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Biochemistry

Purification de protéine anaérobie et l’analyse cinétique via la sonde à oxygène pour l’étude de l’Inhibition et l’activité DesB Dioxygenase

Published: October 3, 2018 doi: 10.3791/58307

Summary

Nous présentons ici un protocole pour la purification de protéine anaérobie, la concentration de protéines anaérobie et ultérieure caractérisation cinétique à l’aide d’un système d’électrodes de l’oxygène. La méthode est illustrée à l’aide de l’enzyme DesB, une enzyme dioxygénase qui est plus stable et plus active lorsque purifié et stockées dans un environnement anaérobie.

Abstract

Les protéines sensibles à l’oxygène, y compris ces enzymes qui utilisent l’oxygène comme substrat, peuvent ont réduit stabilité lorsque purifiée à l’aide de méthodes traditionnelles de purification aérobie. Ce manuscrit montre les détails techniques impliqués dans le processus de purification anaérobie, y compris la préparation des tampons et réactifs, les méthodes de chromatographie sur colonne dans une boîte à gants et le dessalement de la protéine avant cinétique. Également décrites sont les méthodes pour la préparation et à l’aide d’une électrode à oxygène pour effectuer la caractérisation cinétique d’une enzyme utilisant l’oxygène. Ces méthodes sont illustrées à l’aide de l’enzyme dioxygénase DesB, une dioxygénase gallate de la bactérie Sphingobium SP. souche SYK-6.

Introduction

Les enzymes qui utilisent le fer ou autres métaux pour activer l’oxygène sont souvent sensibles à l’inactivation au cours du processus de purification en raison de leur éloignement de l’environnement réducteur d’une cellule. Par conséquent, ces protéines doivent servir de lysats cellulaires, être soumis à des agents réducteurs externes ou être purifiés par voie anaérobie pour s’assurer qu’ils ont une activité enzymatique optimale1,2,3,4. Pour ces enzymes qui sont sensibles à l’oxygène (enzymes contenant du fer plus précisément), effectuer toutes les étapes de purification et caractérisation tout en maintenant des conditions anaérobies est nécessaire pour caractériser complètement à eux. Cela a conduit les chercheurs à élaborer des montages tout laboratoire dans l’enceinte des chambres anaérobies d’études allant de l’expression de la protéine par cristallographie5,6,7,8 .

Dans les présentes, nous rapportons les méthodes d’épuration anaérobie et caractérisation cinétique de l’enzyme DesB à l’aide d’un système d’électrodes de l’oxygène. DesB est une dioxygénase gallate de la bactérie Sphingobium SP. souche SYK-6 qui est lié à LigAB, une dioxygénase protocatecuate partir du même organisme. Les deux enzymes appartiennent à la superfamille des dioxygénase (DGPAM) protocatéchuate de type II qui n’a pas été étudiée date9, probablement en partie due à des enzymes de cette superfamille sont sensibles à l’inactivation quand purifié à l’aide de la norme aérobique méthodes de purification des protéines. Puisque certains enzymes DGPAM affichent promiscuité de substrat, tandis que d’autres sont spécifiques à substrat2,10, plus loin la caractérisation de cette superfamille est nécessaire d’identifier les déterminants de la spécificité. Comme a été observée dans plusieurs enzymes super-familles11,12,13,14,15, petites molécules peuvent modifier l’activité par l’intermédiaire de l’inhibition compétitive directe ou la liaison de molécules à séparer les poches allostériques qui provoque une augmentation ou diminution de l’activité enzymatique16. Alors que la cinétique seul ne peut pas différencier l’emplacement de la reliure d’un modulateur, l’amplitude d’un changement d’activité est important pour comprendre les effets. En tant que telles, méthodes de caractérisation cinétique du DesB native et son activité en présence de 4-nitrocathécol (4NC), un composé utilisé couramment pour caractériser et inhiber dioxygénase enzymes2,17, 18, sont indiqués.

DesB est capable de décomposer gallate, un composé, via une réaction de dioxygénase (EDO) extradiol dans quel anneau ouverture est catalysée par l’oxygène comme l’un des substrats10,19d’aromatique dérivés de la lignine. Cette réaction enzymatique se produit dans le cadre de la décomposition de la lignine, un hétéropolymère aromatique se trouvée dans la paroi cellulaire des plantes. La lignine peut être dépolymérisée, produisant une variété de composés aromatiques qui peut être subdivisée en métabolites central3,20,21,22,23,24 ,25,26,27,28,29,30,31,32,33 . Extradiol dioxygénases (EDO) catalysent un anneau ouverture réaction dihydroxylé de composés aromatiques, où clivage se trouve en bordure d’un diol métal coordonnés ; en revanche, intradiol dioxygénases clivent les composés aromatiques analogues entre les deux groupes hydroxyle (Figure 1). ADE, comme de nombreux autres métalloenzymes, ont un centre métallique divalent pour coordination Fe (II) composé d’un deux-histidine, un-carboxylate triade9,34,35. Ces métalloenzymes devient oxydés, par autooxydation ou axée sur le mécanisme d’inactivation, alors que l’enzyme est rendu inactif2,36,37,38.

Dans les procédures expérimentales décrites dans ce manuscrit, nous utilisons le DesB, un membre de la superfamille DGPAM de la bactérie Sphingobium SP SYK-6, à catalyser l’apport d’oxygène à travers la liaison de C4-C5 de gallate d’Epigallocatechin (Figure 2 a). La régiochimie de ce clivage est analogue à LigAB, qui est une protocatéchuate-4,5-dioxygénase (Figure 2 b). Jusqu’ici, enquêtes de cette dioxygénase gallate n’incluent aucun signalement de composés qui inhibent le DesB10,19,,39. Avec l’utilisation des méthodes de purification aérobie, DesB a manifesté une activité variable, alors qu’avec l’utilisation de méthodes anaérobies, nous avons pu obtenir régulièrement les protéines à activité reproductible. Les études cinétiques décrites ici montrent les méthodes d’épuration anaérobie du DesB, caractérisation cinétique de la réaction du DesB avec gallate et l’inhibition du DesB par 4-nitrocathécol (4NC).

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Protocol

1. Généralités matériaux et méthodes

  1. Préparer tous les médias requis tel que décrit dans le tableau 1. Autoclave à 120 ° c pendant 15 min. stérile filtrer la solution de la SOC, après l’ajout du MgCl2 et du glucose, en le faisant passer à travers un filtre de 0,2 µm. Ajuster le pH de la solution de lysogénie bouillon (médias LB) du meunier avant l’autoclavage. Compléter la solution media LB-Amp après la stérilisation avec des solutions stériles de 0,2 mM de L-cystéine, puis 0,1 mM sulfate d’ammonium ferreux pour améliorer la solubilité et l’expression de la protéine.
  2. Préparer le buffer de Laemmli et en cours d’exécution pour l’électrophorèse sur gel de polyacrylamide (PAGE) comme décrit dans le tableau 2. Ajuster le pH des solutions (à l’aide de la base Tris HCl M 1 pour la préparation de la mémoire tampon) avant de diluer les composants à leur volume final.
  3. Préparer les mémoires tampons pour la purification de la protéine comme décrit dans le tableau 3. Ajuster le pH des solutions (à l’aide de la base Tris HCl M 1 pour la préparation de la mémoire tampon) avant de diluer les composants à leur volume final.
  4. Transférer les tampons préparées dans une bouteille qui peut être scellée avec un bouchon en caoutchouc monotrou et contient un tube de verre.
    1. Utiliser un tuyau pour raccorder le tube en verre du bouchon à une source de vide. Laisser la solution d’une solution contenant sous pression négative pendant environ 30 min, en brassant à vitesse moyenne.
    2. Couper le vide appliqué au sceau tout d’abord, avant de s’éteindre l’aspirateur. Ensuite, percer à travers le bouchon en caoutchouc avec deux aiguilles de 20G (celle qui est assez long pour atteindre le fond de la bouteille et une aiguille plus courte qui peut être utilisée comme un évent d’évacuation de gaz). Des bulles dans un flux constant d’azote tout en remuant à vitesse moyenne pendant 30 min.
    3. Enlever les aiguilles et répéter le dégazage et le bouillonnement en azote pour un total de trois cycles. Lorsque vous avez terminé, bien sceller la bouteille avec un bouchon en caoutchouc solide. De plus fixer le bouchon avec le film de paraffine et de fil de cuivre (20G) et placez-les dans la boîte à gants.
      Remarque : Tous les matériaux sont placés dans la boîte à gants et soumis à 3 cycles de purge de l’antichambre, suivie de passer l’aspirateur sur l’oxygène et il remplissage à l’azote. Tampons utilisés pour la purification et la concentration peuvent être plafonnés et stockés dans la boîte à gants indéfiniment.
  5. Préparer la solution de dithionate de sodium en dissolvant environ une spatule (0,31 "x 2", la plus petite extrémité d’une double culot micro coniques en acier inoxydable spatule) pleine de sodium dithionate environ 1 ml d’eau dégazée dans un tube de microtubes de 1,5 mL . Fermer le tube avec le film de paraffine avant l’enlèvement de la boîte à gants.
    NOTE : Stocker dithionate de sodium solide dans la boîte à gants pour éviter l’oxydation.

2. préparation de la colonne d’Amylose pour la Purification de protéines

  1. Faire un coulis de résine d’amylose haut débit (15 mL) combiné avec 5 volumes de colonne (75 mL) de tampon de colonne d’amylose. Transférer la suspension résinique dans deux flacons de 50 mL sérum et sceller chaque bouteille avec un septum en caoutchouc. Perforer un 20G, aiguille de 305 mm à travers le septum et l’azote de bulle dans la boue pendant environ 1 minute enlever l’oxygène de la suspension. Transvaser la solution contenant des protéines et résine dans la boîte à gants.
  2. Dans la boîte à gants, verser la résine dans une colonne de borosilicate de 2 x 30 cm munie d’un robinet d’arrêt simple, permettant à la résine s’installer et créer un lit de niveau. Vider le tampon de la colonne et équilibrer la colonne avec 3 volumes de colonne (total environ 30 mL) de tampon de colonne amylose dégazé à l’aide de gaz d’azote sous pression pour pousser le tampon par le biais de la résine à environ 1 goutte/s ou 5 mL/min, jusqu'à ce que le solvant soit juste au-dessus de la lit de résine.
    Remarque : Après la protéine est élué (voir étape 3.5 ci-dessous), la résine de colonne d’amylose est régénérée par un lavage avec volume de 1 colonne (10 mL) d’eau, puis volume 1 colonne de dodécylsulfate de sodium à 1 % (SDS) et enfin, 3 volumes de colonne (30 mL) d’eau. Cette étape peut être effectuée à l’extérieur de la boîte à gants. La résine de la colonne est stockée à 4 ° C à 20 % d’éthanol et peut être régénérée jusqu'à 5 fois.

3. protein Expression et Purification anaérobie du DesB

NOTE : Le gène DesB est synthétisé dans le commerce, ayant été placé en pET-15 b, pET-32 a et vecteurs pMAL-c5x à l’aide de la restriction Ndel et BamHI clonage sites.

  1. Toutes les épreuves d’expression protéique conformément aux directives du fabricant pour déterminer les conditions correctes pour l’expression de grande échelle (décrit brièvement ci-dessous).
    1. Transformer les plasmides contenant du DesB en fabrication commerciale, chimiquement compétent e. coli BL21 (DE3) cellules, selon les instructions du fabricant. En bref, décongeler les cellules sur la glace pendant 10 min, ajouter environ 10-50 ng d’ADN plasmidique au mélange cellulaire, choc thermique des cellules à 42 ° C pendant 10 s et les incuber sur glace pendant un 5 min supplémentaires médias SOC ajouter pour obtenir un volume final de 1 mL et permettre la cellules de secouer (~ 200 tr/min) à 37 ° C pendant 60 min. Sur une plaque de LB-Amp, ajouter et répandre 100 µL de la solution de la cellule et incuber une nuit à 37 ° C.
    2. Sélectionnez une seule unité formant colonie par la plaque après incubation pendant la nuit et utiliser cette colonie pour ensemencer 10 mL de médias LB-Amp. Cultiver les cellules pendant la nuit, avec agitation (~ 200 tr/min) à 37 ° C.
    3. À 10 mL de médias, ajouter 100 µL de la solution de croissance durant la nuit et secouer les nouveaux médias, comme indiqué au point 3.1.2 à 37 ° C. Lorsque la densité optique à 600 nm (OD600) est entre 0,4 à 0,8, ajouter isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside (IPTG) pour obtenir une concentration de la solution finale de 1 mM.
    4. Immédiatement enlever une portion de 1 mL de la solution et le transférer dans un tube de microtubes de 1,5 mL avec le temps marqué = 0 heures. Tourner le tube à 15 000 x g pendant 10 min granuler les cellules. Après l’essorage, éliminer le surnageant et stocker les cellules à 4 ° C.
    5. Retirer les aliquotes supplémentaires (1 mL chacune) à intervalles de temps après l’ajout d’IPTG (généralement à 5, 10, 12, 18 et 24 h). Comme indiqué au point 3.1.4, centrifuger chaque tube, éliminer le surnageant et stocker les cellules à 4 ° C.
    6. Une fois que toutes les parties aliquotes sont obtenus, remettre en suspension les cellules de chaque validant dans 30 µL de solution d’extraction de protéine bactérienne, leur incubation à température ambiante pendant 10-15 minutes et centrifuger les tubes à 15 000 × g pendant 5 min séparer les solubles et insolubles protéines.
    7. Transférer la solution de protéines solubles dans un nouveau tube de microcentrifuge et remettre en suspension les pellets insolubles restantes avec 30 µL de solution d’extraction de protéine bactérienne.
    8. Combiner les 30 µL de chaque solution (solutions solubles et insolubles pour chaque validant) avec un volume égal de tampon de Laemmli, puis visualiser sur un gel SDS-PAGE40. Sélectionnez les conditions correspondant aux voies contenant les bandes de taille correcte dans la fraction soluble pour l’expression de la protéine à grande échelle et la purification.
      Remarque : Comme protéine soluble minime a été initialement généré en utilisant les conditions ci-dessus, divers compléments ont été ajoutés pour tester les effets sur l’expression de la protéine soluble, avec 0,2 mM L-cystéine et montrant la protéine accrue de sulfate d’ammonium ferreux de 0,1 mM expression. Selon cet écran d’expression de protéine, un vecteur d’expression appropriée pour production soluble du DesB est vecteur pMAL-c5x.
  2. Après transformation dans Escherichia coli BL21 (DE3), faire un stock de DesB/pMal-c5x en combinant 900 µL de culture bactérienne (cultivée pendant la nuit avec la secousse à 200 tr/min et 37 ° C) avec 100 µL de 80 % de glycérol. Ranger le stock à-80 ° C dans un tube cryogénique.
    NOTE : Faire un nouveau congelés stock environ tous les 6-8 mois.
  3. Utiliser un embout de la pipette pour gratter les cellules du stock congelé et démarrer une culture bactérienne, de plus en plus du jour au lendemain dans 5 mL de médias LB-Amp à 37 ° C sous agitation. Ensemencer 1,5 litres de médias LB-Amp dans un flacon de 2 L à 37 ° C et 200 tr/min, à l’aide de la culture bactérienne cultivée durant la nuit.
    Remarque : En raison de la sensibilité observée de la protéine à l’oxygène, on a trouvé cet espace libre réduit dans la fiole et rendement amélioré de protéine vitesses pour l’expression à grande échelle de secousse modérée.
  4. Induire l’expression de la protéine quand la densité optique à 600 nm (OD600) se situe entre 0,4 à 0,8 à 1 mM IPTG et additionné de 0,2 mM L-cystéine et 0,1 mM sulfate d’ammonium ferreux. Abaisser la température d’incubation à 30 ° C et agiter à 200 tr/min. Tournez en bas des cellules par l’intermédiaire de centrifugation après induction après 24h à 4 700 x g pendant 10 min et jeter les médias usés.
  5. Resuspendre le culot dans 20 mL de tampon de colonne amylose par tous les 1,5 litres de croissance, suivie par l’ajout de 1 mg de lysozyme. Remuer pendant 20 minutes sur la glace.
    NOTE : Plus de mémoire tampon peut être ajouté si la solution est trop visqueuse, comme protéine de solutions qui sont trop visqueuses peuvent perturber l’étape suivante d’homogénéisation.
  6. Lyse la solution remises en suspension cellulaire par l’intermédiaire de l’homogénéisation à haute pression avec 3-5 passe à environ 15 000 lb/po2. La protéine de transfert dans un tube à centrifuger 50 mL et rincer la feuillure avec de l’azote pendant 1 min. Puis, centrifuger la cellule lysate à 20 000 x g pendant 40 min retirer les débris insolubles.
    NOTE : L’homogénéisation réussie provoque la protéine micelles forme comme il coule à travers le tube et dans le flacon de collection, et la solution apparaît comme une couleur brun-gris translucide. Garder la protéine homogénéisée sur glace tout au long du processus.
  7. Après centrifugation, transvaser le surnageant dans un tube de 50 mL (plus d’un peut être nécessaire), cap le tube avec un septum en caoutchouc et avec une aiguille de calibre 20, lentement bulle azote gazeux à travers la solution pendant 2 min à déplacer l’oxygène. Envelopper le septum avec film de paraffine puis fixer avec du fil de cuivre et amener le liquide surnageant dans la boîte à gants ainsi que les matériaux de la colonne.
  8. Équilibrer la colonne (voir étape 2.3) et la protéine surnageante sur la colonne de charge. Recueillir le cheminement dans les fractions de 5 mL sous azote pressurisé modérément (1 goutte/s soit environ 5 mL/min). Ensuite, laver la colonne en utilisant une autre colonne 3 volumes de tampon de colonne d’amylose et collecter manuellement les fractions de 3 mL dans des éprouvettes de verre sous atmosphère d’azote pressurisé modérément (environ 5 mL/min). Éluer la protéine à l’aide de 5 volumes de colonne (~ 50 mL) de tampon d’élution et collecter manuellement les fractions de 3 mL sous pression d’azote modérée (environ 5 mL/min).
    Remarque : Les fractions peuvent alternativement être collectées à l’aide de filtration de la gravité. Environ 12 fractions d’élution doivent être recueillies.
  9. Collecter 30 µL d’extraits des fractions et les supprimer de la boîte à gants pour permettre la visualisation de protéines contenant fractions via l’analyse SDS-PAGE.
    Remarque : Les fractions collectées restent dans la boîte à gants pour la durée de cet essai. Purifiée DesB élue généralement de la colonne en fractions de 3 à 5.

4. anaérobie protéine Concentration/tampon Exchange

  1. Assembler le concentrateur de cellule sous pression, brassé avec un filtre à membrane cellulosique reconstituée 76 mm (coupure de 10 kDa). Ajouter une quantité suffisante de 20 % d’éthanol dans le concentrateur de maintenir la membrane mouillée comme le concentrateur assemblé est transféré dans la boîte à gants.
    Remarque : S’assurer qu’il n’y a pas de larmes dans la membrane et que le joint torique n’est pas froissé.
  2. Après avoir porté le concentrateur de cellule brassé dans la boîte à gants, laver la solution d’éthanol au large de la membrane avec de l’eau. Boucher et pressuriser la cellule brassée pour nettoyer le tubage et la membrane de tout excès d’eau.
  3. Ajouter toutes les fractions contenant des protéines, tel que déterminé par SDS-PAGE (Figure 3) vers le concentrateur. Ajouter suffisamment de tampon d’échange pour obtenir 150 mL de volume de solution de protéines totales.
  4. Pressurisez la chambre cellule brassé à l’aide d’une ligne externe de2 N et concentrer la protéine à 50 mL avec modéré en remuant la vitesse.
    NOTE : Atteindre une concentration de 50 mL prend environ 20 min.
  5. Compléter à 100 mL de tampon d’échange avec 0,1 mM le dithiothréitol (DTT) et de sulfate d’ammonium ferreux de 0,1 mM, ajouter la solution à la cellule brassée et concentrer la protéine à un volume total de 50 mL avec un modéré en remuant la vitesse.
  6. Après que la solution a atteint un volume de 50 mL, ajouter dans le tampon d’échange complété une fois de plus, mais se concentrer la solution d’un volume total de 10 mL avec modéré en remuant la vitesse.
  7. Filtrer le concentré de protéine utilisant un 0,45 µm pore seringue-filtre de taille et partie aliquote dans des tubes de réaction en chaîne (pcr) polymérase individuels 0,2 mL (chacune contenant environ 150 µL de la solution de protéines). Retirer les aliquotes plafonnés de la boîte à gants et immédiatement flash congeler à l’azote liquide. Stocker les aliquotes à-80 ° C.

5. dessalement DesB

  1. Rincer le sac à gants à l’azote pendant environ 1,5 heures avant utilisation.
  2. Décongeler une quantité de 150 µL de protéine purifiée de DesB à l’intérieur du sac à gants, sur la glace.
  3. Pendant ce temps la protéine dégèle, préparez une petite gravité, dessalage colonne contenant 3 mL de gel de dessalement grossier de Sephadex G-25 dans une colonne de borosilicate de 9 mL. Laver la colonne avec 2 volumes de colonne (~ 6 mL) de dégazé desalt tampon.
    NOTE : Remplacez le dessalement gel lorsqu’il y a un changement de couleur de gel du blanc au jaune (après environ 7 utilisations).
  4. Charger le DesB décongelée sur la colonne en utilisant un processus contrôlé par gravité. Jeter le cheminement. Éluer la protéine avec environ 5 mL de tampon de dessalage.
    Remarque : La pression entre le réservoir de remplissage continuellement le sac à gants affectera le taux auquel les solutions s’écouler de la colonne.
  5. Pour la détermination initiale d’élution de la protéine de la colonne, recueillir 12 flacons/elutions (contenant 3 gouttes par flacon). Scellé avec un septum en caoutchouc, retirer le sac à gants et un test pour la présence de la protéine soit directement (par analyse de gel SDS-PAGE) ou indirectement (par l’examen de l’activité de chaque fraction).
    Remarque : En règle générale, les fractions sont testées individuellement pour l’activité, comme indiqué au point 7.1, avec la plus grande activité correspondant à la fraction la plus grande concentration de protéine active. DesB élue généralement à partir de la 7e baisse, après quoi les suivants 9 gouttes de la protéine de morue dessalée sont collectées. Aliquotes de protéine sont stockés sur la glace lors de la mesure de la cinétique (étapes 7.1 à 7.4).

6. préparation de la sonde à oxygène

  1. Polir la bague argent anode et cathode platine avec électrode plus propre et un coton-tige humide jusqu'à ce qu’il n’y a aucun signe visible de dépôts d’oxyde noir.
  2. Avec des ciseaux, coupez environ un carré de 1,5 pouces de papier entretoise (ou roulement papier à cigarettes, qui fonctionne tout aussi bien aussi). Ensuite, couper 1) petits triangles sur chaque face de la place et les fentes 2) dans les coins pour faciliter l’habillage de l’électrode.
  3. Ajouter 5 gouttes d’une solution de KCl 50 % sur l’anode argent groove et connectez-les afin qu’ils forment un anneau continu de la solution. Ajouter 2 gouttes de la solution de KCl 50 % vers le haut de l’électrode de platine. Placez le papier de l’entretoise sur le dessus de l’électrode de platine délicatement et lisser le papier de l’entretoise, donc il n’y a pas de bulles d’air.
    Remarque : Soyez prudent pour éviter de déchirer le papier de l’entretoise.
  4. Couper un morceau de la membrane PTFE (polytétrafluoroéthylène) de 30m de S4 qui est d’environ 2 pouces de longs et placez-le sur le dessus le papier de l’entretoise. Couper les bords de la membrane afin qu’ils sont alignent sur la bague extérieure de l’électrode.
  5. À l’aide de l’applicateur joint torique, pousser le petit joint torique sur l’électrode pour garantir l’entretoise papier et membrane sur l’électrode. Placez le plus grand joint torique sur la rainure circulaire de l’électrode, assurer qu'il n’y a aucune membrane sous elle. Glissez la chambre supérieure de l’électrode sur la base et visser les deux ensemble.
    Remarque : Les deux sont vissés correctement si aucun bâton de bulles d’air sur les côtés de la chambre.
  6. Placer l’électrode assemblé sur sa base et connecter l’électrode au système de surveillance. Lancer le programme de contrôle des électrodes et étalonner l’électrode en exécutant le protocole d’étalonnage de phase liquide (Figure 4 a). La variable de la température doit être la température de la pièce dans laquelle l’expérience est réalisée, et la variable de la pression ambiante est dépendante de la région et les conditions météorologiques actuelles.
    Remarque : La pression ambiante peut provenir d’un bulletin météorologique pour la région.
  7. Ajouter 1 mL de tampon Tris 25 mM dans la chambre d’électrodes, insérer le piston, commencer l’étalonnage de la solution oxygène saturé et ajuster la vitesse d’agitation à 100. Après que l’électrode se stabilise, le point de consigne d’étalonnage pour l’oxygène en solution saturée est déterminée (Figure 4 b).
  8. Sans enlever le piston, utiliser une seringue de l’aiguille et 1 mL de 1,2 x 40 mm à injecter environ 1 mL de solution de dithionite de sodium dans la chambre, en prenant soin d’éviter d’ajouter des bulles d’air (Figure 4). Utiliser un bouchon en caoutchouc pour sceller la chambre d’électrodes immédiatement après addition de dithionite de sodium.
  9. Permettre l’étalonnage de continuer jusqu'à ce que tout l’oxygène est utilisé et le programme est terminé et sauver l’étalonnage (Figure 4). Aspirer la solution de la chambre et rincer la salle avec de l’eau désionisée et piston 5 - 6 fois pour assurer le retrait complet de la dithionite de sodium. Lorsque le rinçage, utilisez un tube de plastique équipé d’un embout de la pipette relié à une fiole à vide côté-bras. Éviter d’endommager la membrane.

7. cinétiques tests à l’aide de la sonde à oxygène

  1. Identifier les aliquotes de morue dessalées contenant la protéine active par tests en série 1 µL de solution d’enzyme à activité dans une solution de tampon Tris de 25 mM, avec un pH de 7,5 et contenant 100 µM gallate. Utilisez les aliquot(s) avec la plus grande activité observée pour les autres expériences. (Voir étape 5.5.1)
  2. Déterminer la vitesse de la réaction enzymatique en mesurant la consommation2 O en utilisant une O2-électrode sensible Clark avec intégration de l’ordinateur par l’intermédiaire de l’unité de commande d’électrode.
    1. Pour chaque donnée cinétique point mesure du DesB, ajouter 1 mL de tampon Tris de 25 mM (pH 7.5) dans la chambre d’électrodes. Ajouter un volume calculé d’une solution mère de 25 mM de gallate d’Epigallocatechin au tampon Tris pour atteindre la concentration de substrat final désiré (0,05-25 mM).
      NOTE : Préparer les solutions fraîches de gallate et composés inhibiteurs avec de l’eau tous les jours et ajuster le pH à 7,5 avec l’ajout de 0,1 mM NaOH, si nécessaire.
    2. Après 10 s de remuer pour permettre pour le mélange de la solution, sceller la chambre avec le piston lentement et visser le haut vers le bas. Un tissu propre peut servir pour absorber l’excès de liquide qui est déplacé de la chambre. Laissez l’électrode s’équilibrer où il peut produire une mesure stable de la concentration d’oxygène dans la solution pendant au moins 1 minute avant de procéder à l’ajout d’enzyme (fond O2 taux de consommation de ± 0,5 µM/min).
    3. À l’aide d’une seringue µL à 10 de gaz, serré, ajouter environ 1 µL d’enzyme (environ enzymatique de 3-7 µM) à la chambre d’électrodes par le piston.
      Remarque : La quantité d’enzyme peut augmenter ou de diminuer en réponse à l’activité observée de l’aliquote spécifique pour permettre des vitesses de réaction suffisante.
    4. Calculer la vitesse de réaction basée sur la pente de la première 30 s de données linéaires après addition de l’enzyme et correct pour fond la consommation2 O en utilisant les 30 s de données immédiatement avant l’addition de l’enzyme. Le taux de la catalyse est égal au taux de consommation de2 O (Figure 5 a).
    5. Après la collecte des données à la fréquence pour une concentration de substrat donné, vider la chambre d’électrodes par aspiration à l’aide d’un tube en plastique relié à une fiole à vide côté-bras et puis les rincer plusieurs fois à l’eau pendant 4 à 6 cycles. Mettre en place la solution dans l’électrode comme indiqué au point 7.2.1 en utilisant une nouvelle concentration de substrat.
    6. Varier les concentrations du substrat de manière non ordonnée et reproduire tout au long de l’expérience pour tenir compte de la diminution de l’activité enzymatique avec le temps (Figure 5 b).
      Remarque : Lorsque les réplicats d’une concentration spécifique sont exécutés et démontrent plus qu’une baisse de 30 % en taux par rapport à une exécution plus tôt, sans essais supplémentaires doivent être effectuées avec ce lot d’enzyme. En règle générale, après 30-40 pistes, l’enzyme montre une diminution de 30 % dans l’activité.
    7. Déterminer les paramètres cinétiques, kchat (la constante catalytique pour la conversion du substrat en produit) et Km (la constante de Michaelis, opérationnellement définie comme la concentration de substrat au cours de laquelle la vitesse initiale est la moitié de la vitesse maximale), par un agencement de moindres carrés des données de chacune des concentrations de substrat à l’équation de Michaelis−Menten (Figure 6) à l’aide de GraphPad Prism.
  3. Ajouter 4-nitrocathécol (4NC) afin de tester son impact sur la cinétique de la dioxygenation et de déterminer la constante d’inhibition (Kj’ai) avec DesB. Pour chaque condition de réaction, les courants des solutions de Tris (50 mM), gallate (25 mM) et 4NC (25 mM) sont combinés et dilué avec de l’eau pour obtenir une solution de 2 mL de tampon Tris de 25 mM (pH 7,5) avec 1 mM gallate et diverses concentrations de 4NC. Le volume de 4NC a été modifié pour atteindre la concentration de l’inhibiteur final désiré (0,05-20 mM).
    1. Après 10 secondes en remuant pour permettre le mélange de la solution, placer le piston dans la chambre lentement et visser le haut vers le bas. Un tissu propre peut servir pour absorber l’excès de liquide qui est déplacé de la chambre. Laissez l’électrode à équilibrer et à produire une mesure stable de la concentration d’oxygène dans la solution pendant au moins 1 minute avant de procéder à l’ajout d’enzyme (fond O2 taux de consommation de ± 0,5 µM/min).
    2. Comme décrit précédemment, ajoutez la protéine (étape 7.2.3), déterminer la vitesse de réaction (étape 7.2.4) et réinitialiser l’électrode pour la condition suivante.
    3. Dans le cadre de cette série d’expériences, déterminer la vitesse de réaction en l’absence d’inhibiteur plusieurs fois. Déterminer l’inhibition par la normalisation des taux de consommation d’oxygène en présence de diverses concentrations d’inhibiteur avec substrat de 1 mM et l’absence d’inhibiteur (v/vo).
    4. Ajustement de l’inhibition de la dioxygenation gallate d’équation 7.3A, puis les données de l’équation 7.3B à l’aide d’un programme graphique (Figure 7).
  4. Déterminer la concentration de l’enzyme précise pour chaque expérience en effectuant une analyse de Bradford après l’achèvement de toutes les séries de cinétiques.
    Remarque : Tous les tarifs ont été corrigées pour la concentration de l’enzyme. Cette étape n’a pas besoin d’être fait dans une boîte à gants ou le sac à gants.

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Representative Results

L’analyse de gel SDS-PAGE des différentes fractions de purification de la construction de fusion DesB-maltose binding protein (MBP) (Figure 3) est présentée. Le gel révèle que la protéine est pure (MW = 91,22 kDa), à l’exception de la présence du DesB (MW = 49.22 kDa) et domaine de protéine MBP (42 kDa) clivé les uns des autres. Fractions E2 et E3 ont été sélectionnés pour la concentration (étape 4.2).

Des résultats reproductibles du DesB analyses cinétiques dépendent un assemblage correct, calibration et technique expérimentale. Il est nécessaire d’entrer la bonne température et pression ambiantes, comme ces variables déterminer le pourcentage d’O2 devrait être dissous dans des solutions au cours de l’essai (Figure 4 a). Le signal initial doit être comprise entre 1800 et 2000 nmol/mL et devrait produire un taux stable proche de zéro, ce qui indique que la saturation en oxygène de la solution évolue peu (Figure 4 b). Une fois le dithionate de sodium est ajouté et la chambre est scellée, le taux de consommation de2 O devrait rapidement et régulièrement augmenter jusqu'à ce qu’il y a un minimum de O2 (< 60 nmol/mL) à gauche dans la solution. Une pente négative constante indique que 1) l’électrode assemblé sans fuites d’air et 2) l’électrode répond adéquatement aux variations de concentration de2 O (Figure 4 , D). Si l’O2 restant en solution n’est pas suffisamment faible, la valeur de décalage de calibration sera incorrecte. L’étalonnage devra être répété avec l’électrode monté correctement, et le dithionite de sodium frais doit être utilisé.

Lorsque l’électrode est correctement calibré, analyses cinétiques peuvent être effectuées. La première mesure établit l’activité de l’enzyme fraîchement dessalée en utilisant 100 µM gallate dans un tampon Tris 25 mM et 1 uL d’enzyme. Avant l’ajout de l’enzyme, le tampon Tris et le gallate d’Epigallocatechin sont remués dans la chambre avec le piston en position. Cela devrait produire un signal initial approximatif entre 250 et 350 nmol/mL, et le signal devrait se stabiliser (± 5 nmol/mL/min) avant que l’enzyme est ajouté. Un signal stable indique qu’il n’y a pas de variables (p. ex., déchiré membrane, dithionite de sodium restes, électrode sale) qui peut entraîner des mesures incohérentes. Lorsque l’enzyme est ajoutée, le signal devrait rapidement et progressivement diminuer, indiquant que la réaction du DesB est en instance, puisque O2 est consommé dans la réaction avec le gallate. La pente de la vitesse initiale avant l’ajout de l’enzyme et le taux catalytique ont été déterminées en utilisant les outils de taux et ajuster la fenêtre à 30 secondes (Figure 5 a). Après environ 1 à 1,5 heures d’utilisation, l’activité enzymatique diminue d’environ 30-50 %, à quel point il ne doit plus être utilisé (Figure 5 b).

Une fois que toutes les mesures cinétiques ont été prises, les données peuvent être tracées à l’aide d’un programme de modélisation (Figure 6). L’activité du DesB avec gallate est obtenue en mesurant le taux de consommation de2 O à des concentrations variables de gallate. Le taux de fond avant l’ajout de l’enzyme est soustraite de la vitesse catalytique pour obtenir le taux corrigé. Le taux corrigé de fond est divisé par la concentration de l’enzyme et branchez-le sur l' équation de 7.3A (Voir l’étape 7.3.3). Un ajustement suffisamment dépend des paramètres initiaux pour K,M et Ksi, (initiales des paramètres :KM = 320 μM, KTR = 1600 μM). Le résultat montre une courbe hyperbolique qui plafonne maximale, puis descend vers le bas un peu comme [gallate] augmente. Il s’agit d’une courbe typique d’une enzyme qui expose l’inhibition du substrat à des concentrations élevées de substrat.

Equation 7.3B

Le taux d’inhibition du DesB avec 4-nitrocathécol a été déterminé en observant la réduction des taux de consommation d’oxygène du DesB avec gallate de 1 mM en présence de diverses concentrations de 4-nitrocathécol (Figure 7). La concentration de 4-NC a comploté contre l’activité normalisée (le taux en présence d’inhibiteur a été divisé par le taux sans tabou) et bon d’équation 7.3B (Voir l’étape 7.3.3). Les résultats indiquent que 4-NC inhibe la consommation d’oxygène, inhibant ainsi la réaction du DesB.

Equation 7.3A

Type de support Composants
Bouillon de Super Optimal avec la répression catabolique (médias SOC) tryptone de 2 % (p/v)
0,5 extrait de levure % (p/v)
10 mM NaCl
2,5 mM KCl
10 mM MgCl2 (ajouté après la stérilisation)
20 mM de glucose (ajouté après la stérilisation)
Bouillon de lysogénie de Miller avec l’ampicilline (médias LB-Amp) 0,5 extrait de levure % (p/v)
tryptone de 1 % (p/v)
1 % (p/v) NaCl
0,1 mg/mL ampicilline (ajouté après la stérilisation)

Table 1. Ingrédients pour la préparation du bouillon super optimal avec la répression catabolique (médias SOC) et bouillon lysogénie de Miller avec l’ampicilline (médias LB-Amp).

Solution de travail Concentration finale de composant
Laemelli tampon pH 6,8 100 mM tris (hydroxyméthyl) aminométhane (Tris)
200 mM le dithiothréitol (DTT),
4 % dodécylsulfate de sodium (SDS)
bleu de bromophénol 0.05 %
20 % de glycérol
Tampon pH 8,3 en cours d’exécution 25 mM Tris
glycine 192 mM
0,1 SDS %

Le tableau 2. Ingrédients pour la préparation des Laemelli et des tampons en cours d’exécution pour l’analyse SDS-PAGE.

Solution de travail Concentration finale de composant
Amylose colonne tampon à pH 7,4 20 mM tris (hydroxyméthyl) aminométhane (Tris)
acide éthylènediaminetétraacétique (EDTA) de 1 mM
200 mM NaCl
Élution tampon pH 7,4 20 mM Tris
EDTA 1 mM
200 mM NaCl
maltose 10 mM
Échange tampon à pH 7.5 50 mM Tris
10 % de glycérol
Dessalement de tampon à pH 7.5 50 mM Tris
10 % tert-butanol

Tableau 3. Ingrédients pour la préparation des tampons pour la purification de la protéine.

Figure 1
Figure 1 : comparaison des réactions catalysées par anneau clivant dioxygénases. Les lignes ondulées montrent la liaison carbone-carbone correspondant qui est clivée lors de la réaction de dioxygénase, où le clivage intradiol (rouge) rompt le lien entre les deux groupes hydroxyles et sauts de clivage (bleu) extradiol une liaison carbone-carbone adjacent à la groupements hydroxyles. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

Figure 2
Figure 2 : les réactions catalysées par le DesB et LigAB, deux concernaient des dioxygénases extradiol qui appartiennent à la superfamille dioxygénase (DGPAM) de type II protocatéchuate. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

Figure 3
Figure 3 : gel SDS-PAGE du DesB montrant purification et concentration des résultats de mesures. Voies sont libellés comme suit : S = protéine standard, FT1 et FT2 = les recueillies par le biais de flux fractions, W1 et W2 = les fractions collectées lavage, E1-E4 = la collecte éluer fractions. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

Figure 4
Figure 4 : courbes de génération d’étalonnage de la sonde à oxygène. (A) avant d’étalonnage, pression et température ambiante sont entrées dans le programme afin de déterminer les concentrations d’oxygène pour les solutions air-équilibrés. (B) la solution oxygène saturé atteint l’équilibre et génère une invite de commandes. (C) Sodium dithionate solution est ajoutée à utiliser tout l’oxygène, comme en témoigne la baisse de signal de l’oxygène. (D) calibrage est obtenu lorsque le signal se stabilise à zéro de concentration en oxygène. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

Figure 5
Figure 5 : les courbes représentant cinétiques illustrant une perte typique d’activité au fil du temps. (A) la réaction de 100 µm gallate utilisant DesB fraîche, avec un taux d’utilisation de2 O de-56.61 µM/min. (B) la réaction du gallate de 100 µm en utilisant DesB après 2 h de collecte de données, avec un taux d’utilisation de2 O de-29.56 µM/min. s’il vous plaît cliquez ici pour afficher une version plus grande de ce chiffre.

Figure 6
Figure 6 : parcelle d’activité DesB avec gallate, apte à l’équation de Michaelis-Menton (noir) et s’adaptent à l’équation de Haldane pour l’inhibition du substrat (rouge ; Équation 7.3B). Les paramètres cinétiques dérivés les deux crises sont comme suit : Michaelis-Menten - kchat = 316 +/-sec 17-1, K,m = 123 +/-26 μM ; Haldane - kchat = 570 +/-110 s-1, K,m = 320 +/-100 μM, KTR = 1600 +/-600 μM. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

Figure 7
Figure 7 : intrigue d’inhibition de la 4-nitrocathécol de dioxygenation du DesB de gallate d’Epigallocatechin (1 mM). S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

Figure 8
Figure 8 : Coordination du gallate de DesB (pdb ID = 3wr3). Comme on le voit dans les nombreux dioxygénases, le ligand coordonne à un atome de fer (II) du site actif dans une façon bidentate. Se fondant sur les similitudes structurelles entre gallate et 4-nitrocathécol (4NC), l’inhibition du DesB par 4NC a été prédite. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

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Discussion

Les étapes critiques dans l’obtention de protéines DesB active purifiée impliquent la formation et le maintien du site actif réduit Fe (II) de l’enzyme. Ainsi, corriger les performances de l’induction, la purification, la concentration, et dessalement étapes sont essentielles à l’obtention d’enzyme active avec succès. Induire l’expression de la protéine en présence de 1 mM de sulfate d’ammonium ferreux assure que Fe (II) est correctement incorporé dans le site actif du DesB. Cette méthode s’inspire des études comme celles avec amidohydrolase métalloenzymes, nécessitant souvent l’ajout de métal pour les milieux de culture pour permettre un pliage correct et une occupation complète du métal binding site6,41,42 ,,43.

L’épuration anaérobie et la concentration dans la boîte à gants sont peut-être les plus critiques et techniquement difficiles étapes dans le présent protocole. Il est essentiel de maintenir une atmosphère sans oxygène dans la boîte à gants. Il faut maintenir le catalyseur de désoxygénation dans la boîte à gants, tel que prescrit par le manuel de changer périodiquement les réservoirs d’azote qui sont attachés à la boîte quand ils sont faibles, assurant qu’il n’y a pas de trous dans les gants attachés à la boîte à gants, et garder un plateau de dessicant frais dans la boîte à gants. Sensible à l’oxygène bandes qui changent de couleur lorsqu’il est exposé à ambiant O2 peuvent être placés dans la boîte pour tester un O2-atmosphère libre. En outre, il faut dégazer pleinement tous les tampons et les solutions qui seront utilisées pendant le processus de purification et de concentration. Afin d’assurer un minimum d’O2 dans les mémoires tampons, prenez bien soin de limiter l’exposition des tampons dégazés dans l’atmosphère lors du basculement entre l’azote bouillonnement et l’aspiration des cycles.

Lorsque vous exécutez la colonne dans la boîte à gants, un bon test pour déterminer s’il y a quantité d’oxygène présente dans les mémoires tampons est de prendre une petite partie de l’une des fractions de lavage (environ 0,1 à 0,5 mL) et le placer dans un tube de microcentrifuge avec une petite portion d’ammoni ferreux um sulfate et sur la TNT (inférieure au montant nécessaire pour l’étape de concentration). Il est alors important de bien mélanger le contenu du tube et observer la couleur changer. Si la solution tours noir, foncé, jaune, ou orange, il y a l’oxygène présents dans les fractions protéiques et il y aura probablement être une activité catalytique réduite après le processus complet de purification et de concentration. Si la solution est une lumière couleur lavande ou jaune très clair, il peut y avoir des minimes O2 actuel, mais il est probable que l’enzyme aura toujours une activité élevée. Le jaune foncé à changement de couleur orange lorsque l’oxygène est présent est probablement causé par l’oxydation du fer dans le sulfate d’ammonium ferreux de Fe (III), formant la rouille44. Pour résoudre ce problème, il est recommandé de dégazer les tampons et permettre d’azote à bouillonner à travers brut la solution protéique pendant 1-2 minutes supplémentaires avant de les placer dans la boîte à gants. En outre, il est important de s’assurer que l’atmosphère dans la boîte à gants est vraiment O2-libre à l’aide de O2-bandes sensibles.

La dernière étape critique, dessalage de l’enzyme avant caractérisation cinétique, nécessite une atmosphère dépourvue d’oxygène et doit être faite sur la glace, car la protéine purifiée est sujette à la dénaturation à température ambiante. Il est essentiel de succès analyses cinétiques, de déterminer quand la protéine de morue dessalée se détache la colonne que les fractions plus concentrées donnent des résultats plus reproductibles. La fraction où la protéine de morue dessalée est éluée doit être déterminée chaque fois qu’un nouveau lot de protéine est purifié et lorsque la colonne est remballée avec nouvelle résine. Si l’activité est faible au cours des analyses cinétiques et les étapes de purification et de concentration ont été techniquement maîtrisés, le problème réside peut-être dans l’étape de dessalement. Lors du dépannage de cette étape, il est crucial de vérifier que la mémoire tampon de 50 mM Tris/10% tert-butanol est complètement dégazé, remballer la colonne avec de la résine Sephadex fraîche et s’assurer qu’il n’y a pas de trous dans le sac à gants.

Après que DesB a été purifié et dessalé avec succès, analyses cinétiques à l’aide de la sonde à oxygène doivent être effectuées avec soin afin d’obtenir des données sur l’activité catalytique de l’enzyme. Mesures cinétiques sont généralement reproductibles lorsqu’une protéine catalytiquement active et concentrée est utilisée. Si les points de données ne sont pas reproductibles, quand on répète un run pour un point de données de substrat ou inhibiteur de la concentration, le problème peut être que la protéine est dénaturée ou oxydé après une utilisation prolongée. Fraîchement de morue dessalée protéine peut être générée comme autorisant la poursuite de collecte de données. Il est important de conserver tous les flacons de l’enzyme, alors que le taux protéique exacte peut être déterminé à l’issue de la collecte de données à l’aide d’une analyse de Bradford. Cette opération s’effectue après les mesures de cinétique parce que l’enzyme perd l’activité au fil du temps, afin d’effectuer tout d’abord peut conduire à abaisser l’activité et des mesures de cinétique inexactes. La concentration de protéines sert ensuite de convertir le taux catalytiques observés dans les vitesses de réaction qui sont nécessaires pour déterminer le nombre de chiffre d’affaires. En plus de préoccupations relatives à la perte d’activité de l’enzyme conduisant à des résultats cinétiques reproductibles, dégradation de la membrane qui recouvre l’électrode après une utilisation prolongée peut aussi causer des défis lors de la reproduction des données. Dégradation de la membrane est généralement indiquée par une augmentation du signal initial (à partir de 250-350 nmol/mL à >350 nmol/mL) ou une incapacité à atteindre un taux de fond stable avant l’ajout de l’enzyme (> ± 5 nmol/mL/min). Cas ou l’autre, il est recommandé de démonter l’électrode, nettoyer les oxydes hors tension de l’électrode à l’aide de la poudre de nettoyage fournie, remonter l’électrode et recalibrer.

La méthode de purification anaérobie est très importante pour les enzymes avec un centre métallique qui peut être oxydée, surtout pour ceux qui ont lié étroitement les métaux qui ne peuvent être échangés après les plis de la protéine. Bien que les enzymes ont évolué pour se protéger en coordonnant l’oxygène seulement après coordination de substrat, ils l’ont fait dans un environnement cellulaire - les montants de saturation d’oxygène dans un milieu in vitro peuvent conduire à une oxydation rapide des métaux et la filialisation de Fe (II) Fe (III) forme inactive31. Cette oxydation/inactivation peut conduire à des résultats faussés, dans laquelle l’enzyme n’est pas dans son état catalytiquement active. Les analyses cinétiques à l’aide d’une électrode sensible à l’oxygène peuvent être appliqués aux enzymes qui dépendent de l’oxygène comme substrat. Plutôt que d’obtenir des paramètres cinétiques à l’aide de la variation dans l’intensité de l’absorption de substrat ou de produit, cette méthode permet la visualisation de la consommation d’oxygène saturée en solution. Cette méthode a été utilisée auparavant avec LigAB, un autre extradiol dioxygenase de la super-famille des protocatéchuate dioxygénase qui dépend de la même façon un FE (II) dans son site actif à coordonner et à s’attacher ses substrats.

Ce manuscrit fournit également des informations supplémentaires sur l’enzyme DesB de souche Sphingobium SYK-6. Suite aux travaux qui définie la fonction enzymatique et la structure du DesB10,19,39, il a été établi aux présentes que le DesB est un catalyseur compétent de la dioxygenation de gallate, avec kchat de 17,8 ± 1,0 s-1 et Km de 45 µM ± 13, pour kchat/km de 3,98 x 10,5 M/s. Ces taux sont comparables à celles déterminées pour les autres enzymes dioxygénase, y compris LigAB (kchat de s 51-1 et kchat/KM de 4.26 x 106 M-1s-1 ) et autres dioxygénases ayant kchat/Km valeurs comprises entre 105-10,8 M-1s-136,45,46 , 47 , 48 , 49 , 50.

Site actif DesB s’est déjà avéré à l’interface de dimère, avec les résidus de deux monomères qui contribuent à la coordination du substrat [résidus provenant du monomère qui lie le Fe (II) sont indiqués par leur numéro de résidu, tandis que les résidus d’autre le monomère sont indiqués par leur nombre de résidus et un nombre premier (p. ex., Glu377ʹ)]6. En l’absence d’informations structurelles montrant les interactions de liaison de 4NC avec DesB, les similitudes structurelles et les différences entre gallate et 4NC peuvent donnent un aperçu de comment DesB peut être inhibée par 4NC. Gallate d’Epigallocatechin a trois substituants hydroxyles à C3, C4 et C5, avec ses hydroxyles C3 et C4, coordonnés au centre de Fe (II) et hydroxyle C5 qui est coordonné par le Glu377ʹ (Figure 8). Le groupe acide carboxylique en C1 est coordonné par Tyr-391ʹ, Tyr-412ʹ, Thr-13 et Thr-267 dans le site actif de DesB. 4NC, qui s’est avéré pour être un inhibiteur de la modeste du DesB, a deux hydroxyles disponibles pour coordonner le centre de Fe (II) et un groupe de nitro C1 qui est isostère à un carboxylate (tout en ayant deux oxygènes de coordination par les résidus de 391, 412, 13 et 267), mais est beaucoup plus électroattracteurs que l’acide carboxylique sur gallate. Puisque 4NC affiche seulement 36,6 % inhibition de la dioxygenation du DesB de gallate lorsque l’inhibiteur était présent en excès 5 fois plus de substrat, il n’est pas surprenant qu’il n’était pas un très puissant inhibiteur (avec un Kj’ai 2,3 ± 0,3 mM). Ceci suggère que l’hydroxyle de la C5 et C1 substituant jouent un rôle important dans la promotion du complexe enzyme-ligand. Étant donné que les résidus Glu377ʹ, Tyr-391ʹ et Tyr-412ʹ sont tous impliqués dans ces interactions, cela donne à penser que DesB site actif contacts avec des monomères adjacents sont importantes pour la mise en place d’un composé et la structuration du site actif.

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Disclosures

Les auteurs ont pas concurrentes d’intérêts financiers ou autres conflits d’intérêts.

Acknowledgments

Nous tenons à remercier le Dr Camille Keller de l’Université wesleyenne pour le support technique. Merci professeur Lindsay D. Eltis et Jenna K. Capyk de l’Université de la Colombie-Britannique, ainsi que Christian Whitman de l’Université du Texas à Austin, pour leurs conseils concernant les méthodes de purification des protéines anaérobie et l’utilisation d’un O2 -électrode sensible.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Isopropyl β-D-1-thiogalactopyranodise Gold Bio Technologies I2481C50
Coomassie Brilliant Blue R-250 Bio-Rad 161-0400
Ammonium persulfate Bio-Rad 161-0700
30% Acrylamide Bio-Rad 161-0158
N,N'tetramethyl-ethylenediamine Bio-Rad 161-0801
Amylose Resin High Flow New England Biolabs E8022S
BL21 (DE3) competent Escherichia coli cells New England Biolabs C2527I
L-cysteine Sigma Aldrich C7352
gallic acid Sigma Aldrich G7384
4-nitrocatechol Sigma Aldrich N15553
Ferrous ammonium sulfate Mallinckrodt 5064
Sodium dithionite Alfa Aesar 33381-22
wheaton serum bottles Fisher Scientific 06-406G
25 mm Acrodisc PF Syringe Filter with Supor Membrane Pall Corportation 4187
400 mL Amicon Stirred Cell Concentrator EMD Millipore UFSC40001
76 mm Millipore Ultracel 10 kDa cutoff reconsituted cellulose membrane filter EMD Millipore PLGC07610
DL-dithiothreitol Gold Bio Technologies DTT50
Sephadex G-25 coarse desalting gal column GE Healthcare 17-0033-01
2 mL Crimp-Top Vials Fisher Scientific 03-391-38
Oxygraph Plus Electrode Control Unit Hansatech Instruments OXYG1 Plus
Oxygen Eletrode Chamber Hansatech Instruments DW1
Electrode Disc Hansatech Instruments S1
PTFE (0.0125 mmX25mm) 30m reel Hansatech Instruments S4
Electrode cleaning Kit Hansatech Instruments S16
Spacer paper Zig Zag available at any gas station
He-series Dri-Lab glove box Vacuum/Atmospheres Company
HE-493 Dri-Train Vacuum/Atmospheres Company
Double-Ended Micro-Tapered Stainless Steel Spatula Fisher Scientific 21-401-10
DWK Life Sciences Kimble Kontes Flex Column Economy Column Fisher Scientific k420400-1530
10 μL, Model 701 N SYR, Cemented NDL 26s ga, 2 in, point stlye 2 syringe Hamilton 80300
DWK Life Sciences Kimble Kontes Flex Column Economy Column Fisher Scientific K420401-1505
Emulsiflex-C5 high-pressure homogenizer Avestin
B-PER Complete Bacterial Protein Extraction Reagent Thermo Fisher Scientific 89821
Lysozyme from chicken egg white Sigma Aldrich 12650-88-3
Sodium dodecyl sulfate Thermo Fisher Scientific 151-21-3
ampicillin Sigma Aldrich 7177-48-2
Tryptone Fisher Scientific BP-1421-500
Yeast extract Fisher Scientific BP1422-2
Sodium Chloride Fisher Scientific S271-10
Potassium Chloride Fisher Scientific P217-3
Magnesium Chloride Fisher Scientific M33-500
Dextrose Fisher Scientific D16-3
Sodium Hydroxide Fisher Scientific S318-1
Tris hydrochloride Fisher Scientific BP153-500
Maltose Fisher Scientific BP684-500
Glycine Fisher Scientific G46-500

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References

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Numéro 140 épuration anaérobie dioxygénase biochimie cinétique d’électrode d’oxygène DesB lignine rupture des cycles
Purification de protéine anaérobie et l’analyse cinétique via la sonde à oxygène pour l’étude de l’Inhibition et l’activité DesB Dioxygenase
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Uchendu, S. N., Rafalowski, A.,More

Uchendu, S. N., Rafalowski, A., Cohn, E. F., Davoren, L. W., Taylor, E. A. Anaerobic Protein Purification and Kinetic Analysis via Oxygen Electrode for Studying DesB Dioxygenase Activity and Inhibition. J. Vis. Exp. (140), e58307, doi:10.3791/58307 (2018).

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