Summary
هنا يمكننا وصف المنهجية التفصيلية المطلوبة لإجراء تجارب التعلم (سفل) الإجهاد--تعزيز الخوف، نموذج السريرية لاضطراب الإجهاد اللاحق للصدمة النفسية، في كل من الفئران والجرذان. النموذج يستخدم جوانب الخوف Pavlovian تكييف وتجميد كفهرس للخوف المعززة في القوارض.
Abstract
ويخشى السلوكيات الهامة للبقاء على قيد الحياة، ولكن يمكن أن تزيد من مستويات مرتفعة من الخوف التعرض لوضع الاضطرابات النفسية مثل اضطراب الإجهاد اللاحق للصدمة النفسية (الاضطراب). لفهم الآليات البيولوجية للتقلبات الخوف في تلك الاضطرابات، من المهم أن تبدأ مع نموذج حيوانية صالحة من الاضطراب. ويصف هذا البروتوكول المنهجية اللازمة لإجراء تجارب التعلم (سفل) الإجهاد--تعزيز الخوف، نموذج السريرية للاضطراب، في الفئران والجرذان. ووضعت سفل إيجاز الجوانب الحرجة للاضطراب، بما في ذلك توعية طويلة الأجل للتعلم الخوف الناجم عن الضغوطات حادة. جوانب استخدامات سفل Pavlovian الخوف تكييف ولكن ينتج استجابة متميزة وقوية من خوف وعي أكبر بكثير من الردود الخوف الشرطي العادي. ويشمل الإجراء صدمة من القوارض في دائرة تكييف وإدارة الصدمات أونسيجناليد 15 موزعة بشكل عشوائي أكثر من 90 دقيقة (لإجراء التجارب على الفئران؛ لإجراء التجارب على الماوس، 10 أونسيجناليد وتستخدم الصدمات موزعة بشكل عشوائي أكثر من 60 دقيقة) . في اليوم 2، توضع القوارض في رواية تكييف السياق حيث تلقي صدمة واحدة؛ ثم، في اليوم 3 فهي وضع مرة أخرى في نفس السياق كما في يوم 2 واختبارها للتغييرات في تجميد مستويات. القوارض التي سبق وتلقى عرض الصدمات تعزيز مستويات من تجميد في يوم الاختبار مقارنة بتلك التي تلقي لا صدمات في اليوم الأول. وهكذا، مع هذا النموذج، تنتج تجربة مجهدة للغاية واحدة (الصدمة النفسية) الخوف الشديد من المحفزات المرتبطة بالحدث الأليم.
Introduction
الخوف سلوك حاسم للبقاء على قيد الحياة، تمكين الأفراد من التعرف على الإخطار والاستجابة. ومع ذلك، يمكن أن تسهم استجابات الخوف مبالغ فيه تطوير الاضطرابات النفسية مثل اضطراب الإجهاد اللاحق للصدمة النفسية (الاضطرابات). إحدى خصائص الاضطراب استجابة مبالغ فيها للضغوطات معتدل، لا سيما تلك التي تذكر بالصدمة الأصلي، وميل إلى وضع مخاوف جديدة1،2. في المختبر، كثيرا ما يقاس الخوف من خلال تجميد السلوك، الذي مؤشر موثوق بها وصالحة اثولوجيكالي من الخوف في البشر والقوارض3،4. في حين أنه معروف أن الاضطراب ينطوي على التقلبات من الخوف والخوف تعزيز التعبير، هناك نقص في نماذج حيوانية قوي الاضطراب التي موثوق بها والتقاط هذا الخوف زيادة استجابة لحافز حميدة نسبيا.
يوفر هذا البروتوكول المنهجية التفصيلية المطلوبة لإجراء تجارب التعلم (سفل) الإجهاد--تعزيز الخوف، نموذجا الإكلينيكية موثوقة وقوية من الاضطراب، في كل من الفئران والجرذان. ويستخدم سفل جوانب Pavlovian تكييف الخوف، لكنها تنتج استجابات متميزة من تكييف الخوف الطبيعي ويجمل الخوف المحسنة التالية الصدمة لوحظت في الاضطراب المرضى5،6. وفي هذا النموذج، تجربة مجهدة للغاية واحدة (يشار إليها هنا كالصدمات) يؤدي إلى دائم التغييرات السلوكية، بما في ذلك الخوف الشديد من المحفزات المرتبطة بالحدث الأليم وازداد القلق وزاد مفاعليه جفل وغيرت جلوكوكورتيكويد يشير إلى7،8. الميزة الرئيسية من سفل هو أنه بعد التعرض للضغوطات صدمة (سلسلة من الصدمات أونسيجناليد) في سياق متميزة، الحيوانات إظهار استجابة خوف مبالغ فيه الضغوطات خفيفة (مثلاً.، صدمة واحدة) في سياق مختلف. الأهم من ذلك، أن تأثير سفل ليس بسبب التعميم من سياق الصدمة إلى سياق الرواية أو صدمة زيادة حساسية5. في نموذجنا، نحن هادف الاستفادة من الإجراءات التي تقلل من أي التعميم إلى سياق رواية مثل نمط الكلمة النقل ورائحة وشبكة متميزة. ولذلك، خلافا لتكييف الخوف العادي، وهو سفل عملية غير قابل للاقتران الذي يؤدي إلى تعلم جديدة في خوف المرتبط غير متناسب بمنبهات بيئية غير مباشرة المرتبطة بتجربة مؤلمة. العمل المكثف الذي يوضح أن دورة 90 دقيقة واحدة تحتوي على 15 الصدمات غير المتوقعة في الفئران (أو دورة 60 دقيقة واحدة تحتوي على 10 الصدمات غير المتوقعة في الفئران) الحث توعية طويلة الأمد لتكييف الخوف جنبا إلى جنب مع زيادة القلق و التقلبات في إيقاع circadian القشري القاعدي. وفي المقابل، ما قبل التعرض لواحد فوتشوك لا تنتج سفل9. وعلاوة على ذلك، يمكن أن تستخدم سفل موثوق في الجرذان والفئران.
ومن ثم فإن هذا النموذج سفل الاضطراب أداة قوية لاستكشاف الآليات البيولوجية التي تشارك في تلك الاضطرابات الفيزيولوجيا المرضية. استخدام سفل، فحص الباحثون كيف يمكن أن تؤثر على التعرض لصدمات التعلم الخوف مستقبلا. وبالإضافة إلى ذلك، يمكن أن يكون هذا النموذج مفيداً للتحقيق في الآليات الخلوية والجزيئية المحددة التي يمكن أن تشارك في تنظيم التعبير الخوف المعززة كما هو ملاحظ في الاضطراب.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1-المواضيع
- الفئران
- ترتيب الفئران للوصول عندما تكون حوالي 90 يوما القديمة ويضم واحد في أقفاص الجرذان القياسية.
ملاحظة: الإسكان واحد ينصح، كما تنتج مجموعة الإسكان تقلب نتيجة للتفاعلات بين الحيوانات في قفص المنزل، لا سيما في أعقاب التعرض للإجهاد. وقد تجلى سفل في الفئران الذكور والإناث منذ فترة طويلة-إيفانز والفئران "سبراغ داولي"، وفي الفئران صغيرات عمرها 19 يوم7،10. - تعيين الحيوانات عشوائياً إلى شرطين على الأقل: الصدمات (n = 8) ولا صدمة (n = 8) (انظر راو et al. 5 لشروط مراقبة إضافية).
- ترتيب الفئران للوصول عندما تكون حوالي 90 يوما القديمة ويضم واحد في أقفاص الجرذان القياسية.
- الفئران
- ترتيب الفئران للوصول عندما تكون حوالي 60 يوما القديمة ويضم مفرد في أقفاص الماوس القياسية. واحد دار الفئران لمدة 4 أسابيع على الأقل قبل الصدمة وكذلك طوال فترة التجربة.
- تعيين الحيوانات عشوائياً إلى شرطين على الأقل: الصدمات (n = 8) ولا الصدمات (n = 8).
2-معدات الإعداد
- قم بإعداد مجموعة واحدة من دوائر الخوف-تكييف لتكون بمثابة إطار A ومجموعة ثانية من دوائر الخوف-تكييف لتكون بمثابة "إطار ب" (انظر الجدول المواد). ضع كل دائرة الخوف-تكييف داخل حجرة مخففة الصوت لمنع تسلل ضوضاء الخارجية (انظر الجدول المواد).
- ضمان أن أسلوب لإلقاء الضوء على الدوائر مع الضوء المرئي (مثل ضوء بيت أبيض علوية) موجود في الدوائر كسياق أ (انظر الجدول المواد).
- ضمان أن تتوفر حلول مختلفة لتنظيف الدوائر بين كل الحيوانات وتقديم روائح مختلفة لكل دائرة (على سبيل المثال-، وتنظيف الحل و 1% من حمض الخليك المخفف).
ملاحظة: من الأهمية بمكان أن تكون الروائح المولدة بواسطة الحيوان القضاء11. - مكان إدراج بلاستيكية في "سياق ب" التفريق بين تخطيط الداخلية السياقين. ويوصي إدراج ثلاثي زجاجي أسود. وبدلاً من ذلك، استخدم ورقة بيضاء من بلاستيك لإنشاء جدار الخلفي منحنى (انظر الجدول المواد).
- ضع أرضيات الشبكة في كل الخوف تكييف غرفة الولادة فوتشوك واستخدام نمط شبكة مختلفة لكل سياق للتفريق بين مادة الكلمة بين سياقات (انظر الجدول المواد).
ملاحظة: أنماط شبكة متميزة بما فيه الكفاية وتشمل الشبكات مسطحة (كافة أشرطة مرتبة في مستوى أفقي واحد)، متداخلة الشبكات (أشرطة مرتبة في طائرتي الإزاحة الأفقية)، والشبكات (أشرطة مرتبة في مستوى أفقي واحد ولكن متفاوتة بالتناوب أقطار). - ضع كعك معدنية نظيفة تحت كل طابق الشبكة لجمع فضلات. رائحة كعك مع محلول التنظيف (انظر الجدول المواد).
- توفر دقة توقيت والسعة لإيصال فوتشوك لكل سياق.
- توصيل مولد صدمة وجهاز تشويش إذاعي القادرة على إيصال 1 mA أو انخفاض السعة الصدمات لكل طابق الشبكة لإيصال فوتشوك (انظر الجدول المواد).
ملاحظة: مولدات صدمة scramblers ينبغي ويقع خارج الصوت تخفيف غرفة، مع الكابلات التي تربط بمولدات كهربائية وجهاز تشويش إذاعي الطوابق الشبكة عبر فتحات الصوت تخفيف غرفة. سيمنع هذا التلف بسبب مضغ، وتنظيف الحل، إلخ. - استخدام متعدد لاختبار الحالي يجري تسليمها بمولد صدمة بوضع كل مسبار على شريط مختلفة من الكلمة الشبكة وتأكيد أن تنتج السعة الصدمة المطلوبة (انظر الجدول المواد).
- تأكد من طريقة للتحكم في توقيت والسعة من صدمة الولادة (مثلاً، برامج الحاسوب) المتاحة (انظر الجدول المواد).
- توصيل مولد صدمة وجهاز تشويش إذاعي القادرة على إيصال 1 mA أو انخفاض السعة الصدمات لكل طابق الشبكة لإيصال فوتشوك (انظر الجدول المواد).
- تأكد من طريقة لتسجيل فيديو كل الحيوانات خلال كل دورة تجريبية المتاحة (انظر الجدول المواد).
ملاحظة: سيكون من الضروري لتسجيل كل 1) عندما الدوائر هي مضيئة الضوء المرئي و 2) عندما تكون الدوائر الداكنة. ويمكن تحقيق هذا الأخير أما باستخدام كاميرا رؤية ليلة أو منيرا وتسجيل الدوائر الداكنة باستخدام ضوء الأشعة تحت الحمراء أو القريبة من الأشعة تحت الحمراء. - التأكد من أن طريقة مميزة لنقل الحيوانات من فيفاريوم إلى "سياق ب" متوفرة كذلك التفريق في السياقين.
ملاحظة: في حين أساليب مثل حوض بلاستيك أسود (38 × 30 × 24 سم) مقسمة إلى أربع حجرات أو أقفاص فارغة نظيفة استخدمت بنجاح، يمكن استخدام أي خانة النقل الأخرى اختلافاً واضحا من قفص المنزل.
3-سفل الداخلي للفئران والجرذان
- التعامل مع جميع القوارض يوميا بإزالتها من هوميكاجي بلطف وعقد كل من 60-90 ثانية لمدة 7 أيام على الأقل قبل بدء الإجراء سفل.
- في يوم 1 من الإجراء سفل، ضع المواضيع في سياق A، حيث سيتلقون الضغوطات المؤلمة.
- إعداد سياق A مع مجموعة واحدة من الطوابق الشبكة (على سبيل المثال.، شقة الشبكات) وإلقاء الضوء على الدوائر مع الضوء المرئي.
- استخدام متعدد لاختبار الحالي يجري تسليمها بمولد صدمة بوضع كل مسبار على شريط مختلفة من الكلمة الشبكة وتأكيد أن تنتج السعة الصدمة المرجوة.
ملاحظة: يمكن أن يؤدي التلف أو التآكل للحانات في إيصال صدمة ضعيفة أو غير متكافئ. يمكن أن يؤثر السوائل بما في ذلك البول لمس الشبكة على طول الجدار التسليم الصدمة. - مسح أسفل الدائرة الجدران والأبواب والرش المقالي تحت أرضيات الشبكة مع حل واحد (على سبيل المثال.، المخفف تنظيف الحل).
ملاحظة: وهذا ضروري للقضاء على الروائح الكريهة من الحيوانات السابقة. - الحيوانات النقل من فيفاريوم إلى الغرفة التجريبية في اقفاصها المنزل وضعها على العربة ومكان فردياً في الدوائر تكييف الخوف. تجلب سوى أحد جولة في قيمتها للحيوانات (يحددها عدد الخوف تكييف الدوائر) إلى غرفة التجربة في وقت.
ملاحظة: لتجنب يفند سبب ترتيب أو توقيت، وينبغي أن تتضمن كل جولة الحيوانات في كل من الصدمة ولا ظروف الصدمة. - لإجراء التجارب على الفئران، استخدام مولد صدمة وسكرامبليرس لتسليم 15 فوتشوكس 1-s، 1-اماه عشوائياً قدمت أكثر من 90 دقيقة (متوسط ISI = 6 دقيقة) من خلال القضبان شبكة الدوائر التي تحتوي على مواضيع حالة الصدمة. كشف عناصر التحكم الصدمة لا في السياق نفسه لمدة 90 دقيقة دون تسليم صدمة.
- لإجراء التجارب على الماوس، استخدام مولد صدمة وسكرامبليرس لتسليم 10 فوتشوكس ق 1، 1--اماه عشوائياً قدم أكثر من 60 دقيقة (متوسط ISI = 6 دقيقة) عن طريق الأرضيات شبكة الدوائر التي تحتوي على مواضيع حالة الصدمة. كشف عناصر التحكم الصدمة لا في السياق نفسه لمدة 60 دقيقة دون تسليم صدمة.
- بعد 90 دقيقة (فأر تجارب) أو 60 دقيقة (تجارب الماوس)، عودة جميع الحيوانات إلى ما هوميكاجيس والعودة فورا إلى فيفاريوم.
- في يوم 2 من الإجراء سفل، تقييم الخوف إلى سياق الصدمة إذا رغبت في ذلك.
- قم بإعداد سياق A كما فعل في يوم 1.
- نقل الحيوانات إلى غرفة التجربة في اقفاصها المنزل كما في يوم 1.
- مكان الحيوانات في سياق A لمدة 8 دقائق دون تسليم صدمة والفيديو تسجيل السلوك خلال الدورة بكاملها.
- بعد 8 دقائق، عودة جميع الحيوانات إلى ما هوميكاجيس والعودة فورا إلى فيفاريوم.
- في يوم 3 من الإجراء سفل، تعرض جميع المواضيع للضغوطات معتدل في "سياق B"
ملاحظة: هذا الإجراء يمكن أن تحدث في أي مكان من 24 ساعة لمدة 90 يوما بعد الضغوطات المؤلمة9.- إقامة "ب سياق" مع مجموعة مختلفة من الشبكة أرضيات من تلك التي استخدمت في سياق A (علىمثل التناوب أو متداخلة أرضيات الشبكة) وأسود أبيض أو الثلاثي منحنى إدراجات زجاجي. لم يضيء الدوائر مع الضوء المرئي؛ على الرغم من ذلك، يمكن استخدام ضوء الأشعة تحت الحمراء أو القريبة من الأشعة تحت الحمراء عند الاقتضاء.
- استخدام متعدد لاختبار الحالي يجري تسليمها بمولد صدمة بوضع كل مسبار على شريط مختلفة من الكلمة الشبكة وتأكيد أن تنتج السعة الصدمة المرجوة. استخدام متعدد لاختبار الحالي يجري تسليمها بمولد صدمة بوضع كل مسبار على شريط مختلفة من الكلمة الشبكة وتأكيد أن تنتج السعة الصدمة المرجوة.
ملاحظة: يمكن أن يؤدي التلف أو التآكل للحانات في إيصال صدمة ضعيفة أو غير متكافئ. يمكن أن يؤثر السوائل بما في ذلك البول لمس الشبكة على طول الجدار التسليم الصدمة. - مسح أسفل الدوائر والرش المقالي تحت أرضيات الشبكة مع الحل لا تستخدم في سياق A (على سبيل المثال-، حمض الخليك 1%).
- الحيوانات النقل من فيفاريوم إلى الغرفة التجريبية بأسلوب يختلف عن الأسلوب المستخدمة لسياق (مثل حوض بلاستيك أسود) ووضعها على حدة في الخوف تكييف الدوائر. تحقيق واحد فقط بقيمة للجولة الحيوانات في غرفة التجربة في وقت واحد (يحددها عدد الخوف تكييف الدوائر).
- تعرض جميع الحيوانات بالضغوطات خفيفة (الموصوفة أدناه) وتسجيل الفيديو تجميد النشاط أثناء الدورة.
- بعد فترة أساس 180-s، تسليم فوتشوك واحدة 1-s، 1-ماجستير (الفئران) أو فوتشوك واحد 2-s، 1-ماجستير (الفئران) إلى جميع الحيوانات.
ملاحظة: تأكد من أن خلال فترة خط الأساس 180-s تجميد لا ينبغي أن تتجاوز 5%12. - إزالة الحيوانات كل 30 ثانية بعد صدمة الولادة والعودة فورا إلى فيفاريوم.
- بعد فترة أساس 180-s، تسليم فوتشوك واحدة 1-s، 1-ماجستير (الفئران) أو فوتشوك واحد 2-s، 1-ماجستير (الفئران) إلى جميع الحيوانات.
- في يوم 4 من الإجراء سفل، اختبار الخوف إلى سياق الضغوطات معتدل.
- إقامة "ب سياق" كما فعل في يوم 3.
- نقل الحيوانات من فيفاريوم إلى الغرفة التجريبية في نفس عملية نقل كما فعل في يوم 3.
- ضع الحيوانات في "سياق ب" لمدة 8 دقائق دون محضر التسليم والفيديو صدمة تجميد طوال الدورة.
- إزالة جميع الحيوانات بعد 8 دقائق والعودة فورا إلى فيفاريوم.
4. تحليل البيانات
- قياس الخوف أثناء الدورات التجريبية المسجلة باستخدام التجميد، والمعرفة كانعدام الحركة كل ما عدا ذلك مما يلزم للتنفس.
ملاحظة: تجميد حققها الأكثر دقة هداف الإنسان أعمى، ولكن هناك العديد من البرامج الآلية التي تؤدي بشكل جيد. ومع ذلك، يجب معايرة جميع النظم الآلية لأحد مراقبي بشرية أن تكون دقيقة13.- نقاط التجميد باليد، ومجرب أعمى للظروف التجريبية يلاحظ هذا الموضوع كل 4 ثوان طوال الفترة الزمنية لفائدة3. في كل ملاحظة، تصنيف هذا الموضوع ك "التجميد" أو "عدم التجميد". مقارنة العدد من الملاحظات التجميد إلى العدد الإجمالي للملاحظات لتحديد نسبة الوقت الذي يقضيه التجميد.
- باستخدام تحليل أشرطة الفيديو الآلي لنقاط التجميد، أولاً التحقق من تطابق النتائج من تحليل أشرطة الفيديو الآلي النتائج التي تم الحصول عليها من ناحية التهديف، حسب درجة تجميد تختلف اختلافاً كبيرا من التحليل الآلي قد يؤدي إلى نتائج غير دقيقة.
ملاحظة: الفئران أو ماوس قد صدم ابدأ ينبغي إظهار تجميد بين صفر و 5 في المائة، بينما القيم الأعلى تشير إلى سوء معايرة المعدات
- استخدام الأساليب المذكورة أعلاه لقياس الخوف خلال الفترات الزمنية للفائدة (الموصوفة أدناه).
- قياس الخوف إلى سياق الصدمات كنسبة الوقت الذي يقضيه تجميد عبر الدورة اختبار كامل 8-دقيقة في اليوم 2.
- قياس تعميم الخوف من سياق الصدمة إلى سياق الضغوطات معتدل كنسبة الوقت الذي يقضيه تجميد خلال فترة الأساس 3-دقيقة في "سياق ب" 3 يوم قبل الولادة صدمة.
ملاحظة: سفل، من المهم التفريق بين السياقات جيدا بما يكفي حتى أنه لا يوجد تعميم كبيرة. - قياس الخوف مباشرة بعد الصدمة في يوم 3 كنسبة الوقت الذي يقضيه تجميد خلال الفترة 30-s الذي يلي الصدمة.
- قياس الخوف إلى سياق الضغوطات معتدل كالوقت المستنفد في المائة عبر الدورة اختبار كامل 8-مين في يوم 4.
- قياس مفاعليه صدمة بالمبلغ أو بسرعة، الحركة خلال الفترة 3-s أثناء ومباشرة بعد الصدمة في يوم 3.
ملاحظة: ينصح ANOVAs لجميع بيانات التحليل، كمجموعات إضافية (على سبيل المثال-، المخدرات العلاج) يمكن إضافتها حسب الضرورة.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
وتظهر نتائج الاختبار سياق الصدمة في اليوم 2 في الشكل 1. الحيوانات في حالة الصدمة وأظهرت مستويات أعلى بكثير من التجمد في سياق A مقارنة بأي ضوابط الصدمات، التي تشير إلى اكتساب الخوف إلى سياق الصدمة [الفئران: F(1,17) = 23.58، ف < 0.01؛ والفئران: F(1,14) = 666.50، ف < 0.0001]. تجميد خلال فترة خط الأساس قبل صدمة واحدة في سياق الرواية في يوم 3 ويرد في الشكل 2. الصدمة ولا صدمة الحيوانات أظهرت مستويات تجميد الحد الأدنى التي لم تختلف عن بعضها البعض [الفئران: F(1,17) = 3.14, p > 0.05؛ والفئران: F(1,14) = 1.70، p > 0.05]. وهذا يدل على أن السياقات A و B كانت متميزة بما فيه الكفاية أن الحيوانات الصدمة لا التعميم من سياق الصدمة إلى سياق الرواية. ويبين الشكل 3مفاعليه إلى صدمة واحدة في يوم 3. الحيوانات الصدمة أظهرت مفاعليه الصدمة أقل مقارنة أي ضوابط الصدمة [الفئران: F(1,17) = 3.59، ف = 0.07؛ الفئران: F(1,14) = 6.53، ف < 0.05]. يشير هذا إلى أن التعلم المعزز الخوف لوحظ في الحيوانات الصدمة ليس بسبب زيادة الاستجابة للصدمة. ويرد في الشكل 4تجميد خلال فترة 30-s مباشرة بعد صدمة واحدة في يوم 3. الحيوانات الصدمة أظهرت تجميد أكبر مقارنة لا صدمات الضوابط، والتي تشير إلى أن التعرض للضغوطات المؤلمة زاد الخوف فور الضغوطات معتدل [الفئران: F(1,17) = 7.29، ف < 0.05؛ والفئران: F(1,14) = 6.10، ف < 0.05]. اختبار حاسم لنموذج سفل هو اختبار السياق في يوم 4 (الشكل 5). أثناء هذا الاختبار، أظهرت الحيوانات الصدمة تجميد أعلى بكثير مقارنة لا صدمة الضوابط، وتشير إلى أن التعرض للضغوطات المؤلمة التي عززت الخوف من تعلم الضغوطات معتدل لاحقة [الفئران: F(1,17) = 14.06، ف < 0.01؛ الفئران: F(1,14) = 12.05، ف < 0.01].
رقم 1: تجميد في سياق A في اليوم 2- (أ) الفئران في حالة الصدمة أظهرت أعلى تجميد من الفئران في حالة صدمة لا (ف < 0.01). (ب) الفئران في حالة الصدمة أظهرت أعلى تجميد من الفئران في حالة صدمة لا (ف < 0.0001). أشرطة الخطأ تمثل الأخطاء المعيارية. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
رقم 2: خط أساس التجميد في "سياق ب" في يوم 3- (أ) الفئران في الصدمة ولا صدمة ظروف عرضت تجميد منخفضة ولم تكن تختلف كثيرا عن بعضها البعض خلال فترة خط الأساس قبل الصدمة 1 (p > 0.05). (ب) الفئران في كل من الصدمة ولا ظروف الصدمة عرضت تجميد منخفضة ولم تكن تختلف كثيرا عن بعضها البعض خلال فترة خط الأساس قبل الصدمة 1 (p > 0.05). أشرطة الخطأ تمثل الأخطاء المعيارية. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
الشكل 3: الصدمات إنقاص مفاعليه صدمة في يوم 3- (أ) الفئران في حالة الصدمة أظهرت اتجاها نحو انخفاض حركة أثناء ومباشرة بعد صدمة واحدة مقارنة بالفئران في حالة صدمة لا (ف = 0.07). (ب) الفئران في حالة الصدمة أظهرت انخفاض حركة أثناء ومباشرة بعد صدمة واحد بالمقارنة مع الفئران في حالة صدمة لا (ف < 0.05). أشرطة الخطأ تمثل الأخطاء المعيارية. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
الشكل 4: تنتج الصدمة تجميد المعزز مباشرة بعد صدمة واحدة في يوم 3- (أ) الفئران في حالة الصدمة أظهرت زيادة تجميد أي من مجموعات الصدمات (ف < 0.05) بالمقارنة. (ب) الفئران في حالة الصدمة أظهرت زيادة كبيرة تجميد أي من مجموعات الصدمات (ف < 0.05) بالمقارنة. أشرطة الخطأ تمثل الأخطاء المعيارية. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
الرقم 5: تنتج الصدمة تجميد المعزز في "سياق ب" في يوم 4- (أ) الفئران في حالة الصدمة أظهرت زيادة تجميد أي من مجموعات الصدمات (ف < 0.01) بالمقارنة. (ب) الفئران في حالة الصدمة أظهرت زيادة كبيرة تجميد أي من مجموعات الصدمات (ف < 0.01) بالمقارنة. أشرطة الخطأ تمثل الأخطاء المعيارية. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
سفل هو نموذج سلوكية قوية من الاضطرابات التي يمكن أن تكون لخص في الجرذان والفئران ويمكن استخدامها لدراسة استجابات الخوف توعية التي تميز اضطراب ما بعد الصدمة. بعد الصدمة، إظهار القوارض استجابة خوف المتزايد في سياق مختلف اختلافاً واضحا إلا بعد ذلك السياق هو يقترن الضغوطات معتدل بمثابة تذكرة بتجربة الصدمة السابقة. بعد الصدمة تظهر القوارض لا غرابة في مستويات عالية من الخوف عندما عاد إلى سياق الصدمة في اليوم 2، مما يشير إلى أن الذاكرة للصدمة سليمة (الشكل 1). ومع ذلك، أنها تظهر تعميم الخوف الحد الأدنى من سياق الصدمة إلى سياق رواية، كما هو مبين بتجميد الحد الأدنى خلال فترة خط الأساس 3-دقيقة في اليوم 3 (الشكل 2). وهذا يشير إلى أن أي تعزيز التعلم في هذا السياق رواية ليست ببساطة بسبب التعميم من سياق الصدمة. وعلاوة على ذلك، لا تظهر الحيوانات تتعرض للضغوطات المؤلمة مفاعليه زيادة لصدمة واحدة في اليوم 3 (الشكل 3)، مشيراً إلى أن تعزيز التعلم هو ينظر ليس بسبب صدمة واحدة كما يلي أكثر إيلاما السابقة التعرض لصدمة. نقديا، الحيوانات المعرضة للضغوطات المؤلمة تظهر زيادة تجميد كل فورا بعد صدمة واحدة في اليوم 3 (الشكل 4) وعندما عاد إلى سياق صدمة واحدة يوم 4 (الشكل 5)، التي تشير إلى استجابة خوف المحسن .
كما أظهرت التجارب السابقة أن سفل تنتج القلق مثل تعزيز النمط الظاهري، كما يتبين من الاستكشاف انخفضت خلال اختبار حقل مفتوح8. آثار هذا الإجراء سفل أظهرت أن تكون دائمة، مستمرة لمدة 90 يوما على الأقل بعد الصدمات، وكذلك إنشاء القوة من طراز5. ومن ثم سفل أداة قيمة لاستكشاف الآليات البيولوجية للاضطراب.
من المهم أن نلاحظ أن سفل ليست مجرد نتيجة لتعميم الخوف أو خوف زيادة التعبير، منذ تجربة مؤلمة يجب أن تسبق الضغوطات معتدل لزيادة خوف سياق يقترن الضغوطات معتدل5. وهذا يحول دون تفسير سفل مشتقة من تعبير الخوف المحسنة. وبالإضافة إلى ذلك، لا يمكن تفسير سفل حسب تعميم خوف من سياق الصدمة إلى سياق رواية نظراً للنتائج السابقة تبين أن انقراض خوف ذكرى مؤلمة لا تخفف من سفل5،14. كما هو من السمات مميزة للاضطراب المقاومة للانقراض (في شكل العلاج التعرض)، وهذا يعزز الصلة بين سفل والاضطراب15. أيضا، ترك التلاعبات التي تنتج فقدان الذاكرة لتكييف الخوف إلى سياق الصدمة سفل يتأثر، كما تشير إلى أن سفل ليس بسبب الخوف التعميم5،10. أخيرا، حين ندرس عادة التعلم المعزز من الخوف السياقية، يعزز الضغط صدمة أونسيجناليد أيضا تكييف الخوف السمعية. تشير هذه النتائج إلى أن سفل شكل من أشكال التوعية مستقرة في الخوف من تعلم الدوائر.
بينما سفل نموذج بسيط في التصميم، جوانب البروتوكول بحاجة إلى أن تلتزم بدقة لنتائج متسقة. على سبيل المثال، الباحثين ينبغي أخذ الحيطة والحذر استخدام أساليب مختلفة جداً من النقل للسياق A و B السياق للحد من التعميم خط الأساس. يمكن أن يؤدي عدم تسديد سياقات A و B مختلفة بما فيه الكفاية أيضا مستويات عالية من التعميم من سياق أ إلى "ب السياق" قبل الصدمة وتعقيد تفسير للنتائج. هناك عامل آخر ينبغي أن تؤخذ أيضا في الاعتبار الوقت الذي تبقى الحيوانات في "سياق ب" بعد صدمة واحدة. فشل إزالة الحيوانات من السياق بعد وقت قصير من صدمة واحدة يمكن أن تنتج انقراض خوف إلى "ب السياق"، مما أدى إلى تناقص تجميد أثناء اختبار السياق اللاحق.
الإجراء سفل يمكن تكييفها للأنواع المتعددة، كما تجلى في قدرته على إنتاج النمط الظاهري الخوف توعية في كل من الفئران والجرذان. من المهم ملاحظة الاختلافات الطفيفة في البروتوكول بين الفئران والجرذان؛ على سبيل المثال، تتطلب الفئران من الضغوطات خفيفة قليلاً أكثر كثافة (2-s صدمة مقارنة بصدمة 1-s في الفئران). وهذا ضروري لحساب لحقيقة أن الفئران تظهر بصورة عامة أقل مستوى التجميد الفئران (انظر الشكل 5). وعلاوة على ذلك، من المهم أن نلاحظ أن هذه البروتوكولات قد وضعت أساسا منذ فترة طويلة-إيفانز الفئران والجرذان C57Bl/6. حين متانة هذا الإجراء يشير إلى أن يمكن تكييفها لسلالات مختلفة من الفئران والجرذان، من المهم النظر في الاختلافات السلوكية بين السلالات. على سبيل المثال، الفئران ديسيبل/2 إظهار تكييف الخوف انخفضت مقارنة بالفئران C57Bl/6، وقد يتطلب ذلك تدريب أقوى بروتوكول16. في المقابل، الفئران سبراغ داولي تميل إلى إظهار مستوى التجميد أعلى من الفئران إيفانز منذ فترة طويلة وقد يتطلب بروتوكول تدريب أضعف لمنع آثار السقف17. ونحن نوصي التلاعب الحالي بين 0.5 و 1.5 درجة الماجستير، كما أنها وسيلة فعالة جداً لقوة تكييف تيتراتي.
وفي الختام، ينتج الإجراء سفل التحسينات السلوكية موثوق وطويل الأمد في التعلم الخوف الذي يلتقط استجابات الخوف المتزايد لوحظ في المرضى الذين يعانون من اضطرابات ما بعد الصدمة. سفل يغير أيضا تدابير أخرى للقلق بما في ذلك انخفاض السلوك الاستكشافي في اختبار حقل مفتوح ومفاعليه potentiated جفل، والتعبير مستقبلات جلوكوكورتيكويد زيادة في بلوخ8. ومن ثم، سفل يمكن أن تكون أداة قوية لفهم جوانب معينة من هذا النمط الظاهري الاضطراب.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
الدكتور فانسيلوو عضو مجلس إدارة المؤسسة في "مختبرات نيوروفيشن".
Acknowledgments
تم تمويل هذا العمل من الوطني معهد للصحة R01AA026530 (أطباء بلا حدود)، مركز ستاجلين للدماغ والسلوكية الصحية (أطباء بلا حدود)، والفيدرالية-F32 MH10721201A1 ونارساد 26612 (عكر) وتايين جبهة الخلاص الوطني-1650604 (سان جرمان).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Fear Conditioning Chamber for Low Profile Floors | Med Associates Inc. | VFC-008-LP | Fear conditioning chamber |
| Sound Attenuating Cubicle | Med Associates Inc. | NIR-022SD | Sound-attentuaing cubicle to prevent intrusion of outside noise |
| NIR/White Light Control Box | Med Associates Inc. | NIR-100VR | Light control box capable of delivering white and near-infrared light |
| NIR VFC Light Box | Med Associates Inc. | NIR-100L2 | White overhead houselight |
| Windex Original Glass Cleaner | Windex | Solution for cleaning and scenting fear conditioning chambers between animals | |
| Acetic acid | Fisher Scientific | A38-212 | Solution for cleaning and scenting fear conditioning chambers between animals |
| A-Frame Chamber Insert | Med Associates Inc. | ENV-008-IRT | Black Plexiglas triangular insert to differentiate internal layout of Contexts A and B |
| Curved Wall Insert | Med Associates Inc. | VFC-008-CWI | White plastic sheet to differentiate internal layout of Contexts A and B |
| Low Profile Contextual Grid Floor with 1/8" Grid Rods for Mouse | Med Associates Inc. | VFC-005A | Flat grid floor for mice |
| Low Profile Contextual Grid Floor with Alternating 1/8" & 3/16" Grid Rods Mouse | Med Associates Inc. | VFC-005-S | Staggered grid floor for mice |
| Low Profile Contextual Grid Floor with 1/8" Staggered Grid Rods for Mouse | Med Associates Inc. | VFC-005A-L | Alternating grid floor for mice |
| Low Profile Contextual Grid Floor with 3/16" Grid Rods for Rat | Med Associates Inc. | VFC-005 | Flat grid floor for rats |
| Low Profile Contextual Grid Floor with Alternating 3/16" & 3/8" Grid Rods | Med Associates Inc. | VFC-005-L | Alternating grid floor for rats |
| Low Profile Contextual Grid Floor with 3/16" Staggered Grid Rods for Rat | Med Associates Inc. | VFC-005-S | Staggered grid floor for rats |
| Metal pans | Med Associates Inc. | Metal pans to catch droppings underneath grid floors | |
| Standalone Aversive Stimulator/Scrambler | Med Associates Inc. | ENV-414S | Shock generator and scrambler for footshock delivery |
| Multimeter | Fluke | 87-5 | Tool for measuring footshock amplitude |
| VideoFreeze Software | Med Associates Inc. | SOF-843 | VideoFreeze software for controlling shock delivery |
| High Speed Firewire Monochrome Video Camera | Med Associates Inc. | VID-CAM-MONO-4 | Video camera capable of recording in near-infrared light |
References
- Bremner, J. D., Krystal, J. H., Southwick, S. M., Charney, D. S. Functional neuroanatomical correlates of the effects of stress on memory. Journal of Traumatic Stress. 8 (4), 527-553 (1995).
- Dykman, R. A., Ackerman, P. T., Newton, J. E. Posttraumatic stress disorder: a sensitization reaction. Integrative Physiological and Behavioral Science. 32 (1), 9-18 (1997).
- Fanselow, M. S., Bolles, R. C. Naloxone and shock-elicited freezing in the rat. Journal of Comparative and Physiological Psychology. 93 (4), 736-744 (1979).
- Fanselow, M. S. What is Conditioned Fear? Trends in Neurosciences. 7, 460-462 (1984).
- Rau, V., DeCola, J. P., Fanselow, M. S. Stress-induced enhancement of fear learning: an animal model of posttraumatic stress disorder. Neuroscience and Biobehavioral Reviews. 29 (8), 1207-1223 (2005).
- Perusini, J. N., Fanselow, M. S. Neurobehavioral perspectives on the distinction between fear and anxiety. Learning and Memory. 22 (9), 417-425 (2015).
- Poulos, A. M., et al. Sensitization of fear learning to mild unconditional stimuli in male and female rats. Behavioral Neuroscience. 129 (1), 62-67 (2015).
- Perusini, J. N., et al. Induction and Expression of Fear Sensitization Caused by Acute Traumatic Stress. Neuropsychopharmacology. 41 (1), 45-57 (2016).
- Rau, V., Fanselow, M. S. Exposure to a stressor produces a long lasting enhancement of fear learning in rats. Stress. 12 (2), 125-133 (2009).
- Poulos, A. M., et al. Amnesia for early life stress does not preclude the adult development of posttraumatic stress disorder symptoms in rats. Biological Psychiatry. 76 (4), 306-314 (2014).
- Fanselow, M. S., Sigmundi, R. A. Species-specific danger signals, endogenous opioid analgesia, and defensive behavior. Journal of Experimental Psychology: Animal Behavior Processes. 12 (3), 301-309 (1986).
- Jacobs, N. S., Cushman, J. D., Fanselow, M. S. The accurate measurement of fear memory in Pavlovian conditioning: Resolving the baseline issue. Journal of Neuroscience Methods. 190 (2), 235-239 (2010).
- Anagnostaras, S. G., et al. Automated assessment of pavlovian conditioned freezing and shock reactivity in mice using the video freeze system. Frontiers in Behavioral Neuroscience. , (2010).
- Long, V. A., Fanselow, M. S. Stress-enhanced fear learning in rats is resistant to the effects of immediate massed extinction. Stress. 15 (6), 627-636 (2012).
- Craske, M. G., et al. Optimizing inhibitory learning during exposure therapy. Behaviour Research and Therapy. 46 (1), 5-27 (2008).
- Paylor, R., Tracy, R., Wehner, J., Rudy, J. W. DBA/2 and C57BL/6 mice differ in contextual fear but not auditory fear conditioning. Behavioral Neuroscience. 108 (4), 810-817 (1994).
- Graham, L. K., et al. Strain and sex differences in fear conditioning: 22 kHz ultrasonic vocalizations and freezing in rats. Pyschology and Neuroscience. 2 (2), 219-225 (2009).
