Summary
Qui presentiamo un protocollo per la purificazione della proteina anaerobica, la concentrazione di proteina anaerobica e successiva caratterizzazione cinetica utilizzando un sistema di elettrodi di ossigeno. Il metodo è illustrato utilizzando l'enzima Giuroma90, un enzima diossigenasi che è più stabile e attivo quando purificato e conservati in un ambiente anaerobico.
Abstract
Proteine sensibili all'ossigeno, compresi quegli enzimi che utilizzano ossigeno come substrato, possono hanno ridotto la stabilità quando purificato utilizzando metodi di depurazione aerobica tradizionale. Questo manoscritto illustra i dettagli tecnici coinvolti nel processo di depurazione anaerobica, compresa la preparazione dei tamponi e reagenti, i metodi per cromatografia su colonna in un vano portaoggetti e la desalificazione della proteina prima della cinetica. Sono anche descritti i metodi per la preparazione e l'utilizzo di un elettrodo di ossigeno per eseguire la caratterizzazione cinetica di un enzima che utilizzano ossigeno. Questi metodi sono illustrati usando l'enzima diossigenasi Giuroma90, un dioxygenase di gallato del batterio Sphingobium ceppo SP. SYK-6.
Introduction
Enzimi che utilizzano ferro o altri metalli per attivare ossigeno sono spesso suscettibili di inattivazione durante il processo di purificazione a causa della loro rimozione dall'ambiente riducente di una cella. Di conseguenza, queste proteine devono essere utilizzate come lisati cellulari, essere sottoposte agli agenti riducenti esterni o essere purificate anaerobicamente per garantire che essi hanno attività enzimatica ottimale1,2,3,4. Per quegli enzimi che sono sensibili all'ossigeno (in particolare ferro-contenenti enzimi), esecuzione di tutte le fasi di purificazione e caratterizzazione mantenendo condizioni anaerobiche sono necessario caratterizzare completamente loro. Questo ha portato i ricercatori a sviluppare configurazioni intero laboratorio entro i confini di anaerobiche alloggiamenti per gli studi che vanno dall'espressione della proteina attraverso cristallografia5,6,7,8 .
Qui, segnaliamo i metodi per la purificazione anaerobica e caratterizzazione cinetica dell'enzima Giuroma90 utilizzando un sistema di elettrodi di ossigeno. Giuroma90 è un dioxygenase di gallato del batterio Sphingobium ceppo SP. SYK-6 che è legato al LigAB, un dioxygenase di protocatecuate dallo stesso organismo. Entrambi gli enzimi appartengono alla superfamiglia di diossigenasi (PCAD) tipo II protocatecuato che non è stata studiata estesamente a data9, probabilmente in parte a causa di enzimi di questa superfamiglia essendo suscettibile di inattivazione quando purificato utilizzando standard aerobica metodi di purificazione della proteina. Poiché alcuni degli enzimi PCAD visualizzare promiscuità di substrato, mentre altri sono substrato specifico2,10, ulteriore caratterizzazione di questa superfamiglia è necessario individuare fattori determinanti di specificità. Come è stato osservato in diversi enzimi superfamilies11,12,13,14,15, piccole molecole possono alterare attività tramite inibizione competitiva diretta o l'associazione di molecole per separare le tasche allosterici che causa un aumento o diminuzione di attività enzimatica16. Mentre cinetica da solo non può distinguere il percorso di associazione di un modulatore, determinare la grandezza di un cambiamento di attività è importante per comprendere gli effetti. Come tali, metodi per la caratterizzazione cinetica di attività nativa di Giuroma90 e la sua attività in presenza di 4-nitrocatechol (4NC), un composto comunemente utilizzato per caratterizzare e inibire diossigenasi enzimi2,17, 18, sono mostrati.
Giuroma90 è in grado di abbattere gallato, un composto, tramite una reazione di diossigenasi (EDO) extradiol in quale anello di apertura è catalizzata usando ossigeno come uno dei substrati10,19lignina-derivato aromatico. Questa reazione enzimatica si verifica all'interno del contesto della ripartizione della lignina, un aromatico heteropolymer trovato nella parete cellulare delle piante. Lignina può essere depolimerizzato, producendo una varietà di composti aromatici che può essere suddiviso in metaboliti centrale3,20,21,22,23,24 ,25,26,27,28,29,30,31,32,33 . Extradiol diossigenasi (EDO) catalizzano un reazione su composti aromatici dihydroxylated, cui scissione si verifica adiacente un diolo metallo-coordinato; di apertura dell'anello al contrario, intradiol diossigenasi fendono analoghi composti aromatici tra i due gruppi di idrossile (Figura 1). Evandri, come molti altri metalloenzymes, dispone di un centro di metalli bivalente per coordinamento Fe (II) composto da una due-istidina, uno-carbossilato triade9,34,35. Questi metalloenzimi ossidarsi, tramite autossidazione o basati sul meccanismo di inattivazione, considerando che l'enzima è reso inattivo2,36,37,38.
Nelle procedure sperimentali descritte in questo manoscritto, utilizziamo Giuroma90, un membro della superfamiglia PCAD da SYK-6, il batterio Sphingobium SP., per catalizzare l'aggiunta di ossigeno attraverso il legame C4-C5 di gallato (Figura 2A). La regiochimica di questa scissione è analoga a LigAB, che è un protocatecuato-4,5-diossigenasi (Figura 2B). Finora, le indagini di questo diossigenasi gallate non includono nessun rapporti di composti che inibiscono la Giuroma9010,19,39. Con l'uso di metodi di depurazione aerobica, Giuroma90 ha esibito l'attività variabile, mentre con l'uso di metodi anaerobici siamo riusciti a ottenere costantemente proteina con attività riproducibile. Gli studi cinetici descritti qui mostrano i metodi per la purificazione anaerobica di Giuroma90, caratterizzazione cinetica della reazione di Giuroma90 con gallato e l'inibizione di Giuroma90 di 4-nitrocatechol (4NC).
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Protocol
1. generale materiali e metodi
- Preparare tutti i mezzi necessari come descritto nella tabella 1. Sterilizzare in autoclave a 120 ° c per 15 min. Sterile filtrare la soluzione SOC, dopo l'aggiunta di MgCl2 e glucosio, facendolo passare attraverso un filtro da 0,2 µm. Regolare il pH della soluzione di brodo Lisogenesi (LB media) del Mugnaio prima della sterilizzazione in autoclave. Integrare la soluzione media LB-Amp dopo sterilizzazione in autoclave con soluzioni sterili di 0,2 mM L-cisteina, quindi 0,1 mM solfato ferroso dell'ammonio per migliorare la solubilità e l'espressione della proteina.
- Preparare il Laemmli buffer e buffer di corsa per elettroforesi in gel di poliacrilamide (pagina) come descritto nella tabella 2. Regolare il pH delle soluzioni (utilizzando 1 M HCl e Tris di base per la preparazione di buffer) prima di diluire i componenti ai loro volumi finali.
- Preparare i buffer per purificazione della proteina come descritto nella tabella 3. Regolare il pH delle soluzioni (utilizzando 1 M HCl e Tris di base per la preparazione di buffer) prima di diluire i componenti ai loro volumi finali.
- Trasferire i buffer preparati in una bottiglia che può essere sigillata con un tappo di gomma di un foro e contiene un tubo di vetro.
- Utilizzare un tubo flessibile per collegare il tubo di vetro nel tappo ad una sorgente di vuoto. Lasciare la soluzione degassare sotto pressione negativa per circa 30 minuti continuando a mescolare a velocità media.
- Rompere il vuoto seal in primo luogo, quindi spegnere il vuoto. Successivamente, perforare attraverso il tappo di gomma con due aghi di 20G (uno che è abbastanza a lungo per raggiungere il fondo della bottiglia e un ago più breve che può essere utilizzato come uno sfogo di fuga di gas). Bolla in un flusso costante di azoto mentre si mescolano a media velocità per 30 min.
- Rimuovere gli aghi e ripetere il degassamento e spumeggiante in azoto per un totale di tre cicli. Al termine, correttamente sigillare la bottiglia con un tappo di gomma solida. Inoltre fissare il fermo con la pellicola di paraffina e filo di rame (20G) e metterli nel vano portaoggetti.
Nota: Tutti i materiali sono collocati in vano portaoggetti e sottoposti a 3 cicli di spurgo l'anticamera, seguita da aspirazione fuori l'ossigeno e riempirlo con azoto. Buffer utilizzati per la purificazione e la concentrazione può essere ridotta e conservati a tempo indeterminato nel vano portaoggetti.
- Preparare la soluzione di Ditionato di sodio sciogliendo circa una spatola (0,31 "x 2", l'estremità più piccola di una spatola di acciaio inox di micro-conico doppio attacco) completa di Ditionato di sodio in circa 1 mL di acqua degassato in una microcentrifuga da 1,5 mL . Sigillare il tubo con la pellicola di paraffina prima della rimozione dalla scatola per guanti.
Nota: Conservare il Ditionato di sodio solido nel vano portaoggetti per prevenire l'ossidazione.
2. preparazione della colonna di amilosio per purificazione della proteina
- Fare un impasto dalla resina di amilosio ad alto flusso (15 mL) combinato con 5 volumi di colonna (75 mL) di tampone di colonna di amilosio. Trasferire l'impasto di resina in due bottiglie da 50 mL del siero e sigillare ogni bottiglia con un setto di gomma. Forare un 20G, ago di 305 mm attraverso i setti e bolla azoto nel liquame per circa 1 minuto per rimuovere l'ossigeno dalla sospensione. Trasferire la resina e la soluzione contenente proteine nel portaoggetti.
- In glove box, versare la resina in una colonna di borosilicato 2 x 30 cm dotata di un semplice rubinetto, permettendo la resina di stabilirsi e creare un letto di livello. Sgocciolare il buffer di colonna ed equilibrare la colonna con 3 volumi di colonna (~ 30 mL in totale) del buffer di colonna degassato amilosio utilizzando gas azoto pressurizzato a spingere il buffer attraverso la resina a circa 1 goccia/s o 5 mL/min, fino a quando il solvente è appena sopra la letto di resina.
Nota: Dopo che la proteina è eluito (Vedi punto 3.5 qui sotto), la resina di colonna di amilosio viene rigenerata mediante lavaggio con volume 1 colonna (10 mL) di acqua, quindi volume 1 colonna di 1% sodio dodecil solfato (SDS) e, infine, 3 volumi di colonna (30 mL) di acqua. Questo passaggio può essere completato all'esterno della scatola di guanto. La resina di colonna è conservata a 4 ° C in etanolo al 20% e può essere rigenerata fino a 5 volte.
3. proteine espressione e purificazione anaerobica di Giuroma90
Nota: Il gene Giuroma90 in commercio è stato sintetizzato, essere stata posta in animali-15b, pET-32a e pMAL-c5x vettori utilizzando la restrizione NdeI e BamHI clonazione siti.
- Completare l'analisi di espressione di proteina secondo le linee guida del produttore per determinare le condizioni corrette per espressione su larga scala (descritti in breve sotto).
- Trasformare i plasmidi contenenti Giuroma90 commercialmente fatti, chimicamente competente e. coli BL21 (DE3) cellule, secondo le istruzioni del produttore. In breve, scongelare le cellule in ghiaccio per 10 minuti, aggiungere circa 10-50 ng di DNA plasmidico alla miscela delle cellule, scossa di calore le cellule a 42 ° C per 10 s e li Incubare in ghiaccio per un ulteriore 5 min media SOC aggiungere per ottenere un volume finale di 1 mL e permettere la cellule a scuotere (~ 200 giri/min) a 37 ° C per 60 min. Un piatto di LB-Amp, aggiungere e diffondere 100 µ l della soluzione cella e incubare per una notte a 37 ° C.
- Selezionare una singola unità formanti colonie dalla piastra dopo incubazione overnight e usare questa colonia per inoculare 10 mL di terreno LB-Amp. Crescere le cellule durante la notte, con agitazione (~ 200 giri/min) a 37 ° C.
- A 10 mL di media, aggiungere 100 µ l della soluzione di crescita durante la notte e scuotere i nuovi media come descritto al punto 3.1.2 a 37 ° C. Quando la densità ottica a 600 nm (OD600) è compreso tra 0.4-0.8, aggiungere isopropilico di β-D-1-thiogalactopyranoside (IPTG) per ottenere una concentrazione di soluzione finale di 1 mM.
- Immediatamente rimuovere un'aliquota di 1 mL della soluzione e trasferirlo in una provetta da microcentrifuga da 1,5 mL con etichettato tempo = 0 ore. Girare il tubo a 15.000 x g per 10 min agglomerare le cellule. Dopo la filatura, rimuovere il supernatante e memorizzare le cellule a 4 ° C.
- Rimuovere ulteriori aliquote (1 mL ciascuno) a intervalli di tempo dopo l'aggiunta di IPTG (in genere a 5, 10, 12, 18 e 24 h). Come descritto al punto 3.1.4, ogni tubo centrifugo, decantare il supernatante e memorizzare le cellule a 4 ° C.
- Una volta che tutte le aliquote sono ottenute, risospendere le cellule da ogni timepoint in 30 µ l di soluzione di estrazione proteica batterica, li Incubare a temperatura ambiente per 10-15 minuti e centrifugare le provette a 15.000 × g per 5 min separare il solubili e insolubili proteine.
- Trasferire la soluzione di proteina solubile ad un nuovo tubo del microcentrifuge e risospendere il pellet insolubile rimanente con 30 µ l di soluzione di estrazione proteica batterica.
- Unire i 30 µ l di ciascuna soluzione (sia solubile che insolubile soluzioni per ogni timepoint) con un volume equivalente di tampone di Laemmli, poi visualizzare su un gel di SDS-PAGE40. Selezionare le condizioni poste per le corsie contenente le bande di dimensioni corrette nella frazione solubile per l'espressione della proteina su larga scala e purificazione.
Nota: Poiché la proteina solubile minimal inizialmente è stata generata utilizzando le condizioni di cui sopra, i vari supplementi sono stati aggiunti per verificare gli effetti sull'espressione della proteina solubile, con 0,2 mM L-cisteina e solfato ferroso dell'ammonio 0,1 mM mostrando migliorata della proteina espressione. Secondo questa schermata di espressione della proteina, un vettore di espressione appropriata per la produzione di sostanza solubile di Giuroma90 era pMAL-c5x vettoriale.
- Dopo la trasformazione in Escherichia coli BL21 (DE3), fare un magazzino di Giuroma90/pMal-c5x combinando 900 µ l di coltura batterica (coltivato pernottamento con agitazione a 200 giri/min e 37 ° C) con 100 µ l di 80% glicerolo. Conservare lo stock a-80 ° C in un tubo criogenico.
Nota: Fare un nuovo congelati stock circa ogni 6-8 mesi. - Utilizzare una pipetta per raschiare le cellule dallo stock congelati e avviare una coltura batterica, crescendo durante la notte in 5 mL di terreno LB-Amp a 37 ° C con agitazione. Inoculare 1,5 litri di media LB-Amp in un pallone da 2 L a 37 ° C e 200 giri/min, utilizzando la coltura batterica coltivata durante la notte.
Nota: A causa della sensibilità osservata della proteina all'ossigeno, è stato trovato quello spazio di testa ridotto nella boccetta e moderata agitazione velocità migliorata proteina resa per espressione su larga scala. - Indurre l'espressione della proteina quando la densità ottica a 600 nm (OD600) è compreso tra 0.4-0.8 con 1 mM IPTG e completati con 0,2 mM L-cisteina e 0,1 mM solfato ferroso dell'ammonio. Abbassare la temperatura di incubazione a 30 ° C e agitare a 200 giri/min. Rotazione verso il basso le cellule tramite centrifugazione dopo post-induzione 24h a 4.700 x g per 10 min e scartare i media abbiamo trascorso.
- Risospendere il pellet cellulare in 20 mL di buffer di amilosio colonna per ogni 1,5 L di crescita, seguita dall'aggiunta di 1 mg di lisozima. Agitare per 20 minuti sul ghiaccio.
Nota: Ulteriori buffer possono essere aggiunti se la soluzione è troppo viscosa, come proteina soluzioni che sono troppo viscosi potrebbero interferire con il passaggio seguente di omogeneizzazione. - Lisare la soluzione di sedimento cellulare tramite omogeneizzazione ad alta pressione con 3-5 passa a circa 15.000 psi. La proteina di trasferimento di un tubo di centrifuga da 50 mL e svuotare lo spazio di testa con azoto per 1 min. Poi, centrifugare la cella lysata a 20.000 x g per 40 min rimuovere i residui insolubili.
Nota: Omogeneizzazione successo provoca la proteina a micelle forma come esso scorre attraverso il tubo e nel pallone di raccolta, e la soluzione appare come un colore marrone-grigio traslucido. Mantenere la proteina omogeneizzata sul ghiaccio durante tutto il processo. - Dopo la centrifugazione, trasferimento del surnatante in una provetta da 50 mL (più di uno potrebbe essere necessario), richiudere la provetta con un setto di gomma e con un ago di calibro 20, lentamente gas di azoto di bolla attraverso la soluzione per 2 min in assenza di ossigeno. Avvolgere il setto con pellicola di paraffina e ulteriormente fissarla con filo di rame e portare il supernatante in glove box insieme con i materiali di colonna.
- Equilibrare la colonna (Vedi punto 2.3) e caricare la proteina surnatante sulla colonna. Raccogliere il flusso continuo in frazioni di 5ml sotto azoto pressurizzato moderatamente (1 goccia al secondo o circa 5 mL/min). Successivamente, lavare la colonna usare un'altra colonna 3 volumi di tampone di colonna di amilosio e raccogliere manualmente le frazioni di 3 mL in provette di vetro sotto azoto pressurizzato moderatamente (circa 5 mL/min). Eluire la proteina utilizzando 5 volumi di colonna (~ 50 mL) di tampone di eluizione e raccogliere manualmente le frazioni di 3 mL in pressione di azoto moderato (circa 5 mL/min).
Nota: Le frazioni in alternativa possono essere raccolti tramite filtrazione a gravità. Circa 12 frazioni di eluizione devono essere raccolti. - Raccogliere 30 aliquote µ l delle frazioni e rimuoverli dalla casella di guanto per consentire la visualizzazione di proteine contenenti frazioni tramite analisi SDS-PAGE.
Nota: La raccolta differenziata rimanga nel cassetto portaoggetti per tutta la durata del test. Giuroma90 purificata in genere eluisce dalla colonna in frazioni 3 a 5.
4. anaerobica proteina concentrazione/Buffer Exchange
- Assemblare il concentratore cellula pressurizzata, mescolato con un filtro a membrana cellulosa ricostituito 76 mm (taglio 10 kDa). Aggiungere una quantità sufficiente di etanolo al 20% nel concentratore per mantenere la membrana bagnata come il concentratore assemblato viene trasferito nel portaoggetti.
Nota: Assicurarsi che non ci sono lacrime nella membrana e che l'o-ring non è rugosa. - Dopo aver portato il concentratore cellula agitata in glove box, lavare la soluzione di etanolo fuori la membrana con acqua. Tappo e pressurizzare la cella agitata per pulire la tubazione e la membrana di eventuale acqua in eccesso.
- Aggiungere tutte le frazioni contenenti proteine come determinato da SDS-PAGE (Figura 3) al concentratore. Aggiungere sufficiente buffer di scambio per ottenere 150 mL di volume di soluzione di proteine totali.
- Pressurizzare la camera di agitata cella usando la linea esterna di2 N e concentrare la proteina a 50 mL con moderata velocità di agitazione.
Nota: Realizzare una concentrazione di 50 mL richiede circa 20 min. - Supplemento 100 mL di tampone di scambio con 0,1 mM dithiothreitol (DTT) e 0,1 mM solfato ferroso dell'ammonio, aggiungere la soluzione alla cella agitata e concentrare la proteina ad un volume totale di 50 mL con una moderata velocità di agitazione.
- Quando la soluzione raggiunge un volume di 50 mL, aggiungere nel buffer di scambio completato una volta di più, ma concentrare la soluzione per un volume totale di 10 mL con moderata velocità di agitazione.
- Filtrare il concentrato della proteina usando un 0,45 µm poro formato siringa filtro e aliquota nelle provette di reazione a catena (pcr) polimerasi individuali 0,2 mL (ciascuno contenente circa 150 µ l di soluzione della proteina). Rimuovere le aliquote ridotte da glove box e immediatamente flash congelarli con azoto liquido. Conservare le aliquote a-80 ° C.
5. Giuroma90 di desalificazione
- Svuotare il sacchetto di guanto con gas azoto per circa 1,5 ore prima dell'uso.
- Scongelare un'aliquota di 150 µ l di proteina purificata di Giuroma90 dentro la borsa per i guanto, sul ghiaccio.
- Mentre la proteina si scioglie, preparare un piccolo peso, desalificazione colonna contenente 3 mL di gel di dissalazione grossolana Sephadex G-25 in una colonna di borosilicato 9 mL. Lavare la colonna con 2 volumi di colonna (~ 6 mL) di degassato desalificare buffer.
Nota: Sostituire il gel di dissalazione quando c'è un cambiamento in gel di colore dal bianco al giallo (dopo circa 7 usi). - Caricare il Giuroma90 scongelati sulla colonna tramite un processo controllato di gravità. Scartare il flusso continuo. Eluire la proteina con circa 5 mL di tampone di desalificazione.
Nota: La pressione dal serbatoio continuamente riempire la borsa di guanto influenzerà il tasso a cui le soluzioni gocciolare dalla colonna. - Per la determinazione iniziale di eluizione di proteina dalla colonna, raccogliere 12 fiale/eluizioni (contenente 3 gocce per flaconcino). Sigillato con un setto di gomma, rimuoverli dalla borsa per i guanto e test per la presenza della proteina sia direttamente (attraverso l'analisi del gel di SDS-PAGE) o indirettamente (attraverso l'esame dell'attività di ogni frazione).
Nota: In genere, le frazioni sono testate singolarmente per attività, come descritto al punto 7.1, con la più grande attività corrispondente alla frazione con la maggiore concentrazione di proteina attiva. Giuroma90 eluisce solitamente a partire nella goccia 7, dopo il quale vengono raccolti i seguenti 9 gocce di proteina dissalata. Aliquote di proteina sono conservate nel ghiaccio durante le misure cinetiche (punti 7.1-7.4).
6. preparazione dell'elettrodo di ossigeno
- Lucidare l'anello d'argento anodo e catodo di platino con elettrodo pulita e un cotton fioc inumidito fino a quando non ci sono segni visibili di depositi di ossido nero.
- Con le forbici, tagliare circa un 1,5-pollice quadrato di distanziale carta (o rotolamento carta da sigarette, che funziona altrettanto bene). Quindi, tagliare 1) piccoli triangoli su ogni faccia del quadrato e 2) fessure negli angoli per facilitare la disposizione dell'elettrodo.
- Aggiungere 5 gocce di una soluzione di KCl 50% nell'anodo di argento di groove e collegarli in modo da formare un anello continuo di soluzione. Aggiungere 2 gocce di soluzione di KCl al 50% alla parte superiore dell'elettrodo di platino. Posizionare la carta distanziale in cima l'elettrodo di platino e lisciare fuori la carta di distanziatore in modo bolle d'aria.
Nota: Prestare attenzione per evitare di strappare la carta di distanziatore. - Tagliare un pezzo della membrana PTFE (politetrafluoroetilene) 30m S4 che è circa 2 pollici di lunghezza e posizionarlo sopra la carta del distanziatore. Tagliare i bordi della membrana in modo che siano allineati con l'anello esterno dell'elettrodo.
- Utilizzando l'applicatore o-ring, spingere l'o-ring piccolo sopra l'elettrodo per garantire il distanziale carta e membrana sopra l'elettrodo. Inserire l'o-ring più grande sulla scanalatura circolare dell'elettrodo, assicurando che non c'è nessuna membrana sotto di esso. Far scorrere la camera superiore dell'elettrodo sulla base e avvitare i due insieme.
Nota: I due sono avvitati correttamente se nessun bastone di bolle di aria ai lati della camera. - Posizionare l'elettrodo montato sulla sua base e collegare l'elettrodo al sistema di monitoraggio. Avviare il programma di controllo di elettrodo e calibrare l'elettrodo eseguendo il protocollo di calibrazione di fase liquida (Figura 4A). La variabile di temperatura dovrebbe essere la temperatura della stanza in cui viene eseguito l'esperimento, e la pressione ambiente variabile è dipenda sulla regione e dati meteo.
Nota: Pressione ambiente possa essere ottenute da un bollettino meteo per la regione. - Aggiungere 1 mL di tampone Tris 25 mM per l'alloggiamento di elettrodo, inserire lo stantuffo, iniziare la calibrazione di una soluzione saturata di ossigeno e regolare la velocità dell'agitatore a 100. Dopo che l'elettrodo si stabilizza, il set-point di calibrazione per l'ossigeno in soluzione satura è determinato (Figura 4B).
- Senza rimuovere lo stantuffo, utilizzare una siringa di ago e 1ml di 1.2 x 40 mm per iniettare circa 1 mL di soluzione di sodio ditionito nell'alloggiamento, facendo attenzione a evitare di aggiungere eventuali bolle d'aria (Figura 4). Utilizzare un tappo di gomma per sigillare la camera di elettrodo immediatamente dopo l'aggiunta di Ditionito di sodio.
- Consentire la calibrazione continuare fino a quando non è utilizzato tutto l'ossigeno e il programma è completato e salvare la calibrazione (Figura 4). Aspirare la soluzione dalla camera e sciacquare il pistone e la camera con acqua deionizzata 5 - 6 volte a garantire la rimozione completa del Ditionito di sodio. Durante il risciacquo, utilizzare un tubo di plastica dotato di un puntale collegato ad un termos di braccio laterale. Evitare di danneggiare la membrana.
7. cinetiche dosaggi utilizzando l'elettrodo di ossigeno
- Identificare le aliquote dissalate contenenti proteina attiva di test in serie 1 µ l di soluzione di enzima per attività in una soluzione di tampone Tris 25 mM, con pH 7,5 e contenente 100 µM gallato. Utilizzare il aliquot(s) con la più grande attività osservate per gli esperimenti restanti. (Vedi punto 5.5.1)
- Determinare la velocità della reazione enzimatica misurando il consumo di O2 utilizzando una O2-elettrodo di Clark-tipo sensibile con l'integrazione di computer tramite l'unità di controllo dell'elettrodo.
- Per ogni dati di cinetica punto di misurazione di Giuroma90, aggiungere 1 mL di tampone Tris 25 mM (pH 7,5) alla camera di elettrodo. Aggiungere un volume calcolato di una soluzione di riserva di 25 mM di gallato nel buffer di Tris per ottenere la concentrazione di substrato finale desiderata (0.05-25 mM).
Nota: Preparare ogni giorno fresche soluzioni di riserva di gallato e composti inibitori con acqua e regolare il pH a 7,5 con l'aggiunta di 0,1 mM NaOH, se necessario. - Dopo 10 s di mescolatura per consentire la miscelazione della soluzione, tenuta la camera con lo stantuffo lentamente e avvitare la parte superiore. Un tessuto pulito può essere utilizzato per assorbire il liquido in eccesso che è stato spostato dalla camera. Consentire l'elettrodo equilibrare dove può produrre una misura stabile della concentrazione di ossigeno nella soluzione per almeno 1 minuto prima di procedere con l'aggiunta dell'enzima (il tasso di consumo sfondo O2 ± 0,5 µM/min).
- Usando un gas stretto 10 µ l siringa, aggiungere circa 1 µ l di enzima (circa 3-7 µM enzima) alla camera di elettrodo attraverso lo stantuffo.
Nota: La quantità di enzima può essere aumentata o diminuita in risposta all'attività osservata dell'aliquota specifica per consentire velocità di reazione essere sufficiente. - Calcolare la velocità di reazione basata sul versante delle prime 30 s di dati lineari dopo l'aggiunta di enzima e corretto per sfondo il consumo di O2 usando il 30 s di dati immediatamente prima dell'aggiunta di enzima. Il tasso di catalisi è pari al tasso di consumo di O2 (Figura 5A).
- Dopo la raccolta dei dati per una concentrazione di substrato dato tasso, svuotare la vaschetta di elettrodo mediante l'aspirazione utilizzando un tubo di plastica collegato ad un termos di braccio laterale e risciacquarle ripetutamente con acqua per 4-6 cicli. Impostazione della soluzione nell'elettrodo come descritto al punto 7.2.1 utilizzando una nuova concentrazione di substrato.
- Variare le concentrazioni di substrato in modo non ordinato e replicare durante tutto il corso dell'esperimento all'account per diminuzioni nell'attività enzimatica con tempo (figura 5B).
Nota: Quando replicati di una concentrazione specifica vengono eseguiti e dimostrano più di una diminuzione del 30% nel tasso rispetto ad una prima fase, ulteriori analisi non devono essere eseguite con batch di enzima. In genere, dopo l'esecuzione del 30-40, l'enzima dimostra una diminuzione del 30% nell'attività. - Determinare i parametri cinetici, kgatto (la costante catalitica per la conversione del substrato in prodotto) e Km (la costante di Michaelis, funzionalmente definita come la concentrazione di substrato in cui la velocità iniziale è metà della velocità massima), mediante un montaggio di minimi quadrati dei dati da ognuna delle concentrazioni di substrato per l'equazione di Michaelis−Menten (Figura 6) tramite GraphPad Prism.
- Per ogni dati di cinetica punto di misurazione di Giuroma90, aggiungere 1 mL di tampone Tris 25 mM (pH 7,5) alla camera di elettrodo. Aggiungere un volume calcolato di una soluzione di riserva di 25 mM di gallato nel buffer di Tris per ottenere la concentrazione di substrato finale desiderata (0.05-25 mM).
- Aggiungere 4-nitrocatechol (4NC) per testare il suo impatto sulla cinetica di dioxygenation e determinare la costante di inibizione (Kho) con Giuroma90. Per ogni condizione di reazione, soluzioni di Tris (50 mM), gallato (25 mM) e 4NC di riserva (25 mM) vengono combinati e diluito con acqua per produrre una soluzione di 2 mL di tampone Tris 25 mM (pH 7.5) con 1 mM di epigallocatechin e variando le concentrazioni di 4NC. Il volume di 4NC è stato variato per ottenere la concentrazione desiderata finale inibitore (0,05-20 mM).
- Dopo 10 secondi di agitazione per consentire la miscelazione della soluzione, porre lo stantuffo nella camera lentamente e avvitare la parte superiore. Un tessuto pulito può essere utilizzato per assorbire il liquido in eccesso che è stato spostato dalla camera. Consentire l'elettrodo equilibrare e produrre una misura stabile della concentrazione di ossigeno nella soluzione per almeno 1 minuto prima di procedere con l'aggiunta dell'enzima (il tasso di consumo sfondo O2 ± 0,5 µM/min).
- Come descritto in precedenza, aggiungere la proteina (punto 7.2.3), determinare il tasso di reazione (punto 7.2.4) e reimpostare l'elettrodo per la condizione successiva.
- Come parte di questa serie di esperimenti, determinare la velocità di reazione in assenza di inibitore più volte. Determinare l'inibizione di normalizzazione dei tassi di consumo di ossigeno in presenza di varie concentrazioni di inibitore con il substrato di 1 mM e l'assenza di inibitore (v/vo).
- Montare l'inibizione di gallato dioxygenation equazione 7.3 a e quindi i dati di inibizione all'equazione 7.3 utilizzando un programma di grafica (Figura 7).
- Determinare la concentrazione di enzima preciso per ogni esperimento eseguendo un'analisi di Bradford dopo il completamento di tutte le esecuzioni di cinetiche.
Nota: Tutti i prezzi sono stati corretti per la concentrazione dell'enzima. Questo passaggio non deve necessariamente essere fatto in un guanto sacchetto o scatola per guanti.
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Representative Results
Viene mostrato l'analisi del gel di SDS-PAGE delle singole frazioni da purificazione del costrutto Giuroma90-maltosio binding protein (MBP) fusione (Figura 3). Il gel rivela che la proteina è pura (MW = 91.22 kDa), tranne la presenza di Giuroma90 (MW = 49.22 kDa) e dominio della proteina MBP (kDa 42) spaccati da altro. Le frazioni E2 ed E3 sono stati selezionati per la concentrazione (punto 4.2).
Risultati riproducibili da test di cinetica enzimatica Giuroma90 dipendono dal corretto montaggio, taratura e tecnica sperimentale. È necessario inserire la corretta temperatura e pressione ambiente, come queste variabili determinano la percentuale di O2 dovuto essere sciolto nelle soluzioni durante l'esecuzione del test (Figura 4A). Il segnale iniziale dovrebbe essere tra 1800 e 2000 nmol/mL e dovrebbe produrre un tasso stabile vicino allo zero, che indica che la saturazione di ossigeno della soluzione minimamente sta cambiando (Figura 4B). Una volta che il Ditionato di sodio è aggiunto e la camera è chiusa, il tasso di consumo di O2 dovrebbe rapidamente e costantemente aumentare fino a quando non c'è minimo O2 (< 60 nmol/mL) a sinistra nella soluzione. Una costante pendenza negativa indica che 1) l'elettrodo assemblato non ha perdite d'aria e 2) l'elettrodo risponde adeguatamente ai cambiamenti nella concentrazione di O2 (Figura 4 e D). Se l'O2 restanti nella soluzione non è sufficientemente bassa, il valore di offset di taratura sarà errato. La taratura dovrà essere ripetuto con l'elettrodo montato correttamente, e ditionito di sodio fresco deve essere utilizzato.
Quando l'elettrodo è calibrato correttamente, test di cinetica enzimatica può essere eseguita. La prima misurazione costituisce l'attività dell'enzima appena dissalata utilizzando 100 µM gallato in tampone Tris 25 mM e 1 uL dell'enzima. Prima dell'aggiunta dell'enzima, il tampone Tris e gallato sono agitate in aula con lo stantuffo in posizione. Questo dovrebbe produrre un segnale iniziale approssimativo tra 250 e 350 nmol/mL, e il segnale si dovrebbe stabilizzare (± 5 nmol/mL/min) prima dell'aggiunta dell'enzima. Un segnale stabile indica che ci sono variabili (ad es., strappato membrana, Ditionito di sodio avanzi, sporco elettrodo) che possono causare misurazioni incoerente. Quando l'enzima viene aggiunto, il segnale dovrebbe rapidamente e costantemente diminuire, che indica che la reazione di Giuroma90 sta procedendo, poiché O2 è consumato nella reazione con gallato. La pendenza del tasso iniziale prima aggiunta di enzimi e sono catalitici sono stati determinati utilizzando gli strumenti di tasso e regolando la finestra per 30 secondi (Figura 5A). Dopo circa 1-1.5 ore di utilizzo, l'attività dell'enzima diminuisce di circa il 30-50%, al punto che non deve più essere utilizzato (figura 5B).
Una volta che sono state prese tutte le misure cinetiche, possono essere tracciati i dati utilizzando un programma di modellazione (Figura 6). L'attività di Giuroma90 con gallato è ottenuta misurando il tasso di consumo di O2 in concentrazioni variabili di gallato. Il tasso di sfondo prima dell'aggiunta dell'enzima viene sottratto dal prezzo catalitico per ottenere il tasso corretto. Il tasso corretto di sfondo è diviso per la concentrazione dell'enzima e predisposta per equazione 7.3 a (vedi passo 7.3.3). Una misura sufficiente è dipendente da parametri iniziali per KM e Ksi, (iniziale parametri:KM = 320 μM, Ksi = 1600 μM). Il risultato mostra una curva iperbolica che raggiunge un plateau massimo, poi scende verso il basso leggermente man mano che aumenta la [gallate]. Si tratta di una tipica curva per un enzima che esibisce l'inibizione del substrato alle alte concentrazioni nel substrato.
Il tasso di inibizione di Giuroma90 con 4-nitrocatechol è stato determinato osservando la riduzione nel tasso di consumo di ossigeno di Giuroma90 con gallato di 1 mM in presenza di diverse concentrazioni di 4-nitrocatechol (Figura 7). La concentrazione di 4-NC era tracciata contro l'attività normalizzato (il tasso in presenza dell'inibitore è stato diviso per il tasso disinibito) e in forma di equazione 7.3 (Vedi punto 7.3.3). I risultati indicano che 4-NC inibisce il consumo di ossigeno, così inibendo la reazione di Giuroma90.
| Tipo di supporto | Componenti |
| Brodo di Super ottima con la repressione dei cataboliti (media SOC) | tryptone di 2% (p/v) |
| 0,5 Estratto di lievito % (p/v) | |
| 10 millimetri di NaCl | |
| 2,5 mM KCl | |
| 10 mM MgCl2 (aggiunto dopo la sterilizzazione) | |
| glucosio 20 mM (aggiunto dopo la sterilizzazione) | |
| Brodo Lisogenesi di Miller con ampicillina (media LB-Amp) | 0,5 Estratto di lievito % (p/v) |
| tryptone di 1% (p/v) | |
| 1% (p/v) NaCl | |
| 0,1 mg/mL ampicillina (aggiunto dopo la sterilizzazione) |
Tabella 1. Ingredienti per la preparazione di brodo super ottima con la repressione dei cataboliti (media SOC) e brodo di Lisogenesi di Miller con ampicillina (media LB-Amp).
| Soluzione di lavoro | Concentrazioni finali di componente |
| Laemelli tampone, pH 6.8 | 100 mM tris (idrossimetil) amminometano (Tris) |
| 200 mM dithiothreitol (DTT), | |
| 4% sodio dodecil solfato (SDS) | |
| blu di bromofenolo 0,05% | |
| 20% glicerolo | |
| Esecuzione di tampone a pH 8.3 | 25 mM Tris |
| glicina 192 mM | |
| 0,1% SDS |
Tabella 2. Ingredienti per la preparazione di Laemelli e buffer in esecuzione per analisi SDS-PAGE.
| Soluzione di lavoro | Concentrazioni finali di componente |
| Amilosio colonna tampone, pH 7,4 | 20 mM tris (idrossimetil) amminometano (Tris) |
| 1 millimetro di acido etilendiamminotetraacetico (EDTA) | |
| 200 mM NaCl | |
| PH tampone di eluizione 7.4 | 20 mM Tris |
| 1 mM EDTA | |
| 200 mM NaCl | |
| maltosio 10mm | |
| Cambio tampone, pH 7.5 | 50 mM Tris |
| 10% glicerolo | |
| Desalificare tampone, pH 7.5 | 50 mM Tris |
| 10% t-butanolo |
Tabella 3. Ingredienti per la preparazione di buffer per purificazione della proteina.
Figura 1: confronto tra le reazioni catalizzate da anello fendendo diossigenasi. Le linee ondulate mostrano il legame carbonio-carbonio corrispondente che viene scisso durante la reazione di diossigenasi, dove intradiol fenditura (rosso) rompe il legame tra i due gruppi dell'idrossile e interruzioni di clivaggio (blu) extradiol un legame carbonio-carbonio adiacente il gruppi di idrossile. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 2: le reazioni catalizzate da Giuroma90 e LigAB, due correlate extradiol diossigenasi che appartengono alla superfamiglia delle diossigenasi (PCAD) di tipo II protocatecuato. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 3: gel di SDS-PAGE di risultati: purificazione e concentrazione passi Giuroma90. Corsie sono indicate come segue: S = proteina standard, FT1 ed FT2 = il flusso attraverso frazioni raccolte, W1 e W2 = le frazioni raccolte lavare, E1-E4 = frazioni eluire i raccolti. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 4: generazione di calibrazione delle curve per l'elettrodo ossigeno. (A) prima di calibratura, pressione e temperatura ambiente sono inseriti nel programma per determinare le concentrazioni di ossigeno per le soluzioni di aria a temperatura costante. (B) la soluzione saturata di ossigeno raggiunge equilibrio e genera un prompt dei comandi. Soluzione di Ditionato di sodio (C) è aggiunto per utilizzare tutto l'ossigeno, come indicato tramite la diminuzione nel segnale di ossigeno. (D) taratura si ottiene quando il segnale si stabilizza a concentrazione zero ossigeno. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 5: rappresentante Curve cinetiche che illustra una tipica perdita di attività nel corso del tempo. (A) la reazione di 100 µm gallate utilizzando Giuroma90 fresco, con un tasso di utilizzo di2 O di-56.61 µM/min (B) la reazione di 100 µm gallate utilizzando Giuroma90 dopo 2 h di raccolta dei dati, con un tasso di utilizzo di2 O di-29.56 µM/min Clicca qui per visualizzare un versione più grande di questa figura.
Figura 6: trama di attività Giuroma90 con gallato, adattano per l'equazione di Michaelis-Menton (nero) e in forma per l'equazione di Haldane per inibizione del substrato (rosso; Equazione 7.3). Parametri cinetici derivati dai PF sono come segue: Michaelis-Menten - kgatto = 316 + /-17 sec-1, Km = 123 + /-26 μM; Haldane - kgatto = 570 + /-110 sec-1, Km = 320 + /-100 μM, Ksi = 1600 + /-600 μM. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 7: trama di inibizione di 4-nitrocatechol di dioxygenation di Giuroma90 di gallato (1 mM). Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 8: coordinamento del gallato di Giuroma90 (pdb ID = 3wr3). Come si è visto in molti diossigenasi, il ligando coordinate a un atomo di ferro (II) sito attivo in modo bidentato. L'inibizione di Giuroma90 da 4NC basato sulle somiglianze strutturali tra gallate e 4-nitrocatechol (4NC), era stato previsto. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
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Discussion
I passaggi critici nell'ottenere attiva, purificata proteina Giuroma90 coinvolgono la formazione e il mantenimento del sito attivo Fe (II) ridotto nell'enzima. Come tale, correggere le prestazioni dell'induzione, purificazione, concentrazione e dissalazione passaggi sono essenziali per ottenere con successo enzima attivo. Che induce l'espressione della proteina in presenza di solfato ferroso dell'ammonio di 1 mM assicura che Fe (II) correttamente è incorporato nel sito attivo del Giuroma90. Questo metodo è ispirato da studi come quelli con amidohydrolase metalloenzymes, che spesso richiedono l'aggiunta di metallo per mezzi di sviluppo per consentire il corretto ripiegamento e piena occupazione del metallo associazione sito6,41,42 ,43.
La depurazione anaerobica e la concentrazione nel vano portaoggetti sono forse i punti più critici e tecnicamente difficile in questo protocollo. È essenziale per mantenere un ambiente privo di ossigeno nel vano portaoggetti. Questo richiede di mantenere il catalizzatore di deossigenazione nel vano portaoggetti, come prescritto dal manuale, cambiare periodicamente i serbatoi di azoto che sono collegati alla scatola di quando essi sono bassi, assicurando che non ci sono fori nei guanti collegati al vano portaoggetti, e mantenendo un vassoio di essiccante fresco nel vano portaoggetti. Strisce di sensibili all'ossigeno che cambiano colore quando esposto all'ambiente O2 possono essere immessi nella casella di testare per una O2-libera atmosfera. Inoltre, è necessario degassare completamente tutti i buffer e soluzioni che verranno utilizzate durante il processo di purificazione e concentrazione. Per garantire la minima O2 nei buffer, fare molta attenzione per limitare l'esposizione dei buffer degassato all'aria quando si passa tra azoto bubbling e l'aspirazione di cicli.
Quando si esegue la colonna nel vano portaoggetti, un buon test per determinare se c'è ossigeno presente nei buffer è di prendere una piccola parte di una delle frazioni di lavaggio (circa 0.1-0.5 mL) e inserirlo in un tubo del microcentrifuge con una piccola porzione di metalli ferrosi ammoni messaggistica unificata solfato e DTT (inferiore all'importo necessario per la fase di concentrazione). Quindi è importante mescolare bene il contenuto della provetta e osservare il colore cambia. Se il soluzione diventa nero, scuro giallo o arancione, non c'è ossigeno presenti nelle frazioni della proteina e ci sarà probabilmente essere ridotta attività catalitica dopo il completo processo di purificazione e concentrazione. Se la soluzione è una luce color lavanda o giallo molto chiaro, ci possono essere minime O2 presenti, ma è probabile che l'enzima avrà ancora ad alta attività. Dal giallo scuro al cambiamento di colore arancione quando l'ossigeno è presente è probabilmente causato da ossidazione del ferro nel solfato ferroso dell'ammonio di Fe (III), formando ruggine44. Per risolvere questo problema, si consiglia di degassare i buffer e consentire l'azoto a bolla attraverso greggio la soluzione della proteina per 1-2 minuti extra prima di introdurli nel vano portaoggetti. Inoltre, è importante garantire che l'atmosfera nel vano portaoggetti è veramente O2-gratis utilizzando O2-strisce sensibili.
L'ultimo passaggio critico, desalificazione l'enzima prima caratterizzazione cinetica, richiede un ambiente privo di ossigeno e deve essere fatto sul ghiaccio, come la proteina purificata è incline alla denaturazione a temperatura ambiente. Determinare quando la proteina dissalata si stacca la colonna è essenziale al successo test di cinetica enzimatica, come le frazioni più concentrate darà i risultati più riproducibili. La frazione dove la proteina dissalata viene eluita deve essere determinata ogni volta un nuovo lotto di proteina è purificato e quando la colonna è reimballata con nuova resina. Se l'attività è bassa durante test di cinetica enzimatica e la procedura di purificazione e concentrazione è stata masterizzata tecnicamente, il problema potrebbe risiedere nel passaggio dissalazione. Durante la risoluzione di questo passaggio, è fondamentale verificare che il buffer di t-butanolo Tris/10% 50 mM è accuratamente degassato, Reimballare la colonna con resina Sephadex fresca e garantire che non ci sono fori nella borsa guanto.
Dopo Giuroma90 è stato purificato con successo e dissalato, test di cinetica enzimatica utilizzando l'elettrodo di ossigeno deve essere eseguita con attenzione per ottenere dati sull'attività catalitica dell'enzima. Misure cinetiche sono riproducibili in genere quando viene utilizzata una proteina cataliticamente attiva e concentrata. Se i punti dati non sono riproducibili, quando si ripete una corsa per un punto dati di concentrazione substrato o inibitore, il problema potrebbe essere che la proteina ha denaturato o ossidato dopo un uso prolungato. Appena dissalata proteina può essere generata per consentire la continuazione della raccolta dei dati. È importante conservare tutte le fiale dell'enzima, quindi la concentrazione esatta della proteina può essere determinata dopo il completamento della raccolta dati utilizzando un'analisi di Bradford. Questo passaggio viene eseguita dopo le misure cinetiche perché l'enzima perde l'attività nel corso del tempo, quindi eseguirla prima può condurre per abbassare attività e misurazioni imprecise cinetica. La concentrazione nella proteina è quindi utilizzata per convertire tassi catalitici nei tassi di reazione che sono necessari per determinare il numero di fatturato. Oltre alle preoccupazioni circa la perdita di attività enzimatica che porta a risultati irriproducibili cinetica, degradazione della membrana che copre l'elettrodo dopo un uso prolungato può anche causare le sfide quando si riproducono i dati. Degradazione della membrana è in genere indicato da un aumento il segnale iniziale (da 250-350 nmol/mL e >350 nmol/mL) o un'incapacità di raggiungere una velocità stabile sfondo prima dell'aggiunta dell'enzima (> ± 5 nmol/mL/min). Se uno è osservato, è consigliabile smontare l'elettrodo, pulire eventuali ossidi fuori l'elettrodo usando la polvere di pulizia fornito, rimontare l'elettrodo e ricalibrare.
Il metodo di purificazione anaerobica è molto importante per gli enzimi con un centro di metallo che possono essere ossidati, soprattutto per coloro che sono strettamente associati metalli che non possono essere scambiati dopo la proteina si piega. Anche se gli enzimi si sono evoluti per proteggere se stessi attraverso il coordinamento dell'ossigeno solo dopo il coordinamento di substrato, lo hanno fatto in un ambiente cellulare - gli importi di saturazione di ossigeno in un ambiente in vitro possono portare a rapida ossidazione dei metalli e la conversione di Fe (II) nell'inattivo Fe (III) forma31. Questa ossidazione/inattivazione può portare a risultati distorto in cui l'enzima non è nello stato attivo cataliticamente. Il test di cinetica enzimatica utilizzando un elettrodo sensibili all'ossigeno può essere applicato agli enzimi che si basano su ossigeno come substrato. Anziché ottenere parametri di cinetica utilizzando il cambiamento nell'intensità di assorbimento del substrato o del prodotto, questo metodo consente la visualizzazione del consumo di ossigeno saturata in soluzione. Questo metodo è stato utilizzato in precedenza con LigAB, un altro extradiol dioxygenase nella superfamiglia protocatecuato diossigenasi che allo stesso modo si basa su un Fe (II) nel suo sito attivo per coordinare e fendere i suoi substrati.
Questo manoscritto fornisce anche ulteriori informazioni sull'enzima Giuroma90 dal ceppo di Sphingobium SP. SYK-6. A seguito dei lavori che ha definito la funzione enzimatica e struttura del Giuroma9010,19,39, è stato stabilito nel presente documento che Giuroma90 è un catalizzatore competente di dioxygenation di gallato, con kgatto di 17,8 ± 1,0 s-1 e Km di 45 µM ± 13, conseguente kgatto/km di 3,98 x 105 M/s. Queste tariffe sono paragonabili a quelli determinati per altri enzimi diossigenasi, compreso LigAB (kgatto di 51 s-1 e kgatto/KM di 4,26 x 106 M-1s-1 ) e altri diossigenasi che hanno kgatto/Km valori che vanno da 105-108 M-1s-136,45,46 , 47 , 48 , 49 , 50.
Il sito attivo Giuroma90 precedentemente è stato indicato per essere interfaccia del dimero con residui da due monomeri contribuendo al coordinamento del substrato [residui provenienti dal monomero che lega il Fe (II) sono indicati dal loro numero di residuo, mentre residui da altri monomeri sono indicate dal loro numero di residui e un primo (cioè, Glu377ʹ)]6. In assenza di informazioni strutturali mostrando le interazioni di legame di 4NC con Giuroma90, le somiglianze strutturali e le differenze tra gallate e 4NC possono fornire informazioni su come Giuroma90 potrebbe essere inibita da 4NC. Gallato ha tre sostituenti ossidrile a C3, C4 e C5, con suoi idrossili C3 e C4, coordinati dal centro di Fe (II) e l'idrossile C5 coordinato dal Glu377ʹ (Figura 8). Il gruppo dell'acido carbossilico al C1 è coordinato da Tyr-391ʹ, Tyr-412ʹ, Thr-13 e Thr-267 nel sito attivo Giuroma90. 4NC, che ha dimostrato di essere un inibitore modesto di Giuroma90, ha due ossidrili disponibili per coordinare il centro di Fe (II) e un gruppo di nitro C1 isosteric per un carbossilato (pur avendo anche due ossigeni per coordinamento dai residui 391, 412, 13 e 267), ma è molto di più elettron-attrattori rispetto l'acido carbossilico il gallato. Poiché 4NC visualizzati solo il 36,6% inibizione della dioxygenation di Giuroma90 di gallato quando l'inibitore era presente in 5 volte eccedenza su substrato, è sorprendente che non era un inibitore molto potente (con un Kho di 2,3 ± 0,3 mM). Ciò suggerisce che il C5 idrossile e C1 sostituente gioca un ruolo significativo nel promuovere il complesso enzima-ligando. Poiché residui Glu377ʹ, Tyr-391ʹ e Tyr-412ʹ sono tutti implicati in queste interazioni, questo suggerisce che i contatti di sito attivo Giuroma90 con monomeri adiacenti sono importanti per il posizionamento di un composto e strutturare il sito attivo.
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Disclosures
Gli autori hanno nessun concorrenti interessi finanziari o altri conflitti di interesse.
Acknowledgments
Vorremmo ringraziare la dottoressa Camille Keller di Wesleyan University per il supporto tecnico. Grazie professore Lindsay D. Eltis e Jenna K. Capyk dalla University of British Columbia, come pure Christian Whitman dall'Università del Texas ad Austin, speciale per i loro consigli per quanto riguarda i metodi di purificazione della proteina anaerobica e l'utilizzo di un O2 -elettrodo sensibile.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Isopropyl β-D-1-thiogalactopyranodise | Gold Bio Technologies | I2481C50 | |
| Coomassie Brilliant Blue R-250 | Bio-Rad | 161-0400 | |
| Ammonium persulfate | Bio-Rad | 161-0700 | |
| 30% Acrylamide | Bio-Rad | 161-0158 | |
| N,N'tetramethyl-ethylenediamine | Bio-Rad | 161-0801 | |
| Amylose Resin High Flow | New England Biolabs | E8022S | |
| BL21 (DE3) competent Escherichia coli cells | New England Biolabs | C2527I | |
| L-cysteine | Sigma Aldrich | C7352 | |
| gallic acid | Sigma Aldrich | G7384 | |
| 4-nitrocatechol | Sigma Aldrich | N15553 | |
| Ferrous ammonium sulfate | Mallinckrodt | 5064 | |
| Sodium dithionite | Alfa Aesar | 33381-22 | |
| wheaton serum bottles | Fisher Scientific | 06-406G | |
| 25 mm Acrodisc PF Syringe Filter with Supor Membrane | Pall Corportation | 4187 | |
| 400 mL Amicon Stirred Cell Concentrator | EMD Millipore | UFSC40001 | |
| 76 mm Millipore Ultracel 10 kDa cutoff reconsituted cellulose membrane filter | EMD Millipore | PLGC07610 | |
| DL-dithiothreitol | Gold Bio Technologies | DTT50 | |
| Sephadex G-25 coarse desalting gal column | GE Healthcare | 17-0033-01 | |
| 2 mL Crimp-Top Vials | Fisher Scientific | 03-391-38 | |
| Oxygraph Plus Electrode Control Unit | Hansatech Instruments | OXYG1 Plus | |
| Oxygen Eletrode Chamber | Hansatech Instruments | DW1 | |
| Electrode Disc | Hansatech Instruments | S1 | |
| PTFE (0.0125 mmX25mm) 30m reel | Hansatech Instruments | S4 | |
| Electrode cleaning Kit | Hansatech Instruments | S16 | |
| Spacer paper | Zig Zag | available at any gas station | |
| He-series Dri-Lab glove box | Vacuum/Atmospheres Company | ||
| HE-493 Dri-Train | Vacuum/Atmospheres Company | ||
| Double-Ended Micro-Tapered Stainless Steel Spatula | Fisher Scientific | 21-401-10 | |
| DWK Life Sciences Kimble Kontes Flex Column Economy Column | Fisher Scientific | k420400-1530 | |
| 10 μL, Model 701 N SYR, Cemented NDL 26s ga, 2 in, point stlye 2 syringe | Hamilton | 80300 | |
| DWK Life Sciences Kimble Kontes Flex Column Economy Column | Fisher Scientific | K420401-1505 | |
| Emulsiflex-C5 high-pressure homogenizer | Avestin | ||
| B-PER Complete Bacterial Protein Extraction Reagent | Thermo Fisher Scientific | 89821 | |
| Lysozyme from chicken egg white | Sigma Aldrich | 12650-88-3 | |
| Sodium dodecyl sulfate | Thermo Fisher Scientific | 151-21-3 | |
| ampicillin | Sigma Aldrich | 7177-48-2 | |
| Tryptone | Fisher Scientific | BP-1421-500 | |
| Yeast extract | Fisher Scientific | BP1422-2 | |
| Sodium Chloride | Fisher Scientific | S271-10 | |
| Potassium Chloride | Fisher Scientific | P217-3 | |
| Magnesium Chloride | Fisher Scientific | M33-500 | |
| Dextrose | Fisher Scientific | D16-3 | |
| Sodium Hydroxide | Fisher Scientific | S318-1 | |
| Tris hydrochloride | Fisher Scientific | BP153-500 | |
| Maltose | Fisher Scientific | BP684-500 | |
| Glycine | Fisher Scientific | G46-500 |
References
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