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Immunology and Infection

तीन आयामी मात्रात्मक चरण इमेजिंग और मशीन लर्निंग का उपयोग करके लिम्फोसाइट उपप्रकारों की लेबल-मुक्त पहचान

doi: 10.3791/58305 Published: November 19, 2018

Summary

हम मात्रात्मक चरण इमेजिंग और मशीन लर्निंग एल्गोरिथ्म का उपयोग करके लिम्फोसाइट उपप्रकारों की लेबल-मुक्त पहचान के लिए एक प्रोटोकॉल का वर्णन करते हैं । 3 डी अपवर्तन सूचकांक की माप tomograms के लिम्फोसाइटों वर्तमान 3d रूपात्मक और जैव रासायनिक जानकारी व्यक्तिगत कोशिकाओं के लिए है, जो तब सेल प्रकार की पहचान के लिए एक मशीन सीखने के एल्गोरिथ्म के साथ विश्लेषण किया जाता है ।

Abstract

हम यहां लेबल के लिए एक प्रोटोकॉल का वर्णन-मात्रात्मक चरण इमेजिंग और मशीन सीखने का उपयोग लिम्फोसाइट उपप्रकार के मुक्त पहचान । इम्यूनोलॉजी के अध्ययन के साथ ही विभिन्न रोगों के निदान और उपचार के लिए लिम्फोसाइट उपप्रकारों की पहचान महत्वपूर्ण है । वर्तमान में, लिम्फोसाइट प्रकार वर्गीकृत करने के लिए मानक तरीके प्रतिजन-एंटीबॉडी प्रतिक्रियाओं के माध्यम से विशिष्ट झिल्ली प्रोटीन लेबलिंग पर निर्भर करते हैं । हालांकि, इन लेबलिंग तकनीक सेलुलर कार्यों में फेरबदल के संभावित जोखिम ले । प्रोटोकॉल यहां वर्णित आंतरिक ऑप्टिकल 3 डी मात्रात्मक चरण इमेजिंग और एक मशीन लर्निंग एल्गोरिथ्म द्वारा मापा विरोधाभासों का दोहन द्वारा इन चुनौतियों पर काबू । 3 डी अपवर्तन सूचकांक (आरआई) के माप लिम्फोसाइटों के tomograms 3d आकृति विज्ञान और phenotypes के बारे में मात्रात्मक जानकारी प्रदान करता है । मापा 3 डी आरआई tomograms से निकाले जाने वाले भौतिक पैरामीटर तो मात्रात्मक एक मशीन अधिगम एल्गोरिथ्म के साथ विश्लेषण कर रहे हैं, एक एकल सेल स्तर पर लिम्फोसाइट प्रकार की लेबल मुक्त पहचान को सक्षम करने से । हम B, CD4 + t, और सीडी 8 + t लिम्फोसाइटों के 3 डी आरआई tomograms उपाय और ८०% से अधिक सटीकता के साथ अपने सेल प्रकार की पहचान की । इस प्रोटोकॉल में, हम लिम्फोसाइट अलगाव, 3 डी मात्रात्मक चरण इमेजिंग, और लिम्फोसाइट प्रकार की पहचान करने के लिए मशीन सीखने के लिए विस्तृत कदम का वर्णन ।

Introduction

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लिम्फोसाइटों को बी, हेल्पर (CD4 +) टी, साइटोटोक्सिक (सीडी 8 +) टी, और रेगुलेटरी टी सेल सहित विभिन्न उपप्रकारों में वर्गीकृत किया जा सकता है । प्रत्येक लिम्फोसाइट प्रकार अनुकूली प्रतिरक्षा प्रणाली में एक अलग भूमिका है; उदाहरण के लिए, बी लिम्फोसाइटों एंटीबॉडी का उत्पादन, जबकि टी लिम्फोसाइटों विशिष्ट एंटीजन का पता लगाने, असामान्य कोशिकाओं को खत्म करने, और बी लिम्फोसाइटों को विनियमित. लिम्फोसाइट समारोह और विनियमन कसकर द्वारा नियंत्रित और कैंसर1, स्व-प्रतिरक्षित रोग2, और वायरल संक्रमण3सहित विभिन्न रोगों से संबंधित है । इस प्रकार, लिम्फोसाइट प्रकार की पहचान के लिए इस तरह के रोगों में और क्लीनिक में immunotherapy के लिए अपनी pathophysiological भूमिकाओं को समझने के लिए महत्वपूर्ण है ।

वर्तमान में, लिम्फोसाइट प्रकार वर्गीकृत करने के लिए विधियाँ विशिष्ट सतह झिल्ली प्रोटीन या सतह मार्करों लक्ष्यीकरण द्वारा प्रतिजन-एंटीबॉडी प्रतिक्रियाओं पर निर्भर करते हैं4. लक्ष्यीकरण सतह मार्करों लिम्फोसाइट प्रकार निर्धारित करने के लिए एक सटीक और सटीक तरीका है । हालांकि, यह महंगा रिएजेंट और समय लेने वाली प्रक्रियाओं की आवश्यकता है । इसके अलावा, यह झिल्ली प्रोटीन संरचनाओं के संशोधन और सेलुलर कार्यों के परिवर्तन के जोखिम वहन करती है ।

इन चुनौतियों को दूर करने के लिए, यहां वर्णित प्रोटोकॉल 3 डी मात्रात्मक चरण इमेजिंग (QPI) और मशीन लर्निंग5का उपयोग कर लिम्फोसाइट प्रकारों की लेबल-मुक्त पहचान का परिचय देता है । यह विधि एकल-कक्ष स्तर पर लिम्फोसाइट प्रकार के वर्गीकरण को सक्षम करती है जो व्यक्तिगत लिम्फोसाइटों के लेबल-मुक्त 3d इमेजिंग से निकाली गई रूपात्मक जानकारी पर आधारित होती है. पारंपरिक प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी तकनीक के विपरीत, QPI का उपयोग अपवर्तन सूचकांक (आरआई) वितरण (आंतरिक ऑप्टिकल गुण जीवित कोशिकाओं और ऊतकों) के रूप में ऑप्टिकल कंट्रास्ट6,7। व्यक्तिगत लिम्फोसाइटों के आरआई tomograms लिम्फोसाइटों के उपप्रकारों के लिए विशिष्ट phenotypic जानकारी का प्रतिनिधित्व करते हैं । इस मामले में, व्यक्तिगत लिम्फोसाइटों के 3d आरआई tomograms का उपयोग करने के लिए, एक पर्यवेक्षण मशीन अधिगम एल्गोरिथ्म का उपयोग किया गया प्रणालीबद्ध ।

विभिंन QPI तकनीकों का प्रयोग, 3 डी री कोशिकाओं की tomograms सक्रिय रूप से सेल pathophysiology के अध्ययन के लिए इस्तेमाल किया गया है क्योंकि वे एक लेबल मुक्त, मात्रात्मक इमेजिंग क्षमता प्रदान8,9,10, 11,12,13. इसके अलावा, व्यक्तिगत कोशिकाओं के 3d आरआई वितरण कोशिकाओं के बारे में रूपात्मक, जैव रासायनिक, और यांत्रिक जानकारी प्रदान कर सकते हैं । 3d आरआई tomograms पहले रुधिर के खेतों में उपयोग किया गया है14,15,16,17, संक्रामक रोग18,19, 20, इम्यूनोलॉजी21, सेल जीव विज्ञान22,23, सूजन24, कैंसर25, तंत्रिका विज्ञान26,27, विकास जीव विज्ञान28, विषविज्ञान 29, और माइक्रोबायोलॉजी12,30,31,३२

हालांकि 3d आरआई tomograms कोशिकाओं की विस्तृत रूपात्मक और जैव रासायनिक जानकारी प्रदान करते हैं, लिम्फोसाइट उपप्रकार के वर्गीकरण के लिए बस इमेजिंग 3 डी री tomograms5द्वारा प्राप्त करने के लिए मुश्किल है । व्यवस्थित और मात्रात्मक सेल प्रकार वर्गीकरण के लिए मापा 3d आरआई tomograms का दोहन करने के लिए, हम एक एल्गोरिथ्म सीखने की मशीन का उपयोग किया । हाल ही में, कई कार्यों में बताया गया है जिसमें कोशिकाओं के मात्रात्मक चरण छवियों विभिन्न मशीन लर्निंग एल्गोरिदम३३के साथ विश्लेषण किया गया, सूक्ष्मजीवों३४का पता लगाने सहित, जीवाणु जीनस३५ का वर्गीकरण , ३६, तेजी से और लेबल-एंथ्रेक्स बीजाणुओं का मुफ्त पता लगाने३७, शुक्राणु कोशिकाओं का स्वचालित विश्लेषण३८, कैंसर कोशिकाओं के विश्लेषण३९,४०, और मैक्रोफेज सक्रियण४१का पता लगाने ।

यह प्रोटोकॉल 3d QPI और मशीन लर्निंग का उपयोग करके व्यक्तिगत सेल स्तर पर लिम्फोसाइट प्रकारों की लेबल-मुक्त पहचान करने के लिए विस्तृत कदम प्रदान करता है । यह भी शामिल है: 1) माउस रक्त से लिम्फोसाइट अलगाव, 2) लिम्फोसाइट प्रवाह cytometry के माध्यम से छंटाई, 3) 3 डी QPI, 4) 3 डी आरआई tomograms से मात्रात्मक सुविधा निष्कर्षण, और 5) लिम्फोसाइट प्रकार की पहचान के लिए सीखने की निगरानी की ।

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Protocol

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पशु देखभाल और प्रायोगिक प्रक्रियाओं KAIST (KA2010-21, KA2014-01, और KA2015-03) के संस्थागत पशु देखभाल और उपयोग समिति के अनुमोदन के तहत प्रदर्शन किया गया । इस अध्ययन में किए गए सभी प्रयोगों को अनुमोदित दिशा-निर्देशों के अनुसार किया गया.

1. माउस खून से लिम्फोसाइट अलगाव

  1. एक बार एक C57BL/6J माउस सह2 साँस लेना के माध्यम से euthanized है, माउस दिल में एक 26-जी सुई डालें और रक्त की ०.३ मिलीलीटर इकट्ठा । सीधे १०० यू/एमएल हेपरिन के साथ एक ट्यूब में रक्त डाल फॉस्फेट-बफर खारा (पंजाब) के 1 मिलीलीटर के साथ पतला समाधान ।
    नोट: वैकल्पिक रूप से, तिल्ली से लिम्फोसाइटों अलग किया जा सकता है ।
  2. 4 डिग्री सेल्सियस पर 5 मिनट के लिए ४०० x g पर ट्यूब केंद्रापसारक ।
  3. ०.५ मिलीलीटर अमोनियम-क्लोराइड-पोटेशियम lysing ट्यूब करने के लिए बफर जोड़ें और धीरे से यह समाधान मिश्रण करने के लिए कई बार पलटना ।
  4. 5 मिनट के लिए कमरे के तापमान (आरटी) पर ट्यूब मशीन ।
  5. पंजाब के ४.५ मिलीलीटर जोड़कर कोशिकाओं को धो और 5 मिनट के लिए 4 डिग्री सेल्सियस, दो बार में ४०० x g पर केंद्रापसारक ।
  6. supernatant निकालें और 10% भ्रूण गोजातीय सीरम (FBS) के साथ ताजा RPMI-१६४० माध्यम के १०० µ एल में सेल गोली पुनः स्थगित ।
  7. CD16/32 (2.4 g2) एंटीबॉडी के ०.१ µ g को अवरुद्ध करने के लिए ट्यूब में जोड़ें ।
  8. बर्फ पर ट्यूब रखें ।

2. प्रवाह Cytometry और लिम्फोसाइट उपप्रकारों की छंटाई

नोट: सॉर्टिंग लिम्फोसाइटों कक्ष प्रकार के आधार पर स्थापित करने के लिए आवश्यक है जमीन-सत्य (यानी, सही) सेल प्रकार लेबल ट्रेन और पर्यवेक्षणीय अधिगम में वर्गीकारक एक सेल प्रकार का परीक्षण करने के लिए. प्रवाह cytometry, एक सोने के मानक विधि, की पहचान करने के लिए और लिम्फोसाइटों४२अलग किया जाता है ।

  1. ताजा RPMI के १०० µ l में सतह मार्कर धुंधला एंटीबॉडी का एक मिश्रण बनाओ-१६४० मीडियम [के साथ 10% FBS, ०.१ µ जी ऑफ CD3e (17A2), CD8a (53-6.7), CD19 (1D3), CD45R (B220, RA3-6B2), और nk 1.1 (PK136)] और ०.२५ µ जी के CD4 (gk 1.5) एंटीबॉडी को लक्ष् ज, CD4 + टी, और सीडी 8 + टी लिम्फोसाइटों.
  2. कक्ष निलंबन (१.८ चरण में प्राप्त) के लिए एंटीबॉडी मिश्रण के १०० µ एल जोड़ें ।
  3. बर्फ पर 25 मिनट के लिए मशीन ।
  4. पंजाबियों के 5 मिलीलीटर जोड़ने और 4 डिग्री सेल्सियस, दो बार में 5 मिनट के लिए ४०० x g पर केंद्रापसारक द्वारा कोशिकाओं को धो लें ।
  5. ताजा RPMI के 5 मिलीलीटर में सेल गोली resuspend-१६४० मध्यम के साथ 10% FBS और २.५ µ जी के DAPI (4 ', 6-diamidino-2-phenylindole).
  6. ऊपर वर्णित मार्कर के प्रतिदीप्ति स्तर का उपयोग कर प्रवाह cytometry के साथ अलग से प्रत्येक लिम्फोसाइट प्रकार लीजिए. इसके साथ ही DAPI संकेतों का उपयोग मृत कोशिकाओं को बाहर निकालें ।
    नोट: विस्तृत प्रोटोकॉल प्रवाह cytometry-आधारित कक्ष सॉर्टिंग के बारे में पहले४२वर्णित किया गया है ।

3 डी मात्रात्मक चरण इमेजिंग

  1. इमेजिंग प्रक्रियाओं है, जो 5 घंटे के भीतर पूरा किया जाना चाहिए भर में बर्फ पर हल लिम्फोसाइटों रखें (माउस से लिम्फोसाइट अलगाव के बाद से) कोशिका क्षति और जैव रासायनिक परिवर्तन से बचने के लिए ।
  2. किसी सॉर्ट किए गए कक्ष प्रकार का चयन करें (बीच B, CD4 + t, और सीडी 8 + t लिम्फोसाइटों) और नमूना (चरण २.६ में प्राप्त) के लिए १८० कक्षों/µ l के लिए RPMI माध्यम के साथ इष्टतम इमेजिंग स्थिति (यानी, एकल फ़ील्ड के प्रति एक कक्ष-दृश्य) को पतला ।
  3. धीमी इंजेक्शन द्वारा एक इमेजिंग चैंबर में पतला नमूना के १२० μL लोड । अच्छी तरह से नमूने के साथ इमेजिंग चैंबर में बुलबुले की उपस्थिति पर जांच करें । अगर वहाँ बुलबुले हैं, ध्यान से उन्हें हटाने के लिए, के रूप में वे माप की गुणवत्ता से समझौता करेंगे ।
  4. 3d आरआई tomograms एक वाणिज्यिक 3d मात्रात्मक चरण माइक्रोस्कोप, या holotomography, और इसके इमेजिंग सॉफ्टवेयर का उपयोग कर प्राप्त करें ।
    नोट: प्रायोगिक सेटअप के बारे में विस्तृत जानकारी मूल पांडुलिपि5में पाया जा सकता है ।
    1. माइक्रोस्कोप के उद्देश्य लेंस के ऊपर आसुत जल की एक बूंद प्लेस ।
    2. माइक्रोस्कोप के अनुवाद के स्तर पर नमूने के साथ इमेजिंग चैंबर प्लेस और अपने स्थान को समायोजित इतना है कि नमूना उद्देश्य लेंस के साथ संरेखित करता है ।
    3. ध्यान और सतहपर क्लिक करके उद्देश्य और संघनित्र लेंस के अक्षीय पदों को समायोजित, क्रमशः, इमेजिंग सॉफ्टवेयर के "माइक्रोस्कोप" परिप्रेक्ष्य के "अंशांकन" टैब पर ।
    4. उद्देश्य और संघनित्र लेंस ऑटो मोडपर क्लिक करके संरेखित करें । वैकल्पिक रूप से, स्कैनिंग मोड का उपयोग करें और मैंयुअल रूप से इतना है कि रोशनी पैटर्न क्षेत्र के मध्य क्षेत्र में स्थानीयकृत रहे है लेंस को समायोजित-देखें ।
    5. सामांय मोड पर लौटें और फ़ील्ड-के-दृश्य में किसी कक्ष का पता लगाने के लिए अनुवाद चरण समायोजित करें ।
    6. उद्देश्य लेंस के अक्षीय स्थिति का समायोजन करके फोकल विमान का पता लगाएं । बिल्कुल सही ध्यान केंद्रित नमूना सीमा स्क्रीन में visualized लगभग अदृश्य बनाता है ।
    7. किसी कक्ष के बिना स्थान ढूंढने के लिए अनुवाद चरण समायोजित करें ।
    8. अलग रोशनी कोण के साथ कई 2d होलोग्राम मापने के लिए जांचना क्लिक करें ।
    9. फ़ील्ड-के-दृश्य के केंद्र में किसी कक्ष का पता लगाने के लिए अनुवाद चरण समायोजित करें ।
    10. "अधिग्रहण" टैब पर जाएँ और कदम 3.4.8 में किया के रूप में समान रोशनी कोण के साथ सेल के होलोग्राम को मापने के लिए 3 डी स्नैपशॉट पर क्लिक करें ।
    11. जब प्राप्त डेटा "डेटा प्रबंधन" पैनल पर प्रस्तुत किया जाता है, अधिग्रहण डेटा पर राइट-क्लिक करें और कदम 3.4.8 और 3.4.10 में मापा होलोग्राम से एक 3 डी आरआई स्कैन को फिर से संगठित करने के लिए प्रक्रिया क्लिक करें, विवर्तन टोमोग्राफी एल्गोरिथ्म का उपयोग 9 , 10 इमेजिंग सॉफ्टवेयर में कार्यांवित किया ।
    12. दोहराने चरणों 3.4.5-3.4.11 से अधिक १०० कोशिकाओं को मापने के लिए मशीन सीखने के लिए सांख्यिकीय शक्ति सुनिश्चित करने के लिए ।
    13. सभी छवियां है कि कदम 3.4.11 के माध्यम से संसाधित कर रहे हैं । visualized किया जा सकता है । "डेटा प्रबंधन" पैनल पर, डेटा पर राइट-क्लिक करें और डेटा विज़ुअलाइज़ करने के लिए खोलें पर क्लिक करें. "डेटा प्रबंधक" पैनल पर आरआई स्कैन क्लिक करें । पर "प्रीसेट" टैब पर, क्लिक करें लोड और डबल क्लिक करें "लिम्फोसाइट. xml", जो एक पूर्वनिर्धारित हस्तांतरण इमेजिंग सॉफ्टवेयर द्वारा प्रदान की स्कैन कल्पना को 3d आरआई वितरण के अनुसार समारोह है ।
  5. दोहराएँ चरण 3.2-3.4 सभी लिम्फोसाइट उपप्रकारों के 3d आरआई tomograms को मापने के लिए.

4. मात्रात्मक रूपात्मक और 3 डी री Tomograms से जैव रासायनिक सुविधा निष्कर्षण

  1. एक एकल फ़ोल्डर में ऊपर मापा सभी tomographic डेटा रखें । इस फ़ोल्डर के सबफ़ोल्डर्स में कक्ष प्रकार विभक्त करें । एक एकल . mat फ़ाइल होने के लिए प्रत्येक स्कैन तैयार करें ।
  2. खुला अनुपूरक फ़ाइल 1 -सुविधा निष्कर्षण (एक छवि प्रसंस्करण सॉफ्टवेयर के लिए लिखा) ।
  3. चरण ४.१ में तैयार स्कैन फ़ोल्डर को निर्दिष्ट करने के लिए 14 पंक्ति संपादित करें ।
  4. किसी फ़ोल्डर को निकाले गए सुविधा डेटा को सहेजने के लिए निर्दिष्ट करने के लिए पंक्ति 15 संपादित करें ।
  5. वैकल्पिक रूप से, 17 रेखा संपादित सुविधा निष्कर्षण के लिए आरआई दहलीज मापदंडों को समायोजित करने के लिए । डिफ़ॉल्ट विकल्प 20 री थ्रेशोल्ड 1.340-1.378 से ०.००२ की एक वृद्धि के साथ पहले5वर्णित के रूप में है ।
  6. कोड निष्पादित करें । डेटासेट में प्रत्येक स्कैन के लिए, कोड पांच सुविधाओं की गणना करता है: भूतल क्षेत्र (एसए), सेलुलर खंड (सीवी), sphericity (एसआई), प्रोटीन घनत्व (पीडी), और शुष्क जन (डीएम), आरआई सीमा प्रति । विस्तृत एल्गोरिथ्म सुविधा निष्कर्षण के लिए5कहीं वर्णित हैं ।
  7. सुविधा निष्कर्षण की निगरानी के लिए, स्क्रीन पर निष्पादन की जांच के दौरान visualizing री थ्रेशोल्ड-आधारित सेल फॉल्ट ।
  8. निकाली सुविधा डेटा पर जांच करें, के रूप में . mat फ़ाइल प्रति स्कैन, चरण ४.४ में निर्दिष्ट फ़ोल्डर में सहेजा गया ।

5. पर्यवेक्षण अध्ययन और पहचान

  1. बेतरतीब ढंग से सुविधा के लिए ४.८ कदम में प्राप्त डेटा विभाजित प्रशिक्षण (७०%) और परीक्षण (30%) अलग फ़ोल्डर्स के साथ सेट ।
  2. खुला अनुपूरक फ़ाइल 2 -ट्रेन (एक छवि प्रसंस्करण सॉफ्टवेयर के लिए लिखा) ।
  3. चरण ५.१ में तैयार प्रशिक्षण सेट को निर्दिष्ट करने के लिए पंक्ति 14 संपादित करें ।
  4. प्रशिक्षित वर्गीकारक को सहेजने के लिए कोई फ़ोल्डर निर्दिष्ट करने के लिए 16 रेखा संपादित करें ।
  5. वर्गीकारक के लिए कोई फ़ाइल नाम सेट करने के लिए रेखा 17 संपादित करें ।
  6. वैकल्पिक रूप से, प्रशिक्षण के लिए सुविधाओं का चयन करने के लिए 19 लाइन संपादित करें । डिफ़ॉल्ट विकल्प, पहले5निर्दिष्ट के रूप में, नीचे प्रतिनिधि परिणाम प्राप्त करने के लिए उपयोग किया गया था ।
  7. कोड निष्पादित करें । प्रशिक्षण सेट की चयनित सुविधाओं का उपयोग करना, कोड k-निकटतम पड़ोसी एल्गोरिथ्म के साथ एक वर्गीकारक गाड़ियों (k-एनएन; k = 4) और उसके बाद वर्गीकारक (चरण ५.५ में नाम के रूप में) चरण ५.४ में निर्दिष्ट फ़ोल्डर में सहेजता है ।
  8. वर्गीकारक प्रदर्शन और पार सत्यापन सटीकता visualizing स्क्रीन पर जांच करें ।
  9. वैकल्पिक रूप से, 5.5-5.7 कदम दोहरा कर विभिन्न सुविधा संयोजन के साथ एकाधिक classifiers ट्रेन. तो सबसे अधिक पार मांयता सटीकता के साथ वर्गीकारक चुनें ।
  10. खुला अनुपूरक फ़ाइल 3 -परीक्षण (एक छवि प्रसंस्करण सॉफ्टवेयर के लिए लिखा) ।
  11. संपादित लाइनों 14-15 परीक्षण किया जा करने के लिए प्रशिक्षित वर्गीकारक निर्दिष्ट करने के लिए ।
  12. चरण ५.१ में तैयार परीक्षण सेट को निर्दिष्ट करने के लिए रेखा 17 संपादित करें ।
  13. कोड निष्पादित करें । ऊपर वर्णित वर्गीकारक परीक्षण सेट में व्यक्तिगत लिम्फोसाइटों के कक्ष प्रकारों की पहचान करता है.
  14. पहचान प्रदर्शन और परीक्षण सटीकता visualizing स्क्रीन पर जांच करें ।

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Representative Results

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चित्रा 1 पूरे प्रोटोकॉल के योजनाबद्ध प्रक्रिया से पता चलता है । यहां प्रस्तुत प्रक्रिया का उपयोग कर, हम अलग B (n = १४९), CD4 + t (n = ९५), और सीडी 8 + t (n = ११२) लिम्फोसाइटों । रोशनी के विभिन्न कोणों पर चरण और आयाम जानकारी प्राप्त करने के लिए, प्रत्येक लिम्फोसाइट के एकाधिक 2d होलोग्राम रोशनी के कोण को बदलने के द्वारा मापा गया (से-६० ° से ६० °). आमतौर पर, ५० होलोग्राम के लिए एक 3 डी आरआई स्कैन पुनर्निर्माण किया जा सकता है, लेकिन 2 डी होलोग्राम की संख्या इमेजिंग गति और गुणवत्ता पर विचार किया जा सकता है समायोजित । आयाम और मापा होलोग्राम के चरण जानकारी का उपयोग कर प्राप्त कर रहे है एक क्षेत्र पुनः प्राप्ति एल्गोरिथ्म के आधार पर बदल रूपान्तर४३,४४। प्रत्येक लिम्फोसाइट के 3 डी आरआई स्कैन ऑप्टिकल विवर्तन टोमोग्राफी एल्गोरिथ्म का उपयोग कर रोशनी के विभिंन कोणों पर एकाधिक 2d पुनर्प्राप्त चरण और आयाम जानकारी से खंगाला गया था । छवि प्रक्रिया और 3 डी आरआई स्कैन पुनर्निर्माण विधि का विवरण21,४५कहीं और पाया जा सकता है ।

चित्रा 2 A-2c इमेजिंग सॉफ्टवेयर के माध्यम से आरआई मूल्यों के अनुसार अलग रंग योजनाओं का आवंटन द्वारा बी, CD4 + टी, और सीडी 8 + टी लिम्फोसाइटों के प्रतिनिधि 3 डी गाया आरआई tomograms दिखाता है । आरआई मान से, मात्रात्मक रूपात्मक (एसए, सीवी, और एसआई) और जैव रासायनिक (पीडी और डीएम) सुविधाओं की गणना की गई (चित्रा 2ए-2c) । यह परिणाम स्पष्ट रूप से दर्शाता है कि 3d आरआई वितरण रूपात्मक के मात्रात्मक विश्लेषण के साथ ही लिम्फोसाइटों के जैव रासायनिक जानकारी में सक्षम बनाता है ।

पर्यवेक्षण मशीन लर्निंग एक एकल सेल स्तर पर लिम्फोसाइट प्रकार की पहचान करने के लिए शोषण किया गया था । मापा 3d आरआई tomograms बेतरतीब ढंग से ७०% और प्रशिक्षण के 30% में विभाजित थे (बी: १०४, CD4 + टी: ६६, और सीडी 8 + टी: ७७) और परीक्षण (बी: ४५, CD4 + टी: 29, और सीडी 8 + टी: ३५) डेटासेट, क्रमशः । हम अधिक से अधिक सेल-प्रकार-विशिष्ट सुविधा अंतरिक्ष में इनकोडिंग फिंगरप्रिंट का उपयोग करने के लिए classifiers अनुकूलित । कुल सटीकता, संवेदनशीलता (ट्रू पॉजिटिव), और विशिष्टता (ट्रू निगेटिव) वर्गीकारक-अनुमानित परिणाम और भू-सत्य कक्ष प्रकार की तुलना करके परिकलित किए गए थे ।

प्रस्तावित प्रोटोकॉल के सबूत की अवधारणा को प्रदर्शित करने के लिए, हम तीन अलग मामलों पर पर्यवेक्षण मशीन सीखने का प्रदर्शन किया: (i) बी और टी लिम्फोसाइटों के द्विआधारी वर्गीकरण और (ii) दो टी लिम्फोसाइट उपप्रकार (CD4 + और सीडी 8 +), और (iii) multiclass सभी लिम्फोसाइट प्रकारों का वर्गीकरण ।

चित्रा 3 प्रशिक्षण और परीक्षण चरणों के लिए अनुकूलित classifiers की पहचान प्रदर्शन दिखाता है । टी और बी लिम्फोसाइट वर्गीकरण की सटीकता ९३.१५% और प्रशिक्षण और परीक्षण के मामलों के लिए ८९.८१%, क्रमशः था । CD4 + और सीडी 8 + टी लिम्फोसाइटों सांख्यिकीय वर्गीकृत किया गया है, और सटीकता ८७.४१% और ८४.३८% प्रशिक्षण और परीक्षण सेट के लिए, क्रमशः था । अंत में, multiclass सेल प्रकार वर्गीकारक की सटीकता ८०.६५% और ७५.९३% प्रशिक्षण और परीक्षण चरणों के लिए, क्रमशः था ।

Figure 1
चित्रा 1 : लेबल के योजनाबद्ध आरेख-शोषण लिम्फोसाइट प्रकार के मुक्त पहचान 3 D मात्रात्मक चरण इमेजिंग और मशीन लर्निंग । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 2
चित्रा 2 : प्रतिनिधि 3 D प्रतिपादित आरआई tomograms मात्रात्मक रूपात्मक और जैव रासायनिक सुविधाओं के साथ प्रत्येक लिम्फोसाइट कोशिका प्रकार के. (A) b cell, (b) CD4 + t प्रकोष् ठ, और (C) सीडी 8 + t cell. स्केल बार = 2 µm. SA, सतह क्षेत्र; CV, सेलुलर मात्रा; एसआई, sphericity; पीडी, प्रोटीन घनत्व; डीएम, ड्राई मास । यह आंकड़ा5अनुमति के साथ संशोधित किया गया है । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 3
चित्रा 3 : पर्यवेक्षणीय मशीन लर्निंग के माध्यम से व्यक्तिगत लिम्फोसाइट प्रकार की पहचान (A) b और t कोशिकाओं का बाइनरी वर्गीकरण, (b) CD4 + और सीडी 8 + टी कोशिकाओं का बाइनरी वर्गीकरण, और (ग) सभी तीन लिम्फोसाइट सेल प्रकारों का multiclass वर्गीकरण; दोनों के लिए प्रशिक्षण और परीक्षण सेट । प्रशिक्षण और परीक्षण के मामलों के बीच छोटे अंतर ध्यान दें, स्थापित classifiers का अच्छा सामांयीकरण सुझाव । प्रत्येक कक्ष प्रकार के नाम के नीचे की संख्या कक्षों की संख्या का उपयोग करने का संकेत देती है । यह आंकड़ा5अनुमति के साथ संशोधित किया गया है । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Supplementary File 1
अनुपूरक फ़ाइल 1: सुविधा निष्कर्षण कोड । (एसए, सीवी, एसआई, पीडी, और डीएम) के बाद आरआई दहलीज-प्रत्येक स्कैन के विभाजन के बाद सुविधाओं निकालने । एक छवि प्रसंस्करण सॉफ्टवेयर में कार्यांवित किया । कृपया यहां क्लिक करें इस फ़ाइल को डाउनलोड करने के लिए ।

Supplementary File 2
अनुपूरक फ़ाइल 2: प्रशिक्षण कोड । चयनित सुविधाओं के आधार पर एक कश्मीर-एनएन वर्गीकारक प्रशिक्षण प्रशिक्षण । एक छवि प्रसंस्करण सॉफ्टवेयर में कार्यांवित किया । कृपया यहां क्लिक करें इस फ़ाइल को डाउनलोड करने के लिए ।

Supplementary File 3
अनुपूरक फ़ाइल 3: परीक्षण कोड । एक नए डेटासेट के लिए एक प्रशिक्षित कश्मीर-एनएन वर्गीकारक का परीक्षण (यानी, परीक्षण सेट). एक छवि प्रसंस्करण सॉफ्टवेयर में कार्यांवित किया । कृपया यहां क्लिक करें इस फ़ाइल को डाउनलोड करने के लिए ।

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Discussion

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हम एक प्रोटोकॉल है कि 3 डी मात्रात्मक चरण इमेजिंग और मशीन सीखने का दोहन लिम्फोसाइट प्रकार के लेबल से मुक्त पहचान को सक्षम बनाता है प्रस्तुत करते हैं । इस प्रोटोकॉल के महत्वपूर्ण चरणों मात्रात्मक चरण इमेजिंग और सुविधा का चयन कर रहे हैं । इष्टतम होलोग्राम इमेजिंग के लिए, कोशिकाओं के घनत्व के रूप में ऊपर वर्णित नियंत्रित किया जाना चाहिए । कोशिकाओं की यांत्रिक स्थिरता भी एक सटीक 3 डी आरआई वितरण प्राप्त करने के लिए महत्वपूर्ण है क्योंकि फ्लोटिंग या कंपन सेलुलर गति दीप्ति कोण परिवर्तन पर होलोग्राम माप परेशान करेगा । हम इसलिए, जब तक नमूना स्थिर हो गया था और होलोग्राम को मापने से पहले इमेजिंग चैंबर में स्थिर कई मिनट इंतजार किया । अंत में, इमेजिंग चैंबर के अंदर बुलबुले समस्याग्रस्त जब हवा और नमूने के बीच आरआई मतभेदों के कारण होलोग्राम को मापने कर रहे हैं; इस प्रकार, नमूना ध्यान से इमेजिंग चैंबर के लिए लोड किया जाना चाहिए ।

सुविधा निष्कर्षण और चयन मदद वर्गीकारक की पहचान प्रदर्शन का निर्धारण । हम 5 मात्रात्मक रूपात्मक (CV, एसए, एसआई) और जैव रासायनिक (पीडी, डीएम) 3 डी आरआई वितरण से 20 अलग आरआई दहलीज मूल्यों पर सुविधाओं की गणना; इस प्रकार, हम १०० सुविधाओं की कुल निकाला । हम exhaustively इष्टतम सुविधा और वर्गीकारक संयोजन है, जो बताते है कि सबसे अच्छा पार मांयता सटीकता का चयन किया गया था खोजा । हम कश्मीर-एनएन (कश्मीर = 4 और कश्मीर = 6), रैखिक भेदभाव विश्लेषण, द्विघात भेदभाव विश्लेषण, भोली Bayes, और निर्णय पेड़ सहित 6 अलग मशीन सीखने एल्गोरिदम, परीक्षण किया है, और हमने पाया है कि कश्मीर-एनएन (कश्मीर = 4 ) ने बेहतरीन पहचान का प्रदर्शन दिखाया । हालांकि, समर्थन वेक्टर मशीन और न्यूरॉन नेटवर्क सहित अन्य मशीन सीखने के तरीकों का उपयोग कर पहचान सटीकता में सुधार करने के लिए एक मौका है ।

इस प्रोटोकॉल लिम्फोसाइट प्रकार की पहचान करने के क्रम में 3 डी मात्रात्मक चरण इमेजिंग के माध्यम से आंतरिक ऑप्टिकल संपत्तियों उपाय; इस प्रकार, यह एक लेबलिंग प्रक्रिया प्रतिजन-एंटीबॉडी प्रतिदीप्ति या चुंबकीय मनका-आधारित कोशिका-छंटाई तकनीक है, जो झिल्ली प्रोटीन संरचनाओं को संशोधित करने के सेलुलर समारोह में फेरबदल का जोखिम है में इस्तेमाल प्रतिक्रियाओं पर आधारित की आवश्यकता नहीं है । इसके अलावा, वर्तमान विधि 3 डी आरआई वितरण उपायों और 3 डी रूपात्मक और सेल, जो एक एकल शॉट होलोग्रफ़ी विधि४६द्वारा प्राप्त नहीं किया जा सकता है के बारे में जैव रासायनिक जानकारी प्रदान करता है; इसलिए, उच्च-आयामी जानकारी के कारण प्रोटोकॉल की पहचान प्रदर्शन अधिक सटीक है ।

इस प्रोटोकॉल की एक छोटी सी सीमा नमूना चरण के मैनुअल समायोजन और पर्यवेक्षणीय मशीन सीखने के लिए आवश्यक लेबलिंग प्रक्रिया है । हम मैनुअल शोधों चरण का समायोजन और होलोग्राम मापा, जो सबसे अधिक समय लेने वाली कदम कर रहे हैं द्वारा एक लिम्फोसाइट खोजा । इस सीमा एक स्वचालित मोटर चालित मंच या microfluidic चैनल उपकरणों को रोजगार के द्वारा सुधार किया जाएगा । पर्यवेक्षणीय अधिगम के संबंध में ज्ञात लिम्फोसाइट प्रकारों को श्रेष्ठतम वर्गीकारक स्थापित करने के लिए आवश्यक हैं; इस प्रकार, हम पहले अलग और antigen-एंटीबॉडी-आधारित सॉर्टिंग तकनीक पर आधारित लिम्फोसाइट सेल प्रकार की पहचान करने के लिए किया था । बहरहाल, इस प्रोटोकॉल अभी भी लिम्फोसाइटों के आंतरिक ऑप्टिकल कंट्रास्ट का उपयोग करता है, और लेबल एजेंट एंटीबॉडी निर्दिष्ट करने के लिए इस्तेमाल मापा 3 डी री सिग्नल पर नगण्य प्रभाव पड़ता है । इसलिए, स्थापित वर्गीकारक एक लेबल-मुक्त तरीके से लिम्फोसाइटों की पहचान करने के लिए उपयोग किया जा सकता है ।

हालांकि इस प्रोटोकॉल मुख्य रूप से व्यक्तिगत कोशिकाओं के 3 डी री tomograms को मापने के द्वारा लिम्फोसाइटों के phenotypes का उपयोग करता है, इन 3 डी आरआई डेटा भी अंय पादी के बेहतर वर्गीकरण के लिए या proteomic जानकारी को संबोधित विधियों के साथ संयोजन में इस्तेमाल किया जा सकता है उपप्रकारों. हाल ही में, correlative माइक्रोस्कोपी तकनीक संयोजन प्रतिदीप्ति इमेजिंग और QPI४७,४८,४९पेश किया गया है । इस प्रोटोकॉल में प्रस्तुत दृष्टिकोण भी इन correlative इमेजिंग तरीकों को बढ़ाया जा सकता है ।

लिम्फोसाइट प्रकार की लेबल-मुक्त पहचान का अध्ययन pathophysiology या लिम्फोसाइट प्रकारों के बीच असामान्य लिम्फोसाइटों या अनुपात का पता लगाकर रोग का निदान करने के लिए लागू किया जा सकता है । इसके अलावा, इस प्रोटोकॉल पूरे रक्त विश्लेषण करने के लिए लाल रक्त कोशिकाओं, प्लेटलेट्स सहित विभिंन कोशिकाओं की पहचान के द्वारा लागू किया जा सकता है, और सफेद रक्त कोशिकाओं ।

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Disclosures

प्रो वाई पार्क, वाई. जो, वाई. एस. किम, और एस ली Tomocube, Inc, एक कंपनी है कि ऑप्टिकल विवर्तन टोमोग्राफी और मात्रात्मक चरण इमेजिंग उपकरणों के व्यावसाय और काम के प्रायोजकों में से एक है में वित्तीय हितों की है ।

Acknowledgments

यह काम KAIST BK21 + प्रोग्राम, Tomocube, इंक, और कोरिया के नेशनल रिसर्च फाउंडेशन (2015R1A3A2066550, 2017M3C1A3013923, 2018K000396) द्वारा समर्थित था । Y. जो KAIST राष्ट्रपति फैलोशिप और आासान फाउंडेशन जैव चिकित्सा विज्ञान छात्रवृत्ति से समर्थन स्वीकार करता है ।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Mouse Daehan Biolink C57BL/6J mice  gender and age-matched, 6 – 8 weeks
Falcon conical centrifuge tube ThermoFisher Scientific 14-959-53A 15 mL
Phosphate-buffered saline  Sigma-Aldrich 806544-500ML
Ammonium-chloride-potassium lysing buffer  ThermoFisher Scientific A1049201
RPMI-1640 medium Sigma-Aldrich R8758
Fetal bovine serum ThermoFisher Scientific 10438018
Antibody BD Biosciences 553140 (RRID:AB_394655) CD16/32 (clone 2.4G2)
Antibody BD Biosciences 555275 (RRID:AB_395699) CD3ε (clone 17A2)
Antibody Biolegnd 100734 (RRID:AB_2075238) CD8α (clone 53-6.7)
Antibody BD Biosciences 557655 (RRID:AB_396770) CD19 (clone 1D3)
Antibody BD Biosciences 557683 (RRID:AB_396793) CD45R/B220 (clone RA3-6B2)
Antibody BD Biosciences 552878 (RRID:AB_394507) NK1.1 (clone PK136)
Antibody eBioscience 11-0041-85 (RRID:AB_464893) CD4 (clone GK1.5)
DAPI  Roche 10236276001 4,6-diamidino-2-phenylindole
Flow cytometry  BD Biosciences Aria II or III 
Imaging chamber Tomocube, Inc. TomoDish
Holotomography Tomocube, Inc. HT-1H
Holotomography imaging software Tomocube, Inc. TomoStudio
Image professing software MathWorks Matlab R2017b

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References

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तीन आयामी मात्रात्मक चरण इमेजिंग और मशीन लर्निंग का उपयोग करके लिम्फोसाइट उपप्रकारों की लेबल-मुक्त पहचान
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Yoon, J., Jo, Y., Kim, Y. S., Yu, Y., Park, J., Lee, S., Park, W. S., Park, Y. Label-Free Identification of Lymphocyte Subtypes Using Three-Dimensional Quantitative Phase Imaging and Machine Learning. J. Vis. Exp. (141), e58305, doi:10.3791/58305 (2018).More

Yoon, J., Jo, Y., Kim, Y. S., Yu, Y., Park, J., Lee, S., Park, W. S., Park, Y. Label-Free Identification of Lymphocyte Subtypes Using Three-Dimensional Quantitative Phase Imaging and Machine Learning. J. Vis. Exp. (141), e58305, doi:10.3791/58305 (2018).

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