Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Biochemistry

Anaërobe EiwitReiniging en kinetische analyse via zuurstof-elektrode voor het bestuderen van de activiteit van de DesB Dioxygenase en inhibitie

doi: 10.3791/58307 Published: October 3, 2018

Summary

Hier presenteren we een protocol voor anaërobe EiwitReiniging, anaërobe eiwitconcentratie en latere kinetische karakterisering met behulp van een zuurstof-elektrode-systeem. De methode wordt geïllustreerd met behulp van het enzym DesB, een dioxygenase enzym die meer stabiel actief en wanneer gezuiverd en in een anaëroob milieu opgeslagen.

Abstract

Zuurstof-gevoelige eiwitten, met inbegrip van deze enzymen die gebruik maken van de zuurstof als substraat, kunnen stabiliteit wanneer gereinigd met behulp van traditionele aerobic zuivering methoden hebben verminderd. Dit manuscript illustreert de technische details die betrokken zijn bij het zuiveringsproces van anaërobe, met inbegrip van de voorbereiding van reagentia, buffers en de methoden voor kolom-chromatografie in een handschoen vak en het ontzouten van het eiwit vóór kinetiek. Ook beschreven, zijn de methoden voor de voorbereiding en het gebruik van een zuurstof-elektrode voor het uitvoeren van kinetische karakterisering van een enzym dat zuurstof-met behulp van. Deze methodes worden geïllustreerd met behulp van het enzym dioxygenase DesB, een gallate dioxygenase van de bacterie Sphingobium sp. strain Unnethes-6.

Introduction

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Enzymen die gebruik maken van ijzer of andere metalen te activeren van zuurstof zijn vaak gevoelig voor inactivering tijdens het zuiveringsproces vanwege hun verwijdering uit de vermindering omgeving van een cel. Daarom deze eiwitten als cel lysates moeten worden gebruikt, onderworpen aan externe reductoren of anaëroob gezuiverd worden om ervoor te zorgen dat zij optimaal enzymatische activiteit1,2,3,4. Voor deze enzymen die is zuurstof-gevoelige (specifiek ijzer-bevattende enzymen), uitvoeren van alle stappen voor de zuivering en karakterisering met behoud van anaërobe omstandigheden noodzakelijk om hen volledig te karakteriseren. Dit heeft ertoe geleid dat onderzoekers te ontwikkelen volledige laboratorium set-ups binnen de grenzen van anaërobe kamers voor studies variërend van eiwit expressie t/m kristallografie5,6,7,8 .

Hierin, rapporteren we methodes voor de anaërobe zuivering en kinetische karakterisering van het enzym DesB met behulp van een zuurstof-elektrode-systeem. DesB is een gallate dioxygenase van de bacterie Sphingobium sp. strain Unnethes-6, die betrekking heeft op LigAB, een dioxygenase van de protocatecuate van het hetzelfde organisme. Beide enzymen behoren tot het type II protocatechuate dioxygenase (PCAD) superfamilie die heeft niet uitvoerig bestudeerd tot en met datum9, waarschijnlijk deels te wijten aan enzymen van deze superfamilie wordt gevoelig voor inactivering wanneer gereinigd met behulp van standaard aërobe Eiwit zuivering methoden. Aangezien sommigen van de PCAD enzymen substraat promiscuïteit, tonen terwijl anderen substraat-specifieke2,10, verdere is karakterisering van deze superfamilie nodig om te identificeren specificiteit determinanten. Zoals geconstateerd in verschillende enzym superfamilies11,12,13,14,15, kunnen kleine molecules activiteit via directe competitieve remming of de binding van wijzigen moleculen om te scheiden allosteric zakken waardoor een toename of afname van enzymatische activiteit16. Kinetiek alleen kan niet de locatie van de binding van een modulator differentiëren, bepaling van de omvang van een activiteit wijzigen is belangrijk voor het begrijpen van de effecten. Als dergelijke, methoden voor kinetische karakterisering van inheemse DesB activiteit en de activiteit in aanwezigheid van 4-nitrocatechol (4NC), een verbinding die vaak gebruikt om te karakteriseren en remmen dioxygenase enzymen2,17, 18, worden weergegeven.

DesB is in staat te breken gallaat, een aromatische lignine afkomstige samengestelde, via een extradiol dioxygenase (EDO) reactie in die ring opening wordt gekatalyseerd met behulp van zuurstof als één van de substraten10,19. Deze enzymatische reactie treedt op binnen de context van de afbraak van lignine, een aromatische heteropolymer gevonden in de celwand van planten. Lignine kan worden depolymerized, opbrengst van een verscheidenheid aan aromatische verbindingen die kan worden verder onderverdeeld in Centraal metabolieten3,20,21,22,23,24 ,25,26,27,28,29,30,31,32,33 . Extradiol dioxygenases (EDO) katalyseren een reactie op dihydroxylated aromatische verbindingen, waar decollete grenzend aan een metaal-gecoördineerd diol voorkomt; openen ring in tegenstelling, klieven intradiol dioxygenases analoog aromatische verbindingen tussen de twee hydroxylgroepen (Figuur 1). EDOs, zoals veel andere metalloenzymes, hebben een divalente metalen center voor coördinerende Fe(II) samengesteld uit een twee-histidine, één-carboxylaat triade9,34,35. Deze metalloenzymes worden geoxideerd, via autoxidation of mechanisme gebaseerde inactivatie, overwegende dat het enzym inactief2,36,37,38wordt weergegeven.

In de experimentele procedures die worden beschreven in dit manuscript, gebruiken we DesB, een lid van de PCAD-superfamilie van de bacterie Sphingobium sp. Unnethes-6, te katalyseren van de toevoeging van zuurstof in de C4-C5-band van gallate (figuur 2A). De regiochemistry van deze splitsing is analoog aan LigAB, een protocatechuate-4,5-dioxygenase (figuur 2B). Onderzoek van deze gallate dioxygenase omvatten tot nu toe geen meldingen van stoffen die een remmende werking DesB10,19,39. Met het gebruik van aërobe zuivering methoden tentoongesteld DesB variabele activiteit, terwijl met het gebruik van anaerobe methoden konden we consequent krijgen eiwit met reproduceerbare activiteit. De kinetische studies beschreven hier tonen de methoden voor anaërobe zuivering van DesB, kinetische karakterisering van de reactie van DesB met gallate en de remming van DesB door 4-nitrocatechol (4NC).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

1. algemene materialen en methoden

  1. Bereiden alle vereiste media zoals beschreven in tabel 1. Autoclaaf op 120 ˚C voor 15 min. steriel Filtreer de oplossing van de SOC, na toevoeging van MgCl2 en glucose, door het passeren van een 0,2 µm filter. Breng de pH van de Millers lysogenie Bouillon (LB-media) oplossing vóór autoclaaf. Supplement de LB-Amp media oplossing na autoclaaf met steriele oplossingen van 0,2 mM L-cysteïne, dan 0.1 mM ferro ammoniumsulfaat eiwit expressie en de oplosbaarheid te verbeteren.
  2. Voorbereiden op de Laemmli buffer en lopende buffer polyacrylamide gelelektroforese (pagina) zoals beschreven in tabel 2. Breng de pH van de oplossingen (met behulp van 1 M HCl en Tris base buffer voorbereiding) voor het verdunnen van de componenten aan hun laatste volumes.
  3. Voorbereiden op de buffers eiwitreiniging zoals beschreven in tabel 3. Breng de pH van de oplossingen (met behulp van 1 M HCl en Tris base buffer voorbereiding) voor het verdunnen van de componenten aan hun laatste volumes.
  4. De voorbereide buffers overbrengen in een fles die kan worden verzegeld met een een-gat rubberstop en bevat een glazen buis.
    1. Gebruik een slang in de glazen buis in de stop verbinden met een vacuüm bron. Laat de oplossing voor ontgas onder negatieve druk gedurende ongeveer 30 minuten al roerend op middellange snelheid.
    2. Breek het vacuüm zegel, dan u eerst het vacuüm schakelt. Vervolgens doorboren via de rubberstop met twee naalden van 20G (een die is lang genoeg om het bereiken van de bodem van de fles, en een kortere naald die kan worden gebruikt als een gas ontsnappen vent). Bubble in een gestage stroom van stikstof tijdens het roeren op middellange snelheid gedurende 30 minuten.
    3. Verwijder de naalden en herhaal de ontgassing en borrelende in stikstof voor een totaal van drie cycli. Wanneer u klaar bent, goed sluit de fles met een stevige rubberstop. Verder beveiligen de stop met paraffine film en koperdraad (20G), en plaats ze in de ' glovebox '.
      Opmerking: Alle materialen zijn in de ' glovebox ' geplaatst en onderworpen aan 3 cycli van het purgeren de wachtkamer, gevolgd door stofzuigen uit de zuurstof en het bijvullen met stikstof. Buffers gebruikt voor reiniging en concentratie kunnen worden afgetopt en opgeslagen in het handschoenenkastje voor onbepaalde tijd.
  5. Bereid de natrium dithionate oplossing door ontbinding van ongeveer één spatel (0.31 "x 2", de kleine connector van een tweepuntige micro-tapered edelstaal spatel) vol met natrium dithionate in ongeveer 1 mL ontgaste water in een tube van 1,5 mL microcentrifuge . Het zegel van de buis met paraffine film voordat zij zijn afgehaald van het handschoenenkastje.
    Opmerking: Bewaar solide natrium dithionate in het handschoenenkastje ter voorkoming van oxidatie.

2. voorbereiding van de Amylose kolom eiwitreiniging

  1. Een gier van hoge stroom amylose hars (15 mL) gecombineerd met 5 kolom volumes (75 mL) voor amylose kolom buffer maken Breng het hars drijfmest in twee 50 mL serum flessen en sluit elke fles met een rubber tussenschot. Punctie een 20G, 305 mm naald door de septa en bubble stikstof in de drijfmest voor ongeveer 1 minuut om zuurstof van de schorsing. Breng het hars en eiwithoudende oplossing in het handschoenenkastje.
  2. In het handschoenenkastje, giet u de hars in een 2 x 30 cm borosilicaat kolom voorzien van een eenvoudige afsluiter, waardoor de hars te regelen en een niveau bed maken. Afvoer van de kolom buffer en equilibreer van de kolom met 3 kolom volumes (~ 30 mL totaal) voor ontgaste amylose kolom buffer met hydrofoor stikstofgas te duwen de buffer door de hars op ongeveer 1 druppel/s of 5 mL/min, totdat het oplosmiddel net boven is de hars bed.
    Opmerking: Na het eiwit wordt geëlueerd (zie stap 3.5 hieronder), de amylose kolom hars wordt geregenereerd door wassen met 1 kolom hoeveelheid (10 mL) water, dan 1 kolom volume van 1% natrium dodecyl sulfaat (SDS) en ten slotte 3 kolom volumes (30 mL) water. Deze stap kan worden uitgevoerd buiten het handschoenenkastje. De hars van de kolom wordt opgeslagen bij 4 ° C in de 20% ethanol en kan tot 5 keer opnieuw worden gegenereerd.

3. eiwit expressie en anaërobe zuivering van DesB

Opmerking: Het DesB-gen werd commercieel gesynthetiseerd, in huisdier-15b, huisdier-32a en pMAL-c5x vectoren met behulp van de beperking van het NdeI en BamHI klonen sites hebben geplaatst.

  1. Voltooi de eiwit expressie testen volgens de richtlijnen van de fabrikant om te bepalen van de juiste voorwaarden voor grootschalige expressie (in het kort hieronder beschreven).
    1. De DesB-bevattende plasmiden omvormen commercieel gemaakte, chemisch bevoegde E. coli BL21 (DE3) cellen, volgens de instructies van de fabrikant. Kortom, ontdooien van de cellen op het ijs gedurende 10 minuten, voeg ongeveer 10-50 ng van plasmide DNA aan de cel mengsel, warmte schok de cellen bij 42 ° C gedurende 10 s, en hen uit te broeden op ijs voor een extra 5 min. Voeg SOC media te verkrijgen van een eindvolume van 1 mL en de cellen te schudden (~ 200 rpm) bij 37 ° C gedurende 60 minuten. Een LB-Amp-plaat, toevoegen en verspreiden van 100 µL van de cel-oplossing en na een nacht bebroeden bij 37 ° C.
    2. Selecteer een eenheid kolonievormend van de plaat na een incubatieperiode van overnachting en gebruik van deze kolonie om te enten 10 mL van LB-Amp media. 'S nachts, groeien van de cellen met het schudden (~ 200 rpm) bij 37 ° C.
    3. Voeg 100 µL van de overnachting groei oplossing tot 10 mL van de media, en schudden van de nieuwe media, zoals beschreven in stap 3.1.2 bij 37 ° C. Wanneer de extinctie op 600 nm (OD600) is tussen 0,4-0,8, isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside (IPTG) tot een concentratie van de eindoplossing van 1 mM aan toe te voegen.
    4. Onmiddellijk verwijderen van een hoeveelheid van 1 mL van de oplossing en het overbrengen van een tube microcentrifuge 1,5 mL met gelabelde tijd = 0 uur. Draai de buis bij 15.000 x g gedurende 10 minuten aan het einde van de cellen. Na spinnen, verwijder het supernatant en opslaan van de cellen bij 4 ° C.
    5. Extra aliquots (van elk 1 mL) op tijdsintervallen verwijderen na toevoeging van de IPTG (doorgaans op 5, 10, 12, 18 en 24 h). Zoals beschreven in stap 3.1.4, elke buis centrifugeren, decanteren het supernatant en opslaan de cellen bij 4 ° C.
    6. Zodra alle de aliquots worden verkregen, resuspendeer de cellen uit elke timepoint in 30 µL van bacteriële eiwitten extractieoplossing, incubeer hen bij kamertemperatuur gedurende 10-15 minuten, en centrifugeer de buizen bij 15.000 × g gedurende 5 min om te scheiden van de oplosbare en onoplosbare eiwitten.
    7. Breng de oplossing van de oplosbaar eiwit over een nieuwe microcentrifuge-buis en resuspendeer de resterende onoplosbare pellets met 30 µL van bacteriële eiwitten extractievloeistof.
    8. De 30 µL van elke oplossing (zowel oplosbare en onoplosbare oplossingen voor elke timepoint) combineren met een gelijk volume Laemmli buffer en visualiseren op een SDS-pagina gel40. Selecteer criteria overeenkomt met de rijstroken met de juiste maat banden in de oplosbare fractie voor grootschalige eiwit expressie en zuivering.
      Opmerking: Aangezien minimale oplosbaar eiwit was in eerste instantie gegenereerd met behulp van de bovengenoemde voorwaarden, diverse supplementen werden toegevoegd om te testen voor effecten op de oplosbaar eiwit expressie, met 0,2 mM L-cysteïne en 0.1 mM ferro ammoniumsulfaat tonen verbeterde eiwit expressie. Volgens dit eiwit expressie scherm was een adequate uitdrukking vector voor oplosbare productie van DesB pMAL-c5x vector.
  2. Na de transformatie in Escherichia coli BL21 (DE3), een voorraad van DesB/pMal-c5x maken door het combineren van 900 µL van bacteriecultuur (volwassen overnachting met schudden bij 200 rpm en 37 ° C) met 100 µL 80% glycerol. Slaan de voorraad bij-80 ° C in een cryogene buis.
    Opmerking: Maak een nieuwe bevroren voorraad ongeveer elke 6-8 maanden.
  3. Gebruik een pipet tip te schrapen van cellen uit de bevroren voorraad en beginnen een bacteriële cultuur, groeiende 's nachts in 5 mL LB-Amp media bij 37 ° C met schudden. Inoculeer 1,5 liter LB-Amp media in een maatkolf van 2 L bij 37 ° C en 200 rpm, met behulp van de overnachting geteelde bacteriecultuur.
    Opmerking: Als gevolg van de waargenomen gevoeligheid van het eiwit aan zuurstof bleek dat verminderde headspace in de kolf en matige snelheden verbeterde eiwit opbrengst voor grootschalige expressie schudden.
  4. Eiwit expressie veroorzaken wanneer de extinctie op 600 nm (OD600) is tussen 0,4-0,8 met 1 mM IPTG en aangevuld met 0,2 mM L-cysteïne en 0.1 mM ferro ammoniumsulfaat. Verlaag de incubatietemperatuur tot 30 ° C en schudden bij 200 rpm. Spin down de cellen via centrifugeren na 24 h na inductie bij 4700 x g gedurende 10 minuten en gooi de gebruikte media.
  5. Resuspendeer de pellet cel in 20 mL amylose kolom buffer per elke 1,5 L van groei, gevolgd door de toevoeging van 1 mg van lysozym. Roer gedurende 20 minuten op het ijs.
    Opmerking: Meer buffer kan worden toegevoegd als de oplossing al te visceus is, oplossingen die al te visceus zijn als eiwitten de volgende homogenisator stap kunnen verstoren.
  6. Lyse de geresuspendeerde cell oplossing via hogedruk homogenisering met 3-5 passes op ongeveer 15.000 psi. Het eiwit overbrengen in een tube van 50 mL centrifuge en spoel de headspace met stikstof voor 1 min. Centrifugeer vervolgens de cel lysate bij 20.000 x g gedurende 40 min te verwijderen van de onoplosbare puin.
    Opmerking: Succesvolle homogenisatie zorgt ervoor dat het eiwit naar formulier micellen zoals het loopt door de buis en in de maatkolf van de collectie en de oplossing als een doorschijnend grijs-bruine kleur verschijnt. Houd het gehomogeniseerde eiwit op het ijs gedurende het gehele proces.
  7. Na het centrifugeren cap overdracht de bovendrijvende substantie in een tube van 50 mL (meer dan één kan het nodig zijn), de buis met een rubber tussenschot en een 20-gauge-naald, langzaam zeepbel stikstofgas via de oplossing voor 2 min verplaatsen van zuurstof. Wikkel het septum met paraffine film verder beveiligen met koperdraad en brengen het supernatant in het handschoenenkastje samen met de kolom materialen.
  8. De kolom equilibreer (zie stap 2.3) en het eiwit supernatant op de kolom te laden. Verzamel de doorstroming in 5 mL breuken onder matig hydrofoor stikstof (1 druppel per seconde of ongeveer 5 mL/min). Vervolgens was de kolom met behulp van een andere kolom 3 volumes van amylose kolom buffer en handmatig verzamelen 3 mL breuken in glazen reageerbuizen onder matig hydrofoor stikstof (ongeveer 5 mL/min). Elueer de eiwit 5 kolom volumes (~ 50 mL) van elutie buffer gebruiken en handmatig verzamelen 3 mL breuken onder druk van de gematigde stikstof (ongeveer 5 mL/min).
    Opmerking: De breuken kunnen als alternatief worden verzameld met behulp van de zwaartekracht filtratie. Ongeveer 12 elutie breuken moeten worden verzameld.
  9. Verzamelen 30 µL aliquots van breuken en ze te verwijderen uit het vak handschoen om de visualisatie van eiwithoudende breuken via analyse van de SDS-pagina.
    Opmerking: De verzamelde breuken in het handschoenenkastje blijven voor de duur van deze test. Gezuiverde DesB meestal GC kolom in breuken 3 t/m 5.

4. anaerobe eiwit concentratie/Buffer Exchange

  1. Voeg de hydrofoor, stirred cel concentrator met een membraanfilter van 76 mm geregenereerde cellulose (10 cutoff kDa). Voeg een voldoende hoeveelheid van 20% ethanol in de concentrator te houden van het membraan nat als de geassembleerde concentrator wordt omgezet in het handschoenenkastje.
    Opmerking: Zorg ervoor dat er geen scheuren in het membraan en dat de O-ring niet is gerimpeld.
  2. Wassen na het brengen van de concentrator stirred cel in het handschoenenkastje, de ethanol oplossing uit het membraan met water. Cap en druk uitoefenen op de stirred cel om de buis en membraan van eventuele overtollige water schoon te maken.
  3. Het toevoegen van alle fracties die eiwitten zoals bepaald door SDS-PAGE (Figuur 3) met de concentrator bevatten. Voeg voldoende uitwisseling buffer om de opbrengst van 150 mL totaal eiwit oplossing volume.
  4. Druk uitoefenen op de kamer van de stirred cel met behulp van een externe N2 lijn en concentreren van het eiwit tot 50 mL met matige snelheid roeren.
    Opmerking: Verwezenlijking van een concentratie van 50 mL duurt ongeveer 20 min.
  5. Aanvulling van 100 mL uitwisseling buffer met 0,1 mM dithiothreitol (DTT) en 0.1 mM ferro ammoniumsulfaat, de oplossing aan de stirred cel toevoegen, en concentreren van het eiwit tot een totaal volume van 50 mL met een matige snelheid roeren.
  6. Nadat de oplossing een volume van 50 mL bereikt, toevoegen in de buffer aangevuld uitwisseling eens te meer, maar de oplossing tot een totaal volume van 10 mL met matige snelheid roeren concentreren.
  7. Filteren van het geconcentreerde eiwit met behulp van een 0,45 µm porie grootte spuit filter en aliquot in individuele 0,2 mL polymerase kettingreactie (pcr) buizen (elk met ongeveer 150 µL van de eiwit-oplossing). Verwijder de afgetopte aliquots van het handschoenenkastje en onmiddellijk flitser bevriezen ze met vloeibare stikstof. Opslaan van de aliquots bij-80 ° C.

5. ontzouten DesB

  1. Spoel de handschoen zak met stikstofgas gedurende ongeveer 1,5 uur vóór gebruik.
  2. Ontdooi een hoeveelheid 150 µL van gezuiverde DesB eiwit binnenkant van de handschoen tas, op ijs.
  3. Terwijl het eiwit ontdooit, bereiden een kleine zwaartekracht, ontzouten kolom met 3 mL Sephadex G-25 grof demineralisatie gel in een 9 mL borosilicaat-kolom. Was de kolom met 2 kolom volumes (~ 6 mL) van ontgast buffer desalt.
    Nota: Vervang de demineralisatie gel wanneer er een wijziging in gel kleur van wit naar geel (na ongeveer 7 gebruikt).
  4. Laad de ontdooide DesB op de kolom via een proces van zwaartekracht bestuurde. Gooi de doorstroming. Elueer de proteïne met ongeveer 5 mL ontzouten buffer.
    Opmerking: De druk van het gastank voortdurend vullen de handschoen zak zal beïnvloeden het tarief waartegen de oplossingen van de kolom druppelen.
  5. Verzamelen voor de aanvankelijke vaststelling van de elutie van de proteïne van de kolom, 12 flesjes/elutions (met 3 druppels per flacon). Verzegeld met een rubber tussenschot, verwijderen uit de zak van de handschoen en de test op de aanwezigheid van eiwitten hetzij direct (door middel van SDS-pagina gel analyse) of indirect (via onderzoek van de activiteit van elke fractie).
    Opmerking: Doorgaans de breuken zijn afzonderlijk getest voor activiteit, zoals beschreven in stap 7.1, met de grootste activiteit overeenkomt met de breuk met de grootste concentratie aan actieve eiwitten. DesB GC meestal beginnen in het 7de drop, waarna de volgende 9 druppels ontzout eiwit worden verzameld. Eiwit aliquots worden opgeslagen op het ijs tijdens de kinetiek metingen (stappen 7.1-7.4).

6. voorbereiding van de zuurstof-elektrode

  1. Pools de zilveren anode ring en platina kathode met een elektrode schoner en een vochtige Q-tip totdat er geen zichtbare tekenen van zwart oxide deposito's zijn.
  2. Knip met een schaar, ongeveer een 1.5-inch vierkant spacer papier (of voortschrijdende sigarettenpapier, die ook zo goed werkt). Vervolgens snijd 1) kleine driehoekjes op elke zijde van het plein en de 2) spleten in de hoeken op de steun van de verpakking van de elektrode.
  3. Voeg 5 druppels van een 50%-KCl oplossing op de zilveren anode groove en sluit ze dus ze een ononderbroken ring van oplossing vormen. Voeg 2 druppels van de KCl oplossing van 50% naar de top van de platina-elektrode. Zorgvuldig plaats de spacer papier op de top van de platina-elektrode en het papier spacer gladstrijken, dus er geen luchtbellen zijn.
    Opmerking: Wees voorzichtig om te voorkomen dat de spacer papier scheuren.
  4. Knip een stukje van de S4 30m PTFE (polytetrafluorethyleen) membraan dat is ongeveer 2 inches lang en plaats deze op de top van de spacer papier. De randen van het membraan afgesneden zodat ze zijn uitgelijnd met de buitenste ring van de elektrode.
  5. Met behulp van de O-ring-applicator, de kleine O-ring over de elektrode om veilig de spacer papier en membraan op de elektrode te duwen. Plaats de grotere O-ring op de circulaire groef van de elektrode, ervoor te zorgen is er geen membraan eronder. Schuif de bovenste kamer van de elektrode op de base en de twee aan elkaar schroeven.
    Opmerking: De twee zijn geschroefd op goed als geen lucht bubbels vasthouden aan de zijkanten van de kamer.
  6. Plaats de geassembleerde elektrode op de basis en de elektrode te verbinden tot het monitoringsysteem. Initiëren van het controleprogramma van de elektrode en kalibreren van de elektrode door het uitvoeren van de vloeibare fase kalibratie protocol (figuur 4A). De variabele temperatuur moet de temperatuur van de ruimte waarin het experiment wordt uitgevoerd, en de omgevingsdruk variabele is afhankelijk van de regio en de huidige weersomstandigheden.
    Opmerking: Omgevingsdruk kan worden verkregen bij een weerbericht voor het gebied.
  7. Voeg 1 mL 25 mM Tris buffer naar de kamer van de elektrode, invoegen van de plunjer, beginnen de kalibratie van een zuurstof verzadigde oplossing en pas de snelheid van de roerder aan 100. Nadat de elektrode stabiliseert, de kalibratie set-point voor het zuurstof verzadigde oplossing wordt bepaald (figuur 4B).
  8. Zonder het verwijderen van de plunjer, kunt een 1.2 x 40 mm naalden en 1 mL spuit van natrium dithioniet ongeveer 1 mL te injecteren in de zaal, voorzichtig om te voorkomen dat u toevoegt luchtbellen (figuur 4C). Gebruik een rubberstop te verzegelen van de elektrode kamer onmiddellijk na toevoeging van natrium dithioniet.
  9. Toestaan dat de kalibratie voort te zetten totdat alle zuurstof wordt gebruikt en het programma is voltooid en de kalibratie (Figuur 4 d) opslaan. De oplossing van de zaal gecombineerd en spoel de plunjer en kamer met gedeïoniseerd water 5 - 6 keer om ervoor te zorgen volledige verwijdering van de natrium-dithioniet. Wanneer spoelen, gebruik een plastic buis voorzien van een tip van de pipet verbonden aan een zijarm vacuüm maatkolf. Te voorkomen beschadiging van het membraan.

7. kinetische testen met behulp van de zuurstof-elektrode

  1. Identificeer de desalted aliquots die actieve eiwitten bevatten serieel 1 µL van enzym oplossing voor activiteit te testen in een oplossing van 25 mM Tris buffer met pH 7.5 en bevattende 100 µM gallate. Gebruik de aliquot(s) met de grootste waargenomen activiteit voor de resterende experimenten. (Zie stap 5.5.1)
  2. De snelheid van de enzymatische reactie te bepalen door het meten van O2 consumptie met behulp van een O-2-gevoelige Clark-type elektrode met computer integratie via de besturingseenheid van de elektrode.
    1. Wijs voor elk kinetics meting van DesB, voeg 1 mL 25 mM Tris buffer (pH 7.5) aan de kamer van de elektrode. Een berekende volume van de stockoplossing van een 25 mM van gallate toevoegen aan de buffer van de Tris te bereiken van de gewenste uiteindelijke substraat concentratie (0.05-25 mM).
      Opmerking: Bereiden dagelijks verse stamoplossingen van gallate en inhiberende verbindingen met water en breng de pH op 7.5 met de toevoeging van 0,1 mM NaOH, indien nodig.
    2. Na 10 s van roeren zodat voor het mengen van de oplossing, verzegelen van de kamer met de zuiger langzaam en schroef de bovenkant naar beneden. Een schone tissue kan worden gebruikt om de overtollige vloeistof dat wordt verplaatst van de kamer op u inwerken. Het toestaan van de elektrode te equilibreer waar het kan produceren een stabiele meting van de zuurstofconcentratie in de oplossing gedurende ten minste 1 minuut voordat u verdergaat met de toevoeging van het enzym (achtergrond O2 consumptie snelheid van ± 0,5 µM/min).
    3. Met behulp van een gas strak 10 µL spuit, ongeveer 1 µL van enzym (ongeveer 3-7 µM enzym) toevoegen aan de kamer van de elektrode door middel van de zuiger.
      Opmerking: De hoeveelheid enzym kan worden verhoogd of verlaagd in reactie op de waargenomen activiteit van het specifieke afgepipetteerde deel te voorzien van reactiesnelheden toereikend.
    4. Bereken de snelheid van de reactie op basis van de helling van de eerste 30 s van lineaire gegevens na toevoeging van het enzym en correcte voor achtergrond O2 consumptie met behulp van de 30 s van gegevens onmiddellijk voorafgaand aan de toevoeging van het enzym. Het tarief van catalyse is gelijk aan het tarief van O2 consumptie (figuur 5A).
    5. Na het verzamelen van de gegevens voor een bepaald substraat concentratie, leeg de zaal van de elektrode door middel van aspiratie met behulp van een plastic buis verbonden met een zijarm vacuüm kolf en spoeldouche herhaaldelijk met water voor 4-6 cycli. De oplossing in de elektrode instellen zoals beschreven in stap 7.2.1 met een nieuwe concentratie van het substraat.
    6. Substraat concentraties variëren op een niet geordende wijze en repliceren in de loop van het experiment bij account voor afname van de enzymactiviteit met tijd (figuur 5B).
      Opmerking: Wanneer wordt gerepliceerd voor een bepaalde concentratie worden uitgevoerd en meer dan een 30% daling van de rente in vergelijking met een eerder lopen tonen, geen aanvullende tests moeten worden uitgevoerd met die partij van enzym. Meestal na 30-40 punten toont het enzym een afname met 30% van de activiteit.
    7. Bepalen van de kinetische parameters, kkat (de katalytische constante voor de conversie van substraat naar product) en Km (de Michaelis constante, operationeel gedefinieerd als de concentratie van de ondergrond waarop het oorspronkelijke tarief is de helft van de maximale snelheid), door een montage van de kleinste kwadraten van gegevens uit elk van de concentraties van substraat voor de vergelijking van de Michaelis−Menten (Figuur 6) met behulp van Prisma GraphPad.
  3. Voeg 4-nitrocatechol (4NC) om te testen van het effect ervan op dioxygenation kinetiek en bepalen de remming constante (Kik) met DesB. Voor elke voorwaarde die reactie, voorraad oplossingen van Tris (50 mM), gallate (25 mM) en 4NC (25 mM) worden gecombineerd, verdund met water tot het opleveren van een 2 mL oplossing van 25 mM Tris buffer (pH 7.5) met 1 mM gallate en wisselende concentraties van 4NC. Het volume van de 4NC was gevarieerd om te bereiken van de gewenste uiteindelijke remmer concentratie (0.05-20 mM).
    1. Na 10 seconden van het roeren van de oplossing mengen, plaats de zuiger in de zaal langzaam en schroef de bovenkant naar beneden. Een schone tissue kan worden gebruikt om de overtollige vloeistof dat wordt verplaatst van de kamer op u inwerken. Het toestaan van de elektrode equilibreer en produceren een stabiele meting van zuurstofgehalte in de oplossing gedurende ten minste 1 minuut voordat u verdergaat met de toevoeging van het enzym (achtergrond O2 consumptie snelheid van ± 0,5 µM/min).
    2. Zoals eerder is beschreven, toevoegen van het eiwit (stap 7.2.3), bepalen van de reactiesnelheid (stap 7.2.4) en reset van de elektrode voor de volgende voorwaarde.
    3. Als een deel van deze serie van experimenten, bepalen de reactiesnelheid bij gebrek aan remmer meerdere keren. Bepaal de remming door standaardisatie van de tarieven van zuurstofverbruik in aanwezigheid van verschillende concentraties van de Inhibitor van de omwenteling met 1 mM substraat en het ontbreken van de Inhibitor van de omwenteling (v/vo).
    4. Passen de remming van gallate dioxygenation voor vergelijking 7.3A en vervolgens de inhibitie gegevens voor vergelijking 7.3B met behulp van een grafische programma (Figuur 7).
  4. Bepaal de concentratie van de precieze enzym voor elk experiment door het uitvoeren van een analyse van Bradford na voltooiing van alle kinetische punten.
    Opmerking: Alle prijzen werden gecorrigeerd voor de concentratie van enzym. Deze stap hoeft niet te worden gedaan in een handschoenenkastje of handschoen tas.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

De SDS-pagina gel analyse van afzonderlijke fracties van de reiniging van de DesB-maltose bindende eiwit (MBP) fusion construct (Figuur 3) wordt getoond. De gel blijkt dat het eiwit pure is (MW = 91.22 kDa), met uitzondering van de aanwezigheid van DesB (MW = 49.22 kDa) en MBP eiwit domein (42 kDa) gekloofd van elkaar. Breuken E2 en E3 werden geselecteerd voor concentratie (stap 4.2).

Reproduceerbare resultaten uit DesB kinetische testen is afhankelijk van correcte montage, kalibratie en experimentele techniek. Het is noodzakelijk voor het invoeren van de juiste omgevingstemperatuur en -druk, aangezien deze variabelen bepalen het percentage O2 moeten worden opgelost in oplossingen tijdens de assay (figuur 4A). Het eerste signaal moet tussen 1800 en 2000 nmol/mL en moet produceren een stabiele rente dicht bij nul, hetgeen betekent dat de zuurstof saturatie van de oplossing minimaal (figuur 4B) aan het veranderen is. Zodra de natrium-dithionate wordt toegevoegd en de zaal is verzegeld, het tarief van O2 consumptie moet snel en gestaag toenemen totdat er minimale O2 (< 60 nmol/mL) liet in de oplossing. Een constante negatieve helling geeft aan dat 1) de geassembleerde elektrode geen lucht lekken heeft en 2) de elektrode adequaat op veranderingen in O2 concentratie (figuur 4C en D reageert is). Als de O-2 nog in oplossing niet voldoende laag is, zullen de kalibratie-offsetwaarde onjuist zijn. De kalibratie moet worden herhaald met de elektrode correct gemonteerd, en verse natrium dithioniet moet worden gebruikt.

Wanneer de elektrode is correct gekalibreerd, kunnen kinetische testen worden uitgevoerd. De eerste meting wordt de activiteit van het vers desalted enzym met behulp van 100 µM gallate in 25 mM Tris buffer en 1 uL van enzym. Vóór toevoeging van het enzym, worden de Tris buffer en gallate bewogen in de kamer met de plunjer in positie. Dit een geschatte eerste signaal tussen 250 en 350 nmol/mL moet produceren, en het signaal moet stabiliseren (±5 nmol/mL/min) voordat het enzym wordt toegevoegd. Een stabiel signaal geeft aan dat er geen variabelen (b.v., gescheurd membraan, overgebleven natrium dithioniet, vuile elektrode) dat kan leiden tot inconsistente metingen. Wanneer enzym wordt toegevoegd, wordt het signaal moet snel en gestaag dalen, die aangeeft dat de reactie van DesB verloopt, aangezien O2 in de reactie met gallate is verbruikt. De helling van het oorspronkelijke tarief voordat enzym toevoeging en de katalytische tarief werden bepaald door de hulpprogramma's tarief en aanpassen van het venster tot 30 seconden (figuur 5A). Na ongeveer 1-1,5 uur van gebruik, vermindert de enzymactiviteit door ongeveer 30-50%, op welk punt het moet niet langer worden gebruikt (figuur 5B).

Zodra alle kinetische metingen zijn genomen, kunnen de gegevens worden uitgezet met behulp van een modeling programma (Figuur 6). De activiteit van DesB met gallate wordt verkregen door het meten van de snelheid van O2 consumptie in uiteenlopendeconcentratiesverkrijgbaar gallate. Het tarief van de achtergrond vóór toevoeging van het enzym wordt afgetrokken van het katalytische tarief te verkrijgen van de gecorrigeerde snelheid. De achtergrond gecorrigeerde tarief is gedeeld door de concentratie van enzym en uitgerust voor vergelijking 7.3A (zie stap 7.3.3). Een voldoende pasvorm is afhankelijk van de oorspronkelijke parameters voor K,M en Ksi, (initiële parameters:KM = 320 μM, Ksi = 1600 μM). Het resultaat toont een hyperbolische kromme die een maximale plateau bereikt, dan hellingen naar beneden iets als [gallate] toeneemt. Dit is een typische kromme voor een enzym dat substraat remming bij hoge substraat concentraties vertoont.

Equation 7.3B

De remming van de DesB met 4-nitrocatechol werd bepaald door het observeren van de vermindering van zuurstof verbruik tarief van DesB met 1 mM gallate in aanwezigheid van uiteenlopendeconcentratiesverkrijgbaar van 4-nitrocatechol (Figuur 7). De 4-NC-concentratie was uitgezet tegen de genormaliseerde activiteit (het tarief in aanwezigheid van de Inhibitor van de omwenteling werd gedeeld door het ongeremd tarief) en passen bij de vergelijking 7.3B (zie stap 7.3.3). De resultaten wijzen erop dat 4-NC remt de consumptie van zuurstof, waardoor de remming van de DesB reactie.

Equation 7.3A

Mediatype Onderdelen
Super optimale bouillon met onderdrukking van de omzettingsproducten (SOC media) 2% (g/v) trypton
0,5 gistextract-% (w/v)
10 mM NaCl
2.5 mM KCl
10 mM MgCl2 (toegevoegd na sterilisatie)
20 mM glucose (toegevoegd na sterilisatie)
Millers lysogenie bouillon met ampicilline (LB-Amp media) 0,5 gistextract-% (w/v)
1% (m/v) trypton
1% (m/v) NaCl
0,1 mg/mL ampicilline (toegevoegd na sterilisatie)

Tabel 1. Ingrediënten voor de bereiding van super optimale bouillon met onderdrukking van de omzettingsproducten (SOC media) en Millers lysogenie bouillon met ampicilline (LB-Amp media).

Werkende oplossing Component eindconcentraties
Laemelli Buffer, pH 6.8 100 mM tris (hydroxymethyl) aminomethane (Tris)
200 mM dithiothreitol (DTT),
4% natrium dodecyl sulfaat (SDS)
0,05% bromophenol blauw
20% glycerol
Uitvoeren Buffer pH 8.3 25 mM Tris
192 mM glycine
0,1% SDS

Tabel 2. Ingrediënten voor de bereiding van Laemelli en lopende buffers SDS-pagina analyseren.

Werkende oplossing Component eindconcentraties
Amylose kolom Buffer, pH 7.4 20 mM tris (hydroxymethyl) aminomethane (Tris)
1 mM ethyleendiamminetetra azijnzuuroplossing (NA2EDTA)
200 mM NaCl
PH van de Buffer elutie 7.4 20 mM Tris
1 mM EDTA
200 mM NaCl
10 mM maltose
Exchange Buffer, pH 7.5 50 mM Tris
10% glycerol
Buffer, pH 7.5 desalt 50 mM Tris
10% t-butanol

Tabel 3. Ingrediënten voor de bereiding van buffers voor eiwitreiniging.

Figure 1
Figuur 1: vergelijking van de reacties gekatalyseerd door ring splijten dioxygenases. De golvende lijnen tonen de bijbehorende koolstof-koolstofbinding dat is gekloofd tijdens de reactie van de dioxygenase, waar intradiol decollete (rood) breekt de band tussen de twee hydroxylgroepen en extradiol splitsing (blauw) pauzes een koolstof-koolstofbinding grenzend aan de hydroxylgroepen. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

Figure 2
Figuur 2: de reacties gekatalyseerd door DesB en LigAB, twee verwante extradiol dioxygenases die tot de superfamilie van type II protocatechuate dioxygenase (PCAD behoren). Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

Figure 3
Figuur 3: SDS-pagina gel van DesB resultaten reiniging en concentratie stappen. Rijstroken worden als volgt aangeduid: S = eiwit standaard, FT1 en FT2 = de verzamelde doorstroomtest breuken, W1 en W2 = de verzamelde wassen breuken, E1-E4 = de verzamelde Elueer breuken. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

Figure 4
Figuur 4: generatie van kalibratie buigt voor de zuurstof-elektrode. (A) voorafgaand aan kalibratie, worden omgevingstemperatuur en -druk ingevoerd in het programma om te bepalen van zuurstofconcentraties voor lucht-geëquilibreerd oplossingen. (B) de zuurstof verzadigde oplossing bereikt evenwicht en genereert een prompt. (C) natrium dithionate oplossing wordt toegevoegd aan het gebruiken van alle zuurstof, zoals aangegeven door de afname van de zuurstof signaal. (D) kalibratie wordt verkregen wanneer het signaal op nul zuurstofconcentratie stabiliseert. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

Figure 5
Figuur 5: vertegenwoordiger kinetische curven ter illustratie van een typische verlies van activiteit na verloop van tijd. (A) de reactie van 100 µm gallate verse DesB, met een O-2 bestedingspercentage van-56.61 µM/min. (B) de reactie van 100 µm gallate met behulp van DesB na 2 h van gegevensverzameling, met een O-2 bestedingspercentage van-29.56 µM/min. gelieve Klik hier om een grotere versie van dit cijfer.

Figure 6
Figuur 6: Plot of DesB activiteit met gallaat, aanpassen aan de Michaelis-Menton vergelijking (zwart), en fit voor de vergelijking van de Haldane voor substraat remming (rood; Vergelijking 7.3B). Kinetische parameters afgeleid van de twee past zijn als volgt: Michaelis-Menten - kkat = 316 +/-17 sec-1, Km = 123 +/-26 μM; Haldane - kkat = 570 +/-110 sec-1, Km = 320 +/-100 μM, Ksi = 1600 +/-600 μM. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

Figure 7
Figuur 7: perceel van 4-nitrocatechol inhibitie van DesB dioxygenation van gallate (1 mM). Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

Figure 8
Figuur 8: coördinatie van gallate door DesB (VOB ID = 3wr3). Zoals gezien in vele dioxygenases, coördineert de ligand om een actieve site ijzer(II) atoom in een bidentate mode. Gebaseerd op de structurele gelijkenissen tussen gallate en 4-nitrocatechol (4NC), werd de remming van DesB door 4NC voorspeld. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

De kritische stappen bij het verkrijgen van actieve, gezuiverde eiwit van het DesB betrekking hebben op de vorming en handhaving van de verminderde Fe(II) actieve site in het enzym. Als zodanig, het corrigeren van prestaties van de inductie, zuivering, concentratie en demineralisatie maatregelen zijn noodzakelijk voor het actieve enzym met succes te verkrijgen. Inducerende eiwituitdrukking in aanwezigheid van 1 mM ferro ammoniumsulfaat, zorgt u ervoor dat de Fe(II) correct is opgenomen in de actieve site van DesB. Deze methode is geïnspireerd door studies zoals die met amidohydrolase metalloenzymes, waarvoor vaak de toevoeging van metaal tot groei media om juiste vouwen en volledige bezetting van het metaal bindende site6,41,42 ,43.

De anaërobe zuivering en de concentratie in het handschoenenkastje zijn misschien de meest kritische en technisch moeilijke stappen in dit protocol. Het is essentieel om een zuurstofvrij atmosfeer in het handschoenenkastje. Dit vereist het behoud van de deoxygenering katalysator in de ' glovebox ', zoals voorgeschreven door de handleiding regelmatig wijzigt de stikstof-tanks die zijn gekoppeld aan het vak wanneer ze laag zijn, ervoor te zorgen dat er zijn geen gaten in de handschoenen gekoppeld aan de ' glovebox ', en het bijhouden van een dienblad van verse droogmiddel in de ' glovebox '. Zuurstof-gevoelige stroken die veranderen van kleur bij blootstelling aan ambient O2 kunnen worden geplaatst in het vak om te testen voor een O-2-vrije sfeer. Er moet bovendien volledig ontgas alle buffers en oplossingen die zal worden gebruikt tijdens het proces van reiniging en concentratie. Om minimale O2 in de buffers, besteden veel zorg aan het beperken van blootstelling van de ontgaste buffers in de lucht wanneer u overschakelt tussen stikstof borrelen en stofzuigen cycli.

Wanneer de kolom in het handschoenenkastje uitgevoerd, een goede test om te bepalen of er zuurstof aanwezig is in de buffers is om een klein deel van een van de fracties wassen (ongeveer 0,1-0,5 mL) en breng dit in een microcentrifuge-buis met een klein gedeelte van ferro ammoni Umm sulfaat en DTT (minder dan het bedrag dat nodig is voor de concentratie stap). Het is vervolgens belangrijk om de inhoud van de tube goed mengen en observeren van de kleur wijzigen. Als de oplossing bochten zwart, donker geel, of oranje, er is zuurstof aanwezig in de eiwitfracties, en er zal waarschijnlijk worden verminderde katalytische activiteit na de volledige reiniging en concentratie. Als de oplossing een licht is lavendel of zeer licht-gele kleur, kunnen er minimale O2 aanwezig, maar het is waarschijnlijk dat het enzym hoogactieve nog zal hebben. De donker geel tot oranje kleur te veranderen wanneer zuurstof aanwezig is wordt waarschijnlijk veroorzaakt door oxidatie van het ijzer in de ferro ammoniumsulfaat te Fe(III), vorming van roest44. U kunt dit probleem oplossen, is het aanbevolen om de buffers ontgas en toestaan van stikstof bubble via ruwe de eiwit-oplossing voor 1-2 extra minuten alvorens hen te plaatsen in het handschoenenkastje. Ook, is het belangrijk om ervoor te zorgen dat de sfeer in het handschoenenkastje echt O2 is-gratis met behulp van O2-gevoelige stroken.

De laatste kritieke stap, ontzouten van het enzym voorafgaand aan kinetische karakterisering, vereist een zuurstofvrij atmosfeer en moet worden gedaan op het ijs, zoals de gezuiverde proteïne gevoelig voor denaturatie bij kamertemperatuur is. Bepalen wanneer het desalted eiwit komt uit de kolom is essentieel voor succesvolle kinetische testen, als de meest geconcentreerde breuken de meest reproduceerbare resultaten geven. Het gedeelte waar de desalted proteïne wordt geëlueerd moet telkens een nieuwe partij van eiwit wordt gezuiverd en wanneer de kolom is omgepakt met nieuwe hars worden bepaald. Als activiteit tijdens kinetische testen slinkt en de zuivering en concentratiestappen is technisch onder de knie hebt, kan het probleem liggen in de demineralisatie stap. Bij het oplossen van deze stap, is het van cruciaal belang om te controleren dat de 50 mM Tris/10% t-butanol buffer grondig ontgaste is, opnieuw inpakken van de kolom met verse Sephadex hars, en zorgen dat er geen gaten in de zak van de handschoen zijn.

Nadat DesB is met succes gezuiverd en ontzout, moeten kinetische testen met behulp van de zuurstof-elektrode zorgvuldig worden uitgevoerd om het verkrijgen van gegevens over de katalytische activiteit van het enzym. Kinetische metingen zijn meestal worden gereproduceerd wanneer een catalytically actief en geconcentreerde eiwit wordt gebruikt. Als gegevenspunten niet reproduceerbaar zijn wanneer een run herhalen voor een substraat of remmer gegevenspunt van concentratie, kan het probleem worden dat het eiwit is gedenatureerd of geoxideerd na langdurig gebruik. Eiwit vers ontzout kan worden gegenereerd zodat de voortzetting van de gegevensverzameling. Het is belangrijk om alle flesjes van het enzym, behouden dus de exacte eiwitconcentratie kan worden bepaald na voltooiing van het verzamelen van de gegevens met behulp van een analyse van Bradford. Deze stap wordt uitgevoerd na de kinetiek metingen omdat het enzym activiteit na verloop van tijd, verliest dus het uitvoeren van het eerste kan leiden tot lagere activiteit en onjuiste kinetiek metingen. De eiwitconcentratie wordt vervolgens gebruikt om te converteren van waargenomen katalytische tarieven naar de reactiesnelheden die nodig zijn om te bepalen hoeveel omzet. Naast bezorgdheid over het verlies van de enzymactiviteit leidt tot irreproducible kinetiek resultaten, afbraak van het membraan die betrekking hebben op de elektrode na langdurig gebruik kan ook uitdagingen veroorzaken bij het reproduceren van gegevens. Aantasting van het membraan wordt meestal aangegeven door een toename van het oorspronkelijke signaal (van 250-350 nmol/mL tot >350 nmol/mL) of een onvermogen om te bereiken van een stabiele achtergrond tarief vóór toevoeging van het enzym (> ±5 nmol/mL/min). Indien een wordt waargenomen, is het aanbevolen om de elektrode te demonteren, schoon elke stikstofoxiden uit de elektrode met behulp van de meegeleverde schoonmaak poeder, Monteer de elektrode en kalibreren.

De methode van de anaërobe zuivering is erg belangrijk voor enzymen met een metalen centrum dat kan worden geoxideerd, vooral voor degenen die hebben strak gebonden metalen die kunnen niet worden omgeruild na het vouwen van eiwitten. Hoewel de enzymen zijn geëvolueerd om zichzelf te beschermen door het coördineren van zuurstof alleen na substraat coördinatie, zij hebben gedaan in een mobiele omgeving - de saturating hoeveelheid zuurstof in een in vitro -omgeving kunnen leiden tot snelle oxidatie van metalen en de omzetting van Fe(II) in de inactieve Fe(III) formulier31. Deze oxidatie/inactivering kan leiden tot scheve resultaten waarin het enzym niet in de catalytically actieve status is. De kinetische testen met behulp van een zuurstof-gevoelige elektrode kunnen worden toegepast op enzymen die afhankelijk zijn van zuurstof als substraat. In plaats van kinetiek parameters met behulp van de verandering in intensiteit van de absorptie van substraat of product te verkrijgen, kan deze methode voor de visualisatie van zuurstofverbruik verzadigd in oplossing. Deze methode is eerder gebruikt met LigAB, een andere extradiol dioxygenase in de protocatechuate dioxygenase superfamilie die ook afhankelijk van een Fe(II) in de actieve site is te coördineren en te klieven zijn substraten.

Dit manuscript bevat ook extra informatie over het enzym DesB van Sphingobium sp. stam Unnethes-6. Naar aanleiding van het werk dat gedefinieerd de enzymatische functie en structuur van DesB10,19,39, werd vastgesteld hierin dat DesB een bevoegde katalysator van de dioxygenation van gallaat, met kkat van is 17.8 ± 1,0 s-1 en Km 45 ± 13 µm, resulterend in kkat/Km 3.98 x 105 M/s. Deze tarieven zijn vergelijkbaar met die voor andere dioxygenase enzymen, met inbegrip van de LigAB bepaald (kkat van 51 s-1 en kkat/KM van 4.26 x 106 M-1s-1 ) en andere dioxygenases die heb kkat/Km waarden variërend van 105-108 M-1s-136,45,46 , 47 , 48 , 49 , 50.

De DesB actieve site bleek eerder te worden op het raakvlak van dimeer, met resten van beide monomeren bij te dragen tot de coördinatie van het substraat [residuen afkomstig van het monomeer die bindt van de Fe(II) worden aangeduid met hun nummer residu, terwijl residuen van de andere monomeer worden aangeduid met hun nummer residu en een priemgetal (d.w.z. Glu377ʹ)]6. Bij gebreke van structurele informatie weergegeven: de interacties van de binding van 4NC met DesB, kunnen de structurele gelijkenissen en verschillen tussen gallate en 4NC inzicht geven in hoe DesB kan worden geremd door 4NC. Gallate heeft drie hydroxyl substituenten C3, C4 en C5, met haar C3 en C4 hydroxyls wordt afgestemd op het Fe(II) center en de C5 hydroxyl wordt gecoördineerd door het Glu377ʹ (Figuur 8). De carbonzuur-groep bij C1 wordt gecoördineerd door Tyr-391ʹ, Tyr-412ʹ, Thr-13 en Thr-267 in de DesB actieve site. 4NC, die bleek te zijn een bescheiden inhibitor van DesB, heeft twee hydroxyls beschikbaar om het Fe(II) center en één C1 nitro groep die is isosteric aan een carboxylaat (terwijl het ook hebben twee oxygens voor coördinatie door residuen 391, 412, 13 en 267), maar is veel meer te coördineren elektron-intrekken dan de carbonzuur voor gallate. Aangezien 4NC alleen 36,6% inhibitie van de DesB dioxygenation van gallate weergegeven als de Inhibitor van de omwenteling in 5-fold overschrijding van substraat aanwezig was, is het niet verrassend dat het was niet een zeer krachtige remmer (met een Kik van 2.3 ± 0,3 mM). Dit suggereert dat de C5 hydroxyl en C1 substituent een belangrijke rol spelen bij de bevordering van het enzym-ligand-complex. Aangezien Glu377ʹ en afvallen, Tyr-391ʹ, Tyr-412ʹ allemaal bij deze interacties betrokken zijn, suggereert dit dat DesB actieve site contacten met aangrenzende monomeren zijn belangrijk voor de plaatsing van een compound en structurering van de actieve site.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

De auteurs hebben geen concurrerende financiële belangen of andere belangenconflicten.

Acknowledgments

We zouden graag bedanken Dr. Camille Keller van Wesleyan University voor technische ondersteuning. Speciale dank aan Professor Lindsay D. Eltis en Jenna K. Capyk van de University of British Columbia, evenals Christian Whitman van de Universiteit van Texas in Austin, voor hun advies over anaërobe eiwit zuivering methoden en het gebruik van een O2 -gevoelige elektrode.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Isopropyl β-D-1-thiogalactopyranodise Gold Bio Technologies I2481C50
Coomassie Brilliant Blue R-250 Bio-Rad 161-0400
Ammonium persulfate Bio-Rad 161-0700
30% Acrylamide Bio-Rad 161-0158
N,N'tetramethyl-ethylenediamine Bio-Rad 161-0801
Amylose Resin High Flow New England Biolabs E8022S
BL21 (DE3) competent Escherichia coli cells New England Biolabs C2527I
L-cysteine Sigma Aldrich C7352
gallic acid Sigma Aldrich G7384
4-nitrocatechol Sigma Aldrich N15553
Ferrous ammonium sulfate Mallinckrodt 5064
Sodium dithionite Alfa Aesar 33381-22
wheaton serum bottles Fisher Scientific 06-406G
25 mm Acrodisc PF Syringe Filter with Supor Membrane Pall Corportation 4187
400 mL Amicon Stirred Cell Concentrator EMD Millipore UFSC40001
76 mm Millipore Ultracel 10 kDa cutoff reconsituted cellulose membrane filter EMD Millipore PLGC07610
DL-dithiothreitol Gold Bio Technologies DTT50
Sephadex G-25 coarse desalting gal column GE Healthcare 17-0033-01
2 mL Crimp-Top Vials Fisher Scientific 03-391-38
Oxygraph Plus Electrode Control Unit Hansatech Instruments OXYG1 Plus
Oxygen Eletrode Chamber Hansatech Instruments DW1
Electrode Disc Hansatech Instruments S1
PTFE (0.0125 mmX25mm) 30m reel Hansatech Instruments S4
Electrode cleaning Kit Hansatech Instruments S16
Spacer paper Zig Zag available at any gas station
He-series Dri-Lab glove box Vacuum/Atmospheres Company
HE-493 Dri-Train Vacuum/Atmospheres Company
Double-Ended Micro-Tapered Stainless Steel Spatula Fisher Scientific 21-401-10
DWK Life Sciences Kimble Kontes Flex Column Economy Column Fisher Scientific k420400-1530
10 μL, Model 701 N SYR, Cemented NDL 26s ga, 2 in, point stlye 2 syringe Hamilton 80300
DWK Life Sciences Kimble Kontes Flex Column Economy Column Fisher Scientific K420401-1505
Emulsiflex-C5 high-pressure homogenizer Avestin
B-PER Complete Bacterial Protein Extraction Reagent Thermo Fisher Scientific 89821
Lysozyme from chicken egg white Sigma Aldrich 12650-88-3
Sodium dodecyl sulfate Thermo Fisher Scientific 151-21-3
ampicillin Sigma Aldrich 7177-48-2
Tryptone Fisher Scientific BP-1421-500
Yeast extract Fisher Scientific BP1422-2
Sodium Chloride Fisher Scientific S271-10
Potassium Chloride Fisher Scientific P217-3
Magnesium Chloride Fisher Scientific M33-500
Dextrose Fisher Scientific D16-3
Sodium Hydroxide Fisher Scientific S318-1
Tris hydrochloride Fisher Scientific BP153-500
Maltose Fisher Scientific BP684-500
Glycine Fisher Scientific G46-500

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Awaya, J. D., Walton, C., Borthakur, D. The pydA-pydB fusion gene produces an active dioxygenase-hydrolase that degrades 3-hydroxy-4-pyridone, an intermediate of mimosine metabolism. Applied Microbiology and Biotechnology. 75, (3), 583-588 (2007).
  2. Barry, K. P., Taylor, E. A. Characterizing the Promiscuity of LigAB, a Lignin Catabolite Degrading Extradiol Dioxygenase from Sphingomonas paucimobilis SYK-6. Biochemistry. 52, (38), 6724-6736 (2013).
  3. Colabroy, K. L., Smith, I. R., Vlahos, A. H. S., Markham, A. J., Jakubik, M. E. Defining a kinetic mechanism for l-DOPA 2,3 dioxygenase, a single-domain type I extradiol dioxygenase from Streptomyces lincolnensis. Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Proteins and Proteomics. 1844, (3), 607-614 (2014).
  4. Imsand, E. M., Njeri, C. W., Ellis, H. R. Addition of an external electron donor to in vitro assays of cysteine dioxygenase precludes the need for exogenous iron. Archives of Biochemistry and Biophysics. 521, (1), 10-17 (2012).
  5. Tsai, C. -L., Tainer, J. A. Methods in Enzymology. David, S. S. 599, Academic Press. 157-196 (2018).
  6. Kuchenreuther, J. M., et al. High-Yield Expression of Heterologous [FeFe] Hydrogenases in Escherichia coli. Public Library of Science ONE. 5, (11), e15491 (2010).
  7. Dupuy, J., et al. Crystallization and preliminary X-ray diffraction data for the aconitase form of human iron-regulatory protein 1. Acta Crystallographica Section F. 61, (5), 482-485 (2005).
  8. Fan, L., et al. XPD Helicase Structures and Activities: Insights into the Cancer and Aging Phenotypes from XPD Mutations. Cell. 133, (5), 789-800 (2008).
  9. Vaillancourt, F. H., Bolin, J. T., Eltis, L. D. The ins and outs of ring-cleaving dioxygenases. Critical Reviews in Biochemistry and Molecular Biology. 41, 241-267 (2006).
  10. Sugimoto, K., et al. Molecular Mechanism of Strict Substrate Specificity of an Extradiol Dioxygenase, DesB, Derived from Sphingobium sp. SYK-6. Public Library of Science ONE. 9, (3), e92249 (2014).
  11. Lewis-Ballester, A., et al. Structural insights into substrate and inhibitor binding sites in human indoleamine 2,3-dioxygenase 1. Nature Communications. 8, (2017).
  12. Lipscomb, J. D., Hoffman, B. M. Allosteric control of O-2 reactivity in Rieske oxygenases. Structure. 13, (5), 684-685 (2005).
  13. Mccray, J. A., Brady, F. O. Allosteric Control of Transient Kinetics of Carbon Monoxide-L-Tryptoohan-2,3-Dioxygenase Complex-Formation. Federation Proceedings. 32, (3), 469 (1973).
  14. Pearson, J. T., Siu, S., Meininger, D. P., Wienkers, L. C., Rock, D. A. In Vitro Modulation of Cytochrome P450 Reductase Supported Indoleamine 2,3-Dioxygenase Activity by Allosteric Effectors Cytochrome b(5) and Methylene Blue. Biochemistry. 49, (12), 2647-2656 (2010).
  15. Walsh, H. A., Daya, S. Inhibition of hepatic tryptophan-2,3-dioxygenase: Superior potency of melatonin over serotonin. Journal of Pineal Research. 23, (1), 20-23 (1997).
  16. Barry, K. P., et al. Exploring allosteric activation of LigAB from Sphingobium sp strain SYK-6 through kinetics, mutagenesis and computational studies. Archives of Biochemistry and Biophysics. 567, 35-45 (2015).
  17. Reynolds, M. F., et al. 4-Nitrocatechol as a probe of a Mn(II)-dependent extradiol-cleaving catechol dioxygenase (MndD): comparison with relevant Fe(II) and Mn(II) model complexes. Journal of Biological Inorganic Chemistry. 8, (3), 263-272 (2003).
  18. Tyson, C. A. 4-Nitrocatechol as a colorimetric probe for non-heme iron dioxygenases. Journal of Biological Chemistry. 250, (5), 1765-1770 (1975).
  19. Kasai, D., Masai, E., Miyauchi, K., Katayama, Y., Fukuda, M. Characterization of the gallate dioxygenase gene: Three distinct ring cleavage dioxygenases are involved in syringate degradation by Sphingomonas paucimobilis SYK-6. Journal of Bacteriology. 187, (15), 5067-5074 (2005).
  20. Billings, A. F., et al. Genome sequence and description of the anaerobic lignin-degrading bacterium Tolumonas lignolytica sp. nov. Standards in Genomic Sciences. 10, (1), 106 (2015).
  21. Brown, M. E., Chang, M. C. Y. Exploring bacterial lignin degradation. Current Opinion in Chemical Biology. 19, 1-7 (2014).
  22. Bugg, T. D. H., Ahmad, M., Hardiman, E. M., Rahmanpour, R. Pathways for degradation of lignin in bacteria and fungi. Natural Product Reports. 28, (12), 1883-1896 (2011).
  23. Clarkson, S. M., et al. Construction and Optimization of a Heterologous Pathway for Protocatechuate Catabolism in Escherichia coli Enables Bioconversion of Model Aromatic Compounds. Applied and Environmental Microbiology. 83, (18), (2017).
  24. de Gonzalo, G., Colpa, D. I., Habib, M. H. M., Fraaije, M. W. Bacterial enzymes involved in lignin degradation. Journal of Biotechnology. 236, 110-119 (2016).
  25. Falade, A. O., Eyisi, O. A. L., Mabinya, L. V., Nwodo, U. U., Okoh, A. I. Peroxidase production and ligninolytic potentials of fresh water bacteria Raoultella ornithinolytica and Ensifer adhaerens. Biotechnology Reports. 16, 12-17 (2017).
  26. Gall, D. L., Ralph, J., Donohue, T. J., Noguera, D. R. A Group of Sequence-Related Sphingomonad Enzymes Catalyzes Cleavage of β-Aryl Ether Linkages in Lignin β-Guaiacyl and β-Syringyl Ether Dimers. Environmental Science & Technology. 48, (20), 12454-12463 (2014).
  27. Li, J., Yuan, H., Yang, J. Bacteria and lignin degradation. Frontiers of Biology in China. 4, (1), 29-38 (2009).
  28. Masai, E., Katayama, Y., Nishikawa, S., Fukuda, M. Characterization of Sphingomonas paucimobilis SYK-6 genes involved in degradation of lignin-related compounds. Journal of Industrial Microbiology & Biotechnology. 23, 364-373 (1999).
  29. Morales, L. T., González-García, L. N., Orozco, M. C., Restrepo, S., Vives, M. J. The genomic study of an environmental isolate of Scedosporium apiospermum shows its metabolic potential to degrade hydrocarbons. Standards in Genomic Sciences. 12, (1), 71 (2017).
  30. Shettigar, M., et al. Isolation of the (+)-Pinoresinol-Mineralizing Pseudomonas sp. Strain SG-MS2 and Elucidation of Its Catabolic Pathway. Applied and Environmental Microbiology. 84, (4), (2018).
  31. Shi, Y., et al. Characterization and genomic analysis of kraft lignin biodegradation by the beta-proteobacterium Cupriavidus basilensis B-8. Biotechnology for Biofuels. 6, (1), 1 (2013).
  32. Varman, A. M., et al. Decoding how a soil bacterium extracts building blocks and metabolic energy from ligninolysis provides road map for lignin valorization. Proceedings of the National Academy of Sciences. 113, (40), E5802-E5811 (2016).
  33. Wu, W., et al. Lignin Valorization: Two Hybrid Biochemical Routes for the Conversion of Polymeric Lignin into Value-added Chemicals. Scientific Reports. 7, (1), 8420 (2017).
  34. Koehntop, K. D., Emerson, J. P., Que, L. The 2-His-1-carboxylate facial triad: a versatile platform for dioxygen activation by mononuclear non-heme iron(II) enzymes. Journal of Biological Inorganic Chemistry. 10, (2), 87-93 (2005).
  35. Lipscomb, J. D. Mechanism of extradiol aromatic ring-cleaving dioxygenases. Current Opinion in Structural Biology. 18, (6), 644-649 (2008).
  36. Machonkin, T. E., Doerner, A. E. Substrate specificity of Sphingobium chlorophenolicum 2,6-dichlorohydroquinone 1,2-dioxygenase. Biochemistry. 50, 8899-8913 (2011).
  37. Suzuki, T., Kawamichi, H., Imai, K. Amino Acid Sequence, Spectral, Oxygen-Binding, and Autoxidation Properties of Indoleamine Dioxygenase-Like Myoglobin from the Gastropod Mollusc Turbo cornutus. Journal of Protein Chemistry. 17, (8), 817-826 (1998).
  38. Vaillancourt, F. H., Labbe, G., Drouin, N. M., Fortin, P. D., Eltis, L. D. The Mechanism-based Inactivation of 2,3-Dihydroxybiphenyl 1,2-Dioxygenase by Catecholic Substrates. Journal of Biological Chemistry. 277, (3), 2019-2027 (2002).
  39. Sugimoto, K., et al. Crystallization and preliminary crystallographic analysis of gallate dioxygenase DesB from Sphingobium sp. SYK-6. Acta Crystallographica Section F. 65, (11), 1171-1174 (2009).
  40. Gallagher, S. R. SDS‐Polyacrylamide Gel Electrophoresis (SDS-PAGE). Current Protocols in Essential Laboratory Techniques. 6, (1), 7.3.1-7.3.28 (2012).
  41. Xiang, D. F., et al. Function Discovery and Structural Characterization of a Methylphosphonate Esterase. Biochemistry. 54, (18), 2919-2930 (2015).
  42. Vladimirova, A., et al. Substrate Distortion and the Catalytic Reaction Mechanism of 5-Carboxyvanillate Decarboxylase. Journal of the American Chemical Society. 138, (3), 826-836 (2016).
  43. Korczynska, M., et al. Functional Annotation and Structural Characterization of a Novel Lactonase Hydrolyzing d-Xylono-1,4-lactone-5-phosphate and l-Arabino-1,4-lactone-5-phosphate. Biochemistry. 53, (28), 4727-4738 (2014).
  44. Netto, L. E. S., Stadtman, E. R. The Iron-Catalyzed Oxidation of Dithiothreitol Is a Biphasic Process: Hydrogen Peroxide Is Involved in the Initiation of a Free Radical Chain of Reactions. Archives of Biochemistry and Biophysics. 333, (1), 233-242 (1996).
  45. Arciero, D. M., Orville, A. M., Lipscomb, J. D. Protocatechuate 4,5-Dioxygenase from Pseudomonas testosteroni. Methods in Enzymology. 188, 89-95 (1990).
  46. Harpel, M. R., Lipscomb, J. D. Gentisate 1,2-dioxygenase from pseudomonas. Purification, characterization, and comparison of the enzymes from Pseudomonas testosteroni and Pseudomonas acidovorans. Journal of Biological Chemistry. 265, (11), 6301-6311 (1990).
  47. Ishida, T., Tanaka, H., Horiike, K. Quantitative structure-activity relationship for the cleavage of C3/C4-substituted catechols by a prototypal extradiol catechol dioxygenase with broad substrate specificity. Journal of Biochemistry. 135, (6), 721-730 (2004).
  48. Vaillancourt, F. H., Han, S., Fortin, P. D., Bolin, J. T., Eltis, L. D. Molecular Basis for the Stabilization and Inhibition of 2,3-Dihydroxybiphenyl 1,2-Dioxygenase by t-Butanol. Journal of Biological Chemistry. 273, (52), 34887-34895 (1998).
  49. Veldhuizen, E. J. A., et al. Steady-state kinetics and inhibition of anaerobically purified human homogentisate 1,2-dioxygenase. Biochemical Journal. 386, 305-314 (2005).
  50. Wolgel, S. A., et al. Purification and Characterization of Protocatechuate 2,3-Dioxygenase from Bacillus macerans: a New Extradiol Catecholic Dioxygenase. Journal of Bacteriology. 175, (14), 4414-4426 (1993).
Anaërobe EiwitReiniging en kinetische analyse via zuurstof-elektrode voor het bestuderen van de activiteit van de DesB Dioxygenase en inhibitie
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Uchendu, S. N., Rafalowski, A., Cohn, E. F., Davoren, L. W., Taylor, E. A. Anaerobic Protein Purification and Kinetic Analysis via Oxygen Electrode for Studying DesB Dioxygenase Activity and Inhibition. J. Vis. Exp. (140), e58307, doi:10.3791/58307 (2018).More

Uchendu, S. N., Rafalowski, A., Cohn, E. F., Davoren, L. W., Taylor, E. A. Anaerobic Protein Purification and Kinetic Analysis via Oxygen Electrode for Studying DesB Dioxygenase Activity and Inhibition. J. Vis. Exp. (140), e58307, doi:10.3791/58307 (2018).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter