استخدم خوارزمية تعلم تحت إشراف جهاز.

باستخدام تقنيات مختلفة كبي، توموجرامس ري 3D للخلايا بنشاط استخدمت لدراسة الخلية الفيزيولوجيا المرضية لأنها توفر تسمية مجاناً، كمية التصوير قدرة8،،من910، 11،،من1213. أيضا، يمكن أن توفر توزيعات ري 3D من خلايا فردية المورفولوجية والكيميائية الحيوية والنشاط الحيوي من المعلومات حول الخلايا. 3D ري توموجرامس قد استخدمت سابقا في مجالات أمراض الدم14،15،،من1617،18،الأمراض المعدية19، 20، علم المناعة21، خلية علم الأحياء22،23، التهاب24، السرطان25، علم الأعصاب26،27، علم الأحياء التنموي28، وعلم السموم 29، وعلم الأحياء الدقيقة12،30،،من3132.

على الرغم من أن 3D ري توموجرامس توفير معلومات تفصيلية المورفولوجية والبيوكيميائية للخلايا، أمر يصعب تحقيقه ببساطة التصوير 3D توموجرامس ري5تصنيف الأنواع الفرعية اللمفاويات. منهجياً وكمياً استغلال توموجرامس ري 3D قياس لتصنيف نوع الخلية، ونحن تستخدم خوارزمية تعلم آلة. في الآونة الأخيرة، عدة أعمال أفيد في المرحلة الكمية التي تم تحليل صور خلايا مع مختلف آلة التعلم خوارزميات33، بما في ذلك الكشف عن الكائنات الحية الدقيقة34، تصنيف جنس البكتيرية35 , الآلي 36، الكشف السريع وخاليا من جراثيم الجمرة الخبيثة37، تحليل الخلايا المنوية38، وتحليل لسرطان خلايا39،40، والكشف عن التنشيط بلعم41.

يوفر هذا البروتوكول خطوات تفصيلية القيام بتحديد أنواع اللمفاويات على مستوى الخلية الفردية باستخدام 3D كبي وآله التعلم خالية من التسمية. وهذا يشمل: 1) اللمفاويات في معزل عن الدم الماوس وفرز الخلايا اللمفاوية 2) عن طريق التدفق الخلوي، كبي 3) ثلاثي الأبعاد، استخراج ميزة 4) كمية من 3D ري توموجرامس والتعلم 5) تحت إشراف لتحديد أنواع اللمفاويات.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

رعاية الحيوان وإجراءات تجريبية أجريت تحت الموافقة على "رعاية الحيوان مؤسسية" واللجنة KAIST الاستخدام (KA2010-21 و KA2014-01 KA2015-03). أجريت جميع التجارب في هذه الدراسة وفقا للمبادئ التوجيهية المعتمدة.

1-اللمفاويات في معزل عن الدم الماوس

  1. حالما يتم euthanized ماوس C57BL/6J عن طريق استنشاق أول أكسيد الكربون2 ، أدخل إبرة 26-ز في قلب الماوس وجمع 0.3 مل دم. مباشرة وضع الدم في أنبوب مع يو/مليلتر 100 الهيبارين الحل المخفف مع 1 مل من المحلول الملحي مخزنة الفوسفات (PBS).
    ملاحظة: بدلاً من ذلك، الخلايا الليمفاوية من الطحال يمكن أن تكون معزولة.
  2. الطرد المركزي الأنبوب في 400 غرام x لمدة 5 دقائق في 4 درجات مئوية.
  3. إضافة 0.5 مل من كلوريد الأمونيوم-البوتاسيوم ليسينج المخزن المؤقت إلى الأنبوب ولطف عكس ذلك بضع مرات لخلط الحل.
  4. احتضان الأنبوب في درجة حرارة الغرفة (RT) لمدة 5 دقائق.
  5. غسل الخلايا بإضافة 4.5 مل من برنامج تلفزيوني وسينتريفوجينج في 400 غرام x لمدة 5 دقائق في 4 درجات مئوية، مرتين.
  6. إزالة المادة طافية وريسوسبيند بيليه الخلية في 100 ميليلتر في المتوسط RPMI 1640 الطازجة مع 10% مصل بقرى الجنين (FBS).
  7. إضافة 0.1 ميكروغرام من جسم CD16/32 (2.4G2) إلى الأنبوب لحجب.
  8. الاحتفاظ بالانبوب على الجليد.

2-التدفق الخلوي وفرز الأنواع الفرعية اللمفاويات

ملاحظة: فرز الخلايا الليمفاوية اعتماداً على نوع الخلية ضروري لإنشاء الخلية الأرض-الحقيقة (أي الصحيح) اكتب تسميات لتدريب واختبار مصنف نوع خلية في التعلم تحت الإشراف. ويستخدم التدفق الخلوي، أسلوب معيار الذهب، تحديد وفصل الخلايا الليمفاوية42.

  1. جعل خليط علامة السطحية تلطيخ أجسام مضادة في 100 ميليلتر الطازجة RPMI 1640 متوسطة [مع 10% FBS، 0.1 ميكروغرام من CD3e (17A2)، CD8a (53-6.7)، CD19 (1 د 3)، CD45R (B220، RA3-6B2)، و NK1.1 (PK136)] و 0.25 ميكروغرام من الأجسام المضادة خلايا CD4 (GK1.5) للهدف ب وخلايا CD4 + T CD8 + T الخلايا الليمفاوية.
  2. إضافة 100 ميليلتر من خليط جسم إلى تعليق الخلية (التي تم الحصول عليها في الخطوة 1.8).
  3. احتضان لمدة 25 دقيقة على الجليد.
  4. غسل الخلايا بإضافة 5 مل من برنامج تلفزيوني وسينتريفوجينج في 400 غرام x لمدة 5 دقائق في 4 درجات مئوية، مرتين.
  5. ريسوسبيند بيليه الخلية في 5 مل متوسط RPMI 1640 الطازجة مع 10% FBS و 2.5 ميكروغرام من DAPI (4 ', 6-دياميدينو-2-فينيليندولي).
  6. جمع كل نوع من أنواع الخلايا اللمفاوية بشكل منفصل مع التدفق الخلوي استخدام مستويات الأسفار من العلامات المذكورة أعلاه. في الوقت نفسه استبعاد الخلايا الميتة باستخدام إشارات DAPI.
    ملاحظة: وصف بروتوكولات مفصلة فيما يتعلق بتدفق الخلية على أساس الخلوي الفرز قد تم سابقا42.

3-تصوير المرحلة الكمية 3D

  1. تبقى لمفاوية فرزها على الجليد طوال إجراءات التصوير، التي ينبغي أن تنجز ضمن ح 5 (منذ عزل الخلايا اللمفاوية من الماوس) لتجنب تلف الخلايا والتعديلات البيوكيميائية.
  2. حدد نوع خلية تم فرزها (بين الخلايا اللمفية CD4 + T ب و CD8 + T) وتمييع العينة (التي تم الحصول عليها في الخطوة 2، 6) إلى الخلايا 180/ميليلتر مع المتوسطة ربمي لشرط التصوير الأمثل (أي خلية واحدة كل واحد من حقل من عرض).
  3. تحميل 120 ميكروليتر من عينة مخففة في تشكيل غرفة تصوير بالحقن ببطء. فحص دقيق على وجود فقاعات في قاعة التصوير مع العينة. إذا كان هناك فقاعات، بعناية إزالة لهم، كما أنها سوف تهدد نوعية القياسات.
  4. الحصول على توموجرامس ري 3D استخدام مجهر المرحلة كمية تجارية ثلاثية الأبعاد، أو هولوتوموجرافي، ولها برامج التصوير.
    ملاحظة: يمكن الاطلاع على معلومات مفصلة حول إعداد تجريبية في المخطوطة الأصلية5.
    1. ضع قطره ماء المقطر على رأس الهدف عدسة المجهر.
    2. ضع دائرة التصوير مع العينة في مرحلة الترجمة المجهر وضبط موقعة بحيث يحاذي العينة مع عدسة الهدف.
    3. ضبط مواقف محورية للعدسات الهدف ومكثف بواسطة النقر فوق السطح، و التركيز على التوالي، ضمن علامة التبويب "معايرة" المنظور "المجهر" من برامج التصوير.
    4. قم بمحاذاة العدسات الهدف ومكثف بواسطة النقر فوق وضع السيارات. بدلاً من ذلك، استخدام وضع المسح الضوئي ، وضبط العدسات يدوياً بحيث يتم ترجمة أنماط الإضاءة في المنطقة الوسطى من الحقل للعرض.
    5. العودة إلى الوضع العادي وضبط مرحلة الترجمة موقع خلية في الحقل للعرض.
    6. البحث عن المستوى البؤري بضبط موضع العدسة الهدف المحوري. تركز الكمال يجعل الحدود عينة تصور في الشاشة يكاد يكون غير مرئي.
    7. ضبط مرحلة الترجمة للبحث عن موقع دون خلية.
    8. انقر فوق معايرة قياس الهولوغرام 2D متعددة مع اختلاف الإضاءة زوايا.
    9. ضبط مرحلة الترجمة لتحديد موقع خلية في وسط الحقل من العرض.
    10. الانتقال إلى علامة التبويب "اكتساب" وانقر فوق لقطة ثلاثية الأبعاد لقياس الصور المجسمة للخلية مع زوايا الإضاءة متطابقة كما فعلت في الخطوة 3.4.8.
    11. عندما يتم تقديم البيانات المكتسبة في لوحة "إدارة البيانات"، انقر بالزر الأيمن على البيانات المكتسبة وانقر فوق عملية إعادة بناء توموجرام ري 3D من الهولوغرام تقاس بالخطوات 3.4.8 و 3.4.10، باستخدام خوارزمية حيود التصوير المقطعي 9 , 10 نفذت في برامج التصوير.
    12. كرر الخطوات 3.4.5-3.4.11 لقياس أكثر من 100 خلية لضمان القوة الإحصائية لالة التعلم.
    13. كل الصور التي يتم معالجتها من خلال هذه الخطوة 3.4.11. يمكن تصور. في لوحة "إدارة البيانات"، انقر بالزر الأيمن البيانات وانقر فوق فتح لتصور البيانات. انقر فوق "توموجرام ري" على لوحة "إدارة البيانات". في علامة التبويب "مسبقاً"، انقر فوق تحميل وانقر نقراً مزدوجاً فوق "lymphocyte.xml"، ونقل المعرفة مسبقاً دالة توفرها برامج التصوير لتصور توموجرام وفقا للتوزيعات ري 3D.
  5. كرر الخطوات من 3.2-3.4 قياس 3D توموجرامس ري من جميع الأنواع الفرعية اللمفاويات.

4-استخراج ميزة المورفولوجية والبيوكيميائية كمية من توموجرامس ري 3D

  1. ضع كافة البيانات تمجربهك قياس أعلاه في مجلد واحد. تقسيم أنواع الخلايا الموجودة في المجلدات الفرعية لهذا المجلد. إعداد كل توموجرام ليكون ملف واحد .mat .
  2. فتح التكميلية الملف 1 -"استخراج ميزة" (مكتوبة لبرامج معالجة صور).
  3. تحرير السطر 14 لتعيين المجلد توموجرام إعدادها في الخطوة 4، 1.
  4. تحرير السطر 15 لتعيين مجلد لحفظ البيانات المستخرجة سمة.
  5. بشكل اختياري، تحرير السطر 17 لضبط المعلمات عتبة ري لاستخراج ميزة. الخيار الافتراضي 20 عتبات ري من 1.340-1.378، مع زيادة 0.002 كما هو موضح سابقا5.
  6. تنفيذ التعليمات البرمجية. لكل توموجرام في dataset، التعليمة البرمجية بحساب خمس ميزات: المساحة (SA)، وحجم الخلوية (CV)، كروية (سي)، وكثافة البروتين (PD)، ووزن جاف (مارك ألماني)، كل عتبة ري. يتم وصف الخوارزميات مفصلة لاستخراج ميزة في أماكن أخرى5.
  7. من أجل مراقبة استخراج ميزة، أثناء التنفيذ التحقق على الشاشة تصور تقسيم الخلية المستندة إلى عتبة ري.
  8. التحقق من البيانات المستخرجة سمة، كملف .mat كل توموجرام، تم حفظها في المجلد المعين في الخطوة 4، 4.

5-الإشراف على التعلم وتحديد الهوية

  1. تقسيم البيانات الميزة التي تم الحصول عليها في الخطوة 4، 8 للتدريب (70 في المائة)، واختبار (30 في المائة) مجموعات مع مجلدات منفصلة عشوائياً.
  2. فتح التكميلية الملف 2 -قطار (كتب لبرامج معالجة صور).
  3. تحرير السطر 14 إلى تعيين مجموعة التدريب إعدادها في الخطوة 5، 1.
  4. تحرير سطر 16 لتعيين مجلد الذي تريد حفظ المصنف المدربين.
  5. تحرير سطر 17 لتعيين اسم ملف للمصنف.
  6. بشكل اختياري، تحرير السطر 19 لتحديد الميزات للتدريب. الخيار الافتراضي، كما المحدد سابقا5، استخدمت للحصول على النتائج الممثلة أدناه.
  7. تنفيذ التعليمات البرمجية. باستخدام الميزات المحددة لمجموعة التدريب، تدرب التعليمة البرمجية مصنف مع كاقرب جاره خوارزمية (ك-NN; k = 4) وثم حفظ المصنف (كما يدعى في الخطوة 5، 5) في المجلد المعين في الخطوة 5، 4.
  8. تحقق من على الشاشة تصور أداء المصنف ودقة عبر التحقق من صحة.
  9. بشكل اختياري، تدريب مصنفات متعددة مع مجموعات مختلفة من ميزة بتكرار الخطوات 5.5-5.7. ثم اختر المصنف مع الصليب-التحقق من دقة أعلى.
  10. فتح التكميلية الملف 3 -اختبار (كتب لبرامج معالجة صور).
  11. تحرير خطوط 14-15 لتعيين المصنف مدربين لفحصها.
  12. تحرير سطر 17 إلى تعيين مجموعة اختبار إعدادها في الخطوة 5، 1.
  13. تنفيذ التعليمات البرمجية. المصنف المذكورة أعلاه يحدد أنواع خلية لمفاوية الفردية في مجموعة الاختبار.
  14. تحقق من على الشاشة تصور القيام بتحديد ودقة الاختبار.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

الرقم 1 يبين عملية تخطيطية للبروتوكول بأكملها. استخدام الإجراء المعروضة هنا، ونحن عزل ب (n = 149)، خلايا CD4 + T (n = 95)، و CD8 + T (n = 112) لمفاوية. للحصول على معلومات المرحلة والسعة في زوايا مختلفة من الإضاءة، قيست الهولوغرام 2D متعددة لكل اللمفاويات بتغيير زاوية الإضاءة (من-60 ° إلى 60 °). نموذجياً، الهولوغرام 50 يمكن استخدامها لإعادة بناء توموجرام ري 3D، ولكن يمكن تعديل عدد الصور المجسمة في 2D نظراً لسرعة ونوعية التصوير. يتم استرداد معلومات السعة والمرحلة من الهولوغرام المقاسة باستخدام خوارزمية استرداد حقل استناداً إلى تحويل فورييه43،44. كان بناؤها توموجرام ري ثلاثية الأبعاد لكل اللمفاويات من 2D استرجاع المرحلة والسعة معلومات متعددة في زوايا مختلفة من الإضاءة باستخدام خوارزمية التصوير المقطعي الحيود الضوئية. صورة عملية وأسلوب التعمير توموجرام ري 3D يمكن الاطلاع على تفاصيل في أماكن أخرى21،45.

الشكل 2 يظهر A-2_C توموجرامس ري المقدمة 3D الممثل من الخلايا اللمفية CD4 + T ب و CD8 + T بتخصيص ألوان مختلفة وفقا لقيم ري عن طريق برامج التصوير. من القيم ري، الكمية المورفولوجية (SA، السيرة الذاتية، والاشتراكية) وحسبت البيوكيميائية الميزات (PD ومارك ألماني) (الشكل 2A-2_C). هذه النتيجة تبين بوضوح أن تمكن 3D ري توزيع التحليل الكمي للمعلومات الصرفية وكذلك البيوكيميائية للخلايا الليمفاوية.

استغلت آلة تحت إشراف التعلم التعرف على أنواع الخلايا اللمفاوية على مستوى خلية واحدة. توموجرامس ري 3D قياس عشوائياً انقسمت إلى 70% و 30% من التدريب (باء: 104 و CD4 + t: 66 و CD8 + t: 77)، واختبار (ب: 45 و CD4 + t: 29 و CD8 + t: 35) مجموعات البيانات، على التوالي. نحن الأمثل المصنفات أقصى استخدام بصمات الخلية-نوع معين المشفرة في الفضاء الميزة. بمقارنة النتائج تنبأ المصنف وأنواع الخلايا الأرض-الحقيقة حساب مجموع دقة وحساسية (الإيجابية الحقيقية)، وخصوصية (الحقيقية سلبية).

من أجل إثبات الدليل على مفهوم البروتوكول المقترح، أجرينا آلة تحت إشراف التعلم في ثلاث حالات مختلفة: تصنيف ثنائي لمفاوية (ط) ب وترينيداد والمخططات اللمفاويات T (ثانيا) اثنين (CD4 + و CD8 +) (ثالثا) مولتيكلاس تصنيف جميع أنواع الخلايا اللمفاوية.

الرقم 3 يبين هوية الأداء الأمثل من المصنفات لمراحل التدريب والاختبار. وكان دقة التصنيف T واللمفاويات ب 93.15% و % 89.81 للتدريب وحالات الاختبار، على التوالي. اللمفاويات CD4 + و CD8 + T صنفت إحصائيا، والدقة 87.41% و % 84.38 للتدريب ومجموعات اختبار، على التوالي. وأخيراً، دقة المصنف نوع الخلية مولتيكلاس هو 80.65% و 75.93% لمراحل التدريب والاختبار، على التوالي.

Figure 1
الشكل 1 : التخطيطية خالية من التسمية بتحديد أنواع اللمفاويات استغلال 3 د المرحلة الكمية تصوير وآله التعلم. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

Figure 2
الشكل 2 : الممثل 3 د أصدرت توموجرامس ري لكل نوع من الخلايا اللمفاويات مع الخصائص المورفولوجية والكيميائية الحيوية الكمية- (أ) بالخليه، (ب) خلايا CD4 + "تي" خلية، والخلية (ج (CD8 + T. شريط المقياس = 2 ميكرومتر. SA، المساحة السطحية؛ السيرة الذاتية، وحجم الخلوية؛ سي، كروية؛ PD، كثافة البروتين؛ مارك ألماني، ووزن جاف. يتم تعديل هذا الرقم مع إذن5. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

Figure 3
الشكل 3 : أنواع تحديد اللمفاويات الفردية عن طريق التعلم تحت إشراف آلة (أ) ثنائي تصنيف ب وخلايا T، والتصنيف (ب) ثنائي لخلايا CD4 + و CD8 + T وتصنيف جميع أنواع الخلايا اللمفاويات الثلاثة؛ (ج) مولتيكلاس لمجموعات التدريب والاختبار. ملاحظة الفرق الصغيرة بين التدريب وحالات الاختبار، مما يوحي بالتعميم لطيفة من المصنفات الثابتة. الأرقام أدناه الأسماء كل نوع خلية تشير إلى العدد الخلايا المستخدمة. يتم تعديل هذا الرقم مع إذن5. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

Supplementary File 1
التكميلية ملف 1: ميزة استخراج التعليمات البرمجية. استخراج السمات (SA، والسيرة الذاتية، سي، PD، ومارك ألماني) بعد الانقسام القائم على عتبة ري من كل توموجرام. نفذت في برامج معالجة صور. اضغط هنا لتحميل هذا الملف.

Supplementary File 2
التكميلية ملف 2: رمز التدريب- تدريب ك-NN مصنف تدريب استناداً إلى الميزات المحددة. نفذت في برامج معالجة صور. اضغط هنا لتحميل هذا الملف.

Supplementary File 3
التكميلية الملف 3: اختبار التعليمات البرمجية. اختبار مصنف-NN مدربين كلمجموعة بيانات جديدة (أي.، مجموعة اختبار). نفذت في برامج معالجة صور. اضغط هنا لتحميل هذا الملف.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

نقدم بروتوكول التي تمكن من تحديد أنواع اللمفاويات استغلال المرحلة الكمية 3D تصوير وآله التعلم خالية من التسمية. الخطوات الأساسية لهذا البروتوكول تصوير وميزة اختيار المرحلة الكمية. للتصوير المجسم الأمثل، ينبغي أن تتم مراقبة كثافة الخلايا كما هو موضح أعلاه. الاستقرار الميكانيكي للخلايا مهم أيضا للحصول على توزيع ري 3D دقيقة نظراً لأن الطلبات العائمة أو الذبذبات الخلوية سوف تخل بقياسات ثلاثية الأبعاد عند تغيير زاوية الإضاءة. ولذلك انتظرنا عدة دقائق حتى أصبح العينة مستقرة وثابتة في قاعة التصوير قبل قياس الصور المجسمة. وأخيراً، إشكالية فقاعات داخل غرفة التصوير عند قياس الهولوغرام بسبب الاختلافات ري بين الهواء والعينة؛ وبالتالي، يجب تحميل العينة بعناية إلى غرفة التصوير.

استخراج ميزة واختيار المساعدة في تحديد أداء تحديد المصنف. قمنا بحساب 5 الكمية المورفولوجية (السيرة الذاتية، SA، SI) والبيوكيميائية (PD، مارك ألماني) الميزات من توزيع ري 3D في 20 قيم العتبة ري مختلفة؛ وهكذا، نحن استخراج ما مجموعة 100 من الميزات. بحثنا في استفاضة تركيبات الميزة والمصنف الأمثل، الذي تبين أنه تم تحديد دقة عبر التحقق من صحة أفضل. اختبرنا 6 خوارزميات التعلم آلة مختلفة، بما في ذلك ك-NN (k = 4 و k = 6)، تحليل التمييز الخطي وتحليل التمييز التربيعية والسذاجة بايز، وشجرة القرارات ونحن وجدت أن ك-NN (k = 4 ) أظهرت أفضل أداء تحديد الهوية. ومع ذلك، هناك فرصة لتحسين دقة تحديد الهوية باستخدام آلة أخرى تعلم أساليب، بما في ذلك دعم ناقل الجهاز والشبكات العصبية.

هذا البروتوكول تدابير جوهرية الخصائص البصرية عن طريق التصوير ثلاثي الأبعاد الكمية المرحلة بغية تحديد أنواع اللمفاويات؛ وهكذا، أنها لا تتطلب عملية التوسيم استناداً إلى ردود فعل ضد مستضد المستخدمة في الأسفار أو المغناطيسي حبة التقنيات القائمة على فرز الخلايا، التي لها مخاطر تغيير وظيفة الخلوية عن طريق تعديل الهياكل بروتين الغشاء. وعلاوة على ذلك، الأسلوب الحالي التدابير 3D ري التوزيع وتوفر معلومات المورفولوجية والبيوكيميائية 3D حول الخلية، والتي لا يمكن الحصول عليها أسلوب تجسيدي طلقة واحدة46؛ ولذلك، أداء تحديد البروتوكول أكثر دقة بسبب معلومات عالية ثلاثي الأبعاد.

التعديل اليدوي للمرحلة القيد طفيفة من هذا البروتوكول والمطلوب وصف عملية التعلم تحت إشراف الجهاز. بحثنا لمفاويات بضبط المرحلة متعدية اليدوي والصور المجسمة المقاسة، وهي الخطوات الأكثر استهلاكاً للوقت. وستتحسن هذا القيد باستخدام مرحلة إليه مؤتمتة أو أجهزة القناة موائع جزيئية. فيما يتعلق بالتعلم تحت الإشراف، أنواع اللمفاويات المعروفة المطلوبة إنشاء المصنف الأمثل؛ وهكذا، كان لعزل أول لدينا وتحديد أنواع الخلايا اللمفاويات استناداً إلى تقنية الفرز المستندة إلى جسم مستضد. ومع ذلك، لا يزال يستخدم هذا البروتوكول على النقيض البصرية الأصيلة من الخلايا الليمفاوية، ووكلاء وضع العلامات المستخدمة لتحديد الأجسام المضادة آثار لا تذكر على إشارة ري 3D المقاسة. ولذلك، يمكن استخدام المصنف المتبعة لتحديد الخلايا الليمفاوية بطريقة خالية من التسمية.

على الرغم من أن هذا البروتوكول يستخدم أساسا تعمل من الخلايا الليمفاوية بقياس 3D توموجرامس ري من الخلايا الفردية، يمكن أيضا استخدام هذه البيانات ري 3D في تركيبة مع طرائق أخرى لمعالجة الأنماط الجينية أو معلومات البروتين لتصنيف أفضل أنواع فرعية. في الآونة الأخيرة، كانت تقنيات الفحص المجهري الارتباطية الجمع بين التصوير بالأسفار وكبي أدخلت47،،من4849. كما يمكن توسيع هذا النهج الواردة في هذا البروتوكول إلى هذه الأساليب التصوير ستتحقق.

يمكن تطبيق تحديد تسمية خالية من أنواع اللمفاويات إلى دراسة الفيزيولوجيا المرضية أو تشخيص المرض عن طريق الكشف عن الخلايا اللمفية غير طبيعي أو نسب بين أنواع الخلايا اللمفاوية. وعلاوة على ذلك، يمكن تطبيق هذا البروتوكول لتحليل الدم كله عن طريق تحديد خلايا مختلفة بما في ذلك خلايا الدم الحمراء والصفائح الدموية وخلايا الدم البيضاء.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

بارك ي. أ. د. وجو Y.، ي. س. كيم ولي س لها المصالح المالية في توموكوبي، شركة، شركة تتاجر التصوير المقطعي الحيود الضوئية والكمية المرحلة تصوير الصكوك وهي واحدة من مقدمي مشروع القرار للعمل.

Acknowledgments

أيد هذا العمل الكوري BK21 + البرنامج, توموكوبي, Inc.، والوطنية بحوث مؤسسة كوريا (2015R1A3A2066550, 2017M3C1A3013923, 2018 ك 000396). يوسف جو تسلم الدعم من الزمالات الرئاسي الكوري واسان منحة العلوم الطبية الحيوية.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Mouse Daehan Biolink C57BL/6J mice  gender and age-matched, 6 – 8 weeks
Falcon conical centrifuge tube ThermoFisher Scientific 14-959-53A 15 mL
Phosphate-buffered saline  Sigma-Aldrich 806544-500ML
Ammonium-chloride-potassium lysing buffer  ThermoFisher Scientific A1049201
RPMI-1640 medium Sigma-Aldrich R8758
Fetal bovine serum ThermoFisher Scientific 10438018
Antibody BD Biosciences 553140 (RRID:AB_394655) CD16/32 (clone 2.4G2)
Antibody BD Biosciences 555275 (RRID:AB_395699) CD3ε (clone 17A2)
Antibody Biolegnd 100734 (RRID:AB_2075238) CD8α (clone 53-6.7)
Antibody BD Biosciences 557655 (RRID:AB_396770) CD19 (clone 1D3)
Antibody BD Biosciences 557683 (RRID:AB_396793) CD45R/B220 (clone RA3-6B2)
Antibody BD Biosciences 552878 (RRID:AB_394507) NK1.1 (clone PK136)
Antibody eBioscience 11-0041-85 (RRID:AB_464893) CD4 (clone GK1.5)
DAPI  Roche 10236276001 4,6-diamidino-2-phenylindole
Flow cytometry  BD Biosciences Aria II or III 
Imaging chamber Tomocube, Inc. TomoDish
Holotomography Tomocube, Inc. HT-1H
Holotomography imaging software Tomocube, Inc. TomoStudio
Image professing software MathWorks Matlab R2017b

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Alizadeh, A. A., et al. Distinct types of diffuse large B-cell lymphoma identified by gene expression profiling. Nature. 403, (6769), 503 (2000).
  2. Von Boehmer, H., Melchers, F. Checkpoints in lymphocyte development and autoimmune disease. Nature Immunology. 11, (1), 14 (2010).
  3. Sáez-Cirión, A., et al. HIV controllers exhibit potent CD8 T cell capacity to suppress HIV infection ex vivo and peculiar cytotoxic T lymphocyte activation phenotype. Proceedings of the National Academy of Sciences. 104, (16), 6776-6781 (2007).
  4. Fischer, K., et al. Isolation and characterization of human antigen-specific TCRαβ+ CD4-CD8-double-negative regulatory T cells. Blood. 105, (7), 2828-2835 (2005).
  5. Yoon, J., et al. Identification of non-activated lymphocytes using three-dimensional refractive index tomography and machine learning. Scientific Reports. 7, (1), 6654 (2017).
  6. Popescu, G. Quantitative phase imaging of cells and tissues. McGraw Hill Professional. (2011).
  7. Lee, K., et al. Quantitative phase imaging techniques for the study of cell pathophysiology: from principles to applications. Sensors. 13, (4), 4170-4191 (2013).
  8. Kim, D., et al. Refractive index as an intrinsic imaging contrast for 3-D label-free live cell imaging. bioRxiv. 106328 (2017).
  9. Kim, K., et al. Optical diffraction tomography techniques for the study of cell pathophysiology. Journal of Biomedical Photonics & Engineering. 2, (2), (2016).
  10. Wolf, E. Three-dimensional structure determination of semi-transparent objects from holographic data. Optics Communications. 1, (4), 153-156 (1969).
  11. Kus, A., Dudek, M., Kemper, B., Kujawinska, M., Vollmer, A. Tomographic phase microscopy of living three-dimensional cell cultures. Journal of Biomedical Optics. 19, (4), 046009 (2014).
  12. Kim, T., et al. White-light diffraction tomography of unlabelled live cells. Nature Photonics. 8, (3), 256 (2014).
  13. Simon, B., et al. Tomographic diffractive microscopy with isotropic resolution. Optica. 4, (4), 460-463 (2017).
  14. Kim, Y., et al. Profiling individual human red blood cells using common-path diffraction optical tomography. Scientific Reports. 4, (2014).
  15. Park, H., et al. Measuring cell surface area and deformability of individual human red blood cells over blood storage using quantitative phase imaging. Scientific Reports. 6, (2016).
  16. Lee, S., et al. Refractive index tomograms and dynamic membrane fluctuations of red blood cells from patients with diabetes mellitus. Scientific Reports. 7, (2017).
  17. Merola, F., et al. Tomographic flow cytometry by digital holography. Light-Science & Applications. 6, (2017).
  18. Park, Y., et al. Refractive index maps and membrane dynamics of human red blood cells parasitized by Plasmodium falciparum. Proceedings of the National Academy of Sciences. 105, 13730-13735 (2008).
  19. Park, H., et al. Characterizations of individual mouse red blood cells parasitized by Babesia microti using 3-D holographic microscopy. Scientific Reports. 5, 10827 (2015).
  20. Chandramohanadas, R., et al. Biophysics of malarial parasite exit from infected erythrocytes. Public Library of Science ONE. 6, (6), 20869 (2011).
  21. Yoon, J., et al. Label-free characterization of white blood cells by measuring 3D refractive index maps. Biomedical Optics Express. 6, (10), 3865-3875 (2015).
  22. Kim, K., et al. Three-dimensional label-free imaging and quantification of lipid droplets in live hepatocytes. Scientific Reports. 6, 36815 (2016).
  23. Kim, D., et al. Label-free high-resolution 3-D imaging of gold nanoparticles inside live cells using optical diffraction tomography. Methods. (2017).
  24. Lenz, P., et al. Multimodal Quantitative Phase Imaging with Digital Holographic Microscopy Accurately Assesses Intestinal Inflammation and Epithelial Wound Healing. Journal of Visualized Experiments. (115), (2016).
  25. Huang, J., Guo, P., Moses, M. A. A Time-lapse, Label-free, Quantitative Phase Imaging Study of Dormant and Active Human Cancer Cells. Journal of Visualized Experiments. (132), (2018).
  26. Yang, S. A., Yoon, J., Kim, K., Park, Y. Measurements of morphological and biochemical alterations in individual neuron cells associated with early neurotoxic effects in Parkinson's disease. Cytometry Part A. 91, (5), 510-518 (2017).
  27. Cotte, Y., et al. Marker-free phase nanoscopy. Nature Photonics. 7, (2), 113-117 (2013).
  28. Nguyen, T. H., Kandel, M. E., Rubessa, M., Wheeler, M. B., Popescu, G. Gradient light interference microscopy for 3D imaging of unlabeled specimens. Nature Communications. 8, (1), 210 (2017).
  29. Kwon, S., et al. Mitochondria-targeting indolizino [3, 2-c] quinolines as novel class of photosensitizers for photodynamic anticancer activity. European Journal of Medicinal Chemistry. 148, 116-127 (2018).
  30. Bennet, M., Gur, D., Yoon, J., Park, Y., Faivre, D. A Bacteria-Based Remotely Tunable Photonic Device. Advanced Optical Materials. (2016).
  31. Kim, T. I., et al. Antibacterial Activities of Graphene Oxide-Molybdenum Disulfide Nanocomposite Films. ACS Applied Materials & Interfaces. 9, (9), 7908-7917 (2017).
  32. Bedrossian, M., Barr, C., Lindensmith, C. A., Nealson, K., Nadeau, J. L. Quantifying Microorganisms at Low Concentrations Using Digital Holographic Microscopy (DHM). Journal of Visualized Experiments. (129), (2017).
  33. Jo, Y., et al. Quantitative Phase Imaging and Artificial Intelligence: A Review. arXiv preprint. arXiv:1806.03982 (2018).
  34. Javidi, B., Moon, I., Yeom, S., Carapezza, E. Three-dimensional imaging and recognition of microorganism using single-exposure on-line (SEOL) digital holography. Optics Express. 13, (12), 4492-4506 (2005).
  35. Jo, Y., et al. Label-free identification of individual bacteria using Fourier transform light scattering. Optics Express. 23, (12), 15792-15805 (2015).
  36. Jo, Y., et al. Angle-resolved light scattering of individual rod-shaped bacteria based on Fourier transform light scattering. Scientific Reports. 4, 5090 (2014).
  37. Jo, Y., et al. Holographic deep learning for rapid optical screening of anthrax spores. Science Advances. 3, (8), 1700606 (2017).
  38. Mirsky, S. K., Barnea, I., Levi, M., Greenspan, H., Shaked, N. T. Automated analysis of individual sperm cells using stain-free interferometric phase microscopy and machine learning. Cytometry Part A. 91, (9), 893-900 (2017).
  39. Roitshtain, D., et al. Quantitative phase microscopy spatial signatures of cancer cells. Cytometry Part A. 91, (5), 482-493 (2017).
  40. Lam, V. K., Nguyen, T. C., Chung, B. M., Nehmetallah, G., Raub, C. B. Quantitative assessment of cancer cell morphology and motility using telecentric digital holographic microscopy and machine learning. Cytometry Part A. (2017).
  41. Pavillon, N., Hobro, A. J., Akira, S., Smith, N. I. Noninvasive detection of macrophage activation with single-cell resolution through machine learning. Proceedings of the National Academy of Sciences. (2018).
  42. Basu, S., Campbell, H. M., Dittel, B. N., Ray, A. Purification of Specific Cell Population by Fluorescence Activated Cell Sorting (FACS). Journal of Visualized Experiments. (41), e1546 (2010).
  43. Takeda, M., Ina, H., Kobayashi, S. Fourier-transform method of fringe-pattern analysis for computer-based topography and interferometry. Journal of the Optical Society of America. 72, (1), 156-160 (1982).
  44. Debnath, S. K., Park, Y. Real-time quantitative phase imaging with a spatial phase-shifting algorithm. Optics Letters. 36, (23), 4677-4679 (2011).
  45. Kim, K., et al. High-resolution three-dimensional imaging of red blood cells parasitized by Plasmodium falciparum and in situ hemozoin crystals using optical diffraction tomography. Journal of Biomedical Optics. 19, (1), 011005 (2013).
  46. Vercruysse, D., et al. Three-part differential of unlabeled leukocytes with a compact lens-free imaging flow cytometer. Lab on a Chip. 15, (4), 1123-1132 (2015).
  47. Kim, K., et al. Correlative three-dimensional fluorescence and refractive index tomography: bridging the gap between molecular specificity and quantitative bioimaging. Biomedical Optics Express. 8, (12), 5688-5697 (2017).
  48. Shin, S., Kim, D., Kim, K., Park, Y. Super-resolution three-dimensional fluorescence and optical diffraction tomography of live cells using structured illumination generated by a digital micromirror device. arXiv preprint. arXiv:1801.00854 (2018).
  49. Chowdhury, S., Eldridge, W. J., Wax, A., Izatt, J. A. Structured illumination multimodal 3D-resolved quantitative phase and fluorescence sub-diffraction microscopy. Biomedical Optics Express. 8, (5), 2496-2518 (2017).
تحديد أنواع فرعية اللمفاويات باستخدام التصوير ثلاثي الأبعاد الكمية المرحلة خالية من التسمية وآله التعلم
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Yoon, J., Jo, Y., Kim, Y. S., Yu, Y., Park, J., Lee, S., Park, W. S., Park, Y. Label-Free Identification of Lymphocyte Subtypes Using Three-Dimensional Quantitative Phase Imaging and Machine Learning. J. Vis. Exp. (141), e58305, doi:10.3791/58305 (2018).More

Yoon, J., Jo, Y., Kim, Y. S., Yu, Y., Park, J., Lee, S., Park, W. S., Park, Y. Label-Free Identification of Lymphocyte Subtypes Using Three-Dimensional Quantitative Phase Imaging and Machine Learning. J. Vis. Exp. (141), e58305, doi:10.3791/58305 (2018).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
simple hit counter