Summary
여기 우리는 혐 기성 단백질 정화, 혐 기성 단백질 농도, 그리고 산소 전극 시스템을 사용 하 여 후속 운동 특성에 대 한 프로토콜을 제시. DesB, 더 안정적이 고 적극적인 정화 하 고 혐 기성 환경에서 저장 한 dioxygenase 효소 효소를 사용 하 여 메서드를 보여 줍니다.
Abstract
산소에 민감한 단백질, 그 효소를 활용 한 기질으로 산소를 포함 하 여 전통적인 호 기성 정화 방법을 사용 하 여 정화 하는 때 안정성을 줄일 수 있습니다. 이 원고에서는 장갑 상자에 담 론 전에 단백질의 버퍼 및 시 약, 열 착 색 인쇄기에 대 한 방법의 준비를 포함 하 여 혐 기성 정화 과정에 관련 된 기술적인 세부 사항을 보여 줍니다. 또한 준비 하 고 산소를 이용 하는 효소의 활동적인 특성화를 수행 하는 산소 전극 사용 방법이 있습니다. 이 메서드는 DesB, Sphingobium sp. 스트레인 SYK-6 박테리아에서 gallate dioxygenase dioxygenase 효소를 사용 하 여 그림.
Introduction
철 또는 산소를 활성화 하기 위하여 다른 금속을 사용 하는 효소 들은 정화 과정 동안 비활성화에 취약 그들의 제거 때문에 셀의 줄이는 환경에서. 따라서이 단백질, 세포 lysates로 사용 해야 외부 감소 시키는 대리인를 복종 될 또는 있도록 그들은 최적 효소 활동1,2,,34anaerobically 정화. 그 효소는 산소에 민감한 (특히 철 분 포함 된 효소), 혐 기성 상태를 유지 하면서 모든 정화 및 특성화 단계를 수행 완전히 그들을 특성화 하는 데 필요한입니다. 이 주도하 고 있다 결정학5,6,7,8 단백질 표정에서 배열 하는 연구에 대 한 혐 기성 챔버의 범위 내에서 전체 실험실 체제를 개발 하는 연구원 .
여기, 우리는 혐 기성 정화 및 효소는 산소 전극 시스템을 사용 하 여 DesB의 운동 특성에 대 한 방법을 보고 합니다. DesB은 Sphingobium sp. 스트레인 SYK-6 LigAB, 동일한 유기 체에서 protocatecuate dioxygenase 관련 된 박테리아에서 gallate dioxygenase입니다. 두 효소 유형 II protocatechuate dioxygenase (PCAD) superfamily 날짜9, 에어로빅 표준을 사용 하 여 정화 하는 때 비활성화에 취약 되 고이 superfamily의 효소 때문에 가능성이 광범위 하 게 공부 하지는에 속한다 단백질 정화 방법입니다. PCAD 효소의 일부 표시 기판 성행위 동안 다른 기판 전용2,10, 추가이 superfamily의 특이성 결정을 식별 하는 데 필요한입니다. 으로 여러 효소 superfamilies11,12,13,,1415에 관찰 되었습니다, 작은 분자 직접 경쟁 저해를 통해 활동 또는의 바인딩을 변경할 수 있습니다. 분자 효소 활동16감소 또는 증가 일으키는 allosteric 주머니를 분리. 속도 론 혼자는 변조기의 바인딩 위치를 차별화 수 없습니다, 하는 동안 활동 변화의 크기를 결정 하는 것이 효과 이해 중요 합니다. 기본 DesB 활동과 4-nitrocatechol (4NC), 일반적으로 특성 및 dioxygenase 효소2,17, 를 억제 하는 데 사용 하는 화합물의 존재 그것의 활동의 운동 특성, 방법 18, 표시 됩니다.
DesB는 gallate, 리그 닌 파생 향기로운 화합물, 어떤 반지 여 기판10,19의 하나로 산소를 사용 하 여 촉매는 extradiol dioxygenase (에) 반응을 통해 무 너 뜨 리 수 있다. 이 효소 반응은 식물의 세포 벽에서 발견 한 향기로운 heteropolymer 리그 닌의 붕괴의 컨텍스트 내에서 발생 합니다. 리그 닌을 depolymerized 수 있습니다, 그리고 다양 한 방향족 화합물을 저조한 세분화 될 수 있습니다 추가 중앙 대사3,20,,2122,23,24에 ,25,26,,2728,29,30,31,32,33 . Extradiol dioxygenases (에) 촉매 dihydroxylated 방향족 화합물, 금속 조정 diol;에 인접 한 분열이 발생에 반응 열 반지 대조적으로, intradiol dioxygenases 쪼개 두 개의 수 산 기 그룹 (그림 1) 간의 유사한 향기로운 화합물. 다른 많은 metalloenzymes 같은 EDOs 2 히스티딘, 1-카복실산 깡패9,,3435의 구성 조정 Fe(II) divalent 금속 센터가 있다. 이 metalloenzymes 될 산화, autoxidation 또는 비활성화 메커니즘에 기초를 둔 반면 효소 비활성2,36,,3738렌더링 됩니다.
이 원고에서 설명 하는 실험 절차에 우리 DesB, 박테리아 Sphingobium sp. SYK-6, gallate (그림 2A)의 c 4-c 5 본드에 걸쳐 산소의 추가 촉매 하에서 PCAD superfamily의 구성원을 사용 합니다. 이 분열의 regiochemistry는 유사한 LigAB, protocatechuate-4, 5-dioxygenase (그림 2B). 지금까지,이 gallate dioxygenase의 조사 DesB10,,1939을 억제 하는 화합물의 보고를 포함 한다. 호 기성 정화 방법의 사용으로 DesB 전시 변수 활동, 혐 기성 방법의 사용으로 일관 되 게 재현할 수 활동 단백질을 얻을 수 있었습니다. 여기에 설명 된 운동 연구 DesB, gallate와 DesB의 반응과 4-nitrocatechol (4NC)에 의해 DesB의 억제의 운동 특성의 혐 기성 정화에 대 한 방법을 보여줍니다.
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Protocol
1. 일반 재료 및 방법
- 표 1에 설명 된 대로 모든 필요한 미디어를 준비 합니다. 압력솥에서 15 분 멸 균에 대 한 120 ˚C 0.2 µ m 필터를 통해 그것을 전달 하 여 MgCl2 , 포도 당의 추가 후 SOC 솔루션을 필터링 합니다. 압력가 마로 소독 전에 밀러의 Lysogeny 국물 (파운드 미디어) 솔루션의 pH를 조정 합니다. 0.2 m m L-시스테인, 다음 0.1 m m 철 암모늄 황산 단백질 표정 및 가용성을 향상 시키기의 살 균 솔루션 압력가 마로 소독 후 파운드 앰프 미디어 솔루션을 보완 합니다.
- 표 2에 설명 된 대로 polyacrylamide 젤 전기 이동 법 (페이지)에 대 한 Laemmli 버퍼 및 실행 버퍼를 준비 합니다. 그들의 마지막 볼륨에 구성 요소를 희석 하기 전에 (버퍼 준비를 위한 1 M HCl와 트리 스 기준을 사용 하 여) 솔루션의 pH를 조정 합니다.
- 표 3에 설명 된 대로 단백질 정화에 대 한 버퍼를 준비 합니다. 그들의 마지막 볼륨에 구성 요소를 희석 하기 전에 (버퍼 준비를 위한 1 M HCl와 트리 스 기준을 사용 하 여) 솔루션의 pH를 조정 합니다.
- 유리 튜브를 포함 하 고 한 홀 고무 마 개와 함께 밀봉 될 수 있다 병을 준비 버퍼를 전송 합니다.
- 유리 튜브 마 개에 진공 원본에 연결 하는 호스를 사용 합니다. 중간 속도에서 교 반 하면서 약 30 분에 대 한 부정적인 압력을 받고 드 솔루션을 수 있습니다.
- 도장 먼저, 다음 해제 진공 진공 브레이크. 다음, (병, 그리고 가스 탈출 환기로 사용 될 수 있는 한 짧은 바늘의 하단에 도달 충분히 하나) 두 20 G 바늘 고무 마 개를 통해 피어스. 30 분 동안 중간 속도로 교 반 하면서 질소의 지속적인 흐름에 거품.
- 바늘을 제거 하 고 세 사이클의 총에 대 한 생성 및 질소에서 버블링을 반복 합니다. 완료 되 면, 제대로 단단한 고무 마 개와 함께 병 인감. 또한 파라핀 영화와 구리 와이어 (20 G), 스 토퍼를 장악 하 고는 글러브에 넣어.
참고: 모든 재료는 글러브에 배치 되며 산소 밖으로 진공 청소기로 청소 및 질소로 충 진 antechamber 정화의 3 주기를 받게. 정화 및 농도 사용 되는 버퍼 출장 고 글러브 박스에 무기한으로 저장 될 수 있습니다.
- 약 한 주걱 (0.31 "x 2", 양방향 마이크로 테이퍼 스테인레스 주걱의 작은 끝) 1.5 mL microcentrifuge 튜브에서 degassed 물 약 1 mL에 나트륨 dithionate의 완전 용 해 하 여 나트륨 dithionate 솔루션을 준비 . 글러브 박스에서 제거 하기 전에 파라핀 영화 튜브 인감.
참고: 산화를 방지 하기 위해 장갑 상자에 고체 나트륨 dithionate를 저장 합니다.
2. 단백질 정화 Amylose 열의 준비
- Amylose 열 버퍼의 높은 흐름 amylose 수 지 (15 mL) 5 열 볼륨 (75 mL)와 함께에서 슬러리를 확인 합니다. 2 50 mL 혈 청 병으로 수 지 슬러리를 전송 하 고 각 병 고무 격 막 인감. 현 탁 액에서 산소를 제거 하려면 약 1 분간 슬러리에 20 G, 격 막, 및 거품 질소 통해 305 m m 바늘 찔린 합니다. 글러브 박스에 수 지와 단백질을 포함 하는 솔루션을 전송.
- 글러브 박스에 정착 하 고 레벨 침대를 만들 수 있도록 하는 간단한 자 지 장착 2 x 30 cm 붕 열으로 수 지를 붓는 다. 배수 열 버퍼와 3 열 양의 (~ 30 mL 총) degassed amylose 열 버퍼 용 매 보다 큰 될 때까지 약 1 드롭/s 또는 5 mL/min, 수 지를 통해 버퍼를 압축된 질소 가스를 사용 하는 열 equilibrate는 수 지 침대입니다.
참고: 단백질 후는 eluted (단계 아래 3.5 참조) amylose 열 수 지 물, 1 열 볼륨 (10 mL) 1 열 양의 1% 나트륨 라우릴 황산 염 (SDS), 그리고 마지막으로, 3 열 양의 (30 mL) 물으로 세척 하 여 다시 생성 됩니다. 이 단계는 장갑 상자 완료할 수 있습니다. 열 수 지는 20% 에탄올에 4 ° C에 저장 되며 최대 5 배를 다시 생성할 수 있습니다.
3. 단백질 표정 및 DesB의 혐 기성 정화
참고: DesB 유전자는 상업적으로 합성, 애완 동물-15b, 애완 동물-32a, 및 NdeI 및 BamHI 제한 사이트 복제를 사용 하 여 pMAL c5x 벡터에 배치 하는 데.
- 단백질 표정 분석 대규모 식 (아래에 간단히 설명)에 대 한 정확한 조건을 확인 하려면 제조업체의 지침에 따라 완료 합니다.
- 상업적으로 제작한, 화학적으로 유능한 대장균 으로 DesB를 포함 하는 플라스 미드를 변환 BL21 (DE3) 셀, 제조업체의 지침에 따라. 간단히, 해 동이 분 동안 얼음에 셀 추가, 플라스 미드 DNA의 약 10-50 ng 셀 혼합물, 열 충격에 셀 10 42 ° C에서 s, 고 추가 5 분 추가 SOC 및 미디어를 1 mL의 최종 볼륨을 얻을 수 있도록에 대 한 얼음에 그들을 품 어는 (~ 200 rpm) 60 분 동안 37 ° C에서 흔들어 셀. 파운드 앰프 접시에 추가 및 셀 솔루션의 100 µ L를 확산 하 고 37 ° c.에서 밤새 품 어
- 하룻밤 배양 후 플레이트에서 단일 콜로 니 형성 단위를 선택 하 고이 식민지를 사용 하 여 파운드 앰프 미디어의 10 mL를 접종. (~ 200 rpm) 37 ° c.에 떨고 밤새, 세포 성장
- 미디어의 10 mL를 100 µ L 하룻밤 성장 솔루션의 추가 하 고 37 ° c.에 단계 3.1.2에에서 설명 된 대로 새로운 미디어를 흔들 때 광학 밀도 600 nm (OD600) 0.4-0.8, 사이 이소프로필 β-D-1-thiogalactopyranoside (IPTG) 1 m m의 최종 해결책 농도를 추가.
- 즉시 솔루션의 약 1 mL 수를 제거 하 고 1.5 mL microcentrifuge 튜브 레이블이 지정 된 시간에 전송 = 0 시간. 작은 셀 10 분 15000 x g에서 튜브를 회전 합니다. 회전 후에 상쾌한을 제거 하 고 4 ° c.에서 셀 저장
- (일반적으로 5, 10, 12, 18, 24 h)에서 IPTG의 추가 후에 시간 간격 추가 aliquots (각 1 mL)을 제거 합니다. 3.1.4 단계에 설명 된 대로 각 튜브 원심, 상쾌한, 가만히 따르다와 4 ° c.에서 셀 저장
- aliquots, 가져온 모든 resuspend에서 셀 각 timepoint 30 µ L 세균성 단백질 추출 솔루션,에 10-15 분 동안 실내 온도에 그들을 품 어 고 가용성과 불용 성 분리 5 분 15000 × g에서 튜브 원심 단백질입니다.
- 새로운 microcentrifuge 튜브에 녹는 단백질 해결책을 전송 하 고 30 µ L 세균성 단백질 추출 솔루션의와 나머지 불용 성 펠 릿 resuspend.
- 각 솔루션 (각 timepoint에 대 한 가용성과 불용 성 솔루션)의 30 µ L Laemmli 버퍼의 동등한 양으로 결합 다음 SDS 페이지 젤40에 시각화. 대규모 단백질 표정과 정화에 대 한 수용 성 보다 정확한 크기 밴드를 포함 하는 차선에 해당 하는 조건을 선택 합니다.
참고: 때문에 최소한의 수용 성 단백질은 처음 위의 조건을 사용 하 여 생성 된, 다양 한 보충제에 추가 된 0.2 m L-시스테인 m와 0.1 m m 철 암모늄 황산 보여주는 향상 된 단백질 용 해 단백질 표정에 효과 대 한 테스트 식입니다. 이 단백질 식 화면에 따르면 DesB의 용 해 생산을 위한 적절 한 표정 벡터 pMAL c5x 벡터를 했다.
- 대장균 BL21로 변환에 따라 (DE3), 80% 글리세롤의 100 µ L 900 µ L 세균성 문화 (성장된 하룻밤 200 rpm 고 37 ° C에서 흔들어와) 결합 하 여 DesB/pMal-c5x의 재고를 확인. 극저온 튜브에서-80 ° C에서 재고를 저장 합니다.
참고: 새로운 냉동 주식 약 6-8 개월 마다 확인 합니다. - 피 펫 팁을 사용 하 여 냉동된 주식에서 셀 긁 고 떨고와 37 ° C에서 파운드 앰프 미디어의 5 mL에서 하룻밤 성장 세균성 문화 시작. 37 ° C와 하룻밤 성장된 세균성 문화를 사용 하 여 200 rpm에서 2 L 플라스 크에 파운드-앰프 미디어의 1.5 리터 접종
참고: 산소에 단백질의 관찰 된 감도 때문으로 밝혀졌다 그 감소 headspace 플라스 크에 대규모 식에 대 한 속도 향상 된 단백질 수율을 떨고 온건. - 유도 단백질 표정 때 600에서 광학 밀도 (OD600) 1 m IPTG 0.4-0.8 사이 및 0.2 m m L-시스테인과 0.1 m m 철 황산 암모늄으로 보충. 부 화 온도 30 ° c와 200 rpm에서 흔들어. 4700 x g 10 분에서 24 h 후 유도 후 원심 분리를 통해 셀 아래로 회전 시키십시오 그리고 보낸된 미디어를 삭제.
- Amylose 열 버퍼의 성장, lysozyme의 1 밀리 그램의 추가 의해 다음 모든 1.5 L 당 20 mL에 셀 펠 릿을 resuspend. 얼음에 20 분 동안 저 어.
참고: 더 많은 버퍼 추가할 수 있습니다 솔루션 너무 점성 이면 단백질으로 솔루션 너무 점성을 균질 화 하는 다음 단계를 중단 될 수 있습니다. - 약 15000 psi에 3-5 패스와 고압 균질 통해 resuspended 셀 솔루션 lyse 50 mL 원심 분리기 튜브에 단백질을 전송 하 고 headspace 1 분에 대 한 질소로 플러시. 그런 다음 세포 lysate 불용 성 파편을 제거 40 분 20000 x g에서 원심.
참고: 컬렉션 플라스 크, 그리고 튜브를 통해 흐르는 하 고 솔루션 반투명 회색 갈색 색상으로 나타납니다 양식 micelles 단백질을 하면 성공적인 조직. 과정 전반에 걸쳐 얼음에 무 균된 단백질을 유지. - 원심, 후 (이상 하나 필요할 수 있습니다), 50 mL 튜브에는 상쾌한 전송 튜브 고무 격 막 그리고 20 게이지 바늘, 산소를 치환 하 2 분에 대 한 솔루션을 통해 천천히 거품 질소 가스 모자. 파라핀 영화 심장 랩 더 구리 철사, 그것을 확보 하 고 열 자료와 함께 글러브 박스에는 상쾌한을가지고.
- Equilibrate 열 (단계 2.3 참조) 고 열에 표면에 뜨는 단백질을 로드. 적당히 가압된 질소 (1 드롭/초 또는 약 5 mL/min)에서 5 mL 분수에서 흐름 통해 수집 합니다. 다음, 다른 3 열 양의 amylose 열 버퍼를 사용 하 여 열 세척 하 고 적당히 가압된 질소 (약 5 mL/min)에서 유리 시험관에 3ml 분수를 수동으로 수집. 5 열 양의 (50 mL) 차입 버퍼를 사용 하 여 단백질을 elute 고 적당 한 질소 압력 (약 5 mL/min) 3 mL 분수를 수동으로 수집 합니다.
참고: 분수 또는 수집할 수 있습니다 중력 여과 사용 하 여. 약 12 차입 분수를 수집 해야 합니다. - 분수의 30 µ L aliquots를 수집 하 고 포함 하는 단백질의 시각화 수 있도록 장갑 상자에서 그들을 제거 SDS 페이지 분석을 통해 분수.
참고: 수집 된 분수는이 테스트의 기간에 대 한 장갑 상자에 남아 있습니다. 순화 DesB 일반적으로 분수 3-5 열에서 elutes.
4. 혐 기성 단백질 농도/버퍼 교환
- 76 mm 재구성된 셀 루 로스 멤브레인 필터 (10 kDa 컷오프) 가압, 흔들 셀 집중 장치를 조립. 글러브 박스에 조립된 집중 전송으로 젖은 막 계속 집중 장치에 충분 한 양의 20% 에탄올을 추가 합니다.
주: 막에 눈물이 고 o-링 주름이 되지 확인 하십시오. - 데리고 후 장갑 상자에 흔들된 셀 집중 세척 물으로 막에서 에탄올 솔루션. 모자 하 고 기 압 튜브와의 어떤 과잉의 물 막 청소를 냈다 셀.
- 집중 장치에 SDS 페이지 (그림 3)에 의해 결정 되는 단백질을 포함 하는 모든 분수를 추가 합니다. 충분 한 exchange 버퍼 총 단백질 솔루션 볼륨의 150 mL를 추가 합니다.
- 외부 N2 라인을 사용 하 여 흔들된 셀 챔버 압력 그리고 보통 교 반 속도와 50 mL에 단백질을 집중.
참고: 약 20 분 걸립니다 50 mL의 농도 달성. - 100 mL의 0.1 m m dithiothreitol (DTT)와 0.1 m m 철 암모늄 황산 exchange 버퍼를 보충 하 고 흔들된 셀에 솔루션을 추가 교 반 속도 보통으로 50 mL의 총 볼륨에 단백질을 집중.
- 솔루션 50 mL의 볼륨에 도달, 후 보충된 교환 버퍼에 한 번 더 추가 하지만 보통 교 반 속도와 10 ml 전체 볼륨에 대 한 해결책을 집중.
- 필터링을 사용 하 여 0.45 μ m 기 공 크기 주사기 필터와 약 수 개별 0.2 mL 중 합 효소 연쇄 반응 (pcr) 튜브 (각 단백질 해결책의 약 150 µ L) 집중된 단백질. 글러브 박스에서 받은 aliquots를 제거 하 고 즉시 플래시 액체 질소 그들을 동결. -80 ° c.에 aliquots 저장
5. 염 DesB
- 사용 하기 전에 약 1.5 시간 동안 질소 가스와 장갑 가방을 플러시.
- 얼음에 장갑 가방 내부 정화 DesB 단백질의 150 µ L 약 수 동
- 단백질 녹아서, 하는 동안 작은 중력, 담 9 mL 붕 열에서 Sephadex G-25 거친 염 젤의 3 mL를 포함 하는 열을 준비 합니다. 열 2 열 볼륨 (~ 6 mL)을 씻어 degassed desalt 버퍼.
참고: 대체 염 젤 (약 7 사용) 후 노란색 흰색에서 젤 색깔에 변화가 있을 때. - 해 동된 DesB 중력 제어 과정을 통해 열에 로드 합니다. 흐름을 통해 삭제 합니다. 버퍼를 담의 약 5 mL와 단백질 elute
참고: 지속적으로 장갑 부 대를 작성 하는 가스 탱크에서 압력을 솔루션 열에서 물방울 속도 영향을 줍니다. - 열에서 단백질 차입의 초기 결정에 대 한 12 병/elutions (병 당 3 방울 포함)를 수집 합니다. 고무 격 막으로 밀봉, 그들을 제거 장갑 가방 및 단백질의 존재에 대 한 테스트에서 SDS 페이지 젤 분석) (통해 직접 또는 간접적으로 (심사를 통해 각 분수의 활동의).
참고: 일반적으로, 분수는 개별적으로 대 한 테스트 활동, 활성 단백질의 가장 큰 농도와 분수를 해당 하는 가장 큰 활동으로 7.1, 단계에서 설명한 대로. DesB는 보통 7 드롭, desalted 단백질의 다음 9 방울 수집 후에 시작을 elutes. 단백질 aliquots 속도 측정 (단계 7.1-7.4) 동안 얼음에 저장 됩니다.
6. 산소 전극 준비
- 검정 산화물 예금의 표시 흔적까지 실버 양극 반지와 플래티넘 음극 전극 청소기와 젖은 면봉을 폴란드어.
- 가 위, 약 1 개의 1.5 인치 광장 스페이서 종이 (또는 동등 하 게 잘 작동 하는 담배 롤링 종이)의 잘라. 다음, 전극의 배치를 원조 하기 위하여 모서리에 광장과 2) 슬릿으로의 각 면에 1) 작은 삼각형을 잘라.
- 양극에 50 %KCl 용액 5 방울 그루브와 솔루션의 한 지속적인 반지를 형성 하는 그들은 그래서 그들을 연결을 추가 합니다. 백 금 전극의 상단에 50 %KCl 용액 2 방울을 추가 합니다. 신중 하 게 백 금 전극 위에 스페이서 종이 놓고 아무 공기 방울 되므로 스페이서 종이 밖으로 부드럽게 합니다.
참고: 주의 사용 하 여 공백 종이 찢 어 하지 않도록. - 약 2 인치 긴 S4 30 m PTFE (소계) 막의 조각을 잘라 하 고 스페이서 종이 위에 두십시오. 막의 가장자리를 잘라 그래서 그들은 전극의 외부 반지와 함께 정렬 됩니다.
- 종이 막 전극에는 스페이서를 확보 하 여 전극에 작은 o-링을 밀어 링 주걱을 사용 하 여. 아래 아무 막 확보는 전극의 원형 홈에 큰 링을 놓습니다. 기지에 전극의 상단 챔버를 슬라이드와 나사 2 개를 함께.
참고: 두는 망했다에 제대로 경우 챔버의 양쪽에 없는 공기 거품 지팡이. - 그것의 기초에 조립된 전극을 놓고 전극 모니터링 시스템에 연결 합니다. 전극 제어 프로그램을 시작 하 고 액체 단계 교정 프로토콜 (그림 4A)를 수행 하 여 전극 보정. 온도 변수는 실험 수행은, 방의 온도 및 주위 압력 변수 지역 현재 날씨 상태에 따라 달라 집니다.
참고: 주위 압력 지역의 날씨 보고서를 얻을 수 있습니다. - 추가 25mm Tris 버퍼의 1 mL 전극 실로, 플런저를 삽입, 산소 포화 솔루션의 보정을 시작 하 고 100 교 반기 속도 조정. 후 전극 안정화, 산소 포화 솔루션 결정에 대 한 보정 설정 포인트 (그림 4B).
- 플런저를 제거 하지 않고 어떤 기포 (그림 4C) 추가 되지 않도록 주의 하면서 챔버로 나트륨 dithionite 솔루션의 약 1 mL를 주입 하는 1.2 x 40 m m 바늘과 1 mL 주사기를 사용 합니다. 고무 마 개를 사용 하 여 나트륨 dithionite 추가 후 바로 전극 챔버를 밀봉 하기 위하여.
- 모든 산소 활용 및 프로그램 완료 될 때까지 계속 하 여 저장 (그림 4D) 교정 교정 하실 수 있습니다. 상공에서 솔루션을 발음 하 고 플런저와 챔버 이온된 물으로 5-6 번 씻어 나트륨 dithionite의 완전 한 제거를 보장 하기 위해. Rinsing, 장착 피 펫 팁 쪽 팔 진공 플라스 크에 연결 된 플라스틱 관을 사용 합니다. 멤브레인을 손상 하지 마십시오.
7. 운동 분석 산소 전극을 사용 하 여
- 직렬 25mm Tris 버퍼, ph 7.5의 솔루션에 1 µ L의 효소 활동에 대 한 솔루션을 테스트 하 고 100 µ M gallate를 포함 하 여 활성 단백질을 포함 하는 desalted aliquots를 식별 합니다. 최고의 관찰 활동은 aliquot(s)를 사용 하 여 나머지 실험에 대 한. (단계 5.5.1 참조)
- O2 소비는 O2를 사용 하 여 측정 하 여 효소 반응의 속도 결정-전극 제어 장치를 통해 컴퓨터 통합 민감한 클라크-유형 전극.
- 각 활동 데이터에 대 한 DesB의 측정 포인트, 전극 챔버에 25mm Tris 버퍼 (pH 7.5)의 1 mL을 추가. 원하는 최종 기질 농도 (0.05-25 m m)을 달성 하기 위해 Tris 버퍼에 계산 된 양의 gallate의 25 m m 재고 솔루션을 추가 합니다.
참고: 매일 gallate와 억제 물으로의 신선한 재고 솔루션을 준비 하 고 필요한 경우 0.1 m NaOH, m의 추가 함께 7.5 pH를 조정. - 10 후 s 솔루션의 혼합 수 있도록 저 어 천천히 플런저와 챔버를 밀봉 하 고 아래로 상단 나사. 깨끗 한 조직 상공에서 난민은 과잉 액체를 흡수 하기 위해 사용할 수 있습니다. 그것은 효소 (± 0.5 µ M/min의 배경 O2 소비 속도)의 추가에 진행 하기 전에 적어도 1 분 동안 솔루션에 산소 농도의 안정적인 측정을 생산할 수 있는 equilibrate를 전극을 수 있습니다.
- 가스 꽉 10 µ L 주사기를 사용 하 여 플런저를 통해 전극 챔버를 효소 (약 3-7 µ M 효소)의 약 1 µ L를 추가 합니다.
참고: 효소의 양이 증가 하거나 충분 한 수를 반응 속도 대 한 허용 하도록 특정 약 수의 관찰된 활동에 대 한 응답에서 감소 될 수 있습니다. - 첫번째 30의 기울기에 따라 반응 속도 계산 선형 데이터 효소 추가 후 및 적합의 s O2 소비는 30을 사용 하 여 배경 데이터 효소 추가 직전의 s. 촉매의 비율은 O2 소비 (그림 5A)의 속도.
- 플라스틱 튜브를 사용 하 여 빈 포부를 통해 전극 챔버에 주어진된 기질 농도 대 한 속도 데이터의 수집, 후 측 팔 진공 플라스 크에 연결 하 고 4-6 사이클에 대 한 물으로 반복 해 서 헹 구는. 7.2.1 새로운 기질 농도 사용 하 여 단계에서 설명한 대로 전극에 솔루션을 설정 합니다.
- 정렬 되지 않은 방식으로 기질 농도 시간 (그림 5B)와 효소 활동에 있는 감소에 대 한 계정에 실험의 과정을 통해 복제.
참고: 지금까지 특정 농도의 복제 실행 되는 이전 실행에 비해 속도 30% 감소 보다 더 보여줄 때에 아무 추가 분석 실험 효소의 그 배치와 함께 수행 되어야 한다. 일반적으로 30-40 실행 후 효소 활동에 30% 감소를 보여줍니다. - 운동 매개 변수 k고양이 (제품 기판의 변환에 대 한 촉매 상수)와 Km (Michaelis 상수, 운영 체제는 초기 속도가 기질 농도 정의 결정 최대 속도의 절반) GraphPad Prism을 사용 하 여 Michaelis−Menten 방정식 (그림 6)를 기질 농도의 각각에서 데이터의 최소 제곱 기준으로.
- 각 활동 데이터에 대 한 DesB의 측정 포인트, 전극 챔버에 25mm Tris 버퍼 (pH 7.5)의 1 mL을 추가. 원하는 최종 기질 농도 (0.05-25 m m)을 달성 하기 위해 Tris 버퍼에 계산 된 양의 gallate의 25 m m 재고 솔루션을 추가 합니다.
- 4-nitrocatechol (4NC) dioxygenation 속도에 미치는 영향을 테스트 하 고 결정 저해 상수 (K나) DesB를 추가 합니다. 각 반응 조건에 대 한 재고 트리 (50mm), gallate (25 m m), 및 4NC 솔루션 (25 mM) 결합 하 고 1mm gallate와 25mm Tris 버퍼 (pH 7.5)의 2 mL 해결책을 물으로 희석 4NC의 농도 변화. 4NC 볼륨 원하는 최종 억제제 농도 (0.05-20 m m)을 달성 하기 위해 변화 했다.
- 10 초 후 감동 솔루션의 혼합 수 있도록, 플런저 챔버에 천천히 놓고 내려 상단 나사. 깨끗 한 조직 상공에서 난민은 과잉 액체를 흡수 하기 위해 사용할 수 있습니다. Equilibrate 및 생성 효소 (± 0.5 µ M/min의 배경 O2 소비 속도)의 추가에 진행 하기 전에 적어도 1 분 동안 솔루션에 산소 농도의 안정적인 측정 전극을 수 있습니다.
- 앞에서 설명한 대로 단백질 (7.2.3 단계)를 추가 하 고 반응 속도 (7.2.4 단계)를 확인 한 다음 조건에 대 한 전극 재설정.
- 이 일련의 실험의 일부로, 억제제의 부재에서 반응 속도 여러 번 확인 합니다. 1mm 기판으로 다양 한 억제제 농도의 산소 소비 속도 및 억제제 (v/vo)의 부재의 규격화에 의해 억제를 결정 합니다.
- 적합 방정식 7.3A gallate dioxygenation 그리고 방정식 그래프 프로그램 (그림 7)를 사용 하 여 7.3B 저해 데이터의 억제.
- 모든 운동 실행의 완료 후에 Bradford 분석 실험을 수행 하 여 각 실험에 대 한 정확한 효소 농도 결정 합니다.
참고: 모든 속도 효소 농도 대 한 수정 했다. 이 단계 장갑 상자 또는 글러브 가방에 할 필요가 없습니다.
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Representative Results
표시 된 개별 분수 정화 DesB-맥 아당 의무적인 단백질 (MBP) 퓨전 구문 (그림 3)에서 SDS 페이지 젤 분석이 이다. 젤 밝혀 단백질 순수 (MW = 91.22 kDa), DesB의 존재를 제외한 (MW = 49.22 kDa) MBP 단백질 도메인 (42 kDa) 서로 죽 습. 분수 E2 및 e 3은 농도 (4.2 단계)에 대 한 선정 됐다.
DesB 운동 분석 실험에서 재현성 결과 올바른 어셈블리, 교정, 및 실험 기법에 따라 달라 집니다. 그것은 정확한 온도 압력, 입력 하는 데 필요한 이러한 변수 분석 결과 (그림 4A) 동안 솔루션에 녹아 있을 것으로 예상 하는 O2 의 비율을 결정. 초기 신호 1800 및 2000 nmol/mL 사이 여야 하 고 솔루션의 산소 포화는 최소한 (그림 4B) 변화를 나타내는 0에 가까운 안정적인 속도 생산 한다. 나트륨 dithionate 추가 되 고 챔버 봉인, 일단 O2 소비의 속도 신속 하 고 꾸준히 증가 한다 때까지 최소한의 O2 는 (< 60 nmol/mL) 솔루션에 남아. 지속적인 부정적인 사면 1) 조립된 전극이 공기 누출 없음 2) 전극 (그림 4C 와 D) O2 농도의 변화에 적절 하 게 응답 나타냅니다. 솔루션에 남아 있는 O2 충분히 낮은 경우, 교정 오프셋된 값 잘못 될 것입니다. 보정 제대로 조립 전극으로 반복 될 수 있고 신선한 나트륨 dithionite를 사용 해야 합니다.
때 전극 보정 제대로 운동 분석을 수행할 수 있습니다. 첫 번째 측정 25mm Tris 버퍼에서 100 µ M gallate와 효소의 1 uL을 사용 하 여 갓 desalted 효소의 활동을 설정 합니다. 효소의 추가 하기 전에 Tris 버퍼와 gallate는 자극 챔버에 위치에 플런저와 함께. 이 사이의 250과 350 nmol/mL, 대략적인 초기 신호를 생성 해야 하 고 효소를 추가 하기 전에 신호 (± 5 nmol/mL/min)을 안정화 한다. 안정적인 신호 나타냅니다 없는 변수는 (예를 들어, 막, 남은 나트륨 dithionite, 더러운 전극 찢어진) 일관성 측정 발생할 수 있습니다. 효소 추가 될 때 신호 빠르게 해야 하 고 꾸준히 감소, 나타내는 DesB의 반응 진행, O2 는 gallate와 반응에서 소비 하는 이후. 효소 추가 및 촉매 속도 속도 도구를 사용 하 고 30 초 (그림 5A)를 창 조정 하 여 결정 하기 전에 초기 속도의 사면. 사용의 약 1-1.5 시간, 후 효소 활동 어느 시점에서 그것은 더 이상 해야 약 30-50% 감소 (그림 5B) 사용.
일단 모든 운동 측정가지고 데이터 모델링 프로그램 (그림 6)를 사용 하 여 그릴 수 있습니다. Gallate와 DesB의 활동은 다양 한 gallate 농도에서 O2 소비의 비율을 측정 하 여 얻어진 다. 효소 추가 하기 전에 배경 율 수정 전송률 촉매에서 뺍니다. 배경 수정된 율 효소 농도로 나눈 값 이며 방정식 7.3A (참조 단계 7.3.3)에 장착. KM 과 K시, 초기 매개 변수 의존 하는 충분 한 일치 (초기 매개 변수:KM 320 μ M = K시 = 1600 μ M). 결과 최대 고원 도달 다음 [gallate] 증가 약간 아래쪽으로 경사지는 쌍곡선 곡선을 보여줍니다. 이것은 전시 기판 높은 기질 농도에서 억제 하는 효소에 대 한 일반 곡선 이다.
4-nitrocatechol와 DesB의 억제의 속도 4-nitrocatechol (그림 7)의 다양 한 농도의 1 m m gallate와 DesB의 산소 소비 율에서 감소를 관찰 하 여 결정 했다. 4-NC 농도 (억제제의 속도 노골적인된 속도 의해 분할 되었다) 정규화 된 활동에 대 한 플롯은 방정식 7.3B에 맞는 (7.3.3 단계 참조). 결과 4-NC 따라서 DesB 반응 억제, 산소의 소비를 억제를 나타냅니다.
| 미디어 유형 | 구성 요소 |
| Catabolite 억제 (SOC 미디어)로 슈퍼 최적의 국물 | 2% (w/v) tryptone |
| 0.5% (w/v) 효 모 추출 | |
| 10 mM NaCl | |
| 2.5 m m KCl | |
| 10 m m MgCl2 (살 균 후 추가) | |
| 20 mM 포도 당 (살 균 후 추가) | |
| 암 피 실린 (파운드 앰프 미디어)와 밀러 Lysogeny 국물 | 0.5% (w/v) 효 모 추출 |
| 1% (w/v) tryptone | |
| 1% (w/v) NaCl | |
| 0.1 mg/mL 암 피 실린 (살 균 후 추가) |
표 1. Catabolite 억압 (SOC 미디어) 슈퍼 최적의 국물과 암 피 실린 (파운드 앰프 미디어)와 밀러 lysogeny 국물의 준비에 대 한 재료.
| 작업 솔루션 | 구성 요소 최종 농도 |
| Laemelli 버퍼, pH 6.8 | 100 mM tris (hydroxymethyl) aminomethane (트리 스) |
| 200 m m dithiothreitol (DTT) | |
| 4% 나트륨 라우릴 황산 염 (SDS) | |
| 0.05 %bromophenol 블루 | |
| 20% 글리세롤 | |
| 실행 버퍼 pH 8.3 | 25mm Tris |
| 192 m m 글리신 | |
| 0.1% SDS |
표 2. Laemelli 및 실행 버퍼의 SDS 페이지 분석을 위한 준비에 대 한 재료.
| 작업 솔루션 | 구성 요소 최종 농도 |
| Amylose 열 버퍼, pH 7.4 | 20 mM tris (hydroxymethyl) aminomethane (트리 스) |
| 1 mM ethylenediaminetetraacetic 산 (EDTA) | |
| 200 mM NaCl | |
| 차입 버퍼 pH 7.4 | 20 mM Tris |
| 1 mM EDTA | |
| 200 mM NaCl | |
| 10 m m 맥 아당 | |
| 교환 버퍼, pH 7.5 | 50 mM Tris |
| 10% 글리세롤 | |
| 버퍼, pH 7.5 desalt | 50 mM Tris |
| 10 %t-butanol |
표 3. 단백질 정화에 대 한 버퍼의 준비에 대 한 재료.
그림 1: 링 dioxygenases 절단형 촉매 반응의 비교. 물결선 표시 해당 탄소-탄소 유대는 죽 습 dioxygenase 반응 동안 intradiol 분열 (레드) 2 개의 수 산 기 그룹 및 extradiol (블루) 분열 휴식 사이 유대를 나누기를 탄소-탄소 유대 옆에 수 산 기 그룹입니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 2: DesB와 LigAB에 의해 촉매 반응, 두 관련 유형 II protocatechuate dioxygenase (PCAD) superfamily에 속하는 extradiol dioxygenases. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 3: 정화와 농도 단계 결과 보여주는 DesB의 SDS 페이지 젤. 레인은 다음과 같이 표시 됩니다: S = 단백질 표준, FT1 및 FT2 수집 된 흐름을 통해 분수, W1, W2 = 수집된 세척 분수, E1-E4 = =는 수집 elute 분수. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 4: 산소 전극에 대 한 교정의 세대 곡선. (A) 보정 하기 전에 온도 압력 공기 equilibrated 솔루션에 대 한 산소 농도 확인 하기 위해 프로그램에 입력 됩니다. (B) 산소 포화 해결책 평형에 도달 하 고 프롬프트를 생성 합니다. (C) 나트륨 dithionate 솔루션 산소 신호에서 감소에 표시 된 대로 모든 산소 활용에 추가 됩니다. (D) 보정 신호 제로 산소 농도에서 안정화 될 때 얻을 수 있다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 5: 시간이 지남에 따라 활동의 일반적인 손실을 보여주는 대표적인 운동 곡선. (A) 100 µ m gallate 신선한 DesB를 사용 하 여-56.61의 O2 이용 율의 반응 µ M/분 (B) 100 µ m gallate DesB를 사용 하 여-29.56의 O2 이용 속도와 데이터 컬렉션의 2 시간 후의 반응 µ M/분 여기를 클릭 하십시오 보기는 이 그림의 더 큰 버전.
그림 6: Michaelis Menton 방정식에 맞는 gallate와 DesB 활동의 줄거리 (블랙), 기질 저해 (레드; 위한 Haldane 방정식에 맞는 7.3B 방정식). 두 맞는에서 파생 된 운동 매개 변수는 다음과 같습니다: Michaelis-Menten- k고양이 17 초-1, Km + 316 = = 26 μ M; + 123 Haldane-k고양이 110 초-1, Km + 570 = = 100 μ M, + 320 K시 600 μ M + 1600 =. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 7: gallate (1mm)의 DesB dioxygenation 4 nitrocatechol 억제의 줄거리. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 8: DesB에 의해 gallate의 조정 (pdb ID = 3wr3). 많은 dioxygenases에서 보듯이 ligand bidentate 패션에 액티브 사이트 iron(II) 원자에 조정 합니다. Gallate와 4-nitrocatechol (4NC) 사이의 구조적 유사성을 바탕으로, 4NC로 DesB의 억제가 예언 되었다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
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Discussion
활성, 순화 DesB 단백질을 얻기에 있는 중요 한 단계는 형성 및 효소의 감소 Fe(II) 활성 사이트의 유지 관리를 포함 한다. 따라서, 유도, 정화, 농도, 성능 수정 하 고 염 단계는 활성 효소를 성공적으로 취득에 필수적인. Fe(II)을 DesB의 활성 사이트를 올바르게 통합 보장 1 mM 철 암모늄 황산의 단백질 발현을 유도 합니다. 이 메서드는 종종 적절 한 접는 수 있도록 성장 매체에 금속 추가 및 바인딩 사이트6,41,42 금속의 전체 인을 요구 하는 amidohydrolase metalloenzymes와 같은 연구에 의해 영감을 ,43.
혐 기성 정화와 글러브 박스에서 농도 아마도이 프로토콜의 가장 중요 하 고 기술적으로 어려운 단계. 글러브 박스에 산소 자유로운 분위기를 유지 하기 위해 필수적 이다. 이렇게 하려면 설명서, 주기적으로 변경 하는 때 그들은 낮은, 글러브에 연결 된 장갑에 구멍이 확인 상자에 연결 된 질소 탱크에 의하여 deoxygenation 촉매는 글러브를 유지 하 고 글러브에 신선한 시키는의 트레이 유지. 산소에 민감한 스트립 주변 O2 에 노출 되 면 색을 변경 하는 O2에 대 한 테스트 상자에 배치 될 수 있습니다-무료 분위기. 또한, 그것은 완전히 드 모든 버퍼 및 솔루션 정화 및 농도 과정 사용 될 필요가 있다. 버퍼에서 최소한의 O2 를 위해 상당한 주의를 질소 버블링 하 고 사이클을 진공 청소기로 청소를 전환할 때 공기 degassed 버퍼의 노출을 제한.
글러브 박스에는 열을 실행할 때 산소 버퍼에 있는지 여부를 확인 하는 좋은 테스트는 세척 분수 중의 작은 부분 (약 0.1-0.5 mL) 철 ammoni의 작은 부분을 가진 microcentrifuge 관에 배치 음 황산 및 DTT (농도 단계에 필요한 금액 보다 적은). 그것은 다음 튜브의 내용을 잘 혼합 하 고 변경 색상을 관찰 하는 것이 중요입니다. 어두운 노란색 또는 주황색, 산소는 솔루션 회전 블랙 단백질 분수에 제시 하 고 가능성이 것입니다 완전 한 정화와 집중 과정 후 감소 촉매 활동을 수 있습니다. 만약 솔루션은 빛 라벤더 또는 아주 가벼운 노란 색상, 최소한의 O2 에서, 있을 수 있습니다 하지만 그것은 효소 여전히 높은 활동을 할 것 이다. 오렌지 색상 변화 산소 있으면 어두운 노란색은 발생 철 암모늄 황산에 있는 철의 산화에 의해 Fe(III)에 녹44를 형성 합니다. 이 문제를 해결 하려면 버퍼 드 질소 장갑 상자에 그들을 배치 하기 전에 1-2 추가 분에 대 한 단백질 해결책 원유를 통해 거품을 허용 하는 것이 좋습니다. 또한, 그것은 장갑 상자에 분위기 정말 O2인지 확인 하는 것이 중요-O2를 사용 하 여 무료-민감한 스트립.
마지막 중요 한 단계, 운동 특성, 전에 효소 담 무산 분위기를 요구 하 고 순화 된 단백질은 변성 실 온에서 하는 경향이, 얼음에서 수행 되어야 합니다. Desalted 단백질은 열에서 올 때 결정 가장 집중된 분수 줄 가장 재현성 결과 성공적인 운동 분석 실험에 필수적 이다. 때마다 새로운 배치 단백질의 정화 그리고 열 새로운 수 지와 repacked 어디 desalted 단백질은 eluted 분수를 결정 합니다. 활동은 운동 분석 하는 동안 낮은 정화 및 농도 단계 기술적으로 마스터 하는 경우 문제는 염 단계에 누워 있습니다. 문제 해결이 단계 때 50mm Tris/10% t butanol 버퍼 degassed 철저 하 게 확인, 다시 신선한 Sephadex 수 지와 열 장갑 가방에 구멍이 있는지 확인 하 결정적 이다.
DesB 성공적으로 순화 되었으며 desalted, 후 산소 전극을 사용 하 여 운동 분석 실험 효소의 촉매 활동에 대 한 데이터를 신중 하 게 수행 되어야 합니다. 운동 측정은 촉매로 적극적이 고 농축 단백질 사용 될 때 일반적으로 재현 합니다. 데이터 요소가 없는 경우 재현할 수 기질 또는 억제제 농도 데이터 요소에 대 한 실행을 반복 하는 때, 단백질 변성 또는 확장된 사용 후 산화는 문제가 있을 수 있습니다. 데이터 수집의 계속 수 있도록 갓 desalted 단백질을 생성할 수 있습니다. 그것은 그래서 정확한 단백질 농도 Bradford 분석 실험을 사용 하 여 데이터 컬렉션의 완료 후에 결정 될 수 있다 효소의 모든 튜브를 유지 해야 합니다. 이 단계는 효소 지 면 활동 시간이 지남에, 그래서 그것을 수행 하는 것은 처음으로 이어질 수 있습니다 낮은 활동 및 부정확 한 속도 측정 때문에 속도 측정 후 수행 됩니다. 단백질 농도 다음 회전율 수를 결정 하는 데 필요한 반응 속도 관찰된 촉매 속도 변환 하는 데 사용 됩니다. 효소 활동 명료화 활동 결과의 손실에 대 한 우려, 뿐만 아니라 확장된 사용 후 전극을 덮고 막의 발생할 수 있습니다 또한 도전 데이터를 복제 하는 경우. 막 저하는 일반적으로 증가 (250-350 nmol/mL >350 nmol/mL)에서 초기 신호 또는 효소 추가 전에 안정적인 배경 율을 달성 하는 무 능력에 표시 (> ± 5 nmol/mL/min). 도 관찰 되는 경우 전극 분해, 청소 공급된 청소 분말을 사용 하 여 전극에서 어떤 산화물, 전극, 재조립 및 재조정 하는 것이 좋습니다.
혐 기성 정화 방법은 효소 단백질 접기 후 교환 될 수 없는 금속 바인딩한 밀접 하 게 그들을 위해 특히 산화 수 금속 센터에 대 한 매우 중요 한입니다. 효소 기질 조정 후 산소를 조정 하 여 자신을 보호 하기 위해 진화, 비록 그들은 셀룰러 환경에서 그렇게 했-saturating 양의 산소를 체 외에서 환경에 급속 한 산화 금속으로 이어질 수 있습니다. 그리고 비활성 Fe(III) 양식31에 Fe(II)의 변환. 이 산화/비활성화는 효소 촉매로 활성 상태로 하지는 괴상 한 결과 발생할 수 있습니다. 산소에 민감한 전극을 사용 하 여 운동 분석 한 기질으로 산소에 의존 하는 효소에 적용할 수 있습니다. 기판 또는 제품 흡수의 강도에 변화를 사용 하 여 속도 매개 변수를 얻는 대신이 메서드는 솔루션에서 포화 산소 소비량의 시각화에 대 한 수 있습니다. 이 메서드는 LigAB, protocatechuate dioxygenase superfamily 비슷하게 조정 하 고 그 기판 쪼개 활성 사이트의 Fe(II)에 의존에 다른 extradiol dioxygenase와 이전 사용 되었습니다.
이 원고는 또한 Sphingobium sp. 스트레인 SYK-6에서 효소 DesB에 대 한 추가 정보를 제공합니다. 효소 기능 및 DesB10,,1939의 구조를 정의 하는 작업에 따라 결정 했다 여기 DesB의 k고양이 함께 gallate의 dioxygenation의 유능한 촉매는 17.8 ± 1.0의-1 와 Km k고양이/Km 3.98 x 10의 결과 45 ± 13 µ M,5 M/s. 이 요금은 LigAB를 포함 하 여 다른 dioxygenase 효소에 대 한 결정을 비교 (k51 s-1 과 k고양이의고양이 / 4.26 106 M-1s-1x의KM )와 k고양이다른 dioxygenases /Km 값은 105-108 M-1s-136,,4546 , 47 , 48 , 49 , 50.
DesB 액티브 사이트에서 기판 [는 Fe(II)는 단위체에서 발생 하는 잔류물 잔류물 동안, 잔류물 번호로 표시 됩니다 조정에 기여 두 단위체 잔류물을 가진 이합체 인터페이스에 줬던 이전 다른 단위체에서 그들의 잔류물 번호와 프라임 (즉, Glu377ʹ)으로 표시 됩니다]6. DesB와 4NC의 바인딩 상호 작용을 보여주는 구조 정보의 부재에 구조적 유사성과 차이점 gallate와 4NC 4NC에 의해 DesB 수 저해 하는 방법에 대 한 통찰력을 제공할 수 있습니다. Gallate Fe(II) 센터에 조정 되 고 그것의 c 3와 C4 hydroxyls와 Glu377ʹ에 의해 조정 되 고 C5 수 C3, C4 및 C5, 3 개의 수 산 기 치환 기는 (그림 8). C1에 carboxylic 산 그룹은 DesB 액티브 사이트에서 티 르-391ʹ, Tyr-412ʹ, Thr-13, 및 Thr-267에 의해 조정 됩니다. DesB의 겸손 한 억제제 판명, 4NC 두 hydroxyls Fe(II) 센터와 C1 니트로 그룹 (하면서도 조정에 대 한 두 개의 oxygens 391, 412, 13, 및 267 잔류물에 의해), 하지만 훨씬 더 isosteric는 카복실산을 조정할 수 있다 전자-철회 carboxylic 산 보다 gallate에. 억제제가 기판에 5 초과 때 4NC gallate의 DesB dioxygenation의 36.6% 억제만을 표시, 그것 그것은 매우 강력한 억제제 아니었다 놀라운 일이 아니다 (와는 K나 2.3 ± 0.3 m m). 이 C5 수 산 기 및 C1 치환 기 효소 ligand 복합물을 홍보에 중요 한 역할을 담당할 것을 제안 합니다. 잔류물 Glu377ʹ, Tyr-391ʹ, 및 Tyr 412ʹ 모두 이러한 상호 작용에 연루, 이후이 인접 한 단위체와 DesB 액티브 사이트 연락처는 화합물 및 활성 사이트 구성의 배치에 대 한 중요 한 건의 한다.
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Disclosures
저자는 아무 경쟁 금융 관심사 또는 다른 충돌 있다.
Acknowledgments
우리는 기술 지원에 대 한 웨슬리언 대학교의 박사 카밀 켈러를 감사 하 고 싶습니다. 혐 기성 단백질 정화 방법 및 O2의 사용에 관한 그들의 조언에 대 한 특별 감사 교수 린지 디 Eltis 제 나 K. Capyk 브리티시 컬럼비아의 대학에서 뿐만 아니라 오스틴에 있는 텍사스 대학에서에서 기독교 휘트먼 -민감한 전극.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Isopropyl β-D-1-thiogalactopyranodise | Gold Bio Technologies | I2481C50 | |
| Coomassie Brilliant Blue R-250 | Bio-Rad | 161-0400 | |
| Ammonium persulfate | Bio-Rad | 161-0700 | |
| 30% Acrylamide | Bio-Rad | 161-0158 | |
| N,N'tetramethyl-ethylenediamine | Bio-Rad | 161-0801 | |
| Amylose Resin High Flow | New England Biolabs | E8022S | |
| BL21 (DE3) competent Escherichia coli cells | New England Biolabs | C2527I | |
| L-cysteine | Sigma Aldrich | C7352 | |
| gallic acid | Sigma Aldrich | G7384 | |
| 4-nitrocatechol | Sigma Aldrich | N15553 | |
| Ferrous ammonium sulfate | Mallinckrodt | 5064 | |
| Sodium dithionite | Alfa Aesar | 33381-22 | |
| wheaton serum bottles | Fisher Scientific | 06-406G | |
| 25 mm Acrodisc PF Syringe Filter with Supor Membrane | Pall Corportation | 4187 | |
| 400 mL Amicon Stirred Cell Concentrator | EMD Millipore | UFSC40001 | |
| 76 mm Millipore Ultracel 10 kDa cutoff reconsituted cellulose membrane filter | EMD Millipore | PLGC07610 | |
| DL-dithiothreitol | Gold Bio Technologies | DTT50 | |
| Sephadex G-25 coarse desalting gal column | GE Healthcare | 17-0033-01 | |
| 2 mL Crimp-Top Vials | Fisher Scientific | 03-391-38 | |
| Oxygraph Plus Electrode Control Unit | Hansatech Instruments | OXYG1 Plus | |
| Oxygen Eletrode Chamber | Hansatech Instruments | DW1 | |
| Electrode Disc | Hansatech Instruments | S1 | |
| PTFE (0.0125 mmX25mm) 30m reel | Hansatech Instruments | S4 | |
| Electrode cleaning Kit | Hansatech Instruments | S16 | |
| Spacer paper | Zig Zag | available at any gas station | |
| He-series Dri-Lab glove box | Vacuum/Atmospheres Company | ||
| HE-493 Dri-Train | Vacuum/Atmospheres Company | ||
| Double-Ended Micro-Tapered Stainless Steel Spatula | Fisher Scientific | 21-401-10 | |
| DWK Life Sciences Kimble Kontes Flex Column Economy Column | Fisher Scientific | k420400-1530 | |
| 10 μL, Model 701 N SYR, Cemented NDL 26s ga, 2 in, point stlye 2 syringe | Hamilton | 80300 | |
| DWK Life Sciences Kimble Kontes Flex Column Economy Column | Fisher Scientific | K420401-1505 | |
| Emulsiflex-C5 high-pressure homogenizer | Avestin | ||
| B-PER Complete Bacterial Protein Extraction Reagent | Thermo Fisher Scientific | 89821 | |
| Lysozyme from chicken egg white | Sigma Aldrich | 12650-88-3 | |
| Sodium dodecyl sulfate | Thermo Fisher Scientific | 151-21-3 | |
| ampicillin | Sigma Aldrich | 7177-48-2 | |
| Tryptone | Fisher Scientific | BP-1421-500 | |
| Yeast extract | Fisher Scientific | BP1422-2 | |
| Sodium Chloride | Fisher Scientific | S271-10 | |
| Potassium Chloride | Fisher Scientific | P217-3 | |
| Magnesium Chloride | Fisher Scientific | M33-500 | |
| Dextrose | Fisher Scientific | D16-3 | |
| Sodium Hydroxide | Fisher Scientific | S318-1 | |
| Tris hydrochloride | Fisher Scientific | BP153-500 | |
| Maltose | Fisher Scientific | BP684-500 | |
| Glycine | Fisher Scientific | G46-500 |
References
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- Colabroy, K. L., Smith, I. R., Vlahos, A. H. S., Markham, A. J., Jakubik, M. E. Defining a kinetic mechanism for l-DOPA 2,3 dioxygenase, a single-domain type I extradiol dioxygenase from Streptomyces lincolnensis. Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Proteins and Proteomics. 1844 (3), 607-614 (2014).
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