Summary
定量位相イメージングと機械学習アルゴリズムを用いたリンパ球サブタイプの無料のラベル識別のためのプロトコルについて述べる。リンパ球の 3 D の屈折断層の測定は、細胞の種類を識別するための機械学習アルゴリズムで分析します個々 のセル、3 D の形態学的および生化学的情報を提示します。
Abstract
我々 はここで定量的な位相画像と機械学習を用いたリンパ球サブタイプの無料のラベル識別のためのプロトコルについて説明します。リンパ球サブタイプの同定診断と同様に、免疫学の研究や様々 な疾患の治療が重要です。現在、リンパ球の種類を分類するための標準的な方法は、抗原抗体反応による特定の膜タンパク質をラベルに依存します。ただし、これらの分類の技術は、細胞機能の変更の潜在的なリスクを運ぶ。ここで説明されているプロトコルは、3 D の定量位相イメージングと機械学習アルゴリズムを用いて本質的な光のコントラストを利用してこれらの課題を克服します。リンパ球の三次元屈折率 (RI) 断層の測定は、3 D 形態、個々 のセルの表現型についての定量的な情報を提供します。測定 3 D RI 断層から抽出された生物物理パラメーターは、単一細胞レベルでリンパ球型のラベル フリーの識別を有効にする機械学習アルゴリズムを用いた定量的に分析しています。B、T cd4 および cd8 陽性 T リンパ球の 3 D RI 断層を測定し、80% 以上で、細胞の種類を識別精度。このプロトコルではリンパ球の隔離、3 D 定量位相イメージング、およびリンパ球の種類を識別するための機械学習のための詳細な手順をについて説明します。
Introduction
B、レギュラトリー T 細胞 (cd 8 +) T、(cd 4 +) T ヘルパーを含む様々 なサブタイプに分けられるリンパ球細胞。各リンパ球型適応免疫システムに異なった役割を持ってください。たとえば、B リンパ球は T リンパ球特異抗原を検出、異常な細胞を排除して B リンパ球を調節するのに対し、抗体を生成します。リンパ球機能と規制は密によって制御され癌1、自己免疫疾患2、ウイルス感染症3を含む様々 な疾患に関連。したがって、リンパ球の種類の同定はこのような疾患、免疫療法の診療所での病態生理学的役割を理解することが重要です。
現在、リンパ球の種類を分類するための方法は、特定の表面膜蛋白質または表面マーカー4対象に抗原抗体反応に依存します。表面のマーカーをターゲットはリンパ球の種類を決定する正確かつ正確な方法です。ただし、高価な試薬および時間のかかる手順が必要です。さらに、それは膜蛋白質の構造の変更や細胞機能の変化のリスクを運ぶ。
これらの課題を克服するためには、ここで説明されているプロトコルは、3 D 定量位相イメージング (QPI) と機械学習5を使用してリンパ球タイプのラベル フリー識別を紹介します。このメソッドは、個々 のリンパ球のラベル無料 3 D 画像から抽出した形態学的情報に基づく単一細胞レベルでリンパ球型の分類できます。従来の蛍光顕微鏡技術とは異なり QPI は光のコントラスト6,7として屈折率 (RI) 分布 (生きている細胞や組織の本質的な光学特性) を利用しています。個々 のリンパ球の RI 断層は、リンパ球のサブタイプに固有表現型情報を表します。この場合は、全身の個々 のリンパ球の 3 D の RI 断層を利用する教師つき機械学習アルゴリズムが利用されました。
QPI のさまざまなテクニックを使用して、セルの 3 D RI 断層使用されている積極的に細胞病態学ラベル無料提供するため定量的イメージング機能8,9,10, 11,12,13。また、個々 のセルの 3 D RI 分布細胞形態学的、生化学的、および生体力学的情報を提供します。3 D の RI 断層は、以前血液14,15,16,17, 感染症18,19、の分野で利用されている20、免疫学21、細胞生物学22,23、炎症24、がん25, 神経科学26,27、発生生物学28, 毒物学29、および微生物学12,30,31,32。
3 D RI 断層は、細胞の形態学的および生化学的な詳細を提供する、リンパ球サブタイプの分類は単にイメージング 3 D RI 断層5で達成するために困難であります。体系的かつ定量的細胞型分類のため測定された 3 D RI 断層を悪用、機械学習アルゴリズムを利用しました。最近では、いくつかの作品報告されているどの定量細胞の画像を分析した様々 な機械学習アルゴリズム33、微生物34、35細菌属の分類の検出など,36, 炭疽菌胞子37, 迅速かつ無料のラベル検出は、精子細胞38の解析、マクロファージ活性化41の癌細胞39,40, の分析と検出を自動化しました。
このプロトコルは、3 D QPI と機械学習を用いた個々 の細胞レベルでのリンパ球型の無料のラベル識別を実行する詳細な手順を提供します。これが含まれます: 1) リンパ球分離マウス血、2) リンパ球が 3 D の RI 断層から流れ cytometry、3) 3 D QPI 4) 定量的特徴抽出による並べ替えおよび 5) リンパ球の種類を識別するための学習から。
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Protocol
動物介護施設使用 (KA2010 21, KA2014-01 と KA2015-03) 委員会の KAIST の承認の下で動物の世話と実験手順を行った。承認されたガイドラインに基づき本研究のすべての実験を行った。
1 マウスの血液からリンパ球の隔離
- C57bl/6 j マウスに CO2吸入による安楽死は一度マウスの心臓に 26 G 針を挿入し、血液の 0.3 mL を収集します。直接リン酸緩衝生理食塩水 (PBS) 1 mL で希釈 100 U/mL ヘパリン溶液をチューブ内に血液を置きます。
注: また、脾臓からのリンパ球分離できます。 - 4 ° C で 5 分間 400 x g でチューブを遠心分離します。
- チューブに 0.5 mL のアンモニウム塩化カリウムの溶解バッファーを追加し、そっとそれのいくつかを反転ソリューションをミックスする回。
- 5 分間室温 (RT) で管を孵化させなさい。
- 4.5 mL の PBS を追加し、2 回の 4 ° C で 5 分間 400 × g で遠心分離によって細胞を洗浄します。
- 上澄みを除去し、新鮮な RPMI 1640 媒体 10% 牛胎児血清 (FBS) の 100 μ L で細胞ペレットを再懸濁します。
- CD16/32 (2.4G2) 抗体の 0.1 μ g をブロックするためチューブに追加します。
- 氷の上の管を保ちます。
2. 流れの Cytometry とリンパ球サブタイプの並べ替え
注意: リンパ球細胞の種類に応じて並べ替え地上真実 (すなわち、正しい) 細胞を確立するため重要ですトレーニングおよび学習の細胞型分類をテストするラベルを入力します。識別し、別のリンパ球42フローサイトメトリー、金標準の方法が使用されます。
- RPMI 1640 培の 100 μ L の抗体染色表面マーカーの混合物を作る [10 %fbs、CD3e の 0.1 μ g (17A2)、CD8a (53-6.7)、CD19 (1 D 3) CD45R (B220、RA3 6B2) と NK1.1 (PK136)] とターゲット B、cd 4 + T、および cd 8 + T に CD4 (GK1.5) 抗体の 0.25 μ gリンパ球。
- (1.8 の手順で得られた) 細胞懸濁液を 100 μ L の抗体の混合物を追加します。
- 氷の上の 25 分間インキュベートします。
- 5 mL の PBS を追加し、2 回の 4 ° C で 5 分間 400 × g で遠心分離によって細胞を洗います。
- 10 RPMI 1640 培の 5 mL の細胞ペレットを再懸濁します %fbs、DAPI (4', 6-diamidino-2-phenylindole) の 2.5 μ g。
- 上記マーカーの蛍光レベルを用いたフローサイトメトリーによるリンパ球の種類ごとを個別に収集します。DAPI 信号を使用して、同時にセル除外死んだ。
注: フローサイトメトリーを用いた細胞選別されているフローに関する詳細なプロトコル42前述。
3. 3 D 定量位相イメージング
- 並べ替えられたリンパ球の細胞の損傷の生化学的変化を避けるために (マウスからリンパ球の隔離) 以来 5 時間内で完了する必要があります画像検査手順の中で氷の上を保ちます。
- (B、cd 4 + T、および cd8 陽性 T リンパ球) の間で並べ替えられた細胞タイプを選択し、最適な撮像条件 (すなわち、単一フィールドのビューごとに 1 つのセル) に RPMI 培地で 180 細胞/μ L (2.6 の手順で得られた)、サンプルを希釈します。
- 低速注入によるイメージング室に希釈サンプルの 120 μ L を読み込みます。サンプル画像処理室における気泡の存在を徹底的にチェックします。気泡が存在する場合は、測定値の品質を妥協すると、それらを削除慎重に。
- 商業 3 D の定量位相顕微鏡、または holotomography とそのイメージング ソフトウェアを使用して 3 D の RI 断層を取得します。
注: 実験のセットアップの詳細については、5の元の原稿で見つけることが。- 顕微鏡の対物レンズの上に水の滴を配置します。
- 顕微鏡の翻訳段階でイメージング チャンバー内に試料を置き、対物レンズとサンプルが揃うように、その位置を調整します。
- フォーカスと表面、それぞれタブをクリックして、「校正」イメージング ソフトウェアの「顕微鏡」視点の目標とコンデンサー レンズの軸の位置を調整します。
- 自動モードをクリックして目的とコンデンサー レンズを合わせます。また、スキャン モードを使用し、ビューのフィールドの中央領域に局在する照明パターンは、手動でレンズを調節します。
- 通常モードに戻るし、ビューのフィールドのセルを検索する翻訳段階を調整します。
- 対物レンズの軸方向の位置を調整することにより焦点面を見つけます。ほとんど目に見えない画面で視覚化されるサンプル境界を作る完璧な焦点します。
- セルなしの場所を見つけるに翻訳段階を調整します。
- さまざまな照明の角度で複数の 2 D ホログラムを測定するための調整をクリックします。
- ビューのフィールドの中央にセルを特定する翻訳段階を調整します。
- 「取得」タブに移動し、ステップ 3.4.8 で同一の照明角度を持つセルのホログラムを測定する3 D スナップショット] をクリックして。
- 取得したデータは、「データ管理」パネルに発表は、集録したデータを右クリックし、3.4.8 と 3.4.10, 回折トモグラフィ アルゴリズムを使用しての手順で測定したホログラムからの 3次元 RI 断層を再構築するプロセス] をクリックしてください9,10は、イメージング ソフトウェアで実装されています。
- 機械学習のための検定力を確保するため 100 以上のセルを測定する手順 3.4.5-3.4.11 を繰り返します。
- 3.4.11 ステップによって処理されるすべての画像。視覚化できます。「データ管理」パネル データを右クリックしてしデータを視覚化する開くをクリック。「データ マネージャー」パネルを RI 断層をクリックしてします。「プリセット」タブ ロードをクリックし、3 D の RI 分布よると断層像を可視化するイメージング ソフトウェアによって提供される定義済みの伝達関数である"lymphocyte.xml"をダブルクリックします。
- リンパ球サブタイプのすべての 3 D の RI 断層を測定する 3.2 3.4 の手順を繰り返します。
4 3 D RI 断層から定量的形態学的および生化学的特徴抽出
- 単一のフォルダーに上記の測定すべての断層データを配置します。このフォルダーのサブフォルダー内のセル型を分割します。各断層を単一.matファイルを準備します。
- 補足ファイル 1 - 特徴抽出 (画像処理ソフトウェアの書かれた) を開きます。
- 4.1 準備した断層フォルダーを指定の 14 行目を編集します。
- 特徴データを保存するフォルダーを指定するのには 15 行目を編集します。
- 必要に応じて、特徴抽出のための RI のしきい値パラメーターを調整する 17 行目を編集します。既定のオプションは 1.340 1.378、0.002、5を前述のインクリメントでから 20 里しきい値です。
- コードを実行します。データセット内のすべての断層画像のコードは、5 つの機能を計算します: RI しきい値あたり表面積 (SA)、細胞容積 (CV)、真球度 (SI)、蛋白質密度 (PD) と乾燥質量 (DM)。詳細な特徴抽出アルゴリズムの場所で述べる5。
- 特徴抽出を監視するためを実行中に RI 閾値に基づくセル分割を可視化画面に確認します。
- 4.4 の手順で指定したフォルダーに保存されている断層あたり.matファイルとして抽出した特徴データを確認します。
5. 監修の学習と識別
- ランダムに別々 のフォルダーに手順 4.8 トレーニング (70%) とテスト (30%) のセットで得られたフィーチャ データを分割します。
- オープン補助ファイル 2 - 鉄道 (画像処理ソフトウェアの書かれた)。
- 5.1 準備したトレーニング セットを指定する 14 行目を編集します。
- 訓練された分類器を保存するフォルダーを指定するのには 16 行目を編集します。
- 分類子のファイル名を設定するのには 17 行目を編集します。
- 必要に応じて、トレーニングの機能を選択する 19 行目を編集します。5、以前に指定された既定のオプション以下の代表的な結果を取得する使用だった。
- コードを実行します。トレーニング セットの選択機能を使用して、コード列車kである分類子-最近傍アルゴリズム (k -NN; k = 4) し、5.4 の手順で指定したフォルダーで分類 (手順 5.5 で名前) としてを保存します。
- 識別性能とクロス検証の精度を可視化画面上を確認します。
- 必要に応じて、手順 5.5 5.7 を繰り返すことによってさまざまな機能の組み合わせで複数の識別器を学習します。クロス検証精度の高い分類子を選択します。
- 補足ファイル 3 - テストを開く (画像処理ソフトウェアの書かれた)。
- 14-15 テストする訓練された分類器を指定するための行を編集します。
- 5.1 準備したテスト セットを指定するのには 17 行目を編集します。
- コードを実行します。上記分類は、テスト セット内の個々 のリンパ球の細胞の種類を識別します。
- 話者識別の性能と試験精度可視化画面上を確認します。
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Representative Results
図1は、プロトコル全体のプロセスの概略を示しています。ここに示す手順を使用して、我々 は B を分離した (n = 149)、cd 4 + T (n = 95)、および cd 8 + の T (n = 112) リンパ球。照明の様々 な角度での位相および振幅情報を取得するには、(-60 ° ~ 60 °) からの照明の角度を変更することによって各リンパ球の複数の 2 D ホログラムを測定しました。通常、3 D の RI 断層像を再構築する 50 のホログラムを使用ことができますが、イメージングの速度と品質を考慮した 2 D ホログラム数を調整することができます。フーリエ変換43,44に基づいてフィールド検索アルゴリズムを使用して測定されたホログラムの振幅と位相の情報が取得されます。各リンパ球の 3 D RI 断層は、複数 2D 取得した位相と振幅の情報から様々 な角度で照明光の回折トモグラフィのアルゴリズムを使用して再建されました。画像処理と 3次元 RI 断層像再構成法の詳細は、他の場所で21,45で見つけることができます。
図 2A-2_Cは、イメージング ソフトウェアを介して RI 値に従って異なった色彩の配合を割り当てることによって B、T cd4 および cd8 陽性 T リンパ球の代表的な 3 D レンダリングされた RI 断層を示しています。定量的 RI 値から形態素 (SA, 履歴書, SI) (PD と DM) の生化学的機能を算出した (図 2A-2_C)。この結果は明らかに 3 D の RI 分布できるリンパ球の形態学的、生化学的情報の定量的解析を示します。
教師つき機械学習は、単一細胞レベルでのリンパ球の種類を識別するために利用されました。測定された 3 D RI 断層ランダムに分割された 70%、30% (b: 104、cd 4 + t: 66、および cd 8 + t: 77) トレーニングとテスト (b: 45、cd 4 + t: 29, と cd 8 + t: 35) のデータセット、それぞれ。私たちは、特徴空間でエンコードされた細胞型特異指紋を最大限に利用する分類子を最適化されています。合計の精度、感度 (真陽性)、および特異性 (真陰性) 分類予測結果や地上のセルの種類を比較することで算出しました。
提案プロトコルの概念の証拠を示すために 3 つのケースの教師つき機械学習を実行: バイナリの分類 (i) B および T のリンパ球および (ii) 2 T リンパ球サブタイプ (cd 4 + および cd 8 +) と (iii) multiclassすべてのリンパ球タイプの分類。
図3トレーニングとテスト段階の最適化された識別子の識別性能を示しています。T および B リンパ球の分類の精度は 93.15%、トレーニング、テスト _ ケース、89.81% であった。Cd 4 + および cd 8 + T リンパ球は統計的に分類されたと精度は 87.41% と、トレーニング セットとテスト セットの 84.38% それぞれ。最後に、多細胞型分類器の精度は 80.65% 75.93% トレーニングとテスト段階のあった.
図 1: 悪用するリンパ球の種類の無料のラベル識別のスケマティック ダイアグラム3D 定量位相イメージングと機械学習します。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 2: 代表的な3D レンダリングの定量形態学的および生化学的な機能を持つリンパ球細胞各種 RI 断層。(B 細胞 A)、(B) cd 4 + T 細胞および (C) cd 8 + T 細胞。スケール バー = 2 μ m。 SA、表面積。CV、細胞の容積;SI、真球度;PD は、タンパク質の密度;DM、乾燥質量。この図は、アクセス許可5に変更されます。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 3: 教師つき機械学習による個々 のリンパ球の識別タイプ(A) 二値分類 B ・ T 細胞、cd 4 + および cd 8 + T 細胞 (B) 二値分類 (C) 3 のリンパ球細胞の種類をすべて; の判別のトレーニングとテストの両方のセット。トレーニングとテスト _ ケース、確立された分類子の素敵な汎化を示唆している間に小さな違いに注意してください。セル タイプごとの名の下の数字は、使用されているセルの数を示します。この図は、アクセス許可5に変更されます。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
補足ファイル 1: 機能抽出コード。各断層の RI のしきい値に基づくセグメンテーション後機能 (SA、CV、SI、PD と DM) を抽出しています。画像処理ソフトウェアで実装されています。このファイルをダウンロードするここをクリックしてください。
補足ファイル 2: トレーニング コード。トレーニング、 k -NN 分類選択した機能に基づきます。画像処理ソフトウェアで実装されています。このファイルをダウンロードするここをクリックしてください。
補足ファイル 3: コードをテストします。新しいデータセットの訓練を受けたk最近傍識別分類をテスト (すなわち。、テスト セット)。画像処理ソフトウェアで実装されています。このファイルをダウンロードするここをクリックしてください。
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Discussion
3 D 定量位相イメージングと機械学習を利用したリンパ球の種類の無料のラベル識別を可能にするプロトコルを提案します。このプロトコルの重要なステップは、定量的な位相画像と機能の選択です。最適なホログラフィック画像上記のように細胞の密度を制御する必要があります。細胞の機械的安定性も浮動または振動の細胞挙動は照明角度変更時にホログラム測定を妨げるので正確な 3次元 RI 分布を取得する重要です。我々 は、したがってまでサンプルになり安定した静的イメージング室でホログラムを計測する前に数分を待っていた。イメージング室の内部気泡が問題のある空気と、サンプルの RI の違いによりホログラムを測定するとき最後に、したがって、イメージングの商工会議所にサンプルを注意深く読み込む必要があります。
特徴抽出、選択、分類法の識別性能を決定に役立ちます。5 定量的形態 (CV、SA、SI) を用いて、生化学 (PD, DM) 20 異なる RI のしきい値値で 3 D の RI 分布から機能したがって、合計 100 の機能を抽出しました。我々 は余すところなく最高のクロス検証の精度が選択されたことを示す最適な機能と分類の組み合わせを検索します。我々 はテストを含むk -NN 6 の異なる機械学習アルゴリズム (k = 4、 k = 6)、線形判別分析、二次判別分析、ナイーブベイズと決定ツリー、および私たちが見つかりましたそのk -NN (k = 4) 最高の識別性能を示した。しかし、学習法、サポート ベクトル マシンと神経回路を含む他のマシンを使用して識別精度を向上させるチャンスがあります。
このプロトコルはリンパ球の種類を識別するために 3 D 定量位相イメージングによる固有の光学特性を測定します。したがって、蛍光または磁気ビーズ ベース細胞選別技術、膜蛋白質の構造を変更することにより細胞機能を変更することのリスクを持って用いられる抗原抗体反応に基づくラベル付けプロセスは不要です。また、本法 3 D RI 分布を測定、シングル ショット ホログラフィ法46; で取得できませんのセルに関する 3 D 形態学的および生化学的な情報を提供しますしたがって、プロトコルの識別性能が高次元情報のため正確です。
このプロトコルのマイナーな制限は、サンプル段階の手動調整で義務教師つき機械学習のプロセスを表示します。手動の並進ステージと最も時間がかかるステップ測定のホログラムを調整することによってリンパ球を検索しました。この制限は、自動モーターを備えられた段階かマイクロ チャンネル デバイスを用いることによって改善されるでしょう。教師あり学習について知られているリンパ球の種類が最適なクラシファイアの確立に必要ですしたがって、最初の分離、抗原・抗体・ ベースの並べ替え手法に基づくリンパ球細胞の種類を特定します。それにもかかわらず、このプロトコルは、まだリンパ球の本質的な光のコントラストを使用して、抗体を指定するために使用ラベリング業者に測定する 3 D RI 信号にはほとんど影響があります。したがって、ラベル無料の方法でリンパ球を特定の確立された分類子を使用可能性があります。
ただし、このプロトコルは主に、個々 のセルの 3 D の RI 断層を測定することによりリンパ球の表現型を利用して、これら 3 D RI データも使えますの組み合わせで遺伝子型またはのより良い分類のプロテオーム情報に対処する他のモダリティとサブタイプ。最近では、蛍光イメージングと QPI を組み合わせた相関顕微鏡技術は導入された47,48,49をされています。このプロトコルで紹介した方法は、これらの相関イメージング方法を拡張できます。
リンパ球タイプのラベル フリーの識別は、病態生理を勉強したり、異常なリンパ球やリンパ球の種類の比率を検出することにより病気の診断に適用できます。さらに、このプロトコルは、赤血球、血小板と白血球を含む様々 な細胞を識別することによって全体の血液分析に適用できます。
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Disclosures
・ S ・ リー、Y. S. キム Y. チョ教授 Y の公園 Tomocube 株式会社、光回折トモグラフィと定量位相イメージング機器を製品化、作業のスポンサーの 1 つは、会社の金銭的な利益があります。
Acknowledgments
この作品は、KAIST bk 21 + プログラム、Tomocube、株式会社と、国立研究財団 (2015R1A3A2066550, 2017M3C1A3013923, 2018 K 000396) によって支えられました。Y. ジョーは、KAIST 大統領交わりからアサン財団生物医学科学奨学金サポートを認めています。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Mouse | Daehan Biolink | C57BL/6J mice | gender and age-matched, 6 – 8 weeks |
| Falcon conical centrifuge tube | ThermoFisher Scientific | 14-959-53A | 15 mL |
| Phosphate-buffered saline | Sigma-Aldrich | 806544-500ML | |
| Ammonium-chloride-potassium lysing buffer | ThermoFisher Scientific | A1049201 | |
| RPMI-1640 medium | Sigma-Aldrich | R8758 | |
| Fetal bovine serum | ThermoFisher Scientific | 10438018 | |
| Antibody | BD Biosciences | 553140 (RRID:AB_394655) | CD16/32 (clone 2.4G2) |
| Antibody | BD Biosciences | 555275 (RRID:AB_395699) | CD3ε (clone 17A2) |
| Antibody | Biolegnd | 100734 (RRID:AB_2075238) | CD8α (clone 53-6.7) |
| Antibody | BD Biosciences | 557655 (RRID:AB_396770) | CD19 (clone 1D3) |
| Antibody | BD Biosciences | 557683 (RRID:AB_396793) | CD45R/B220 (clone RA3-6B2) |
| Antibody | BD Biosciences | 552878 (RRID:AB_394507) | NK1.1 (clone PK136) |
| Antibody | eBioscience | 11-0041-85 (RRID:AB_464893) | CD4 (clone GK1.5) |
| DAPI | Roche | 10236276001 | 4,6-diamidino-2-phenylindole |
| Flow cytometry | BD Biosciences | Aria II or III | |
| Imaging chamber | Tomocube, Inc. | TomoDish | |
| Holotomography | Tomocube, Inc. | HT-1H | |
| Holotomography imaging software | Tomocube, Inc. | TomoStudio | |
| Image professing software | MathWorks | Matlab R2017b |
References
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