Summary
Burada anaerobik protein saflaştırma, anaerobik protein konsantrasyonu ve bir oksijen elektrot sistemi kullanarak sonraki kinetik karakterizasyonu için bir iletişim kuralı mevcut. Yöntem enzim DesB, daha istikrarlı ve etkin saflaştırılmış ve anaerobik bir ortamda bir dioxygenase enzim kullanarak gösterilmiştir.
Abstract
Oksijen duyarlı proteinler, oksijen bir substrat olarak kullanan bu enzimler de dahil olmak üzere geleneksel Aerobik arıtma yöntemleri kullanarak saf zaman istikrar azaltılabilir. Bu makale tamponlar ve reaktifler, sütun Kromatografi için yöntemleri hazırlanması bir torpido ve kinetik önce protein desalting Anaerobik arıtma işlemi, ilgili teknik ayrıntılar gösterir. Ayrıca açıklanan hazırlama ve oksijen kullanan enzim kinetik karakterizasyonu gerçekleştirmek için bir oksijen elektrot kullanarak yöntemlerdir. Bu yöntemler dioxygenase enzim DesB, bakteri Sphingobium sp. zorlanma SYK-6 dan gallat dioxygenase kullanarak gösterilmiştir.
Introduction
Demir veya oksijen etkinleştirmek için diğer metaller enzimlerin kez onların kaldırılması nedeniyle azalan bakiyeli bir hücre ortamından inactivation arıtma işlemi sırasında yatkındır. Bu nedenle, bu proteinler hücre lysates kullanılması gerekir, dış azalan bakiyeli acentelere tabi veya anaerobik en uygun enzimatik aktivite1,2,3,4olması için saf. Çoğu bu enzimler için oksijen anaerobik koruyarak tüm arıtma ve karakterizasyonu adımları gerçekleştirme duyarlı (enzimler) özellikle demir içeren, tam olarak onları tanımlamak gereklidir. Bu araştırmacılar tüm Laboratuvar set-up anaerobik salonları protein ifade ile kristalografisi5,6,7,8 arasında değişen çalışmaları için sınırları içinde geliştirmek için neden olmuştur .
Burada, biz yöntemleri anaerobik arıtma ve enzim bir oksijen elektrot sistemi kullanarak DesB kinetik karakterizasyonu için rapor. DesB gallat dioxygenase bakteri Sphingobium sp. zorlanma LigAB, protocatecuate dioxygenase aynı organizmadan ilgili SYK-6 dan var. Her iki enzim olan kapsamlı tarihi9, kısmen ne zaman standart aerobik kullanarak saf inactivation için duyarlı olmak bu süper enzimler nedeniyle büyük olasılıkla araştırılmamıştır tip II protocatechuate dioxygenase (PCAD) süper ait protein saflaştırma yöntemleri. Süre diğer substrat özel2,10, are biraz PCAD enzim substrat karışıklık göstermek bu yana daha fazla bu süper karakterizasyonu özgüllük belirleyicileri tanımlamak gereklidir. Birkaç enzim superfamilies11,12,13,14,15' te gözlemlediği gibi küçük moleküller ile doğrudan rekabet inhibisyon aktivitesi veya bağlama alter molekülleri artışa neden olmaktadır allosteric cepler ayırmak veya enzimatik aktivite16azaltmak için. Kinetik yalnız bir modülatör ciltleme konumu ayırt edemez, bir etkinlik değişikliğin büyüklüğünü belirleme etkileri anlamak için önemlidir. Yerli DesB etkinliği ve faaliyete 4-nitrocatechol (4NC), karakterize ve dioxygenase enzimler2,17, inhibe için yaygın olarak kullanılan bir bileşik huzurunda kinetik karakterizasyonu böyle, yöntemleri 18, gösterilir.
DesB gallat, bir lignin elde edilen aromatik bileşik yolu ile extradiol dioxygenase (EDO) reaksiyon hangi ringde oksijen yüzeylerde10,19biri olarak kullanarak açılış katalizlenir yıkmak yapabiliyor. Bu enzimatik reaksiyon bir aromatik heteropolymer bitkiler hücre duvarında bulunan lignin, dağılımı bağlamında oluşur. Lignin depolymerized, aromatik bileşikler çeşitli verimli daha fazla merkezi metabolitleri3,20,21,22,23,24 bölünebilir ,25,26,27,28,29,30,31,32,33 . Extradiol dioxygenases (EDO) bir halka dihydroxylated aromatik bileşikler, bölünme bitişik metal koordine diol oluştuğu bir tepki açılış katalizler; Buna ek olarak, intradiol dioxygenases iki hidroksil grubu (Şekil 1) benzer aromatik bileşikler ayırmak. EDOs, birçok diğer metaloenzimlerde gibi bir iki-histidin, bir-karboksilat Triad'ın9,34,35oluşan koordinasyon Fe(II) için bir divalent metal merkezi var. Enzim etkin olmayan2,36,37,38işlenir, ancak bu metaloenzimlerde, autoxidation veya inactivation mekanizması tabanlı, okside olur.
Bu el yazması açıklanan deneysel yordamlar, biz DesB, PCAD süper gallat (Şekil 2A) C4-C5 bağ arasında oksijen eklenmesiyle katalizler için bakteri Sphingobium sp. SYK-6, üzerinden bir üyesi kullanmaktadır. Bu dekolte regiochemistry bir protocatechuate-4, 5-dioxygenase (Şekil 2B) olduğu LigAB için benzerdir. Şimdiye kadar bu gallat dioxygenase araştırmalar hiçbir rapor DesB10,19,39inhibe bileşikleri içerir. Anaerobik yöntemlerin kullanımı ile biz sürekli tekrarlanabilir aktivite ile protein almak mümkün iken Aerobik arıtma yöntemleri kullanımı ile değişken etkinlik, DesB sergiledi. Burada açıklanan kinetik çalışmalar DesB, DesB gallat ile reaksiyon ve DesB inhibisyonu 4-nitrocatechol (4NC) tarafından kinetik karakterizasyonu anaerobik arıtma için yöntemleri gösterir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. genel malzeme ve Yöntemler
- Gerekli ortam Tablo 1' de açıklandığı şekilde hazırlayın. Otoklav 120 ˚C 15 dk. steril, MgCl2 ve glikoz, eklenmesinden sonra 0.2 µm filtreden geçirerek SOC çözüm filtre uygulayın. Miller'ın Lysogeny suyu (LB medya) çözüm ısıyla önce pH ayarlayın. LB-Amp medya çözüm ısıyla 0.2 mm L-sistein, sonra 0,1 mM demir amonyum protein ifade ve çözünürlük artırmak için sülfat steril çözümleri ile sonra ek.
- Laemmli tampon ve çalışan tampon polyacrylamide jel elektroforez (sayfa) için Tablo 2' de açıklandığı şekilde hazırlayın. (1 M HCl ve Tris Bankası için arabellek hazırlık kullanarak) çözümler pH onların son birimlere bileşenleri sulandrarak önce ayarlayın.
- Arabellekleri protein arıtma için Tablo 3' te açıklandığı şekilde hazırlayın. (1 M HCl ve Tris Bankası için arabellek hazırlık kullanarak) çözümler pH onların son birimlere bileşenleri sulandrarak önce ayarlayın.
- Hazırlanan arabellekleri bir delikli lastik tıpa ile mühürlü ve bir cam tüp içeren bir şişe aktarın.
- Bir hortum tıpa cam tüpe bir vakum kaynağına bağlanmak için kullanın. Yaklaşık 30 dakika orta hızda karıştırma süre için negatif basınç altında degas çözüm izin verin.
- Mühür ilk, o zaman vakum açmak vakum kır. Ardından, iki 20 G iğneler (bir şişe ve bir gaz kaçış havalandırma kullanılabilecek daha kısa iğnenin altına ulaşmak yeterince uzun bir zaman) ile lastik tıpa pierce. Nitrojen 30 dk için orta hızda karıştırma sırasında sürekli bir akış içinde kabarcık.
- İğneler kaldırmak ve gaz giderme ve azot kabarcıklanma üç devir toplam için yineleyin. Ne zaman tamamlanmak, düzgün bir sağlam kauçuk tıpa şişeyle kapatın. Daha fazla tıpa parafin film ve bakır tel (20 G) ile güvenli ve torpido koyun.
Not: Tüm malzemeler torpidoda yerleştirilmiş ve ardından oksijeni vakumlama ve azot ile dolum antre, tasfiye 3 kür tabi. Arıtma ve toplama için kullanılan arabellek şapkalı ve torpido gözünde süresiz olarak saklanır.
- Yaklaşık bir spatula (0.31 "x 2", Çift uçlu micro-konik paslanmaz çelik spatül küçük ucunu) 1.5 mL microcentrifuge tüp degassed suda yaklaşık 1 ml sodyum dithionate dolu çözülerek sodyum dithionate çözüm hazırlamak . Tüp parafin film önce torpido kaldırılması ile kapatın.
Not: katı sodyum dithionate oksidasyonu önlemek için eldiven kutusunda saklayın.
2. Protein arıtma Amiloz sütun hazırlanması
- Yüksek akış Amiloz reçine (15 mL) 5 sütun cilt (75 mL) ile birlikte gelen bir bulamaç Amiloz sütun tampon yapın. Her şişe bir lastik septum ile mühür ve reçine Bulamaç iki 50 mL serum şişe aktarabilirsiniz. 20 G, 305 mm iğne septa ve kabarcık nitrojen oksijen süspansiyon kaldırmak yaklaşık 1 dakika bulamaç içine delik. Reçine ve protein içeren çözüm eldiven kutusuna aktarın.
- Torpido gözünde, reçine reçine yerleşmek ve bir düzey yatak oluşturmak izin basit bir stopcock ile donatılmış bir 2 x 30 cm borosilikat sütun içine dökün. Sütun tampon drenaj ve sütun 3 sütun cilt (~ 30 mL toplam) basınçlı azot gazı çözücü hemen üstünde olana arabellek yaklaşık 1 damla/s veya 5 mL/dk, reçine ile itmek için kullanarak degassed Amiloz sütun arabelleği ile equilibrate reçine yatak.
Not: sonra protein eluted (bkz. Adım 3.5 aşağıda) Amiloz sütun reçine 1 sütun hacmi (10 mL) su, sonra % 1 Sodyum Lauryl Sülfat (SDS) hacmi 1 sütun ve son olarak, 3 sütun cilt (30 mL) su ile yıkayarak yeniden oluşturulur. Bu adımı torpido dışında tamamlanabilir. Sütun reçine % 20 etanol içinde 4 ° C'de depolanan ve ilâ 5 kere yeniden oluşturulabilir.
3. protein ifade ve DesB anaerobik arıtma
Not: DesB gen ticari olarak, evde beslenen hayvan-15b, evde beslenen hayvan-32a ve pMAL-c5x vektörler siteleri klonlama NdeI ve BamHI kısıtlama kullanarak yerleştirilmiş sentez.
- Protein ifade deneyleri (aşağıda kısaca açıklanmıştır) büyük ölçekli ifade için doğru koşulları belirlemek için üreticinin esaslarına göre tamamlayın.
- DesB içeren plazmid ticari olarak yapılmış, kimyasal olarak yetkili E. coli dönüştürmek BL21 (DE3) hücreleri, üreticinin yönergelerine göre. Kısacası, 10 min için buz hücrelerdeyse çözülme, yaklaşık 10-50 ng plazmid DNA, hücre, Isı şok hücreleri 10 42 ° C'de karışıma s ve onları bir ek 5 dk. 1 ml son hacim elde edilir ve izin eklemek SOC kitle için buz üzerinde kuluçkaya hücreler için 60 dk 37 ° C'de (~ 200 devir/dakika) sallamak. LB-Amp plakasına eklemek ve hücre çözümü 100 µL yaymak ve gecede 37 ° C'de kuluçkaya
- Tek bir koloni oluşturan birim plaka sonra gece kuluçka seçin ve 10 mL LB-Amp medya aşılamak için bu koloni kullanın. Hücreleri gecede, 37 ° C'de (~ 200 devir/dakika) sallayarak ile büyümek
- 10 mL medya için 100 µL gecede büyüme çözüm ekleyin ve 37 ° C'de 3.1.2. adımda açıklandığı gibi yeni medya sallamak Ne zaman optik yoğunluk 600 nm (OD600) 0.4-0.8 arasında izopropil β-D-1-1 mM bir nihai çözüm konsantrasyonu elde etmek için thiogalactopyranoside (IPTG) eklemek.
- Hemen çözüm 1 mL aliquot kaldırmak ve etiketli zaman ile 1.5 mL microcentrifuge tüp aktaran = 0 saat. 15.000 x g hücreleri cips için 10 dakika için de tüp spin. İplik sonra süpernatant çıkarın ve 4 ° C'de hücreler saklayın
- Ek aliquots (1 mL her) IPTG yanı sıra (genellikle, 5, 10, 12, 18 ve 24 s) sonra zaman aralıklarında kaldırın. 3.1.4. adımda açıklandığı gibi her tüpün santrifüj kapasitesi, süpernatant dikkatle boşaltmak ve 4 ° C'de hücreler depolamak
- Tüm aliquots elde edilen, resuspend sonra hücrelerden her timepoint 30 µL bakteriyel protein ayıklama çözümünün içinde onları 10-15 dakika oda sıcaklığında kuluçkaya ve çözünür ve çözünmez ayırmak 5 dak için 15.000 × g de tüpler santrifüj kapasitesi proteinler.
- Çözünür protein çözüm için yeni bir microcentrifuge tüp aktarmak ve kalan çözünmez granül 30 µL bakteriyel protein ayıklama çözüm ile resuspend.
- Her çözüm (her timepoint için hem çözünür ve çözünmez çözümler) 30 µL Laemmli arabellek eşit bir hacmi ile birleştirmek, sonra bir SDS-sayfa jel40görselleştirmek. Çözünür kesir büyük ölçekli protein ifade ve arıtma için doğru boyutu bantlarında içeren kulvar için karşılık gelen koşullar'ı seçin.
Not: bu yana en az çözünür protein başlangıçta Yukarıdaki koşullar kullanılarak oluşturulan, 0.2 mM L-sistein ve 0,1 mM demir amonyum sülfat gelişmiş protein gösterilen çözünür protein ifade üzerindeki etkileri için test etmek için çeşitli takviyeleri eklenmiştir ifade. Bu protein ifade ekran göre uygun ifade vektör DesB çözünür üretimi için pMAL-c5x vektör oldu.
- Dönüştürme Escherichia coli BL21 takip (DE3), bakteriyel Kültür (200 devir/dakika ve 37 ° C sallayarak ile yetişkin bir gecede) 900 µL % 80 gliserol 100 µL ile birleştirerek DesB/pMal-c5x bir hazır olun. Hisse senedi-80 ° C'de kriyojenik bir tüp içinde saklayın.
Not: yeni bir hisse senedi yaklaşık 6-8 ayda donmuş olun. - Pipet Ucu hücreleri donmuş stoktan scrape ve gecede 5 mL LB-Amp medya sallayarak ile 37 ° c de büyüyen bir bakteri kültürü başlatmak için kullanın. 2 lt şişeye 37 ° C ve 200 devir/dakika, gece yetişkin bakteri kültürü kullanarak, medyada LB-Amp 1,5 litre aşılamak.
Not: oksijen için protein gözlenen duyarlılık nedeniyle, bu o azaltılmış headspace şişesi ve hızı geliştirilmiş protein verim için büyük ölçekli ifade sallayarak orta bulundu. - Protein ifade teşvik zaman optik yoğunluk 600 nm (OD600) 0.4-0.8 ile 1 mM IPTG arasındadır ve 0.2 mM L-sistein ve 0,1 mM demir amonyum sülfat ile desteklenmiştir. İnkübasyon sıcaklığı 30 ° c daha düşük ve 200 devir / dakikada sallamak. Santrifüjü 24 saat sonrası indüksiyon 4.700 x g 10 dakika için sonra üzerinden hücreleri aşağı spin ve harcanan medya atın.
- Hücre Pelet Amiloz sütun arabellek her 1, 5 L büyüme, lizozim 1 mg ek tarafından takip başına 20 ml resuspend. 20 dakika boyunca buzda karıştırın.
Not: Daha fazla arabellek çözüm çok viskoz ise, protein çok viskoz çözümleri aşağıdaki homojenizasyon adım engel olabilecek ilave edilebilir. - Resuspended hücre eriyik yolu ile yüksek basınçlı homojenizasyon yaklaşık 15.000 psi de 3-5 geçer ile parçalayıcı. Protein 50 mL santrifüj tüpü aktarmak ve 1 dk. için azot ile headspace floş. Sonra hücre çözünmez enkaz kaldırmak 40 dakika 20.000 x g de lysate santrifüj kapasitesi.
Not: Başarılı homojenizasyon formu micelles için protein tüp ve koleksiyon şişesi içine akar ve çözüm yarı saydam bir gri-kahverengi renk görüntülenir gibi neden olur. Homojenize protein süreci boyunca buz üzerinde tutun. - Santrifüjü sonra transfer süpernatant (gerekli olabilir daha fazla), bir 50 mL tüp içine tüp ile kauçuk septum ve yavaş yavaş kabarcık azot gazı oksijen yerinden 2 min için çözümü üzerinden bir 20'lik iğne ile kap. Septum parafin film ile sarın ve daha fazla bakır tel ile güvenli ve torpido sütun malzemeleri ile birlikte süpernatant getirmek.
- Sütun equilibrate (bkz. Adım 2.3) ve sütun süpernatant protein yük. Akış ile 5 mL kesirler Orta Basınçlı azot (1 damla/saniye veya yaklaşık 5 mL/dak) altında toplamak. Daha sonra başka bir 3 sütun birimleri Amiloz sütun arabelleği kullanarak sütun yıkama ve el ile cam test tüpleri Orta Basınçlı azot (yaklaşık 5 mL/dk) altında 3 mL kesirleri toplamak. 5 sütun cilt (~ 50 mL) elüsyon arabelleği kullanarak protein elute ve el ile 3 mL kesirler orta azot basıncı (yaklaşık 5 mL/dk) altında toplamak.
Not: Yerçekimi filtrasyon kullanarak kesirler alternatif olarak toplanabilir. Yaklaşık 12 elüsyon kesirler toplanmalıdır. - Kesirler 30 µL aliquots toplamak ve bunları protein içeren görselleştirme izin vermek için eldiven kutusundan kaldırmak kesirler SDS-sayfa analizi yoluyla.
Not: Toplanan kesirler torpido gözünde bu test süresince kalır. Saf DesB genellikle sütunundan kesirler 3'ten 5 yer elutes.
4. anaerobik Protein konsantrasyonu/tamponu Exchange
- Basınçlı, çalkalanmış hücre yoğunlaştırıcı 76 mm Sulandırılan selüloz membran filtre (10 kDa kesme) ile bir araya getirin. % 20 etanol yeterli miktarda içine monte yoğunlaştırıcı eldiven kutusuna aktarılır gibi ıslak membran tutmak için dar kurutma başlığını ekleyin.
Not: membran içinde gözyaşı olduğunu ve O-ring buruşuk değil olun. - Torpido karıştırılmış hücre yoğunlaştırıcı getirdikten sonra etanol çözüm kapalı membran su ile yıkayın. Kap ve karıştırılmış hücre boru ve membran aşırı herhangi bir su temiz için baskı yapmak.
- SDS-PAGE tarafından (Şekil 3) için yoğunlaştırıcıyı saptanan protein içeren tüm kesirler ekleyin. Toplam protein çözüm cilt 150 mL vermeye yeterli Döviz arabellek ekleyin.
- Bir dış N2 satırını kullanarak karıştırılmış hücre odası basınç ve hız karıştırarak orta ile protein 50 ml konsantre.
Not: 50 mL konsantrasyonu elde yaklaşık 20 dk sürer. - 100 mL 0,1 mM dithiothreitol (DTT) ve 0,1 mM demir amonyum sülfat ile Satım arabelleği ek, çözüm karıştırılmış hücreye ekleme ve ılımlı karıştırma hızı bir protein toplam hacmiyle 50 mL konsantre.
- Çözüm 50 mL hacmi ulaştıktan sonra ilave Satım arabellekte bir kez daha eklemek ama çözüm 10 mL toplam hacmiyle hız karıştırarak orta ile konsantre.
- Bireysel 0.2 mL polimeraz zincir reaksiyonu (pcr) tüpler içine (her yaklaşık 150 µL protein çözüm içeren) bir 0,45 µm gözenek boyutu şırınga filtre ve aliquot kullanarak yoğun protein filtre. Şapkalı aliquots eldiven kutusundan kaldırmak ve hemen flaş dondurma onları sıvı azot ile. Aliquots-80 ° C'de depolayın
5. desalting DesB
- Kullanmadan önce yaklaşık 1,5 saat eldiven çanta azot gazı ile yıkayın.
- 150 µL aliquot saf DesB protein buz eldiveni çanta içinde çözülme.
- Protein Tammy'nin iken, Sephadex G-25 kaba desalting jel 9 mL borosilikat sütun 3 mL içeren sütun desalting küçük bir yerçekimi hazırlayın. Bir sütun 2 sütun cilt (~ 6 mL) ile yıkayın degassed tampon desalt.
Not: desalting jel (yaklaşık 7 kullanır sonra) sarı beyaz renkli jel bir değişiklik olduğunda değiştirin. - Sütuna bir yerçekimi kontrollü süreci ile çözülmüş DesB yükleyin. Akışı aracılığıyla atın. Protein ile arabellek desalting yaklaşık 5 mL elute.
Not: Hangi sütundan çözümleri damla oranı sürekli eldiven torba doldurma gaz tank basıncı etkiler. - Protein elüsyon sütundaki ilk belirlenmesi için 12 şişe/elutions (şişe başına 3 damla içeren) toplamak. Kauçuk septum ile mühürlenmiş, onları eldiven çanta ve protein varlığı için test doğrudan (SDS-sayfa jel Analizi) yoluyla kaldırmak ya da dolaylı olarak (açmasıyla her kesir etkinliğinin).
Not: Genellikle, kesirler ayrı ayrı faaliyet için kesir aktif protein büyük bir konsantrasyon ile karşılık gelen en büyük aktivite ile 7.1, adımda anlatıldığı gibi test edilmektedir. DesB genellikle aşağıdaki 9 damla desalted protein sonra toplanan 7 düşüş başlayan elutes. Protein aliquots buzda kinetik ölçümleri (adım 7.1 7.4) sırasında saklanır.
6. oksijen elektrodu hazırlanması
- Siyah oksit mevduat belirtisi yok görünür olana gümüş anot halka ve platin elektrot temiz ve nemli bir Q-tip katotlu Lehçe.
- Makasla, yaklaşık bir 1.5-inç kare rondela kağıt (veya eşit inşaat su kuyusu sigara haddeleme kağıt) kesti. Sonra her yüz kare ve 2) yırtmaçlı üzerine 1) küçük üçgenler kaydırma elektrot yardım için köşe kesti.
- %50 KCl çözelti gümüş anot üzerine 5 damla groove ve çözümün bir sürekli halka şeklinde çok onları bağlamak ekleyin. Platin elektrot üstüne % 50 KCl çözüm 2 damla ekleyin. Dikkatle platin elektrot üstüne çıta kağıdı yerleştirin ve böylece hiçbir hava kabarcıkları spacer kağıt pürüzsüz.
Not: spacer kağıt yırtılma önlemek için dikkatli olun. - Yaklaşık 2 inç uzun S4 30 m PTFE (Politetrafloroetilen) membran bir parça keser ve spacer kağıdın üstüne yerleştirir. Elektrot dış halka ile uyumlu olan membran kenarları kesti.
- O-ring aplikatör kullanarak, küçük O-ring spacer kağıt ve membran elektrot üzerine güvenliğini sağlamak için elektrot üzerine itin. Hiçbir membran altındaki sağlanması daha büyük O-ring elektrot, dairesel oluk üzerine yerleştirin. Elektrot kaidenin üzerine üst TMMOB slayt ve birlikte iki vida.
Not: İki üzerinde düzgün hiçbir hava kabarcıkları sopa için odasının tarafında vidalı. - Birleştirilmiş elektrot kaidesi üzerinde yerleştirin ve elektrot izleme sisteme bağlayın. Elektrot denetim programı başlatmak ve sıvı faz kalibrasyon Protokolü (Şekil 4A) gerçekleştirerek elektrot kalibre. Sıcaklık değişken deneme gerçekleştirildiği oda sıcaklığını olmalı ve ortam basıncı değişken bölge ve mevcut hava koşulları üzerinde bağlıdır.
Not: Ortam basıncı hava raporu bölge için elde edilebilir. - 1 mL 25 mM Tris arabellek elektrot odasına ekleyin, pompayı takın, doymuş oksijen çözümünü kalibrasyonu başlar ve karıştırıcı hızını 100'e ayarlayın. Elektrot stabilize sonra doymuş çözüm belirlenir oksijen kalibrasyon ayar noktası (Şekil 4B).
- Pistonu kaldırmadan, herhangi bir hava kabarcığı (Şekil 4 c) ekleyerek önlemek için dikkatli olmak odanın içine yaklaşık 1 mL sodyum dithionite çözeltisi enjekte için 1.2 x 40 mm iğne ve 1 mL şırınga kullanın. Kauçuk tıpa elektrot odası hemen sodyum dithionite eklenmesinden sonra mühür için kullanın.
- Kalibrasyon oksijeni kullanılmaktadır ve programı tamamlanıncaya kadar devam ve kalibrasyon (Şekil 4 d) kaydetmek izin verir. Odası çözümden Aspire edin ve 5 - 6 kez dalgıç ve odası deiyonize suyla durulayın sodyum dithionite tümüyle kaldırılmasını sağlamak için. Durulama, bir yan-kol vakum şişesi bağlı bir pipet ucu ile donatılmış bir plastik tüp kullanın. Membran zarar vermemek.
7. kinetik deneyleri oksijen elektrodu kullanarak
- Seri olarak 25 mM Tris tamponunun pH 7.5 ile bir çözümde 1 µL enzim çözüm etkinliği için test ve 100 µM gallat içeren aktif protein içeren desalted aliquots tanımlayın. Aliquot(s) en büyük gözlenen etkinliği ile kalan deneyler için kullanın. (Bkz. Adım 5.5.1)
- O2 tüketimi bir O2kullanarak ölçerek enzimatik reaksiyon hızını belirlemek-hassas Clark-türü elektrot elektrot kontrol ünitesi ile bilgisayar entegrasyonu ile.
- DesB ölçümü için her kinetik veri noktası, 1 mL 25 mM Tris arabellek (pH 7.5) elektrot odasına ekleyin. Hesaplanan hacmi 25 mM stok çözeltisi gallat istenen final substrat konsantrasyonu (0,05-25 mM) elde etmek için Tris arabelleğe ekleyin.
Not: her gün taze stok çözümleri gallat ve su ile inhibitör bileşikler hazırlamak ve pH 0,1 mM NaOH, ilavesi ile 7,5 için ayarlayın. - 10 sonra çözümü, karıştırma için sağlamak için karıştırma s odası pistonu ile yavaş yavaş mühür ve aşağı üst vida. Temiz bir mendil odasından yerlerinden aşırı sıvı emmek için kullanılabilir. Nereye o-ebilmek üretmek enzim (arka plan O2 tüketim oranını ± 0.5 µM/dk) eklenmesi için devam etmeden önce en az 1 dakika için çözüm içinde oksijen konsantrasyonunun istikrarlı bir ölçüm equilibrate elektrot izin.
- Bir gaz sıkı 10 µL şırınga kullanarak, enzim (yaklaşık 3-7 µM enzim) yaklaşık 1 µL pistonu ile elektrot odaya ekleyin.
Not: Enzim miktarının artırılması veya azaltılması yanıt-e doğru var olmak yeterli tepki oranları için izin vermek için belirli aliquot gözlenen etkinliğin içinde. - İlk 30 yamaçta göre reaksiyon hızı hesaplamak s doğrusal veri enzim ek sonra ve doğru için arka plan O2 tüketimi 30 kullanarak veri hemen önce enzim ek s. Kataliz O2 tüketimi (Şekil 5A) hızına eşit bir oranıdır.
- Bir plastik tüp kullanarak aspirasyon ile elektrot odaya verilen substrat konsantrasyonu oranı veri toplandıktan sonra boş bir yan kol vakum şişesi bağlıyken ve art arda 4-6 döngüleri için su ile durulama. Elektrot çözümde kullanarak yeni bir substrat konsantrasyonu 7.2.1. adımda açıklandığı gibi ayarlayın.
- Sıralı olmayan bir şekilde substrat konsantrasyonu değişir ve enzim aktivitesi (5B rakam) zamanla düşüşler için hesabına deneme seyri boyunca çoğaltır.
Not: belirli bir konsantrasyon çoğaltır çalıştırılır ve bir önceki çalışma için göre oranı % 30 azalma daha fazla göstermek zaman, hiçbir ek deneyleri enzim bu toplu işlemle gerçekleştirilmesi gerekiyor. Tipik olarak, 30-40 çalıştıktan sonra enzim aktivitesi % 30 azalma gösterir. - Kkedi (substrat dönüştürmeye ürün katalitik sabiti) ve Km (operasyonel ilk hızı olan substrat konsantrasyonu tanımlanan Michaelis sabiti, kinetik parametreleri belirlemek yarısı maksimum hız), en küçük kareler uygun GraphPad prizma kullanarak verilerin her birinden substrat konsantrasyonu Michaelis−Menten Denklem (Şekil 6) tarafından.
- DesB ölçümü için her kinetik veri noktası, 1 mL 25 mM Tris arabellek (pH 7.5) elektrot odasına ekleyin. Hesaplanan hacmi 25 mM stok çözeltisi gallat istenen final substrat konsantrasyonu (0,05-25 mM) elde etmek için Tris arabelleğe ekleyin.
- 4-dioxygenation kinetik üzerindeki etkisini test etmek ve DesB ile inhibisyon sabiti (Kben) belirlemek için nitrocatechol (4NC) ekleyin. Her reaksiyon koşul için stok çözümleri Tris (50 mM), gallat (25 mM) ve 4NC (25 mM) birleştirilir ve 2 mL solüsyon 25 mM Tris arabelleği (pH 7.5) ile 1 mM gallat verim için su ile seyreltilmiş ve 4NC konsantrasyonları değişen. 4NC hacmi istenen son inhibitör konsantrasyon (0,05-20 mM) elde etmek için çeşitli.
- Karıştırma, karıştırma çözümü sağlamak için 10 saniye sonra yavaş yavaş odasında pistonu yer ve aşağı üst vida. Temiz bir mendil odasından yerlerinden aşırı sıvı emmek için kullanılabilir. Elektrot equilibrate ve istikrarlı bir ölçüm enzim (arka plan O2 tüketim oranını ± 0.5 µM/dk) eklenmesi için devam etmeden önce en az 1 dakika için çözüm içinde oksijen konsantrasyonunun üretmek izin verir.
- Daha önce açıklandığı gibi protein (adım 7.2.3) ekleyin, reaksiyon oranı (adım 7.2.4) belirlemek ve sonraki durum için elektrot sıfırlamak.
- Bu dizi deney parçası olarak birden çok kez inhibitörü yokluğunda reaksiyon oranı belirler. İnhibisyon çeşitli inhibitörü konsantrasyonları ile 1 mM substrat huzurunda oksijen Tüketim oranları ve inhibitörü (v/vo) yokluğunda standardizasyon tarafından belirler.
- İnhibisyon gallat dioxygenation denklem 7.3A için ve sonra inhibisyon veri denklem grafik programı (Şekil 7) kullanarak 7.3B için uygun.
- Her deneme için kesin enzim konsantrasyonu tüm kinetik metinler tamamlanmasından sonra Bradford tahlil gerçekleştirerek belirlemek.
Not: Tüm fiyatlar için enzim yoğunlaşması düzeltildi. Bu adım bir torpido gözü ya da eldiven çantanızda yapılması gerekmez.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Gösterilen SDS-sayfa jel saflaştırılması maltoz DesB bağlayıcı protein (MBP) füzyon yapı (Şekil 3) üzerinden bireysel kesirler analizidir. Jel protein saf olduğunu ortaya koymaktadır (MW 91.22 kDa =), DesB varlığı dışında (MW 49.22 kDa =) ve MBP protein etki alanı (42 kDa) birbirinden i ciddi. Kesirler E2 ve E3 konsantrasyonu (adım 4.2) için seçildi.
DesB kinetik deneyleri tekrarlanabilir sonuçlar doğru derleme, kalibrasyon ve deneysel teknik üzerinde bağlıdır. Bu değişkenler çözümlerinde tahlil (4A rakam) sırasında çözülmüş beklenen O2 yüzdesini belirlemek gibi girdi belgili tanımlık doğru ortam sıcaklığı ve basınç, gereklidir. İlk sinyal 1800 ve 2000 nmol/mL arasında olmalı ve istikrarlı bir oranı sıfıra, çözümün oksijen doygunluğu (Şekil 4B) en az değişiyor belirten yakın üretmek gerekir. En az O2 kadar sodyum dithionate ekleyip odası kapalı sonra O2 tüketim oranı hızla ve sürekli artması gerektiğini (< 60 nmol/mL) çözümde yaptı. Sabit bir negatif eğim 1) monte elektrot hiçbir hava kaçağı var ve 2) elektrot yeterince O2 konsantrasyonu (Şekil 4 c ve D) değişikliklere yanıt gösterir. Çözüm içinde kalan O2 yeterince düşük değilse, kalibrasyon uzaklık değeri hatalı olur. Kalibrasyon da doğru topladığından elektrot ile tekrarlanması gerekir ve taze sodyum dithionite kullanılmalıdır.
Elektrot düzgün kalibre edilmiş, kinetik deneyleri gerçekleştirilebilir. İlk ölçüm 25 mM Tris arabelleği 100 µM gallat ve 1 uL enzim kullanarak taze desalted enzim aktivitesinin kurar. Enzim toplamadan önce Tris tampon ve gallat odasında pozisyonda pistonu ile karıştırılır. Bu yaklaşık bir ilk sinyal 250 ve 350 nmol/mL arasında üretmek gerekir ve enzim eklenmeden önce sinyal (±5 nmol/mL/dk) stabilize etmek. İstikrarlı bir sinyal, değişken yok gösterir (örneğin, yırtılmış membran, artık sodyum dithionite, kirli elektrot) tutarsız ölçümleri neden olabilir. Enzim eklendiğinde, sinyal hızla gerekir ve giderek DesB reaksiyon devam etmeden, O2 gallat ile tepki olarak tüketilen bu yana olduğunu belirten azaltın. Enzim toplama ve katalitik oranı oranı araçlarını kullanarak ve 30 saniye (5A rakam) penceresine ayarlama tarafından belirlendi önce ilk hızı eğimi. Kullanım yaklaşık 1-1,5 saat sonra yaklaşık % 30-50 bu noktada artık olması gerektiği tarafından enzim aktivitesi azalır (Şekil 5B) kullanılır.
Bir kez tüm kinetik ölçüleri alınmış olması, veri modelleme programı (Şekil 6) kullanarak çizilebilir. DesB aktivite gallat ile değişen gallat konsantrasyonlarda O2 tüketim oranını ölçerek elde edilir. Arka plan oranı enzim ek Önce düzeltilmiş oranı elde etmek için Katalitik oranı çıkarılır. Arka plan düzeltilmiş oranı enzim konsantrasyon tarafından bölünmüş ve denklem 7.3A (bkz: adım 7.3.3) monte. KM ve Ksi, başlangıç parametrelerini yeterli bir uyum bağlıdır (ilk parametre:KM 320 mikron, = Ksi = 1600 mikron). Sonuçta en fazla bir plato ulaşır, sonra [gallat] arttıkça biraz aşağı doğru eğimli bir hiperbolik eğri gösterir. Bu enzim substrat inhibisyon yüksek substrat konsantrasyonu, sergiler için tipik bir eğri var.
DesB inhibisyonu ile 4-nitrocatechol oranı DesB oksijen tüketim oranı 1 mM gallat huzurunda 4-nitrocatechol (Şekil 7) değişen konsantrasyonları ile azalma gözlemleyerek tespit edilmiştir. 4-NC konsantrasyonu (oranı inhibitörü huzurunda rahat oranı ile bölündü) normalleştirilmiş etkinliğe karşı çizildi ve denklem 7.3B uygun (bkz. Adım 7.3.3). Bu 4-NC böylece DesB reaksiyon inhibe oksijen tüketimini engeller sonuçlar gösterir.
| Ortam türü | Bileşenleri |
| Catabolite baskı (SOC kitle) ile süper en iyi et suyu | %2 (w/v) tryptone |
| %0,5 (w/v) Maya ayıklamak | |
| 10 mM NaCl | |
| 2.5 mM KCl | |
| 10 mM MgCl2 (Sterilizasyon sonra ekledi) | |
| 20 mM glikoz (Sterilizasyon sonra ekledi) | |
| Miller'ın Lysogeny suyu ile ampisilin (LB-Amp medya) | %0,5 (w/v) Maya ayıklamak |
| %1 (w/v) tryptone | |
| %1 (w/v) NaCl | |
| 0.1 mg/mL ampisilin (Sterilizasyon sonra ekledi) |
Tablo 1. Catabolite baskı (SOC kitle) ile süper en iyi et suyu ve Miller'ın lysogeny suyu ampisilin (LB-Amp medya) ile hazırlanması için malzemeler.
| Çalışma çözüm | Bileşen son konsantrasyonları |
| Laemelli arabellek, pH 6.8 | 100 mM tris (hydroxymethyl) aminomethane (Tris) |
| 200 mM dithiothreitol (DTT), | |
| % 4 Sodyum Lauryl Sülfat (SDS) | |
| % 0.05 bromophenol mavi | |
| % 20 gliserol | |
| Çalışan tampon pH 8.3 | 25 mM Tris |
| 192 mM glisin | |
| %0.1 SDS |
Tablo 2. Laemelli ve çalışan arabellekleri SDS-sayfa analizi için hazırlanması için malzemeler.
| Çalışma çözüm | Bileşen son konsantrasyonları |
| Amiloz sütun arabellek, pH 7.4 | 20 mM tris (hydroxymethyl) aminomethane (Tris) |
| 1 mM ethylenediaminetetraacetic asit (EDTA) | |
| 200 mM NaCl | |
| Elüsyon tampon pH 7.4 | 20 mM Tris |
| 1 mM EDTA | |
| 200 mM NaCl | |
| 10 mM maltoz | |
| Exchange arabellek, pH 7.5 | 50 mM Tris |
| % 10 gliserol | |
| Arabellek, pH 7.5 desalt | 50 mM Tris |
| % 10 t-butanol |
Tablo 3. Protein arıtma için arabellekleri hazırlanması için malzemeler.
Şekil 1: karşılaştırma dioxygenases bulandı halka tarafından katalize reaksiyonların. Dalgalı çizgiler dioxygenase reaksiyonu sırasında nereden bölüneceğini intradiol bölünme (kırmızı) iki hidroksil grupları ve extradiol bölünme (mavi) sonları arasındaki bağ i ciddi karşılık gelen karbon-karbon bağı bir karbon-karbon bağ bitişik göster hidroksil grupları. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Resim 2: DesB ve LigAB tarafından katalize tepkiler, iki tip II protocatechuate dioxygenase (PCAD) süper için ait olan extradiol dioxygenases ilgili. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Şekil 3: SDS-sayfa jöleyi DesB arıtma ve konsantrasyon adımları sayfa bulundu. Şerit aşağıdaki gibi etiketlenir: S = protein standart, FT1 ve FT2 toplanan akışı aracılığıyla kesirler, W1 ve W2 = toplanan yıkama kesirler, E1-E4 = = toplanan kesirler elute. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Şekil 4: kalibrasyon nesil eğriler için oksijen elektrodu. (A) kalibrasyon önce için ortam sıcaklığı ve basınç hava equilibrated çözümleri için oksijen konsantrasyonu belirlemek için programa girilir. (B) doymuş oksijen çözüm denge ulaşır ve bir ileti oluşturur. (C) sodyum dithionate çözüm oksijeni, yararlanmak için oksijen sinyal azalma gösterildiği gibi eklenir. (D) kalibrasyon sinyali sıfır oksijen konsantrasyonu stabilize zaman elde edilir. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Şekil 5: zaman içinde tipik bir kayıp faaliyet gösteren temsilcisi kinetik eğrileri. (A) taze DesB, bir O2 kullanım oranı-56.61 ile kullanarak 100 µm gallat tepki µM/dk. (B) kullanma DesB-29.56 bir ey2 kullanım oranı ile veri toplama, 2 h sonra 100 µm gallat tepki µM/dak burayı tıklayın görüntülemek için bir Bu rakam daha büyük versiyonu.
Şekil 6: DesB aktivite ile gallat, Michaelis-Menton denkleme uygun Arsa (siyah) ve substrat inhibisyon (kırmızı; Haldane denklemi Sığdır Denklem 7.3B). Kinetik parametrelerin iki uygun türetilmiş gibidir: Michaelis-Menten - kkedi 316 17 sn-1, Km +/-= 123 + / 26 mikron; = Haldane - kkedi 570 + /-110 sn-1, Km = = 100 mikron, +/-320 Ksı 1600 600 mikron +/-=. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Şekil 7: Arsa DesB dioxygenation gallat (1 mM), 4-nitrocatechol inhibisyonu. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Şekil 8: DesB tarafından gallat koordinasyonu (pdb ID = 3wr3). Birçok dioxygenases da görüldüğü gibi ligand için aktif iron(II) atom bidentate bir şekilde koordine eder. Yapısal benzerlikler arasında gallat ve 4-nitrocatechol (4NC) bağlı olarak, DesB inhibisyonu 4NC tarafından tahmin edilmiştir. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Aktif, saf DesB protein almak üzere kritik adımlar oluşturan ve enzim azaltılmış Fe(II) aktif sitesinin bakımı içerir. Bu nedenle, indüksiyon, arıtma, konsantrasyon performansını düzeltmek ve desalting adımları başarıyla etkin enzim elde etmek için gereklidir. Protein ifade 1 mM demir amonyum sülfat huzurunda inducing Fe(II) doğru DesB aktif dahil sağlar. Bu yöntem genellikle metal uygun katlama izin vermek için büyüme ortamına ilavesi ve tam doluluk sitesi6,41,42 bağlama metal gerektirir amidohydrolase metaloenzimlerde olanlar gibi çalışmaları esinlenmiştir ,43.
Anaerobik arıtma ve toplama torpido gözünde belki bu protokolü en kritik ve teknik olarak zor adımlar vardır. Torpido oksijensiz bir ortamda korumak için önemlidir. Bu düşük, torpidoda için bağlı eldiven yeşil vardır sağlanması oldukları zaman kutusuna eklenen azot tankları düzenli aralıklarla değiştirerek el ile tarafından öngörülen torpidoyu deoxygenation katalizör korumak gerektirir ve taze kurutucu bir tepsi içinde torpidoda tutmak. Maruz kaldığında rengini değiştirmek için ortam O2 oksijen duyarlı şeritler için O2test etmek için kutusunda yer yerleştirilebilir-ücretsiz atmosfer. Ayrıca, tam olarak tüm arabellekleri ve arıtma ve toplama işlemi sırasında kullanılan çözümler degas gereklidir. En az O2 arabellekleri emin olmak için köpüren ve döngüleri vakumlama azot arasında geçiş yaparken hava degassed arabelleklerinin maruz kalma sınırı için çok dikkat edin.
Sütun torpido gözünde çalışırken, oksijen arabellekleri mevcut olup olmadığını belirlemek için iyi bir test yıkama kesirler biri küçük bir bölümünü almaktır (yaklaşık 0.1-0.5 mL) ve demir çelik ammoni küçük bir bölümünü bir microcentrifuge boru yere koyun Um sülfat ve DTT (konsantrasyon adım için gerekli miktarı daha az). Sonra tüp içeriği karıştırın ve renk değiştir gözlemlemek önemlidir. Çözüm turnike siyah, koyu sarı veya turuncu, oksijen işte protein kesirler sunmak ve orada-ecek beğenmek azaltılmış katalitik aktivitesi tam arıtma ve toplama işleminden sonra olun. Çözüm bir ışık ise lavanta veya çok açık sarı renk, en az O2 mevcut olabilir, ama enzim hala yüksek etkinlik vardır. Koyu sarı turuncu renk değişikliği oksijen olmadığı durumlarda büyük olasılıkla oksidasyon demir amonyum sülfat, demir Fe(III) için pas44şekillendirme neden olur. Bu sorunu gidermek için bu arabellekleri degas ve azot ile ham protein çözüm torpido gözüne yerleştirerek önce 1-2 ekstra dakika kabarcık izin vermek için tavsiye edilir. Ayrıca, torpido gözünde atmosfer gerçekten O2olduğundan emin olmak önemlidir-O2kullanarak ücretsiz-hassas şeritler.
Enzim kinetik karakterizasyonu önce desalting son önemli adım bir oksijensiz atmosfer gerektirir ve saf protein denatürasyon oda sıcaklığında eğilimli olarak buz üzerinde yapılmalıdır. Desalted protein off sütun geldiğinde belirleme en yoğun kesirler en tekrarlanabilir sonuçlar vermek gibi başarılı kinetik deneyleri için esastır. Nerede desalted protein eluted kesir her zaman yeni bir toplu işlemi protein saf ve sütun yeni reçine ile repacked zaman belirlenmelidir. Aktivite sırasında kinetik deneyleri düşüktür ve arıtma ve toplama adımları Teknik olarak hakim olması, sorunu desalting adımda yalan olabilir. Bu adımı sorun giderirken, 50 mM Tris/10% t-butanol arabellek iyice degassed olup olmadığını kontrol edin, taze Sephadex reçine ile sütun yeniden paketlemek ve eldiven çantada delik yok olduğundan emin olmak çok önemlidir.
DesB başarıyla saflaştırılmış ve desalted sonra enziminin katalitik aktivite verileri elde etmek için oksijen elektrodu kullanarak kinetik deneyleri dikkatle yapılması gerekiyor. Bir catalytically aktif ve yoğun protein kullanıldığında kinetik ölçümleri genellikle tekrarlanabilir. Veri noktaları bir çalıştırmak için bir substrat veya inhibitör konsantrasyon veri noktası yinelenen tekrarlanabilir değildir, sorun protein denatüre veya genişletilmiş kullanımdan sonra okside olabilir. Taze desalted protein-ebilmek var olmak oluşturmak veri toplama devamıdır izin vermek için. Bu yüzden tam protein konsantrasyonu Bradford tahlil kullanarak veri toplamasının tamamlanmasından sonra belirlenebilir enzim, tüm şişeleri korumak önemlidir. Performans ilk alt etkinlik ve yanlış kinetik ölçümleri yol açabilir zaman içinde faaliyet enzim kaybeder çünkü bu adımı kinetik ölçümleri sonra gerçekleştirilir. Protein konsantrasyonu daha sonra gözlenen katalitik gore ciro numarası belirlemek için gereken tepki oranları içine dönüştürmek için kullanılır. İrreproducible kinetik sonuçları için önde gelen enzim aktivitesinin kaybı ile ilgili endişeleri ek olarak, genişletilmiş kullanımdan sonra elektrot kapsayan membran bozulma da zorluklar veri yeniden oluştururken neden olabilir. Membran bozulması genellikle ilk sinyalini (250-350 nmol/mL >350 nmol/ml) veya enzim ek Önce istikrarlı arka plan oranı elde etmek için bir yetersizlik bir artış belirttiği (> ±5 nmol/mL/dak). Ya gözlenen, elektrot sökmeye, herhangi bir oksit sağlanan temizleme tozu kullanarak elektrot kapalı temiz, elektrot yenilemek ve yeniden ayarlamak için önerilir.
Anaerobik arıtma, özellikle için o protein kıvrımlar sonra takas metaller sıkıca bağladıktan okside metal merkezi olan enzimler için çok önemli bir yöntemdir. Enzim substrat Koordinasyon sonra sadece oksijen eşgüdümünü sağlayarak kendilerini korumak için geliştiğini rağmen onlar-si olmak bitmiş öylesine hücresel bir ortamda - doyurarak miktarda oksijen vitro ortamda metallerin hızlı oksidasyon neden olabilir ve etkin olmayan Fe(III) formu31Fe(II) dönüşüm. Bu oksidasyon/inactivation çarpık sonuçları enzim, catalytically etkin durumdayken değil yol açabilir. Bir oksijen duyarlı elektrot kullanarak kinetik deneyleri bir substrat olarak oksijen kullanan enzimler uygulanabilir. Kinetik parametreleri değiştirmek substrat veya ürün absorpsiyon şiddeti kullanma almak yerine, oksijen tüketimi çözümde doymuş görselleştirme için bu yöntem sağlanır. Bu yöntem ile LigAB, başka bir extradiol dioxygenase benzer şekilde koordine etmek ve onun yüzeylerde ayırmak onun aktif bir Fe(II) dayanan protocatechuate dioxygenase süper daha önce kullanılmış.
Bu el yazması enzim DesB Sphingobium sp. zorlanma SYK-6 ilgili ek bilgi de sağlar. Enzimatik işlevi ve yapısı DesB10,19,39tanımlanan iş, burada DesB gallat, dioxygenation kkedi ile yetkili bir katalizör olduğunu tespit edildi 17,8 ± 1,0 s-1 ve K kkedi/Km 3,98 x 10 sonuçlanan 45 ± 13 µMm 5 M/s. Bu oranları bu LigAB dahil olmak üzere diğer dioxygenase enzimler için belirlenen karşılaştırılabilir (51 s-1 ve kkedikedi k/KM 106 M-1s-1 x 4.26 ) ve kkedi-si olmak diğer dioxygenases /Km değerleri 105-108 M-1s-136,45,46 arasında değişen , 47 , 48 , 49 , 50.
DesB etkin siteyi daha önce dimer arabirimiyle [Fe(II) bağlayan monomer kaynaklanan artıkları artıkları ise kalıntı numarasına göre gösterilir substrat koordinasyonu için katkıda bulunan her iki monomerleri üzerinden artıkları, olduğu gösterilmiştir diğer monomer kalıntı sayıları ve bir Başbakan (Örneğin, Glu377ʹ) tarafından belirtilmiştir]6. 4NC bağlama etkileşimleri DesB ile gösterilen yapısal bilgi yokluğunda, yapısal benzerlikler ve farklılıklar arasında gallat ve 4NC nasıl DesB 4NC tarafından inhibe içine bilgiler sağlayabilir. Gallat vardır üç hidroksil ornatıklarla yer değiştirmiştir C3, C4 ve C5, Fe(II) merkezine koordine, C3 ve C4 hydroxyls ve Glu377ʹ tarafından koordine C5 hidroksil (Şekil 8). Karboksilik asit grubunun C1, DesB etkin sitedeki Tyr-391ʹ, Tyr-412ʹ, Thr-13 ve Thr-267 tarafından koordine edilmektedir. İki hydroxyls Fe(II) merkezi ve bir karboksilat isosteric (Ayrıca koordinasyon için iki oxygens artıkları tarafından 391, 412, 13 ve 267 yaparken), ama çok daha fazla bir C1 nitro grubu koordine etmek için bir mütevazı inhibitörü olan DesB olduğunu kanıtladı, 4NC vardır Elektron çekilmesi gallat karboksilik asit daha. 4NC gallat DesB dioxygenation sadece %36.6 inhibisyonu engelleyici substrat üzerine 5-fold fazla mevcut görüntülenirken, bu çok güçlü bir engelleyici değildi unsurprising çünkü (ile bir Kben 2.3 ± 0,3 mM). Bu C5 hidroksil ve C1 organik enzim-ligand karmaşık teşvik önemli bir rol oynamaktadır göstermektedir. Artıkları Glu377ʹ, Tyr-391ʹ ve Tyr-412ʹ tüm bu etkileşimlerde karıştığı, bu DesB aktif ilgililerin bitişik monomerleri ile yerleştirme bir bileşik ve aktif yapılanma için önemli olduğunu gösteriyor.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarlar hiçbir rakip mali çıkarlarının veya diğer çıkar çatışması var.
Acknowledgments
Camille Dr.Keller Wesleyan Üniversitesi Teknik destek için teşekkür etmek istiyorum. Anaerobik protein saflaştırma yöntemleri ve bir O2 kullanımı ile ilgili onların tavsiye için özel Profesör Lindsay D. Eltis ve Jenna K. Capyk British Columbia Üniversitesi gibi Christian Whitman Austin, Texas Üniversitesi teşekkür -hassas elektrot.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Isopropyl β-D-1-thiogalactopyranodise | Gold Bio Technologies | I2481C50 | |
| Coomassie Brilliant Blue R-250 | Bio-Rad | 161-0400 | |
| Ammonium persulfate | Bio-Rad | 161-0700 | |
| 30% Acrylamide | Bio-Rad | 161-0158 | |
| N,N'tetramethyl-ethylenediamine | Bio-Rad | 161-0801 | |
| Amylose Resin High Flow | New England Biolabs | E8022S | |
| BL21 (DE3) competent Escherichia coli cells | New England Biolabs | C2527I | |
| L-cysteine | Sigma Aldrich | C7352 | |
| gallic acid | Sigma Aldrich | G7384 | |
| 4-nitrocatechol | Sigma Aldrich | N15553 | |
| Ferrous ammonium sulfate | Mallinckrodt | 5064 | |
| Sodium dithionite | Alfa Aesar | 33381-22 | |
| wheaton serum bottles | Fisher Scientific | 06-406G | |
| 25 mm Acrodisc PF Syringe Filter with Supor Membrane | Pall Corportation | 4187 | |
| 400 mL Amicon Stirred Cell Concentrator | EMD Millipore | UFSC40001 | |
| 76 mm Millipore Ultracel 10 kDa cutoff reconsituted cellulose membrane filter | EMD Millipore | PLGC07610 | |
| DL-dithiothreitol | Gold Bio Technologies | DTT50 | |
| Sephadex G-25 coarse desalting gal column | GE Healthcare | 17-0033-01 | |
| 2 mL Crimp-Top Vials | Fisher Scientific | 03-391-38 | |
| Oxygraph Plus Electrode Control Unit | Hansatech Instruments | OXYG1 Plus | |
| Oxygen Eletrode Chamber | Hansatech Instruments | DW1 | |
| Electrode Disc | Hansatech Instruments | S1 | |
| PTFE (0.0125 mmX25mm) 30m reel | Hansatech Instruments | S4 | |
| Electrode cleaning Kit | Hansatech Instruments | S16 | |
| Spacer paper | Zig Zag | available at any gas station | |
| He-series Dri-Lab glove box | Vacuum/Atmospheres Company | ||
| HE-493 Dri-Train | Vacuum/Atmospheres Company | ||
| Double-Ended Micro-Tapered Stainless Steel Spatula | Fisher Scientific | 21-401-10 | |
| DWK Life Sciences Kimble Kontes Flex Column Economy Column | Fisher Scientific | k420400-1530 | |
| 10 μL, Model 701 N SYR, Cemented NDL 26s ga, 2 in, point stlye 2 syringe | Hamilton | 80300 | |
| DWK Life Sciences Kimble Kontes Flex Column Economy Column | Fisher Scientific | K420401-1505 | |
| Emulsiflex-C5 high-pressure homogenizer | Avestin | ||
| B-PER Complete Bacterial Protein Extraction Reagent | Thermo Fisher Scientific | 89821 | |
| Lysozyme from chicken egg white | Sigma Aldrich | 12650-88-3 | |
| Sodium dodecyl sulfate | Thermo Fisher Scientific | 151-21-3 | |
| ampicillin | Sigma Aldrich | 7177-48-2 | |
| Tryptone | Fisher Scientific | BP-1421-500 | |
| Yeast extract | Fisher Scientific | BP1422-2 | |
| Sodium Chloride | Fisher Scientific | S271-10 | |
| Potassium Chloride | Fisher Scientific | P217-3 | |
| Magnesium Chloride | Fisher Scientific | M33-500 | |
| Dextrose | Fisher Scientific | D16-3 | |
| Sodium Hydroxide | Fisher Scientific | S318-1 | |
| Tris hydrochloride | Fisher Scientific | BP153-500 | |
| Maltose | Fisher Scientific | BP684-500 | |
| Glycine | Fisher Scientific | G46-500 |
References
- Awaya, J. D., Walton, C., Borthakur, D. The pydA-pydB fusion gene produces an active dioxygenase-hydrolase that degrades 3-hydroxy-4-pyridone, an intermediate of mimosine metabolism. Applied Microbiology and Biotechnology. 75 (3), 583-588 (2007).
- Barry, K. P., Taylor, E. A. Characterizing the Promiscuity of LigAB, a Lignin Catabolite Degrading Extradiol Dioxygenase from Sphingomonas paucimobilis SYK-6. Biochemistry. 52 (38), 6724-6736 (2013).
- Colabroy, K. L., Smith, I. R., Vlahos, A. H. S., Markham, A. J., Jakubik, M. E. Defining a kinetic mechanism for l-DOPA 2,3 dioxygenase, a single-domain type I extradiol dioxygenase from Streptomyces lincolnensis. Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Proteins and Proteomics. 1844 (3), 607-614 (2014).
- Imsand, E. M., Njeri, C. W., Ellis, H. R. Addition of an external electron donor to in vitro assays of cysteine dioxygenase precludes the need for exogenous iron. Archives of Biochemistry and Biophysics. 521 (1), 10-17 (2012).
- Tsai, C. -L., Tainer, J. A. Methods in Enzymology. David, S. S. 599, Academic Press. 157-196 (2018).
- Kuchenreuther, J. M., et al. High-Yield Expression of Heterologous [FeFe] Hydrogenases in Escherichia coli. Public Library of Science ONE. 5 (11), e15491 (2010).
- Dupuy, J., et al. Crystallization and preliminary X-ray diffraction data for the aconitase form of human iron-regulatory protein 1. Acta Crystallographica Section F. 61 (5), 482-485 (2005).
- Fan, L., et al. XPD Helicase Structures and Activities: Insights into the Cancer and Aging Phenotypes from XPD Mutations. Cell. 133 (5), 789-800 (2008).
- Vaillancourt, F. H., Bolin, J. T., Eltis, L. D. The ins and outs of ring-cleaving dioxygenases. Critical Reviews in Biochemistry and Molecular Biology. 41, 241-267 (2006).
- Sugimoto, K., et al. Molecular Mechanism of Strict Substrate Specificity of an Extradiol Dioxygenase, DesB, Derived from Sphingobium sp. SYK-6. Public Library of Science ONE. 9 (3), e92249 (2014).
- Lewis-Ballester, A., et al. Structural insights into substrate and inhibitor binding sites in human indoleamine 2,3-dioxygenase 1. Nature Communications. 8, (2017).
- Lipscomb, J. D., Hoffman, B. M. Allosteric control of O-2 reactivity in Rieske oxygenases. Structure. 13 (5), 684-685 (2005).
- Mccray, J. A., Brady, F. O. Allosteric Control of Transient Kinetics of Carbon Monoxide-L-Tryptoohan-2,3-Dioxygenase Complex-Formation. Federation Proceedings. 32 (3), 469 (1973).
- Pearson, J. T., Siu, S., Meininger, D. P., Wienkers, L. C., Rock, D. A. In Vitro Modulation of Cytochrome P450 Reductase Supported Indoleamine 2,3-Dioxygenase Activity by Allosteric Effectors Cytochrome b(5) and Methylene Blue. Biochemistry. 49 (12), 2647-2656 (2010).
- Walsh, H. A., Daya, S. Inhibition of hepatic tryptophan-2,3-dioxygenase: Superior potency of melatonin over serotonin. Journal of Pineal Research. 23 (1), 20-23 (1997).
- Barry, K. P., et al. Exploring allosteric activation of LigAB from Sphingobium sp strain SYK-6 through kinetics, mutagenesis and computational studies. Archives of Biochemistry and Biophysics. 567, 35-45 (2015).
- Reynolds, M. F., et al. 4-Nitrocatechol as a probe of a Mn(II)-dependent extradiol-cleaving catechol dioxygenase (MndD): comparison with relevant Fe(II) and Mn(II) model complexes. Journal of Biological Inorganic Chemistry. 8 (3), 263-272 (2003).
- Tyson, C. A. 4-Nitrocatechol as a colorimetric probe for non-heme iron dioxygenases. Journal of Biological Chemistry. 250 (5), 1765-1770 (1975).
- Kasai, D., Masai, E., Miyauchi, K., Katayama, Y., Fukuda, M. Characterization of the gallate dioxygenase gene: Three distinct ring cleavage dioxygenases are involved in syringate degradation by Sphingomonas paucimobilis SYK-6. Journal of Bacteriology. 187 (15), 5067-5074 (2005).
- Billings, A. F., et al. Genome sequence and description of the anaerobic lignin-degrading bacterium Tolumonas lignolytica sp. nov. Standards in Genomic Sciences. 10 (1), 106 (2015).
- Brown, M. E., Chang, M. C. Y. Exploring bacterial lignin degradation. Current Opinion in Chemical Biology. 19, 1-7 (2014).
- Bugg, T. D. H., Ahmad, M., Hardiman, E. M., Rahmanpour, R. Pathways for degradation of lignin in bacteria and fungi. Natural Product Reports. 28 (12), 1883-1896 (2011).
- Clarkson, S. M., et al. Construction and Optimization of a Heterologous Pathway for Protocatechuate Catabolism in Escherichia coli Enables Bioconversion of Model Aromatic Compounds. Applied and Environmental Microbiology. 83 (18), (2017).
- de Gonzalo, G., Colpa, D. I., Habib, M. H. M., Fraaije, M. W. Bacterial enzymes involved in lignin degradation. Journal of Biotechnology. 236, 110-119 (2016).
- Falade, A. O., Eyisi, O. A. L., Mabinya, L. V., Nwodo, U. U., Okoh, A. I. Peroxidase production and ligninolytic potentials of fresh water bacteria Raoultella ornithinolytica and Ensifer adhaerens. Biotechnology Reports. 16, 12-17 (2017).
- Gall, D. L., Ralph, J., Donohue, T. J., Noguera, D. R. A Group of Sequence-Related Sphingomonad Enzymes Catalyzes Cleavage of β-Aryl Ether Linkages in Lignin β-Guaiacyl and β-Syringyl Ether Dimers. Environmental Science & Technology. 48 (20), 12454-12463 (2014).
- Li, J., Yuan, H., Yang, J. Bacteria and lignin degradation. Frontiers of Biology in China. 4 (1), 29-38 (2009).
- Masai, E., Katayama, Y., Nishikawa, S., Fukuda, M. Characterization of Sphingomonas paucimobilis SYK-6 genes involved in degradation of lignin-related compounds. Journal of Industrial Microbiology & Biotechnology. 23, 364-373 (1999).
- Morales, L. T., González-García, L. N., Orozco, M. C., Restrepo, S., Vives, M. J. The genomic study of an environmental isolate of Scedosporium apiospermum shows its metabolic potential to degrade hydrocarbons. Standards in Genomic Sciences. 12 (1), 71 (2017).
- Shettigar, M., et al. Isolation of the (+)-Pinoresinol-Mineralizing Pseudomonas sp. Strain SG-MS2 and Elucidation of Its Catabolic Pathway. Applied and Environmental Microbiology. 84 (4), (2018).
- Shi, Y., et al. Characterization and genomic analysis of kraft lignin biodegradation by the beta-proteobacterium Cupriavidus basilensis B-8. Biotechnology for Biofuels. 6 (1), 1 (2013).
- Varman, A. M., et al. Decoding how a soil bacterium extracts building blocks and metabolic energy from ligninolysis provides road map for lignin valorization. Proceedings of the National Academy of Sciences. 113 (40), E5802-E5811 (2016).
- Wu, W., et al. Lignin Valorization: Two Hybrid Biochemical Routes for the Conversion of Polymeric Lignin into Value-added Chemicals. Scientific Reports. 7 (1), 8420 (2017).
- Koehntop, K. D., Emerson, J. P., Que, L. The 2-His-1-carboxylate facial triad: a versatile platform for dioxygen activation by mononuclear non-heme iron(II) enzymes. Journal of Biological Inorganic Chemistry. 10 (2), 87-93 (2005).
- Lipscomb, J. D. Mechanism of extradiol aromatic ring-cleaving dioxygenases. Current Opinion in Structural Biology. 18 (6), 644-649 (2008).
- Machonkin, T. E., Doerner, A. E. Substrate specificity of Sphingobium chlorophenolicum 2,6-dichlorohydroquinone 1,2-dioxygenase. Biochemistry. 50, 8899-8913 (2011).
- Suzuki, T., Kawamichi, H., Imai, K. Amino Acid Sequence, Spectral, Oxygen-Binding, and Autoxidation Properties of Indoleamine Dioxygenase-Like Myoglobin from the Gastropod Mollusc Turbo cornutus. Journal of Protein Chemistry. 17 (8), 817-826 (1998).
- Vaillancourt, F. H., Labbe, G., Drouin, N. M., Fortin, P. D., Eltis, L. D. The Mechanism-based Inactivation of 2,3-Dihydroxybiphenyl 1,2-Dioxygenase by Catecholic Substrates. Journal of Biological Chemistry. 277 (3), 2019-2027 (2002).
- Sugimoto, K., et al. Crystallization and preliminary crystallographic analysis of gallate dioxygenase DesB from Sphingobium sp. SYK-6. Acta Crystallographica Section F. 65 (11), 1171-1174 (2009).
- Gallagher, S. R. SDS‐Polyacrylamide Gel Electrophoresis (SDS-PAGE). Current Protocols in Essential Laboratory Techniques. 6 (1), 7.3.1-7.3.28 (2012).
- Xiang, D. F., et al. Function Discovery and Structural Characterization of a Methylphosphonate Esterase. Biochemistry. 54 (18), 2919-2930 (2015).
- Vladimirova, A., et al. Substrate Distortion and the Catalytic Reaction Mechanism of 5-Carboxyvanillate Decarboxylase. Journal of the American Chemical Society. 138 (3), 826-836 (2016).
- Korczynska, M., et al. Functional Annotation and Structural Characterization of a Novel Lactonase Hydrolyzing d-Xylono-1,4-lactone-5-phosphate and l-Arabino-1,4-lactone-5-phosphate. Biochemistry. 53 (28), 4727-4738 (2014).
- Netto, L. E. S., Stadtman, E. R. The Iron-Catalyzed Oxidation of Dithiothreitol Is a Biphasic Process: Hydrogen Peroxide Is Involved in the Initiation of a Free Radical Chain of Reactions. Archives of Biochemistry and Biophysics. 333 (1), 233-242 (1996).
- Arciero, D. M., Orville, A. M., Lipscomb, J. D. Protocatechuate 4,5-Dioxygenase from Pseudomonas testosteroni. Methods in Enzymology. 188, 89-95 (1990).
- Harpel, M. R., Lipscomb, J. D. Gentisate 1,2-dioxygenase from pseudomonas. Purification, characterization, and comparison of the enzymes from Pseudomonas testosteroni and Pseudomonas acidovorans. Journal of Biological Chemistry. 265 (11), 6301-6311 (1990).
- Ishida, T., Tanaka, H., Horiike, K. Quantitative structure-activity relationship for the cleavage of C3/C4-substituted catechols by a prototypal extradiol catechol dioxygenase with broad substrate specificity. Journal of Biochemistry. 135 (6), 721-730 (2004).
- Vaillancourt, F. H., Han, S., Fortin, P. D., Bolin, J. T., Eltis, L. D. Molecular Basis for the Stabilization and Inhibition of 2,3-Dihydroxybiphenyl 1,2-Dioxygenase by t-Butanol. Journal of Biological Chemistry. 273 (52), 34887-34895 (1998).
- Veldhuizen, E. J. A., et al. Steady-state kinetics and inhibition of anaerobically purified human homogentisate 1,2-dioxygenase. Biochemical Journal. 386, 305-314 (2005).
- Wolgel, S. A., et al. Purification and Characterization of Protocatechuate 2,3-Dioxygenase from Bacillus macerans: a New Extradiol Catecholic Dioxygenase. Journal of Bacteriology. 175 (14), 4414-4426 (1993).
