Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Biochemistry

חלבון אנאירובית טיהור וניתוח קינטי באמצעות אלקטרודה חמצן ללמוד DesB Dioxygenase פעילות וניגוד

doi: 10.3791/58307 Published: October 3, 2018

Summary

כאן אנו מציגים עבור טיהור חלבון אנאירובית, ריכוז חלבון אנאירובית, ואפיון עוקבות קינטי משתמש במערכת אלקטרודה חמצן פרוטוקול. השיטה מומחש באמצעות האנזים DesB, אנזים dioxygenase אשר פעיל כאשר מטוהרים ומאוחסנים בסביבה אנאירובית ויציבה יותר.

Abstract

חלבונים חמצן רגישים, כולל לאנזימים אשר מנצלים חמצן כמו מצע, יכול הפחיתו יציבות כאשר מטוהר בשיטות מסורתיות טיהור אירובי. כתב יד זה ממחיש את הפרטים הטכניים מעורב בתהליך טיהור אנאירובית, כולל הכנת מאגרי, ריאגנטים, השיטות עבור עמודה כרומטוגרפיה תא הכפפות, וכן את desalting של החלבון לפני קינטיקה. גם המתוארים הם השיטות להכנה של באמצעות אלקטרודה חמצן כדי לבצע אפיון קינטי של אנזים ניצול חמצן. שיטות אלו מומחשים באמצעות האנזים dioxygenase DesB, dioxygenase מספר של החיידק Sphingobium sp. זן SYK-6.

Introduction

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

אנזימים לנצל ברזל או מתכות אחרות להפעלת חמצן רגישים לעיתים קרובות איון במהלך תהליך טיהור בגלל הוצאתם מן הסביבה תוך צמצום של תא. לכן, חלבונים אלה חייב לשמש תא lysates, יהיה נתון חיצוני צמצום סוכנים או להיטהר anaerobically כדי להבטיח כי יש להם פעילות אנזימטי אופטימלית1,2,3,4. עבור אלו אנזימים הנמצאים חמצן-רגיש (במיוחד ברזל המכיל אנזימים), ביצוע כל הפעולות לטיהור ואפיון תוך שמירה על תנאים אנאירוביים יש צורך לאפיין אותם באופן מלא. זה הוביל החוקרים לפתח המעבדה כולה set-ups בתחומיו של צ'יימברס אנאירובית ללימודים החל ביטוי חלבון באמצעות קריסטלוגרפיה5,6,7,8 .

במסמך זה, אנו מדווחים על שיטות טיהור אנאירובית ואפיון קינטי של האנזים DesB באמצעות מערכת אלקטרודה חמצן. DesB הוא dioxygenase מספר של החיידק Sphingobium sp. זן SYK-6 הקשורה ל- LigAB, dioxygenase protocatecuate מן האורגניזם באותו. שני אנזימים שייך סוג II protocatechuate dioxygenase (PCAD) superfamily אשר לא בהרחבה נחקרה עד תאריך9, ככל הנראה באופן חלקי בגלל אנזימים של זה superfamily להיות רגישים איון כאשר מטוהר באמצעות תקן אירובי שיטות טיהור חלבונים. מאז חלק אנזימים PCAD להציג את המצע הפקרות ואילו אחרים הם ספציפיים המצע2,10, נוספות אפיון superfamily הזה יש צורך לזהות גורמים ירידה לפרטים. כפי נצפתה מספר אנזימים superfamilies11,12,13,14,15, מולקולות קטנות יכול לשנות את הפעילות באמצעות עיכוב תחרותי ישירה או עקידת מולקולות להפרדה הכיסים allosteric אשר גורמת לעלייה או לירידה בפעילות אנזימטי16. בעוד קינטיקה לבד לא יכול להבדיל בין המיקום מחייב של אפנן, הקובע שסדר הגודל של שינוי פעילות חשוב להבנת ההשפעות. בתור שכזה, שיטות אפיון קינטי של פעילות DesB מקורי, פעילותה בנוכחות 4-nitrocatechol (4NC), תרכובת נפוץ כדי לאפיין ומעכבות dioxygenase אנזימים2,17, 18, מוצגים.

DesB הוא מסוגל לשבור את מספר, ליגנין-derived ארומטי במתחם, דרך לתגובה dioxygenase (אדו) extradiol בטבעת אשר הוא פתיחת מזורז באמצעות חמצן כאחת סובסטרטים10,19. כזאתי אנזימטי מתרחשת בתוך ההקשר של פירוק של ליגנין, heteropolymer ארומטי נמצאו דופן התא בצמחים. יכול להיות depolymerized ליגנין, מניב מגוון של תרכובות ארומטיות אשר ניתן עוד יותר לפרק לתוך מטבוליטים המרכזי3,20,21,22,23,24 ,25,26,27,28,29,30,31,32,33 . Extradiol dioxygenases (אדו) לעודד טבעת פתיחת התגובה על תרכובות ארומטיות dihydroxylated, שבו המחשוף מתרחשת בסמוך diol בתיאום מתכת; לעומת זאת, intradiol dioxygenases קליב תרכובות ארומטיות מקביל בין שתי הקבוצות הידרוקסיל (איור 1). EDOs, כמו metalloenzymes רבים אחרים, יש מרכז מתכת כלט Fe(II) תיאום מורכב של היסטידין שתיים, אחת-carboxylate שילוש9,34,35. אלה metalloenzymes להיות מחומצן, דרך autoxidation או מבוסס על מנגנון איון, ואילו האנזים מעובד אינו פעיל2,36,37,38.

בפרוצדורות ניסיוני תיאר כתב יד זה, אנו מנצלים DesB, חבר superfamily PCAD מן sp. Sphingobium החיידק SYK-6, כדי לעודד התוספת של חמצן על-פני הקשר C4-C5 של מספר (איור 2 א). Regiochemistry של פצילות הזה הוא מקביל LigAB, שהוא protocatechuate-4, 5-dioxygenase (איור 2B). עד כה, חקירות של dioxygenase מספר זה כוללות אין דיווחים על תרכובות המעכבות DesB10,19,39. עם השימוש של שיטות לטיהור אירובי, DesB הציג פעילות משתנה, בעוד עם השימוש בשיטות אנאירובית הצלחנו לקבל באופן עקבי את החלבון עם פעילות לשחזור. המחקרים קינטי המתוארים כאן מלמדים שיטות טיהור אנאירובית של DesB, אפיון קינטי של התגובה של DesB עם מספר, עיכוב של DesB על ידי 4-nitrocatechol (4NC).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

1. כללי חומרים ושיטות

  1. להכין בכל אמצעי התקשורת הדרושים כמתואר בטבלה 1. אוטוקלב-120 הלעפה תרוטרפמט במשך 15 דקות סטרילי לסנן את הפתרון SOC, לאחר התוספת של MgCl2 , גלוקוז, על ידי העברתו דרך מסנן 0.2 µm. להתאים את ה-pH של הטוחן פתרון מרק Lysogeny (מדיה ליברות) לפני autoclaving. תוספת הפתרון מדיה LB-Amp לאחר autoclaving עם פתרונות סטרילי של 0.2 מ מ L-ציסטאין, ואז 0.1 מ מ ברזלי אמוניום סולפט כדי לשפר את ביטוי חלבון, המסיסות.
  2. להכין את מאגר Laemmli ואת מאגר פועלת לזיהוי בג'ל (עמוד) כפי שמתואר בטבלה 2. התאם את רמת החומציות של הפתרונות (באמצעות 1 M HCl, טריס בסיס להכנת מאגר) לפני דילול הרכיבים לאמצעי אחסון הסופי שלהם.
  3. להכין את מאגרי החלבון טיהור כמפורט בטבלה3. התאם את רמת החומציות של הפתרונות (באמצעות 1 M HCl, טריס בסיס להכנת מאגר) לפני דילול הרכיבים לאמצעי אחסון הסופי שלהם.
  4. המאגרים מוכן להעביר בקבוק לפרטיים, עם פקק גומי חור אחד ומכיל שפופרת זכוכית.
    1. השתמש צינור כדי לחבר את צינור זכוכית הפקק למקור ואקום. לאפשר את הפתרון דגה בלחץ שלילי כ 30 דקות תוך כדי ערבוב במהירות בינונית.
    2. לשבור את הואקום חותם ראשון, ואז לבטל את שואב האבק. בשלב הבא, לחדור דרך פקק הגומי עם שתי מחטים 20 גרם (אחד זה מספיק זמן להגיע לתחתית הבקבוק, מחט קצרה אחת יכול לשמש כצינור אוורור לברוח גז). בועה של זרימה קבועה של חנקן תוך כדי ערבוב במהירות בינונית במשך 30 דקות.
    3. הסר את המחטים וחזור את degassing ואת מבעבע בחנקן עבור סכום של שלושה מחזורים. בסיום, כראוי חותם את הבקבוק עם פקק גומי מוצק. בהמשך לאבטח את הפקק עם הסרט פרפין, חוטי נחושת (20 גרם), למקם אותם לתוך בתא הכפפות.
      הערה: כל החומרים ימוקם בתא הכפפות, נתון 3 מחזורים של מנקה את יודע, ואחריו לשאוב החוצה החמצן ואת מילוי זה עם חנקן. מאגרים המשמשים לטיהור ריכוז יכול להיות כתרים, מאוחסנים בתא הכפפות ללא הגבלת זמן.
  5. להכין את הפתרון dithionate של נתרן על ידי המסת כ אחד מרית (0.31 "x 2", סוף יציקה צמצום מיקרו-נירוסטה מרית קטנה יותר) מלא dithionate נתרן בכ-1 מ ל מים degassed בשפופרת microcentrifuge 1.5 mL . חותם את הצינור עם הסרט פרפין לפני הסרת מתא הכפפות.
    הערה: חנות dithionate נתרן מוצק בתא הכפפות כדי למנוע חמצון.

2. הכנה של העמודה עמילוז חלבון טיהור

  1. להפוך של slurry מ שרף עמילוז בריכוז גבוה (15 מ ל) בשילוב עם עמודה 5 כרכים (75 מ ל) עמילוז עמודה המאגר. להעביר את slurry שרף לתוך שני בקבוקים סרום 50 מ ל, לאטום כל בקבוק עם מחיצת גומי. ניקוב של 20 גרם, 305 מ מ המחט דרך septa, בועות חנקן לתוך slurry כדקה בערך להסיר את החמצן ההשעיה. להעביר את שרף, פתרון המכילים חלבון לתוך תא הכפפות.
  2. בתא הכפפות, שופכים את השרף לתוך עמודה בורוסיליקט 2 x 30 ס מ מצויד צימוד פשוטה, ומאפשר שרף להסדיר וליצור מיטה ברמה. לנקז את המאגר עמודה, equilibrate את העמודה עם 3 כרכים עמודה (סה כ ~ 30 מ"ל) עמילוז degassed עמודה המאגר באמצעות גז חנקן בלחץ כדי לדחוף את המאגר דרך השרף כ 1 טיפה/s או 5 מ ל/דקה, עד הממיס הוא מעל שרף למיטה.
    הערה: לאחר החלבון הוא eluted (ראה שלב 3.5 להלן), שרף עמודה עמילוז נוצר מחדש על ידי כביסה עם עמודה 1 נפח (10 מ"ל) מים, ולאחר מכן בעמודה 1 נפח של 1% נתרן גופרתי dodecyl (מרחביות), ולבסוף, 3 כרכים עמודה (30 מ ל) מים. שלב זה יכול להסתיים מחוץ תא הכפפות. השרף בעמודה מאוחסן ב 4 ° C ב- 20% אתנול, שניתן ליצור מחדש עד 5 פעמים.

3. חלבון ביטוי וטיהור אנאירובית של DesB

הערה: הגן DesB מסחרית סונתז, נתקל הונחו לתוך pET-15 ב pET-32a, pMAL-c5x וקטורים באמצעות ההגבלה NdeI ו- BamHI שיבוט אתרים.

  1. להשלים את מבחני ביטוי חלבון בהתאם להנחיות היצרן כדי לקבוע את התנאים הנכונים עבור הביטוי בקנה מידה גדול (המתוארות בקצרה להלן).
    1. להפוך את פלסמידים המכילות DesB עשוי מסחרית, כשיר מבחינה כימית e. coli BL21 כדוריות (DE3), על פי הוראות היצרן. בקצרה, להפשיר את התאים על קרח למשך 10 דקות, להוסיף כ 10-50 ng של פלסמיד DNA לתערובת תא, הלם חום התאים ב 42 מעלות צלזיוס במשך 10 s, דגירה אותם על קרח נוספים 5 דק SOC להוסיף מדיה כדי לקבל נפח סופי של 1 מ"ל ולאפשר תאים לרעוד (~ 200 סל ד) ב 37 מעלות צלזיוס למשך 60 דקות. צלחת LB-Amp, להוסיף, להפיץ µL 100 של הפתרון תא ולהעביר דגירה בין לילה ב 37 º C.
    2. בחר יחידה המושבה יוצרי מהצלחת לאחר דגירה לילה והשתמש המושבה לחסן 10 מ"ל של מדיה LB-Amp. לגדל את התאים בן לילה, ייבוש (~ 200 סל ד) ב 37 º C.
    3. 10 מ"ל של מדיה, להוסיף 100 µL של הפתרון צמיחה לילה, לנער את המדיה החדשה כפי שמתואר בשלב 3.1.2 ב 37 º C. כאשר הצפיפות האופטית-600 nm (OD600) היא בין 0.4-0.8, להוסיף איזופרופיל β-D-1-thiogalactopyranoside (IPTG) הפתרון הסופי בריכוז של 1 מ מ.
    4. מיד להסיר את aliquot 1 מ"ל של הפתרון, להעביר אותו צינור microcentrifuge 1.5 mL עם הזמן שכותרתו = 0 שעות. לסובב את הצינור ב 15,000 g x 10 דקות הצניפה התאים. לאחר מסתובבים, להסיר את תגובת שיקוע ולאחסן את התאים ב 4 º C.
    5. הסר aliquots נוספים (1 מ"ל כל) במרווחי זמן לאחר התוספת של IPTG (בדרך כלל 5, 10, 12, 18 ו 24 h). כפי שמתואר בשלב 3.1.4, centrifuge כל שפופרת, decant את תגובת שיקוע, ולאחסן את התאים ב 4 º C.
    6. לאחר כל aliquots מתקבלים, resuspend תאים מן כל timepoint ב 30 µL של חלבון חיידקי החילוץ פתרון, דגירה אותם בטמפרטורת החדר למשך 10-15 דקות, centrifuge הצינורות ב g × 15,000 עבור 5 דקות להפריד את מסיסים ובחלקם לא מסיסים חלבונים.
    7. להעביר את הפתרון חלבון מסיס צינור microcentrifuge, resuspend כדורי לא מסיסים הנותרים עם 30 µL של חלבון חיידקי החילוץ פתרון.
    8. לשלב את µL 30 של כל פתרון (מסיסים וגם לא מסיסים פתרונות עבור כל timepoint) עם אמצעי אחסון שווה מאגר Laemmli, ולאחר מכן באופן חזותי ג'ל מרחביות-עמוד40. בחר את התנאים המתאימים המסלולים המכיל הלהקות בגודל הנכון בהשבר מסיסים עבור טיהור וביטוי חלבונים בקנה מידה גדול.
      הערה: מאז חלבון מסיס מינימלי נוצר בתחילה באמצעות התנאים לעיל, תוספי מזון שונים נוספו כדי לבדוק את ההשפעות על הביטוי חלבון מסיס, ועם 0.2 מ מ L-ציסטאין 0.1 מ מ ברזלי אמוניום סולפט מציג חלבון משופרת ביטוי. מסך זה ביטוי חלבון, וקטור הביטוי המתאים לייצור מסיסים של DesB היה וקטור pMAL-c5x.
  2. בעקבות השינוי לתוך Escherichia coli BL21 (DE3), להכין מלאי של DesB/pMal-c5x על ידי שילוב µL 900 התרבות חיידקי (מבוגר ללילה ברעידות-200 סל ד ו- 37 מעלות צלזיוס) עם 100 µL של 80% גליצרול. אחסן את המניה ב-80 מעלות צלזיוס צינור ההקפאה.
    הערה: ודא חדש קפוא מניות בערך כל 6-8 חודשים.
  3. השתמש טיפ פיפטה לגרד תאים מן המלאי קפואה ולהתחיל תרבות חיידקים הגדלים בין לילה 5 מ ל LB-Amp מדיה ב 37 מעלות צלזיוס ברעידות. לחסן 1.5 ליטר של התקשורת LB-Amp בקבוקון 2 ל' ב 37 ° C ו 200 סל"ד, באמצעות התרבות חיידקי מבוגר בן לילה.
    הערה: עקב רגישות הנצפה של החלבון לחמצן, התברר קראוון מופחתת את הבקבוק, בינוני רועד במהירויות התשואה חלבון משופרת עבור הביטוי בקנה מידה גדול.
  4. זירוז ביטוי חלבון כאשר הצפיפות האופטית-600 nm (OD600) בין 0.4-0.8 עם 1 מ מ IPTG, בתוספת 0.2 מ מ L-ציסטאין ו- 0.1 מ מ ברזלי אמוניום סולפט. להנמיך את הטמפרטורה דגירה עד 30 ° C ומנערים במהירות של 200 סל ד. ספין למטה התאים באמצעות צנטריפוגה לאחר אינדוקציה שלאחר 24 h ב g 4,700 x 10 דקות ולמחוק את התקשורת מבוזבז.
  5. Resuspend בגדר תא ב- 20 מ"ל עמילוז מאגר עמודה לכל כל 1.5 ליטר של צמיחה, ואחריו התוספת של 1 מ ג של ליזוזים. מערבבים במשך 20 דקות על קרח.
    הערה: מאגר נוסף ניתן להוסיף אם הפתרון הוא גם צמיגה, כמו חלבון פתרונות צמיגה יותר מדי עלולות לשבש את הצעד הבא homogenizing.
  6. Lyse הפתרון תא resuspended ויה המגון בלחץ גבוה עם 3-5 עובר בבית כ 15,000 psi. להעביר את החלבון שפופרת צנטרפוגה 50 מ ל ו לרוקן את קראוון עם חנקן עבור 1 דקות. לאחר מכן, centrifuge תא lysate-g x 20,000 עבור 40 דקות לפנות את הפסולת לא מסיסים.
    הערה: homogenizing מוצלחת גורמת החלבון כדי הקזאין הטופס כפי זורם דרך הצינור, לתוך הבקבוק אוסף, הפתרון מופיע בצבע אפור-חום שקוף. שמור את החלבון homogenized על קרח לאורך כל התהליך.
  7. לאחר צנטריפוגה, העברת תגובת שיקוע לתוך צינור 50 מ ל (יותר מאשר אחד עשוי להיות נחוץ), קאפ הצינור עם מחצה גומי, עם מחט 20 גאייג?, לאט בועות גז חנקן דרך הפתרון למשך 2 דקות את מקומו של החמצן. לעטוף מחצה עם פרפין סרט נוסף לאבטח אותו עם חוט הנחושת ו להכניס את תגובת שיקוע הכפפות יחד עם החומרים עמודה.
  8. Equilibrate את העמודה (ראה שלב 2.3) ולטעון את החלבון supernatant אל העמודה. לאסוף את הזרימה דרך בחלקים מ ל תחת חנקן בלחץ בינוני (טיפה 1/שניה או כ 5 mL/min). לאחר מכן, לשטוף את העמודה שימוש באמצעי אחסון אחר עמודה 3 עמילוז עמודה מאגר ולאסוף באופן ידני 3 mL שברים במבחנות זכוכית תחת חנקן בלחץ בינוני (כ 5 mL/min). Elute החלבון באמצעות אחסון עמודה 5 (~ 50 מ"ל) • תנאי מאגר ולאסוף באופן ידני 3 mL שברים בלחץ מתון חנקן (כ 5 mL/min).
    הערה: השברים לחלופין ניתן לאסוף באמצעות סינון הכבידה. צריך לאסוף כ 12 • תנאי שברים.
  9. לאסוף 30 aliquots µL של שברים ולהסיר אותם מתא הכפפות כדי לאפשר את החזיית המכילים חלבון שברים באמצעות ניתוח מרחביות-דף.
    הערה: שברים שנאספו יישארו בתא הכפפות עבור משך הזמן של המבחן הזה. DesB מטוהרים elutes בדרך כלל מן העמודה בחלקים 3 עד 5.

4. אנאירובית חלבון ריכוז/מאגר Exchange

  1. להרכיב את רכז תא מווסת, מנוער עם מסנן ממברנה תאית משוקם 76 מ מ (10 הקיצוץ kDa). להוסיף כמות מספקת של 20% אתנול לתוך במסוע לשמור על קרום רטוב כמו במסוע שהורכב מועברת. תא הכפפות.
    הערה: ודא כי ישנם בלי דמעות ממברנה o-ring הוא לא מקומט.
  2. לאחר הכנסת במסוע מנוער תא הכפפות, לשטוף את הפתרון אתנול את הקרום עם מים. קאפ, לדחוס את התא מנוער לנקות את צינורות ואת קרום של כל המים העודפים.
  3. הוסף כל השברים המכיל חלבון כפי שנקבע על ידי עמודים מרחביות (איור 3) כדי במסוע. להוסיף מאגר exchange מספיק להניב 150 מ ל חלבון הכולל פתרון האחסון.
  4. לחצים תא תא מנוער באמצעות קו חיצוני2 N ותתרכזו החלבון עד 50 מ"ל עם ערבוב במהירות בינונית.
    הערה: להשגת ריכוז של 50 מ ל לוקח כ- 20 דקות.
  5. תוספת 100 מ של מאגר exchange עם 0.1 מ מ dithiothreitol (DTT) ו- 0.1 מ"מ ברזלי אמוניום סולפט, להוסיף את הפתרון לתא מנוער, להתרכז החלבון כדי הנפח הכולל של 50 מ עם ערבוב במהירות בינונית.
  6. לאחר שהתמיסה נפח של 50 מ ל, להוסיף במאגר exchange שהושלם פעם נוספת, אך להתרכז הפתרון הנפח הכולל של 10 מ"ל עם ערבוב במהירות בינונית.
  7. לסנן את חלבון מרוכז באמצעות 0.45 מיקרומטר נקבובית גודל מזרק מסנן aliquot לתוך בודדים 0.2 מ"ל פולימראז תגובת שרשרת (pcr) צינורות (כל אחד המכיל כ 150 µL של הפתרון חלבון). להסיר את aliquots רצ'ט מתא הכפפות ומקפיאים מיד פלאש עם חנקן נוזלי. לאחסן את aliquots ב-80 מעלות צלזיוס.

5. desalting DesB

  1. לרוקן את השקית כפפה עם גז חנקן במשך כ 1.5 שעות לפני השימוש.
  2. להפשיר aliquot 150 µL חלבון מטוהרים DesB בתוך השקית הכפפות, על קרח.
  3. בעוד החלבון מפשירה, להכין את שדה כבידה קטן, desalting עמודה המכילה 3 מ ל ג'ל desalting גס G-25 ספדקס בעמודה בורוסיליקט 9 מ. לשטוף את העמודה עם עמודה 2 כרכים (~ 6 מ"ל) של degassed desalt מאגר.
    הערה: להחליף את הג'ל desalting כאשר יש שינוי בצבע ג'ל לבן לצהוב (לאחר כ 7 משתמשת).
  4. טען את DesB המופשרים אל העמודה באמצעות תהליך הנשלטות על-ידי כוח הכבידה. למחוק את הזרימה דרך. Elute החלבון עם-5 מ של desalting מאגר.
    הערה: הלחץ למיכל הדלק ללא הרף למלא את השק הכפפות תשפיע על הקצב בו הפתרונות לטפטף מן העמודה.
  5. על קביעה ראשונית של חלבון • תנאי מן העמודה, לאסוף את הבקבוקונים 12/elutions (מכיל 3 טיפות לכל מבחנה). אטום עם מחצה גומי, להסיר אותם מן התיק הכפפות ואת בדיקת נוכחות של חלבון גם באופן ישיר (דרך עמוד מרחביות ג'ל ניתוח) או בעקיפין (באמצעות בחינת הפעילות של כל שבר).
    הערה: בדרך כלל, השברים נבדקים באופן אינדיבידואלי לפעילות, כפי שמתואר בשלב 7.1, עם הפעילות הגדולה ביותר התואם השבר עם הריכוז הגדול ביותר של חלבון פעיל. DesB elutes בדרך כלל מתחיל בתיבה הנפתחת השביעית, אחרי אשר נאספים הטיפות 9 הבאים של חלבון desalted. חלבון aliquots מאוחסנים על קרח במהלך המדידות קינטיקה (שלבים 7.1-7.4).

6. הכנת האלקטרודה חמצן

  1. פולנית כביש הטבעת אנודת כסף של הקתודה פלטינה עם אלקטרודה מנקה, מקל צמר גפן לח עד אין סימנים גלויים של הפקדות השחרה.
  2. עם מספריים לחתוך כ 1.5 אינץ ריבוע אחד של נייר מרווח (או נייר מתגלגל סיגריות, אשר עובד באותה מידה גם כן). לאחר מכן, לחתוך משולשים קטנים 1) על כל פניה של הכיכר ושל 2) חרכי אל הפינות כדי לסייע עטיפה של האלקטרודה.
  3. להוסיף 5 טיפות פתרון אשלגן כלורי 50% אל האנודה כסף groove ולחבר אותם כך שהם יוצרים טבעת אחת רציפה של פתרון. להוסיף 2 טיפות של הפתרון אשלגן כלורי 50% לחלק העליון של האלקטרודה פלטינה. הנח את הנייר מרווח על גבי האלקטרודה פלטינה ובזהירות להחליק את הנייר מרווח אז יש אין בועות אוויר.
    הערה: נקוט זהירות כדי למנוע קורע את הנייר מרווח.
  4. חותכים פיסת קרום PTFE (טפלון) 30 מ' S4 הוא כ 2 ס מ ארוך ומניחים אותו על גבי הנייר מרווח. לחתוך את הקצוות של הקרום אז הם מיושרים עם הטבעת החיצונית של האלקטרודה.
  5. באמצעות את המוליך o-ring, תדחוף את o-ring קטן האלקטרודה כדי לאבטח מרווח נייר, קרום על גבי האלקטרודה. מקם את גדול יותר o-ring אל החריץ מעגלית של האלקטרודה, הבטחת שיש אין קרום מתחת לזה. שקופית התא העליון של האלקטרודה על גבי הבסיס ולעזאזל עם השניים יחד.
    הערה: השניים הם מוברג כראוי אם אין מקל בועות אוויר אל צידי החדר.
  6. מקום האלקטרודה שהורכב על בסיסו וחבר האלקטרודה למערכת ניטור. ליזום שתוכנית בקרת אלקטרודה, לכייל את האלקטרודות על-ידי ביצוע פרוטוקול כיול שלב נוזלי (איור 4A). המשתנה הטמפרטורה צריכה להיות הטמפרטורה של החדר שבו מתבצע הניסוי, המשתנה ללחץ הסביבתי הוא תלוי האזור ואת תנאי מזג האוויר הנוכחיים.
    הערה: ללחץ הסביבתי ניתן להשיג דיווח מזג האוויר באזור.
  7. להוסיף 1 מ"ל 25 מ מ טריס מאגר תא אלקטרודה, להוסיף על הבוכנה, להתחיל את הכיול של פתרון רווי חמצן, וכן לכוונן את מהירות בחישה עד 100. לאחר האלקטרודה מייצבת, כיול ערכת-נקודת החמצן רווי פתרון נקבע (איור 4B).
  8. מבלי להסיר את הבוכנה, השתמש מזרק 1 מ"ל ומחט 1.2 x 40 מ מ כדי להזריק כ 1 מ"ל של נתרן dithionite פתרון לתוך החדר, וישתדלו להימנע מהוספת בועות אוויר (איור 4C). השתמש פקק גומי כדי לאטום את התא אלקטרודה מיד לאחר תוספת dithionite סודיום.
  9. לאפשר את הכיול להמשיך החמצן מנוצל עד השלמת התוכנית ולשמור את הכיול (איור 4D). האחות הפתרון מן החדר ולשטוף את הבוכנה ואת קאמרית עם מים יונים 5 - 6 פעמים כדי להבטיח הסרה מלאה של dithionite נתרן. בעת שטיפה, להשתמש צינור פלסטיק מצויד טיפ פיפטה מחובר flask ואקום מהצד של הזרוע. למנוע נזק הקרום.

7. קינטי מבחני באמצעות האלקטרודה חמצן

  1. לזהות את aliquots desalted המכילה חלבון פעיל על-ידי באופן סדרתי בדיקות 1 µL של אנזים פתרון עבור פעילות פתרון מאגר טריס 25 מ מ, עם pH 7.5 ומכילה מספר 100 מיקרומטר. השתמש את aliquot(s) עם הפעילות הגדול ביותר שנצפה על הניסויים הנותרים. (ראה שלב 5.5.1)
  2. לקבוע את הקצב של התגובה אנזימטי על ידי מדידת צריכת2 O שימוש של O2-אלקטרודה קלארק-סוג רגיש עם שילוב המחשב באמצעות יחידת הבקרה אלקטרודה.
    1. עבור כל הנתונים קינטיקה הצבע מדידה של DesB, להוסיף 1 מ"ל 25 מ מ טריס מאגר (pH 7.5) לתא אלקטרודה. להוסיף נפח מחושב של פתרון מניות 25 מ מ של מספר המאגר טריס להשגת ריכוז המצע הסופי הרצוי (0.05-25 מ מ).
      הערה: להכין טרי מלאי פתרונות של מספר ותרכובות מעכבות עם מים מדי יום, להתאים את ה-pH 7.5 עם התוספת של 0.1 מ"מ NaOH, במידת הצורך.
    2. אחרי 10 s של ערבוב כדי לאפשר ערבוב של הפתרון, לסגור את המיכל עם הבוכנה לאט ו בורג למעלה למטה. טישו נקי עשוי לשמש כדי לספוג את הנוזלים העודפים הוא שנעקרו מבתיהם מן החדר. לאפשר האלקטרודה equilibrate בו הוא יכול לייצר יחידת מידה יציב ריכוז החמצן בפתרון במשך לפחות דקה אחת לפני שתמשיך כדי התוספת של אנזים (רקע O2 צריכת שיעור של ± 0.5 מיקרומטר/min).
    3. באמצעות גז חזק 10 µL מזרק, להוסיף כ- 1 µL של אנזים (כ 3-7 מיקרומטר. אנזים) תא אלקטרודה דרך הבוכנה.
      הערה: כמות האנזים יכול להיות עלה או ירד בתגובה לפעילות שנצפה aliquot מסוים כדי לאפשר תגובה המחירים להספיק.
    4. לחשב את מהירות התגובה מבוסס על המדרון של 30 הראשון s של נתונים ליניאריים לאחר תוספת אנזימים ונכונה עבור רקע צריכת2 O באמצעות 30 s של הנתונים מיד לפני תוספת אנזימים. הקצב של זרז שווה קצב הצריכה2 O (איור 5A).
    5. לאחר איסוף הנתונים שיעור עבור ריכוז המצע נתון, לרוקן את התא אלקטרודה דרך שאיפה באמצעות צינור פלסטיק המחוברים אל בקבוק ואקום מהצד של הזרוע, השטיפה שוב ושוב עם מים למשך 4-6 מחזורים. להגדיר את הפתרון ב האלקטרודה כפי שמתואר בשלב 7.2.1 באמצעות ריכוז המצע החדש.
    6. משתנים ריכוז המצע בצורה לא מסודרת, לשכפל לאורך כל הקורס של הניסוי לחשבון עבור ירידה בפעילות האנזים עם הזמן (איור 5B).
      הערה: כאשר בית ריכוז מסוים מופעלים להפגין יותר מאשר ירידה של 30% במחיר בהשוואה בניהול מוקדם יותר, אין מבחני נוספים צריכה להתבצע עם זה אצווה של האנזים. בדרך כלל, לאחר 30-40 פועל, האנזים מדגים ירידה של 30% בפעילות.
    7. לקבוע את הפרמטרים קינטי, kחתול (הקבוע קטליטי עבור ההמרה של המצע למוצר) ו- Km (מיכאליס הקבוע, מבצעית הגדיר את ריכוז המצע שבו והמחיר ההתחלתי הוא למחצית מהירות מקסימלית), על ידי התאמה ריבועים של נתונים מכל ריכוז המצע המשוואה Michaelis−Menten (איור 6) באמצעות מנסרה GraphPad.
  3. מוסיפים 4-nitrocatechol (4NC) כדי לבדוק את ההשפעה על dioxygenation קינטיקה ולקבוע את הקבוע עיכוב (Kאני) עם DesB. עבור כל תנאי התגובה, מלאי פתרונות של טריס (50 מ מ), מספר (25 מ מ), 4NC (25 מ מ) משולבים, מדולל עם מים להניב פתרון 2 מ"ל של מאגר טריס 25 מ מ (pH 7.5) עם מספר 1 מ"מ ושלל ריכוזים של 4NC. עוצמת הקול של 4NC היה מגוונות על מנת להשיג את ריכוז המעכב הסופי הרצוי (0.05-20 מ מ).
    1. לאחר 10 שניות של ערבוב להתיר ערבוב של הפתרון, למקם את המשאבה בבית הבליעה לאט, בורג למעלה למטה. טישו נקי עשוי לשמש כדי לספוג את הנוזלים העודפים הוא שנעקרו מבתיהם מן החדר. לאפשר האלקטרודה equilibrate ולייצר מדידה יציב של ריכוז חמצן הפתרון במשך לפחות דקה אחת לפני שתמשיך כדי התוספת של אנזים (רקע O2 צריכת שיעור של ± 0.5 מיקרומטר/min).
    2. כמתואר לעיל, להוסיף את החלבון (שלב 7.2.3), לקבוע את קצב התגובה (שלב 7.2.4), לאפס את האלקטרודה עבור התנאי הבא.
    3. כחלק של סדרת ניסויים, לקבוע את קצב התגובה בהיעדר מעכב מספר פעמים. לקבוע עיכוב על ידי סטנדרטיזציה של שיעור של צריכת החמצן בנוכחות ריכוזים שונים מעכב עם סובסטרט 1 מ מ, היעדר מעכב (v/vo).
    4. מתאים עיכוב של מספר dioxygenation את משוואת 7.3A ולאחר מכן את הנתונים עיכוב משוואת 7.3B באמצעות תוכנית graphing (איור 7).
  4. לקבוע ריכוז האנזים מדויק עבור ניסוי על-ידי ביצוע וזמינותו ברדפורד לאחר סיום כל הרצפים קינטי.
    הערה: כל המחירים היו מתוקנות על ריכוז האנזים. שלב זה אינו צריך להיעשות הכפפות או שקית הכפפות.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

המוצג הוא ניתוח ג'ל מרחביות-דף של שברים בודדים מטיהור של הבונה פיוז'ן (איור 3) חלבון (MBP) מחייב DesB-מלטוז. הג'ל מגלה כי החלבון הוא טהור (MW = 91.22 kDa), למעט הנוכחות של DesB (MW = 49.22 kDa) ובתחום MBP חלבון (42 kDa) ביקע אחד מהשני. שברים E2 ו- E3 נבחרו ריכוז (שלב 4.2).

תוצאות מבחני קינטי DesB לשחזור תלויות הרכבה נכונה, כיול, טכניקה חדשה וניסיונית. זה הכרחי קלט את טמפרטורת הסביבה הנכונה ואת הלחץ, כמו משתנים אלה לקבוע את אחוזי O2 צפוי להיות מומס פתרונות במהלך וזמינותו (איור 4A). האות הראשוני צריך להיות בין 1800 ו-2000 nmol/mL, צריך לייצר קצב יציב של קרוב לאפס, המציין כי רווית החמצן של הפתרון מינימלית משתנה (איור 4B). לאחר dithionate נתרן מתווספת לחדר סגור, קצב הצריכה2 O צריך במהירות ובזהירות להגדיל עד שיש O מינימלי2 (< 60 nmol/mL) עזב את הפתרון. מדרון יציב שלילית מציינת 1) אלקטרודה שהורכב יש אין דליפות אוויר 2) אלקטרודה שלמאחה מגיב לשינויים בריכוז2 O (איור 4C ו- D). אם O2 שנותרו בתמיסה לא מספיק נמוך, ערך ההיסט כיול יהיו שגויים. הכיול יצטרך להיות חוזרות ונשנות עם האלקטרודה התאספו כהלכה, ויש להשתמש טרי סודיום dithionite.

כאשר האלקטרודה מכויל כהלכה, ניתן לבצע מבחני קינטי. המדידה הראשונה מבססת את פעילותו של האנזים desalted טרי באמצעות מספר 100 מיקרומטר במאגר טריס 25 מ מ ו- 1 uL של האנזים. לפני חיבור של האנזים, טריס מאגר של מספר הם מנוער בבית הבליעה עם הבוכנה בעמדה. זה צריך לייצר אות ראשוני משוער בין 250 ו-350 nmol/mL, האות אמור לייצב (±5 nmol/mL/min) לפני האנזים נוסף. אות יציב מציין כי קיימים משתנים אין (למשל, נקרע קרום, שאריות של נתרן dithionite, אלקטרודה מלוכלך) זה עלול לגרום מדידות לא עקבי. בעת הוספת האנזים, האות עליו במהירות, בהתמדה ירידה, המציין התגובה של DesB הוא הליך, מאז O2 הוא נצרך בעקבות התגובות עם מספר. השיפוע של הקצב ההתחלתי לפני בנוסף האנזים וקצב קטליטי נקבעו על-ידי שימוש בכלי קצב ושינוי החלון ל-30 שניות (איור 5A). לאחר כ- 1-1.5 שעות של שימוש, מקטין פעילות האנזים בכ 30-50%, ובשלב זה כבר לא צריך להיות בשימוש (איור 5B).

לאחר כל המדידות קינטי נלקחו, יכולים להיות מותווים הנתונים תוכנית דוגמנות (איור 6). הפעילות של DesB עם מספר מתקבל על ידי מדידת קצב הצריכה2 O בריכוזים מספר משתנים. רקע קצב לפני תוספת אנזימים יופחת לפי קצב קטליטי כדי להשיג את קצב המתוקן. הקצב המתוקן רקע מחולק על ידי ריכוז אנזים, התאימה ל משוואת 7.3A (ראה שלב 7.3.3). התאמה די תלויה הפרמטרים הראשוני עבור KM ו- Kסי, (בראשי תיבות פרמטרים:KM = 320 μM, קייסי = 1600 μM). התוצאה מראה לעקומה היפרבולית מגיע רמה מקסימלית, ולאחר מכן מדרונות כלפי מטה מעט ככל [מספר]. . זה עיקול אופיינית עבור אנזים זה מוצגים המצע עיכוב בריכוזים גבוהים המצע.

Equation 7.3B

הקצב של עיכוב של DesB עם 4-nitrocatechol נקבע על ידי התבוננות הקטנת קצב צריכת החמצן של DesB עם מספר 1 מ מ בנוכחות ריכוזים שונים של 4-nitrocatechol (איור 7). ריכוז 4-NC סומן נגד הפעילות מנורמל (הקצב בנוכחות מעכב הייתה מחולקת לפי שער חסרת מעצורים) ולהתאים את משוואת 7.3B (ראה שלב 7.3.3). התוצאות מצביעות על שזה 4-NC מעכב את צריכת החמצן, ובכך מעכב את התגובה DesB.

Equation 7.3A

סוג מדיה רכיבים
מרק סופר אופטימלית עם דיכוי Catabolite (SOC מדיה) טריפטון 2% (w/v)
0.5 תמצית שמרים % (w/v)
10 מ מ NaCl
2.5 מ"מ אשלגן כלורי
10 מ מ MgCl2 (נוסף לאחר עיקור)
גלוקוז 20 מ מ (נוסף לאחר עיקור)
מרק Lysogeny של מילר עם אמפיצילין (LB-Amp מדיה) 0.5 תמצית שמרים % (w/v)
טריפטון 1% (w/v)
1% (w/v) NaCl
0.1 מ"ג/מ"ל אמפיצילין (נוסף לאחר עיקור)

טבלה 1- החומרים עבור הכנת מרק סופר אופטימלית עם דיכוי catabolite (מדיה SOC), מרק lysogeny של מילר עם אמפיצילין (LB-Amp מדיה).

פתרון עבודה רכיב ריכוזים הסופי
מאגר Laemelli, pH 6.8 100 מ מ טריס (hydroxymethyl) aminomethane (טריס)
dithiothreitol 200 מ"מ (DTT),
4% נתרן גופרתי dodecyl (מרחביות)
bromophenol 0.05% כחול
20% גליצרול
הפעלת מאגר pH 8.3 25 מ מ טריס
גליצין 192 מ מ
0.1% מרחביות

בטבלה 2. החומרים עבור הכנת Laemelli, מאגרי פועל לניתוח עמוד מרחביות.

פתרון עבודה רכיב ריכוזים הסופי
עמילוז עמודה מאגר, pH 7.4 20 מ מ טריס (hydroxymethyl) aminomethane (טריס)
1 מ מ ethylenediaminetetraacetic חומצה (EDTA)
200 מ"מ NaCl
• תנאי מאגר pH 7.4 20 מ מ טריס
1 מ מ EDTA
200 מ"מ NaCl
מלטוז 10 מ מ
מאגר Exchange, pH 7.5 50 מ מ טריס
10% גליצרול
Desalt מאגר, pH 7.5 50 מ מ טריס
10% t-butanol

טבלה 3- החומרים עבור הכנה של מאגרי טיהור חלבון.

Figure 1
איור 1: השוואה של התגובות על ידי הטבעת ביקוע dioxygenases. הקווים המסולסלים להראות הקשר פחמן-פחמן המתאים הוא ביקע במהלך התגובה dioxygenase, היכן intradiol המחשוף (אדום) שובר את הקשר בין שתי קבוצות הידרוקסיל מעברי המחשוף (כחול) extradiol קשר פחמן-פחמן סמוכים זה קבוצות הידרוקסיל. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

Figure 2
איור 2: התגובות על ידי DesB, LigAB, קרובי משפחה dioxygenases extradiol אשר שייכים superfamily dioxygenase (PCAD) סוג II protocatechuate. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

Figure 3
איור 3: ג'ל מרחביות-דף של DesB מראה ריכוז וטיהור צעדים תוצאות. מסלולים מסומנים כדלקמן: S = חלבון תקן, FT1, FT2 = שנאספו זרימה דרך שברים, W1, W2 = שברים שטיפת שנאספו, E1-E4 = שברים elute שנאספו. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

Figure 4
איור 4: דור של כיול מתעקם על האלקטרודה חמצן. (א) לפני לכיוונון, טמפרטורת הסביבה ואת הלחץ מוזנים לתוך התוכנית כדי לקבוע ריכוז חמצן לפתרונות equilibrated אוויר. (ב) הפתרון רווי חמצן מגיע שיווי משקל ומייצר הנחיה. (ג) נתרן dithionate פתרון נוסף לנצל את כל החמצן, כפי שצוין על ידי הירידה אות חמצן. (ד) כיול מתקבל כאשר האות מייצבת-אפס ריכוז חמצן. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

Figure 5
איור 5: נציג עקומות קינטי הממחישות לאובדן טיפוסי של פעילות לאורך זמן. (א) התגובה של מספר 100 מיקרומטר, באמצעות DesB טריים, עם שיעור הניצול2 O של-56.61 לדקה מיקרומטר (B) התגובה של מספר 100 מיקרומטר שימוש DesB לאחר שעתיים של איסוף נתונים, עם שיעור הניצול2 O של-29.56 לדקה מיקרומטר אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של הדמות הזו.

Figure 6
איור 6: מגרש של פעילות DesB עם מספר, שיתאים את משוואת מיכאליס-מנטון (שחור), מתאים למשוואה Haldane עבור עיכוב המצע (אדום; משוואת 7.3B). פרמטרים קינטי נגזר מתאים שני הם כדלקמן: מיכאליס-מנטן - kחתול = 316 + /-17 שניה-1, Km = 123 + /-26 μM; Haldane - kחתול = 570 + /-110 שניה-1, Km = 320 + /-100 μM, קייסי = 1600 + /-600 μM. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

Figure 7
איור 7: מגרש של עיכוב 4-nitrocatechol של DesB dioxygenation של מספר (1 מ"מ). אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

Figure 8
איור 8: תיאום של מספר על-ידי DesB (pdb ID = 3wr3). כפי שניתן לראות dioxygenases רבים, ליגנד מרכזת את אטום iron(II) אתר פעיל בצורה bidentate. על סמך הדמיון המבני בין מספר 4-nitrocatechol (4NC), היה חזה עיכוב של DesB על ידי 4NC. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

השלבים הקריטיים בהשגת חלבון DesB פעיל, מטוהרים לערב היווצרות ושמירה של האתר הפעיל Fe(II) מופחתת של האנזים. ככזה, לתקן ביצועים של אינדוקציה, היטהרות, ריכוז, desalting צעדים חיוניים להשגת בהצלחה אנזים פעיל. גרימת ביטוי חלבון בנוכחות 1 מ"מ ברזלי אמוניום סולפט מבטיחה כי Fe(II) הוא שולב בצורה נכונה האתר הפעיל של DesB. שיטה זו היא בהשראת מחקרים כאלה עם amidohydrolase metalloenzymes, אשר לעיתים קרובות דורשים התוספת של מתכת למדיה הצמיחה כדי לאפשר קיפול נכונה, מתפוסה מלאה של המתכת מחייב האתר6,41,42 ,43.

טיהור אנאירובית וריכוז בתא הכפפות הם אולי השלבים הקריטיים ביותר וקשה טכנית ב פרוטוקול זה. זה חיוני כדי לשמור על אווירה נטולת חמצן בתא הכפפות. זה דורש שמירה על הזרז deoxygenation בתא הכפפות כפי שנקבעו על ידי המדריך, מעת לעת לשנות את הטנקים חנקן שמצורפים לתיבה כאשר הם נמוך, ובכך אין חורים ב כפפות שמצורף בתא הכפפות, ו שמירה על מגש של טרי? סופג לחות בתא הכפפות. רצועות חמצן רגיש המשנות צבע כאשר הם נחשפים O הסביבה2 יוטלו בתיבת לבדיקת O2-אווירה חופשית. יתר על כן, יש צורך מלא דגה כל מאגרי ופתרונות אשר ישמש במהלך תהליך ריכוז וטיהור. כדי להבטיח מינימלי O2 במאגרי, שמור על עצמך להגביל את החשיפה של מאגרי degassed האווירית, בעת מעבר בין חנקן מבעבעים ושאיבת מחזורים.

בעת הפעלת העמודה בתא הכפפות, מבחן טוב כדי לקבוע האם יש חמצן נוכח במאגרי היא לקחת חלק קטן מאחד השברים לשטוף (כ 0.1-0.5 מ"ל) ולמקם אותו צינור microcentrifuge עם חלק קטן ammoni ברזלי . חומצה גופרתית, DTT (פחות מהסכום הדרוש עבור השלב ריכוז). אז חשוב לערבב את תכולת השפופרת היטב ולבחון את צבע לשנות. אם הפתרון פונה שחור, כהה, צהוב, או כתום, יש חמצן להציג שברים חלבון, שם צפויה להיות פעילות קטליטית מופחתת לאחר התהליך המלא של ריכוז וטיהור. אם הפתרון הוא אור צבע לבנדר או קלה מאוד-צהוב, ייתכנו מינימלי O2 הנוכחי, אך סביר כי האנזים עדיין יש פעילות גבוהה. צהוב כהה לשינוי צבע כתום כשיש חמצן נגרם על ידי חמצון של הברזל שמצוי ברזלי אמוניום סולפט כדי Fe(III), יוצרים חלודה44. כדי לתקן בעיה זו, מומלץ דגה המאגרים ולאפשר בחנקן בועה דרך גולמי הפתרון חלבון 1-2 דקות נוספות לפני הצבתם בתא הכפפות. בנוסף, חשוב לוודא כי האווירה בתא הכפפות הוא באמת O2-חינם באמצעות O2-רצועות רגיש.

השלב הקריטי האחרון, desalting את האנזים לפני אפיון קינטי, דורש אווירה נטולת חמצן, חייב להיעשות על קרח, כמו חלבון מטוהרים הוא נוטה דנטורציה בטמפרטורת החדר. קביעת כאשר החלבון desalted יורד העמודה הוא חיוני בהצלחה מבחני קינטי, כמו שברים מרוכז ביותר לתת את התוצאות ביותר לשחזור. השבר שבו החלבון desalted הוא eluted להיקבע בכל פעם אוסף חדש של חלבון מטוהרים, כאשר העמודה הוא ארז עם שרף חדש. אם פעילות היא נמוכה במהלך מבחני קינטי, השלבים ריכוז וטיהור היה מומחה טכנית, הנושא ינוח בשלב desalting. בעת פתרון שלב זה, חשוב לבדוק כי המאגר t-butanol 50 מ מ Tris/10% הוא degassed ביסודיות, repack העמודה עם שרף ספדקס טריים, ולוודא כי ישנם בלי חורים בשקית הכפפות.

לאחר DesB יש כבר בהצלחה מטוהר desalted, מבחני קינטי משתמש האלקטרודה חמצן יש לבצע בזהירות כדי לקבל נתונים על פעילות קטליטית של האנזים. מדידות קינטי הם בדרך כלל לשחזור כאשר חלבון מרוכז האקטיביות catalytically משמש. אם נקודות הנתונים אינם לשחזור כאשר חוזרים ריצה עבור נקודת נתונים ריכוז המצע או מעכב, הבעיה עשויה להיות כי החלבון שפגע בסימני או מחומצן לאחר שימוש ממושך. ניתן להפיק חלבון טרי desalted כדי לאפשר המשך של איסוף נתונים. חשוב לשמור על כל צלוחיות של האנזים, אז ניתן לקבוע ריכוז חלבון המדויק לאחר השלמת איסוף הנתונים באמצעות וזמינותו של ברדפורד. שלב זה מבוצע לאחר המדידות קינטיקה כי האנזים מאבד פעילות לאורך זמן, אז קודם ביצוע זה עשוי להוביל להורדת פעילות ומדידות קינטיקה לא מדויק. ריכוז חלבון משמש לאחר מכן להמיר שנצפה המחירים קטליטי שיעורי התגובה הדרושות כדי לקבוע את מספר מחזור. בנוסף חששות לגבי אובדן פעילות אנזים מוביל irreproducible קינטיקה תוצאות, השפלה של קרום המכסה האלקטרודה לאחר שימוש ממושך עלול לגרום גם אתגרים בעת שכפול נתונים. ממברנה השפלה מזוהה בדרך כלל באמצעות עלייה האות הראשונית (של 250-350 nmol/mL כדי ^350 nmol/mL) או חוסר יכולת להשיג שיעור רקע יציב לפני חיבור אנזים (> ±5 nmol/mL/min). אם גם הוא ציין, מומלץ לפרק האלקטרודה, לנקות כל תחמוצות את האלקטרודה באמצעות האבקה ניקוי שסופקו, להרכיב מחדש את האלקטרודות של לכייל מחדש.

שיטת טיהור אנאירובית חשוב מאוד אנזימים עם מרכז מתכת יכול להיות תחמוצת, במיוחד עבור אלה אשר יש הלחוצים מתכות אשר ניתן להמירו לאחר הקפלים חלבון. למרות אנזימים התפתחו כדי להגן על עצמם על ידי תיאום חמצן רק לאחר תיאום המצע, הם עשו זאת בסביבה התאית - כמויות החמצן בסביבה במבחנה saturating יכול להוביל חמצון מהיר של מתכות ההמרה של Fe(II) לתוך טופס Fe(III) לא פעיל31. החמצון/איון זה יכול להוביל לתוצאות מוטה שבו האנזים אינו במצבו הפעיל catalytically. ניתן להחיל את מבחני קינטי באמצעות אלקטרודה חמצן רגיש אנזימים המסתמכים על חמצן כמו מצע. במקום קבלת קינטיקה פרמטרים באמצעות השינוי עוצמת הקליטה המצע או מוצר, שיטה זו מאפשרת עבור הפריט החזותי של צריכת חמצן ספוג בתמיסה. בשיטה זו נעשה שימוש בעבר עם LigAB, dioxygenase extradiol עוד ב superfamily dioxygenase protocatechuate שתלויה באופן דומה Fe(II) של האתר הפעיל שלו כדי לתאם קליב סובסטרטים שלה.

כתב יד זה מספק גם מידע נוסף על האנזים DesB מהמאמץ sp. Sphingobium SYK-6. בעקבות העבודה שמגדיר את הפונקציה אנזימטי ואת המבנה של DesB10,19,39, נקבע בזאת כי DesB הוא זרז המוסמכים של dioxygenation של מספר, עם kהחתול של 17.8 ± 1.0 s-1 ו- Km של 45 ± 13 מיקרומטר, וכתוצאה מכך kהחתול/Kמ' של 3.98 x 105 M/s. המחירים הללו דומות לאלה שנקבע אנזימים dioxygenase אחרים, כולל LigAB (kהחתול של 51 s-1 ו- kחתול/KM של 4.26 x6 מ' 10-1s-1 ) ו dioxygenases אחרים אשר יש kחתול/ ערכיKm הנע בין 105-108 ז-1s-136,45,46 , 47 , 48 , 49 , 50.

האתר הפעיל DesB הוצגה קודם לכן להיות בהממשק דימר, עם משקעים של שני מונומרים לתרום התיאום של המצע [שאריות שמקורם מונומר המאגד את Fe(II) מסומנים באמצעות מספר שאריות שלהם, בעוד שאריות מ מונומר אחרים יצוינו באמצעות מספר שאריות שלהם פריים (קרי: Glu377ʹ)]6. בהעדר נתוני מבנה מציג את האינטראקציות איגוד של 4NC עם DesB, מבניים קווי הדמיון וההבדלים בין מספר 4NC יכול לספק תובנה איך DesB יכול להיות מעוכבים על ידי 4NC. מספר יש שלושה substituents הידרוקסיל-C3, C4, C5, עם hydroxyls שלה C3 ו- C4 להיות מתואמת למרכז Fe(II), את הידרוקסיל C5 להיות מתואמת על ידי Glu377ʹ (איור 8). הקבוצה חומצה קרבוקסילית-C1 מתואמת על ידי טיר-391ʹ, Tyr-412ʹ, חמישי-13 ו חמישי-267, האתר הפעיל DesB. 4NC, שהוכחו מעכב צנוע של DesB, יש שתי hydroxyls זמין לתאם את מרכז Fe(II) ואת C1 ניטרו קבוצה אחת isosteric כדי carboxylate (בעודכם נהנים גם שני oxygens לתיאום על ידי שאריות 391, 412, 13 ו- 267), אבל הוא הרבה יותר אלקטרון-פורש יותר חומצה קרבוקסילית על מספר. מאז 4NC מוצג רק 36.6% עיכוב של dioxygenation DesB של מספר כאשר החומר המדכא היה נוכח עודף 5-fold מעל המצע, זה מפתיע, אפוא, כי לא היה מעכב חזק מאוד (עם Kאני של 2.3 ± 0.3 מ מ). הדבר מצביע על כך הידרוקסיל C5 ו- C1 מתמיר לשחק תפקיד משמעותי בקידום הקומפלקס אנזים-ליגנד. מאז שאריות Glu377ʹ טיר-391ʹ, טיר-412ʹ הם כולם מעורבים אינטראקציות אלה, הדבר מצביע על כי DesB אנשי אתר פעיל עם מונומרים סמוכים חשובים עבור המיקום של תרכובת ובניית האתר הפעיל.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

המחברים יש אין מתחרים אינטרסים כלכליים או אחרים ניגודי עניינים.

Acknowledgments

ברצוננו להודות. דר ' קלר קאמי מתה האוניברסיטה לקבלת תמיכה טכנית. תודה פרופסור לינדזי ד Eltis ו ג'נה Capyk ק מ אוניברסיטת בריטיש קולומביה, וכן כריסטיאן וויטמן של אוניברסיטת טקסס באוסטין, מיוחדת על עצתם לגבי שיטות טיהור חלבונים אנאירובית ושימוש של האוריאולס2 -אלקטרודה רגיש.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Isopropyl β-D-1-thiogalactopyranodise Gold Bio Technologies I2481C50
Coomassie Brilliant Blue R-250 Bio-Rad 161-0400
Ammonium persulfate Bio-Rad 161-0700
30% Acrylamide Bio-Rad 161-0158
N,N'tetramethyl-ethylenediamine Bio-Rad 161-0801
Amylose Resin High Flow New England Biolabs E8022S
BL21 (DE3) competent Escherichia coli cells New England Biolabs C2527I
L-cysteine Sigma Aldrich C7352
gallic acid Sigma Aldrich G7384
4-nitrocatechol Sigma Aldrich N15553
Ferrous ammonium sulfate Mallinckrodt 5064
Sodium dithionite Alfa Aesar 33381-22
wheaton serum bottles Fisher Scientific 06-406G
25 mm Acrodisc PF Syringe Filter with Supor Membrane Pall Corportation 4187
400 mL Amicon Stirred Cell Concentrator EMD Millipore UFSC40001
76 mm Millipore Ultracel 10 kDa cutoff reconsituted cellulose membrane filter EMD Millipore PLGC07610
DL-dithiothreitol Gold Bio Technologies DTT50
Sephadex G-25 coarse desalting gal column GE Healthcare 17-0033-01
2 mL Crimp-Top Vials Fisher Scientific 03-391-38
Oxygraph Plus Electrode Control Unit Hansatech Instruments OXYG1 Plus
Oxygen Eletrode Chamber Hansatech Instruments DW1
Electrode Disc Hansatech Instruments S1
PTFE (0.0125 mmX25mm) 30m reel Hansatech Instruments S4
Electrode cleaning Kit Hansatech Instruments S16
Spacer paper Zig Zag available at any gas station
He-series Dri-Lab glove box Vacuum/Atmospheres Company
HE-493 Dri-Train Vacuum/Atmospheres Company
Double-Ended Micro-Tapered Stainless Steel Spatula Fisher Scientific 21-401-10
DWK Life Sciences Kimble Kontes Flex Column Economy Column Fisher Scientific k420400-1530
10 μL, Model 701 N SYR, Cemented NDL 26s ga, 2 in, point stlye 2 syringe Hamilton 80300
DWK Life Sciences Kimble Kontes Flex Column Economy Column Fisher Scientific K420401-1505
Emulsiflex-C5 high-pressure homogenizer Avestin
B-PER Complete Bacterial Protein Extraction Reagent Thermo Fisher Scientific 89821
Lysozyme from chicken egg white Sigma Aldrich 12650-88-3
Sodium dodecyl sulfate Thermo Fisher Scientific 151-21-3
ampicillin Sigma Aldrich 7177-48-2
Tryptone Fisher Scientific BP-1421-500
Yeast extract Fisher Scientific BP1422-2
Sodium Chloride Fisher Scientific S271-10
Potassium Chloride Fisher Scientific P217-3
Magnesium Chloride Fisher Scientific M33-500
Dextrose Fisher Scientific D16-3
Sodium Hydroxide Fisher Scientific S318-1
Tris hydrochloride Fisher Scientific BP153-500
Maltose Fisher Scientific BP684-500
Glycine Fisher Scientific G46-500

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Awaya, J. D., Walton, C., Borthakur, D. The pydA-pydB fusion gene produces an active dioxygenase-hydrolase that degrades 3-hydroxy-4-pyridone, an intermediate of mimosine metabolism. Applied Microbiology and Biotechnology. 75, (3), 583-588 (2007).
  2. Barry, K. P., Taylor, E. A. Characterizing the Promiscuity of LigAB, a Lignin Catabolite Degrading Extradiol Dioxygenase from Sphingomonas paucimobilis SYK-6. Biochemistry. 52, (38), 6724-6736 (2013).
  3. Colabroy, K. L., Smith, I. R., Vlahos, A. H. S., Markham, A. J., Jakubik, M. E. Defining a kinetic mechanism for l-DOPA 2,3 dioxygenase, a single-domain type I extradiol dioxygenase from Streptomyces lincolnensis. Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Proteins and Proteomics. 1844, (3), 607-614 (2014).
  4. Imsand, E. M., Njeri, C. W., Ellis, H. R. Addition of an external electron donor to in vitro assays of cysteine dioxygenase precludes the need for exogenous iron. Archives of Biochemistry and Biophysics. 521, (1), 10-17 (2012).
  5. Tsai, C. -L., Tainer, J. A. Methods in Enzymology. David, S. S. 599, Academic Press. 157-196 (2018).
  6. Kuchenreuther, J. M., et al. High-Yield Expression of Heterologous [FeFe] Hydrogenases in Escherichia coli. Public Library of Science ONE. 5, (11), e15491 (2010).
  7. Dupuy, J., et al. Crystallization and preliminary X-ray diffraction data for the aconitase form of human iron-regulatory protein 1. Acta Crystallographica Section F. 61, (5), 482-485 (2005).
  8. Fan, L., et al. XPD Helicase Structures and Activities: Insights into the Cancer and Aging Phenotypes from XPD Mutations. Cell. 133, (5), 789-800 (2008).
  9. Vaillancourt, F. H., Bolin, J. T., Eltis, L. D. The ins and outs of ring-cleaving dioxygenases. Critical Reviews in Biochemistry and Molecular Biology. 41, 241-267 (2006).
  10. Sugimoto, K., et al. Molecular Mechanism of Strict Substrate Specificity of an Extradiol Dioxygenase, DesB, Derived from Sphingobium sp. SYK-6. Public Library of Science ONE. 9, (3), e92249 (2014).
  11. Lewis-Ballester, A., et al. Structural insights into substrate and inhibitor binding sites in human indoleamine 2,3-dioxygenase 1. Nature Communications. 8, (2017).
  12. Lipscomb, J. D., Hoffman, B. M. Allosteric control of O-2 reactivity in Rieske oxygenases. Structure. 13, (5), 684-685 (2005).
  13. Mccray, J. A., Brady, F. O. Allosteric Control of Transient Kinetics of Carbon Monoxide-L-Tryptoohan-2,3-Dioxygenase Complex-Formation. Federation Proceedings. 32, (3), 469 (1973).
  14. Pearson, J. T., Siu, S., Meininger, D. P., Wienkers, L. C., Rock, D. A. In Vitro Modulation of Cytochrome P450 Reductase Supported Indoleamine 2,3-Dioxygenase Activity by Allosteric Effectors Cytochrome b(5) and Methylene Blue. Biochemistry. 49, (12), 2647-2656 (2010).
  15. Walsh, H. A., Daya, S. Inhibition of hepatic tryptophan-2,3-dioxygenase: Superior potency of melatonin over serotonin. Journal of Pineal Research. 23, (1), 20-23 (1997).
  16. Barry, K. P., et al. Exploring allosteric activation of LigAB from Sphingobium sp strain SYK-6 through kinetics, mutagenesis and computational studies. Archives of Biochemistry and Biophysics. 567, 35-45 (2015).
  17. Reynolds, M. F., et al. 4-Nitrocatechol as a probe of a Mn(II)-dependent extradiol-cleaving catechol dioxygenase (MndD): comparison with relevant Fe(II) and Mn(II) model complexes. Journal of Biological Inorganic Chemistry. 8, (3), 263-272 (2003).
  18. Tyson, C. A. 4-Nitrocatechol as a colorimetric probe for non-heme iron dioxygenases. Journal of Biological Chemistry. 250, (5), 1765-1770 (1975).
  19. Kasai, D., Masai, E., Miyauchi, K., Katayama, Y., Fukuda, M. Characterization of the gallate dioxygenase gene: Three distinct ring cleavage dioxygenases are involved in syringate degradation by Sphingomonas paucimobilis SYK-6. Journal of Bacteriology. 187, (15), 5067-5074 (2005).
  20. Billings, A. F., et al. Genome sequence and description of the anaerobic lignin-degrading bacterium Tolumonas lignolytica sp. nov. Standards in Genomic Sciences. 10, (1), 106 (2015).
  21. Brown, M. E., Chang, M. C. Y. Exploring bacterial lignin degradation. Current Opinion in Chemical Biology. 19, 1-7 (2014).
  22. Bugg, T. D. H., Ahmad, M., Hardiman, E. M., Rahmanpour, R. Pathways for degradation of lignin in bacteria and fungi. Natural Product Reports. 28, (12), 1883-1896 (2011).
  23. Clarkson, S. M., et al. Construction and Optimization of a Heterologous Pathway for Protocatechuate Catabolism in Escherichia coli Enables Bioconversion of Model Aromatic Compounds. Applied and Environmental Microbiology. 83, (18), (2017).
  24. de Gonzalo, G., Colpa, D. I., Habib, M. H. M., Fraaije, M. W. Bacterial enzymes involved in lignin degradation. Journal of Biotechnology. 236, 110-119 (2016).
  25. Falade, A. O., Eyisi, O. A. L., Mabinya, L. V., Nwodo, U. U., Okoh, A. I. Peroxidase production and ligninolytic potentials of fresh water bacteria Raoultella ornithinolytica and Ensifer adhaerens. Biotechnology Reports. 16, 12-17 (2017).
  26. Gall, D. L., Ralph, J., Donohue, T. J., Noguera, D. R. A Group of Sequence-Related Sphingomonad Enzymes Catalyzes Cleavage of β-Aryl Ether Linkages in Lignin β-Guaiacyl and β-Syringyl Ether Dimers. Environmental Science & Technology. 48, (20), 12454-12463 (2014).
  27. Li, J., Yuan, H., Yang, J. Bacteria and lignin degradation. Frontiers of Biology in China. 4, (1), 29-38 (2009).
  28. Masai, E., Katayama, Y., Nishikawa, S., Fukuda, M. Characterization of Sphingomonas paucimobilis SYK-6 genes involved in degradation of lignin-related compounds. Journal of Industrial Microbiology & Biotechnology. 23, 364-373 (1999).
  29. Morales, L. T., González-García, L. N., Orozco, M. C., Restrepo, S., Vives, M. J. The genomic study of an environmental isolate of Scedosporium apiospermum shows its metabolic potential to degrade hydrocarbons. Standards in Genomic Sciences. 12, (1), 71 (2017).
  30. Shettigar, M., et al. Isolation of the (+)-Pinoresinol-Mineralizing Pseudomonas sp. Strain SG-MS2 and Elucidation of Its Catabolic Pathway. Applied and Environmental Microbiology. 84, (4), (2018).
  31. Shi, Y., et al. Characterization and genomic analysis of kraft lignin biodegradation by the beta-proteobacterium Cupriavidus basilensis B-8. Biotechnology for Biofuels. 6, (1), 1 (2013).
  32. Varman, A. M., et al. Decoding how a soil bacterium extracts building blocks and metabolic energy from ligninolysis provides road map for lignin valorization. Proceedings of the National Academy of Sciences. 113, (40), E5802-E5811 (2016).
  33. Wu, W., et al. Lignin Valorization: Two Hybrid Biochemical Routes for the Conversion of Polymeric Lignin into Value-added Chemicals. Scientific Reports. 7, (1), 8420 (2017).
  34. Koehntop, K. D., Emerson, J. P., Que, L. The 2-His-1-carboxylate facial triad: a versatile platform for dioxygen activation by mononuclear non-heme iron(II) enzymes. Journal of Biological Inorganic Chemistry. 10, (2), 87-93 (2005).
  35. Lipscomb, J. D. Mechanism of extradiol aromatic ring-cleaving dioxygenases. Current Opinion in Structural Biology. 18, (6), 644-649 (2008).
  36. Machonkin, T. E., Doerner, A. E. Substrate specificity of Sphingobium chlorophenolicum 2,6-dichlorohydroquinone 1,2-dioxygenase. Biochemistry. 50, 8899-8913 (2011).
  37. Suzuki, T., Kawamichi, H., Imai, K. Amino Acid Sequence, Spectral, Oxygen-Binding, and Autoxidation Properties of Indoleamine Dioxygenase-Like Myoglobin from the Gastropod Mollusc Turbo cornutus. Journal of Protein Chemistry. 17, (8), 817-826 (1998).
  38. Vaillancourt, F. H., Labbe, G., Drouin, N. M., Fortin, P. D., Eltis, L. D. The Mechanism-based Inactivation of 2,3-Dihydroxybiphenyl 1,2-Dioxygenase by Catecholic Substrates. Journal of Biological Chemistry. 277, (3), 2019-2027 (2002).
  39. Sugimoto, K., et al. Crystallization and preliminary crystallographic analysis of gallate dioxygenase DesB from Sphingobium sp. SYK-6. Acta Crystallographica Section F. 65, (11), 1171-1174 (2009).
  40. Gallagher, S. R. SDS‐Polyacrylamide Gel Electrophoresis (SDS-PAGE). Current Protocols in Essential Laboratory Techniques. 6, (1), 7.3.1-7.3.28 (2012).
  41. Xiang, D. F., et al. Function Discovery and Structural Characterization of a Methylphosphonate Esterase. Biochemistry. 54, (18), 2919-2930 (2015).
  42. Vladimirova, A., et al. Substrate Distortion and the Catalytic Reaction Mechanism of 5-Carboxyvanillate Decarboxylase. Journal of the American Chemical Society. 138, (3), 826-836 (2016).
  43. Korczynska, M., et al. Functional Annotation and Structural Characterization of a Novel Lactonase Hydrolyzing d-Xylono-1,4-lactone-5-phosphate and l-Arabino-1,4-lactone-5-phosphate. Biochemistry. 53, (28), 4727-4738 (2014).
  44. Netto, L. E. S., Stadtman, E. R. The Iron-Catalyzed Oxidation of Dithiothreitol Is a Biphasic Process: Hydrogen Peroxide Is Involved in the Initiation of a Free Radical Chain of Reactions. Archives of Biochemistry and Biophysics. 333, (1), 233-242 (1996).
  45. Arciero, D. M., Orville, A. M., Lipscomb, J. D. Protocatechuate 4,5-Dioxygenase from Pseudomonas testosteroni. Methods in Enzymology. 188, 89-95 (1990).
  46. Harpel, M. R., Lipscomb, J. D. Gentisate 1,2-dioxygenase from pseudomonas. Purification, characterization, and comparison of the enzymes from Pseudomonas testosteroni and Pseudomonas acidovorans. Journal of Biological Chemistry. 265, (11), 6301-6311 (1990).
  47. Ishida, T., Tanaka, H., Horiike, K. Quantitative structure-activity relationship for the cleavage of C3/C4-substituted catechols by a prototypal extradiol catechol dioxygenase with broad substrate specificity. Journal of Biochemistry. 135, (6), 721-730 (2004).
  48. Vaillancourt, F. H., Han, S., Fortin, P. D., Bolin, J. T., Eltis, L. D. Molecular Basis for the Stabilization and Inhibition of 2,3-Dihydroxybiphenyl 1,2-Dioxygenase by t-Butanol. Journal of Biological Chemistry. 273, (52), 34887-34895 (1998).
  49. Veldhuizen, E. J. A., et al. Steady-state kinetics and inhibition of anaerobically purified human homogentisate 1,2-dioxygenase. Biochemical Journal. 386, 305-314 (2005).
  50. Wolgel, S. A., et al. Purification and Characterization of Protocatechuate 2,3-Dioxygenase from Bacillus macerans: a New Extradiol Catecholic Dioxygenase. Journal of Bacteriology. 175, (14), 4414-4426 (1993).
חלבון אנאירובית טיהור וניתוח קינטי באמצעות אלקטרודה חמצן ללמוד DesB Dioxygenase פעילות וניגוד
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Uchendu, S. N., Rafalowski, A., Cohn, E. F., Davoren, L. W., Taylor, E. A. Anaerobic Protein Purification and Kinetic Analysis via Oxygen Electrode for Studying DesB Dioxygenase Activity and Inhibition. J. Vis. Exp. (140), e58307, doi:10.3791/58307 (2018).More

Uchendu, S. N., Rafalowski, A., Cohn, E. F., Davoren, L. W., Taylor, E. A. Anaerobic Protein Purification and Kinetic Analysis via Oxygen Electrode for Studying DesB Dioxygenase Activity and Inhibition. J. Vis. Exp. (140), e58307, doi:10.3791/58307 (2018).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter