Summary
ここで嫌気性蛋白質の浄化、嫌気性蛋白質濃度、酸素電極システムを使用して後続の速度論的解析のためのプロトコルを提案する.DesB より安定し、精製し、嫌気性環境で保存されているときにアクティブであるジオキシゲナーゼ酵素酵素を用いた方法を示します。
Abstract
これらの酵素は、基質として酸素を利用するを含む酸素感受性タンパク質は伝統的な有酸素浄化メソッドを使用して精製した際の安定性が減少します。この原稿は、グローブ ボックスと反応速度論の前に蛋白質の脱塩でバッファーおよび試薬のカラム ・ クロマトグラフィ法の準備を含む嫌気性精製プロセスに関与する技術的な詳細を示しています。準備および酸素電極を使用して酸素を利用した酵素の速度論的解析を実行するためのメソッドは、述べる。これらのメソッドは、ジオキシゲナーゼ酵素細菌Sphingobium sp. ひずみ SYK 6 から没食子酸ジオキシゲナーゼ DesB を使用して説明します。
Introduction
鉄や他の金属には活性酸素を利用する酵素は、それらの除去のため細胞の還元環境から浄化プロセス中に不活化を受けやすい。したがって、これらの蛋白質はセル lysates として使用する必要があります、外部の還元剤にさらされるまたは最適な酵素活性1,2,3,4があるように嫌気浄化されます。これらの酵素は酸素感受性 (具体的には鉄を含む酵素)、嫌気的条件を維持しながらすべての精製と諸性質の手順を実行するそれらを完全に特徴づける必要です。これは、嫌気性チャンバー結晶5,6,7,8 を介してタンパク質発現に至る研究の範囲内で全体の研究室のセットアップを開発する研究者をつながっています。.
ここで、嫌気性の精製と酵素酸素電極を用いた DesB の速度論的解析法を報告する.DesB は、没食子酸ジオキシゲナーゼ細菌Sphingobium sp. ひずみ SYK-6 LigAB、同じ有機体から protocatecuate ジオキシゲナーゼに関連しているからです。日9、好気性の標準を使用して精製した場合不活化を受けやすいこのスーパーファミリーの酵素の一部可能性がありますに広範囲に研究されていないタイプ II プロトカテク酸-ジオキシゲナーゼ (PCAD) スーパーファミリーに属する両方の酵素蛋白質の浄化方法。PCAD 酵素のいくつかはありますが基質特異的2,10, 基板混乱を表示からさらにこのスーパーファミリーの特性評価は特異性の決定要因を識別するために必要です。小さな分子が直接競争の阻害を介して活動またはのバインディングを変更できますいくつか酵素ガ11,12,13,14,15で確認されています別のアロステリック ポケットが増加または減少酵素活性16する分子。速度だけでは、変調器の結合場所を区別できない、効果を理解するために重要なは活動変化の大きさを決定します。このような DesB のネイティブ アクティビティおよびその活動 4-nitrocatechol (4NC) を特徴付けるジオキシゲナーゼ酵素2,17,を抑制する一般的に使用される化合物の存在下での速度論的解析法18日が表示されます。
DesB は、リグニン由来芳香族化合物、基板10,19の一つとして酸素を使用して開口部を触媒するリングで extradiol ジオキシゲナーゼ (江戸) 反応による没食子酸を分解することができます。この酵素反応は芳香族 heteropolymer は、植物の細胞壁のリグニン分解のコンテキスト内で発生します。リグニンを depolymerized することができます、さまざまな芳香族化合物を降伏するさらに分けることが中央代謝物3,20,21,22,2324, ,25,26,27,28,29,30,31,32,33.Extradiol dioxygenases (江戸) を触媒、胸の谷間が金属配ジオール; に隣接して発生する dihydroxylated 芳香族化合物の反応を開環対照的に、intradiol dioxygenases は、2 つのヒドロキシル グループ (図 1) と芳香族化合物類似を切断します。他の多くの酵素のような EDOs 2 ヒスチジン 1-カルボン酸トライアド9,34,35から成る調整鉄 (ii) の二価金属センターがあります。これらの酵素は、酵素が非アクティブな2,36,37,38を表示されるに対し自動酸化、不活性化のメカニズムに基づくと酸化になります。
本稿では、実験手順では、DesB、没食子酸 (図 2 a) の C4 C5 結合に酸素の付加を触媒する細菌Sphingobium sp. SYK-6 から PCAD スーパーファミリーのメンバーを利用します。この胸の谷間の regiochemistry は、プロトカテク酸--4, 5-ジオキシゲナーゼ (図 2 b) は、LigAB に似ています。これまでのところ、この没食子酸ジオキシゲナーゼの調査は、DesB10,19,39を阻害する化合物のレポートを含めません。有酸素浄化方法の使用は、DesB では、変数の活動を嫌気的方法の使用に一貫して再現可能なアクティビティとタンパク質を取得することができました、出展しました。ここで説明した動力学的研究 DesB、没食子酸と DesB の反応と 4-nitrocatechol (4NC) による DesB の阻害の速度論的解析の嫌気性の浄化メソッドに示します。
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Protocol
1. 一般材料と方法
- 表 1に示すようにすべての必要なメディアを準備します。15 分無菌 120 ° C のオートクレーブは、0.2 μ m フィルターを通過して MgCl2とグルコースの添加後 SOC ソリューションをフィルターします。オートクレーブに入れる前にミラーのホストゲノム スープ (LB 媒体) 溶液の pH を調整します。0.2 mM、0.1 mM 鉄アンモニウムの硫酸塩タンパク質発現と溶解性を高める L-システインのオートクレーブ滅菌ソリューション後補足 LB アンプ メディア ソリューションです。
- 表 2で説明したよう、ポリアクリルアミドゲル電気泳動 (ページ) の塩化物イオンとバッファーと連続したバッファーを準備します。彼らの最終的なボリュームにコンポーネントを希釈する前に (バッファーの準備のため 1 M HCl とトリスのベースを用いた) 溶液の pH を調整します。
- 表 3で説明した蛋白質の浄化のためのバッファーを準備します。彼らの最終的なボリュームにコンポーネントを希釈する前に (バッファーの準備のため 1 M HCl とトリスのベースを用いた) 溶液の pH を調整します。
- 1 穴ゴム栓で密封することができますし、ガラス管が含まれているボトルに準備されたバッファーを転送します。
- ストッパーでガラス管を真空装置に接続するのにホースを使用します。中速で攪拌しながら約 30 分間の否定的な圧力の下でドガにソリューションを許可します。
- シールが最初に、その後、真空をオフに真空を破る。次に、(エスケープ ガスベントとして使用することができます 1 つの短い針と、ボトルの底に達するのに十分な長さは、1) 2 つの 20 G 針でゴム栓を貫通します。30 分の中速で攪拌しながら窒素の定常流のバブルします。
- 針を削除し、3 つのサイクルの合計脱気、窒素バブリングを繰り返します。完了したら、正しく固体ゴム栓とボトルを密封します。さらにパラフィン フィルムと銅線 (20 G)、ストッパーを固定し、グローブ ボックスに配置します。
注: すべての材料は、グローブ ボックスに配置、控えの間、続いて酸素吸引と窒素補充のパージの 3 サイクルを受けます。精製・濃縮に使用されるバッファーを頂いたし、グローブ ボックスに無期限に保存できます。
- 約 1 つへら (0.31"× 2"、両頭マイクロテーパー ステンレス製ヘラの小さい方の端) を 1 mL 約 1.5 mL 遠心チューブにガスを抜かれた水のナトリウム ジチオンの完全溶解してナトリウム ジチオン液を準備します。.グローブ ボックスから削除する前にパラフィン フィルム チューブをシールします。
注: は、酸化を防ぐためにグローブ ボックスに固体ナトリウム ジチオンを格納します。
2. 蛋白質の浄化のアミロース カラムの準備
- アミロース列バッファーのハイフロー アミロース樹脂 (15 mL) を 5 列ボリューム (75 mL) と組み合わせてからスラリーを作る。2 つの 50 mL の血清ボトルに樹脂スラリーを転送し、ゴムキャップとそれぞれのボトルのシールします。スラリー、懸濁液から酸素を取り除くに約 1分間に 20 G、隔壁、およびバブルの窒素を 305 mm 針を穿刺します。樹脂とタンパク質含有溶液をグローブ ボックスに転送します。
- グローブ ボックスで解決し、レベルのベッドを作成する樹脂を許可する単純な活栓装備 2 x 30 cm ホウケイ酸列に樹脂を注ぐ。列バッファーを切るし、溶媒が真上まで約 1 のドロップ/秒または 5 mL/分で樹脂を通してバッファーをプッシュする加圧窒素ガスを使用して脱アミロース列バッファーの 3 列ボリューム (〜 30 mL の合計) のコラムを平衡させ、樹脂ベッド。
注: 後、タンパク質が溶出 (3.5 以下のステップを参照)、アミロース列ガレージが 1 列ボリューム (10 mL)、水の 1 列量 1% ナトリウム dodecyl 硫酸塩 (SDS)、および最終的に、3 列ボリューム (30 mL) 水の洗浄によって再生成されます。グローブ ボックスの外側は、この手順を実行することができます。列樹脂は 4 ° c 20% エタノールで格納され、5 回までを再生成することができます。
3. 蛋白質の表現および DesB の嫌気性の浄化
注: DesB 遺伝子市販合成された、ペット 15 b、32 a、ペットおよびクローニング サイト NdeI および病原の制限を使用して pMAL c5x ベクトルに配置されて有する。
- (下記で簡単に説明) 大規模な表現のための正しい条件を決めるには製造元のガイドラインによるとタンパク質発現アッセイを完了します。
- 変換 DesB を含むプラスミド商業的、化学的に有能なエシェリヒア属大腸菌BL21 (DE3) 細胞、製造元の指示に従って。簡単に言えば、10 分間氷の上細胞を解凍、10 の 42 ° C でセルをセルの混合物、熱衝撃にプラスミド DNA のおよそ 10-50 ng を追加 s、追加 5 分 1 mL の最終的なボリュームを取得し、許可する追加の SOC のメディアのための氷の上にそれらをインキュベートし、60 分の 37 ° c (~ 200 rpm) を振るセルです。LB アンプ板追加し広がり細胞液を 100 μ l 添加し 37 ° C で一晩インキュベート
- 一晩インキュベートした後プレートからコロニー形成単位を選択し、この植民地を使ってポンド アンプ メディアの 10 mL を接種します。37 ° C で (~ 200 rpm) を振動で一晩、セルを育てなさい
- 10 mL の培地、一晩成長溶液 100 μ L を追加し、37 ° C で 3.1.2 の手順で説明するように、新しいメディアを振るとき 600 の光学濃度イソプロピル β-D-1-thiogalactopyranoside (IPTG) 1 mM の最終溶液濃度を取得するを追加 nm (外径600) は 0.4 から 0.8 の間。
- すぐにソリューションの 1 mL の約数を削除し、ラベル付けされた時間と 1.5 mL 遠心チューブに転送 0 時間を =。細胞のペレットを 10 分間 15,000 × g でチューブをスピンします。回転後、上澄みを除去し、4 ° C で細胞を保存
- (通常は 5、10、12、18、24 h) IPTG の添加後の時間間隔で追加因数 (各 1 mL) を削除します。3.1.4 の手順で説明するよう各チューブを遠心、上清をデカント、4 ° C で細胞を保存
- 試料を取得すると、すべてはからの細胞を再懸濁します細菌のタンパク質抽出液の 30 μ L で各 timepoint 10-15 分、室温でインキュベートして水溶性と不溶性を分離する 5 分間 15,000 × g でチューブを遠心分離蛋白質。
- 新しい微量遠心チューブに可溶性タンパク質溶液を移し、細菌のタンパク質抽出溶液の 30 μ L で残りの不溶性のペレットを再懸濁します。
- 塩化物イオンとバッファーの等しいボリュームと各ソリューション (各 timepoint の水溶性と不溶性の両方のソリューション) の 30 μ L を結合し、SDS ページのゲル40上に視覚化します。大規模な蛋白質の表現そして浄化のための可溶性画分で正しいサイズのバンドを含む車線に対応する条件を選択します。
注: 最小限の可溶性タンパク質では、上記の条件を使用して生成された当初、以来様々 なサプリメント追加された 0.2 mM L システインと強化された蛋白質を示す 0.1 mM 鉄アンモニウム硫酸塩の可溶性タンパク質発現に与える影響をテストするには式です。このタンパク質式画面によると DesB の可溶性生産のため適切な表現のベクトルは pMAL c5x ベクトルだった
- 大腸菌BL21 に変換を次 (DE3)、80% のグリセロールの 100 μ L と 900 μ L の培養 (37 ° C、200 rpm で振とうしながら成長した一晩) を組み合わせることで DesB/pMal c5x の在庫を作る。クライオ チューブに-80 ° c 株式を格納します。
注: 作成新しいフローズン タイプ約 6-8 ヶ月ごと。 - ピペット チップを使用して冷凍ストックから細胞をこすりし、揺れで 37 ° C で LB アンプ メディアの 5 mL で一晩成長細菌培養を開始します。37 ° C と一晩培養細菌を使用して 200 の rpm で 2 L フラスコで LB アンプ メディアの 1.5 リットルを接種します。
注: 酸素にタンパク質の観察された感受性のため分かった削減ヘッドスペースガス フラスコと中程度の大規模な式の速度向上蛋白質収量の揺れ。 - タンパク質の発現を誘導するときに 600 の光学濃度 nm (外径600) は 0.4-0.8 ~ 1 mm IPTG の 0.2 mM L システインと 0.1 mM 鉄アンモニウム硫酸を添加しました。30 ° c の孵化の温度を下げ、200 rpm で振る。スピン ・ ダウン 4,700 × g 10 分間に 24 h 後誘導後遠心分離して細胞と使用済みメディアを破棄します。
- リゾチームの 1 mg の添加に続いて、成長のすべての 1.5 L あたりアミロース列バッファーの 20 mL の細胞ペレットを再懸濁します。氷の上を 20 分間かき混ぜます。
注: より多くのバッファーをタンパク質としても粘性のソリューション可能性があります均質化、次の手順を中断解決策があまりにも粘性の場合追加できます。 - 約 15,000 psi で 3-5 パスで高圧均質化によって再懸濁細胞液を溶解させます。50 mL の遠心管に蛋白質を転送し、1 分の窒素とヘッド スペースをフラッシュします。細胞ライセート不溶性のがれき撤去を 40 分間 20,000 × g で遠心分離します。
注: 成功した均質化コレクション フラスコにチューブを通して流れるし、ソリューションが半透明の灰色茶色色として表示されますフォーム ミセルにタンパク質を原因します。プロセス全体の氷の上の均質化蛋白質を保ちます。 - 遠心分離の後転送上清 (以上 1 つ必要があります)、50 mL のチューブにキャップ ゴム中隔と 20 ゲージ針、酸素を転置するために 2 分のためのソリューションを通じてゆっくりとバブルの窒素のガス管です。パラフィン フィルムで中隔を包むとさらに、銅線で固定し、列の材料と一緒にグローブ ボックスに上清をもたらします。
- コラムを平衡させ (手順 2.3 参照) 列に上清タンパク質を読み込むとします。通過 (1 滴/秒または約 5 mL/分) 適度に加圧窒素下で 5 mL の一部分を収集します。次に、アミロース列バッファーの別の 3 列ボリュームを使用して、列を洗って、適度に加圧窒素 (約 5 mL/分) の下でガラス試験管に 3 mL の一部分を手動で集めます。5 列ボリューム (~ 50 mL) の溶出バッファーを使用したタンパク質を溶出し、手動で適当な窒素圧力 (約 5 mL/分) の下で 3 mL の一部分を収集します。
注: 分数または収集できます重力ろ過を用いたします。約 12 溶出画分を収集する必要があります。 - 分数の 30 μ 因数を収集し、タンパク質を含む可視化できるようにグローブ ボックスからそれらを削除 SDS-PAGE 分析による分数。
注: 収集した分数は、このテストの期間はグローブ ボックスに残ります。精製 DesB は通常 5 から 3 の分数列からた。
4. 嫌気性蛋白質濃度/バッファー交換
- 76 mm 再構成されたセルロース膜フィルター (カットオフ 10 kDa) と加圧、攪拌セル コンセントレーターを組み立てます。組み立てのコンセントレーターがグローブ ボックスに転送されると膜を維持するコンセントレーターに 20% のエタノールの十分な量を追加します。
注: は、細胞膜には涙がないしわない o リングがあることを確認します。 - 撹拌槽のコンセントレーターをグローブ ボックスに持ち込み後、に水膜をエタノール溶液を洗ってください。キャップし、チューブと、余分な水分の膜をきれいにする撹拌セルを加圧します。
- コンセントレーターに SDS ページ (図 3) で決定されたタンパク質を含むすべての画分を追加します。総蛋白質の解決の容積の 150 mL を生成するための十分な exchange バッファーを追加します。
- 外線 N2を用いた撹拌槽室を加圧し、適度な攪拌スピード 50 mL に蛋白質を集中します。
注: は、約 20 分かかります 50 mL の濃度を達成します。 - 100 mL の 0.1 mM ジチオトレイトール (DTT) と 0.1 mM 硫酸第一鉄アンモニウム交換バッファーを補完、撹拌槽にソリューションを追加し、攪拌スピード中等度 50 mL の合計容積に蛋白質を集中します。
- ソリューション 50 mL の量に達すると後、もう一度補われた交換バッファーの追加、その攪拌スピード穏健派と 10 mL の合計容積に解決策を集中します。
- 集中を使用して蛋白質 0.45 μ m 孔サイズのシリンジ フィルターそして因数個々 の 0.2 mL ポリメラーゼの連鎖反応 (pcr) の管に (各蛋白質の解決の約 150 μ L を含む) にフィルターを適用します。グローブ ボックスから頂いた因数を削除し、フラッシュがすぐにそれらを液体窒素に凍結します。因数-80 ° C で保存します。
5. DesB の脱塩
- 使用前に約 1.5 時間の窒素ガスでグローブ バッグをフラッシュします。
- 氷の上、グローブ バッグ内浄化された DesB 蛋白質の 150 μ 因数分解しなさい。
- タンパク質を分解すると、小さな重力、9 mL ホウケイ酸列のセファデックス G-25 粗脱塩ゲルの 3 mL を含む列を脱塩を準備します。2 列ボリューム (~ 6 mL) を洗い流す脱バッファーを脱塩します。
メモ: は、(約 7 使用) 後ゲル色が白から黄色に変更がある場合に脱塩ゲルを交換します。 - 重力制御のプロセスを介して列に解凍 DesB をロードします。流れを破棄します。約 5 ml のバッファーを脱塩のタンパク質を溶出します。
注意: グローブ バッグを継続的に充填ガスのタンクからの圧力で解列から点滴速度を影響します。 - 列からタンパク質の溶出の最初の決定、12 バイアル/有害溶出 (バイアルあたり 3 滴を含む) を収集します。ゴム隔壁で密閉、それらを削除グローブ バッグと蛋白質の存在のためのテストから直接 (SDS ページのゲルの分析) によってまたは間接的 (を介して各画分の活動の検討)。
注: 通常、分数個々 にテストされるアクティビティのアクティブなタンパク質の最大濃度の割合に対応する最大の活動手順 7.1 で説明しました。DesB は通常、脱塩蛋白質の次の 9 滴を収集した後、第 7 回のドロップで始まってた。タンパク質因数は、速度測定 (手順 7.1 7.4) 中に氷に格納されます。
6. 酸素電極の準備
- 黒い酸化物の目に見える兆候がないまで銀アノード リングと白金陰極電極クリーナーと湿った綿棒を磨きます。
- はさみ、スペーサー用紙 (またはも同様に動作するタバコ ローリング ペーパー) の約 1 つ 1.5 インチの四角にカットします。その後、電極の折り返しを支援するためにコーナーに広場と 2) スリットの各面に 1) 小さな三角形をカットします。
- 銀陽極上に 50 %kcl 溶液 5 滴溝し、彼らは、ソリューションの 1 つの連続的なリングを形成するので接続を追加します。白金電極の上に 50% の KCl 溶液 2 滴を追加します。慎重に白金電極上にスペーサー紙を置き、スペーサー紙を滑らかに空気の泡がないので。
注: は、スペーサー紙を引き裂くことを避けるために注意を使用します。 - 約 2 インチの長さは、S4 30 m PTFE (ポリテトラフルオロ エチレン) 膜の一部を切断し、スペーサー紙の上に置きます。彼らは電極の外側のリングに揃えて配置されますので、膜の端が切れます。
- O リングのアプリケーターを使用して、紙と膜電極上にスペーサーを固定する電極を小型の o リングを押してください。その下にある膜がないことを確認、電極の円形溝に大きな o リングを配置します。ベースの上に電極の上部室をスライドさせ、一緒に 2 つのネジします。
注: 2 つは上ねじ止め正しく場合は空気泡棒の商工会議所の側面に。 - そのベースに組み立てられた電極を配置して電極を監視システムに接続します。電極制御プログラムを開始し、液相キャリブレーション プロトコル (図 4 a) を実行することにより、電極のキャリブレーションします。温度変数は実験が行われ、部屋の温度は、周囲の圧力変数地域と現在の気象条件によって異なります。
注: 大気圧は、地域の天気予報から入手できます。 - 電極箱に 25 mM Tris バッファーの 1 つの mL を追加、プランジャーを挿入、酸素飽和液の調整を開始、100 を攪拌速度を調整します。電極が安定、酸素の飽和溶液を決定のキャリブレーション セット ポイント (図 4 b)。
- プランジャーを削除せずには、空気の泡 (図 4) を追加することに注意しながら、商工会議所に約 1 mL のナトリウム ハイドロサルファイト溶液を注入するのに 1.2 x 40 mm 針と 1 mL 注射器を使用します。ナトリウム ハイドロサルファイト添加直後に電極チャンバーを密封するのにゴム栓を使用します。
- すべての酸素を利用し、プログラムが完了するまで続行して保存 (図 4) 校正校正を許可します。商工会議所からソリューションを吸引し、プランジャーと脱イオン水で商工会議所を 5-6 回リンス亜ジチオン酸ナトリウムの完全な除去を確実にします。洗浄、側腕真空フラスコに接続されているピペット チップ搭載プラスチック製のチューブを使用します。細胞膜の損傷を防ぐ。
7. 酸素電極を用いたカイネティックアッセイ
- 連続 25 mM Tris バッファー ph 7.5 のソリューションで活性酵素液 1 μ L をテストし、100 μ M の没食子酸を含むアクティブな蛋白質を含んでいる脱塩因数を識別します。最大観測活動と残りの実験のため、aliquot(s) を使用します。(手順 5.5.1 参照)
- O2を使用して O2消費量を測定することにより酵素反応の速度を決定する-クラーク型電極電極コントロール ユニットを介してコンピューター統合。
- 各速度データ ポイント DesB の測定は、電極箱に 25 mM Tris バッファー (pH 7.5) の 1 つの mL を追加します。没食子酸の原液を 25 mM の計算された容積を目的最終的な基質濃度 (0.05 〜 25 ミリメートル) を達成するために Tris バッファーに追加します。
注: は、毎日没食子酸と水と阻害化合物の新鮮な在庫ソリューションを準備し、7.5 0.1 mM NaOH 添加で pH を調整する必要に応じて。 - 10 後 s を可能にするソリューションの混合攪拌のチャンバー内にプランジャーをゆっくりとシールし、上部のスクリュー ダウン。クリーンな組織は、商工会議所から避難は余分な液体を吸収する使用場合があります。酵素 (背景 O2消費率 ± 0.5 μ M/分) の付加に進む前に、少なくとも 1 分溶液中の酸素濃度の安定した測定を作り出すことができるそれを平衡に電極を許可します。
- ガス タイト 10 μ L のシリンジを使用すると、プランジャーを電極箱に約 1 μ L の酵素 (約 3-7 μ M 酵素) を追加します。
注: 酵素の量が増加または十分な反応速度を許可する特定の因数の観測活動への応答で減少します。 - 最初の 30 の傾きに基づく反応速度の計算線形データの正しい酵素添加後の s の背景、30 を使用して O2消費酵素剤添加の直前にデータの s。触媒作用の率は O2消費量 (図 5 a) のレートと同じです。
- プラスチック製のチューブを使用して吸引による電極チャンバーを空に与えられた基板濃度の速度データのコレクションの後側腕真空フラスコに接続され、4-6 サイクルの水で繰り返し洗浄。7.2.1 新しい基質の濃度を使用しての手順で説明するよう、電極にソリューションを設定します。
- 順序付けされていない方法で基質濃度を変化し、(図 5 b) 時間と酵素活性の減少のためのアカウントに実験の過程で複製します。
注: 特定濃度の反復実行されるより以前に実行と比較した速度の 30% 減少を示す、追加のアッセイを実行しない酵素のバッチで。通常、30-40 の実行後、酵素は活性の 30% 減少を示しています。 - K猫(基板の製品への転換に触媒定数) と Km (ミカエリス定数、運用初期速度がある基質濃度として定義されて、速度論的パラメーターを決定します。最大速度の半分)、グラフパッド プリズムを用いた Michaelis−Menten 式 (図 6) に基質濃度のそれぞれからデータの最小二乗フィッティングによる。
- 各速度データ ポイント DesB の測定は、電極箱に 25 mM Tris バッファー (pH 7.5) の 1 つの mL を追加します。没食子酸の原液を 25 mM の計算された容積を目的最終的な基質濃度 (0.05 〜 25 ミリメートル) を達成するために Tris バッファーに追加します。
- 4 nitrocatechol (4NC) を分解速度に及ぼす影響をテストし、DesB と阻害定数 (K私) を決定するを追加します。反応条件ごとにストック トリス (50 mM)、没食子酸 (25 mM)、および 4NC のソリューション (25 mM) と 25 mM Tris バッファー (pH 7.5) 1 mM 没食子酸との 2 mL の溶液を生成する水で希釈を組み合わせるし、4NC の濃度を変化させます。4NC のボリュームは、目的の最終的な阻害剤濃度 (0.05 〜 20 ミリメートル) を達成するために変化させた。
- ソリューションの混合を許可する攪拌の 10 秒後商工会議所でゆっくりとピストンを配置、スクリュー トップ ダウン。クリーンな組織は、商工会議所から避難は余分な液体を吸収する使用場合があります。均衡を取って、酵素 (背景 O2消費率 ± 0.5 μ M/分) の付加に進む前に、少なくとも 1 分の酸素濃度の安定した測定を生成する電極を許可します。
- 前述したように、タンパク質 (ステップ 7.2.3) を追加 (7.2.4 ステップ)、反応速度を決定する、次の条件のため電極をリセットします。
- この一連の実験において、複数回の阻害剤の反応速度を決定します。1 mM の基板に様々 な添加剤の存在下で酸素消費率と阻害剤 (v/vo) の不在の標準化によって阻害を決定します。
- 方程式 7.3a [没食子酸分解し、方程式 7.3B グラフ作成プログラム (図 7) を使用してデータが抑制の抑制に合います。
- ブラッドフォードの試金運動のすべての実行が完了した後に実行することによって各実験のため正確な酵素濃度を決定します。
注: すべての料金は、酵素濃度の修正されました。この手順は、グローブ ボックスやグローブ バッグで行う必要はありません。
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Representative Results
DesB マルトース結合タンパク質 (MBP) 融合コンストラクト (図 3) の精製から個々 の分数の SDS ページのゲルの分析は、示されています。ゲルを明らかにタンパク質が純粋である (MW = 91.22 kDa)、DesB の存在を除いて (MW = 49.22 kDa) と MBP タンパク質ドメイン (42 kDa) をお互いから切断します。分数 E2 および E3 は、濃度 (ステップ 4.2) に選ばれました。
DesB カイネティックアッセイから再現性のある結果は、適切なアセンブリ、校正、および実験手法によって異なります。これらの変数は、O2ソリューション (図 4 a) アッセイ中に解散する予定の割合を決定する正しい周囲温度と圧力を入力する必要があります。最初の信号 1800 と 2000 nmol/mL の間する必要があります、ソリューションの酸素飽和度は最小限 (図 4 b) の変更をことを示すゼロに近い安定したレートを生成する必要があります。一度ナトリウム ジチオンを追加し、部屋を密閉する O2消費率増やす必要があります迅速かつ着実に最小限の O2があるまで (< 60 nmol/mL) ソリューションの左します。安定した負の勾配は、1) 組み立てられた電極に空気漏れがないことを示し 2) 電極が (図 4およびD) O2濃度の変化に応答して適切に。O2は、ソリューションの残りは十分に低い、キャリブレーション オフセット値は不正確になります。キャリブレーションが正しく組み立てられた電極で繰り返されなければならない、亜ジチオン酸ナトリウムを新鮮なを使用する必要があります。
電極が正しく校正されて、カイネティックアッセイが実行できます。最初の測定は、25 mM Tris バッファーで 100 μ M の没食子酸と酵素の 1 uL を使用して新鮮な脱塩の酵素の活性を確立します。酵素の加算の前に Tris バッファーと没食子酸が商工会議所で位置にプランジャーで攪拌しました。これは 250 と 350 nmol/mL、間おおよそ初期信号を生成する必要があり、酵素を追加する前に、信号 (± 5 nmol/mL/分) で安定するはず。安定した信号は変数がないことを示します(例えば、引き裂かれた膜、亜ジチオン酸ナトリウムが残り、汚れた電極) 測定の矛盾を引き起こす可能性があります。酵素を添加すると、信号は急速にする必要があり、着実に減らして、O2は没食子酸との反応で消費されるので、DesB の反応が進むであることを示します。酵素剤添加触媒率率ツールを使用して、30 秒 (図 5 a) ウィンドウを調整することによって定量した前に初期速度の勾配。酵素活性減少する必要がありますは、もはやその時点で約 30-50% 使用の約 1 から 1.5 時間後 (図 5 b) を使用します。
すべての運動測定が実行されると、モデリング プログラム (図 6) を使用してデータをプロットできます。没食子酸と DesB の活動は、さまざまな没食子酸濃度の O2の消費率を測定することによって取得されます。酵素剤添加前にバック グラウンド率は修正されたレートを取得する触媒のレートから差し引かれます。バック グラウンドの補正率は酵素濃度で割った値し、方程式 7.3a [ (を参照してくださいステップ 7.3.3) を装着しました。十分なフィットは KMと Ksi、初期パラメーターに依存している (最初のパラメーター:KM = 320 μ M Ksi = 1600 μ M)。結果は、最大高原に達するとその [レート] が増加するにつれて、少し下向きに傾斜双曲線カーブを示しています。これは、高い基質濃度で基質阻害を示す酵素の典型的な曲線です。
4 nitrocatechol と DesB の阻害率は、4-nitrocatechol (図 7) のさまざまな濃度の存在下で 1 mM 没食子酸と DesB の酸素消費量の減少を観察することによって決定されました。4 NC 濃度 (阻害剤存在下でレートは奔放率によって分断された) 正規化された活動に対してプロットしたと適合する方程式 7.3B (7.3.3 の手順を参照してください)。その 4 NC DesB 反応を阻害するため、酸素の消費量を抑制することが示唆されました。
| メディアの種類 | コンポーネント |
| カタボライト抑制 (SOC のメディア) に超最適のスープ | 2% (w/v) トリプトン |
| 0.5% (w/v) 酵母エキスします。 | |
| 10 mM の NaCl | |
| 2.5 mM KCl | |
| 10 mM MgCl2 (滅菌後追加) | |
| 20 mM グルコース (滅菌後追加) | |
| アンピシリン (LB アンプ メディア) とミラーのホストゲノム スープ | 0.5% (w/v) 酵母エキスします。 |
| 1% (w/v) トリプトン | |
| 1% (w/v) 食塩 | |
| 0.1 mg/mL アンピシリン (滅菌後追加) |
表 1.カタボライト抑制 (SOC のメディア) に超最適のスープとアンピシリン (LB アンプ メディア) とミラーのホストゲノム スープの準備のための成分です。
| 作業ソリューション | コンポーネントの最終濃度 |
| Laemelli バッファー pH 6.8 | 100 mM トリス (ヒドロキシメチル) アミノメタン (トリス) |
| 200 mM ジチオトレイトール (DTT) | |
| 4% ドデシル硫酸ナトリウム (SDS) | |
| 0.05% ブロモフェノール ブルー | |
| 20% グリセロール | |
| 実行バッファー pH 8.3 | 25 mM トリス |
| 192 mM グリシン | |
| 0.1% SDS |
表 2.Laemelli と実行バッファーの SDS-PAGE 解析のための準備のための成分です。
| 作業ソリューション | コンポーネントの最終濃度 |
| アミロース列バッファー、pH 7.4 | 20 mM トリス (ヒドロキシメチル) アミノメタン (トリス) |
| 1 mM エチレンジアミン四酢酸 (EDTA) | |
| 200 mM の NaCl | |
| 溶出バッファー pH 7.4 | 20 mM トリス |
| 1 mM EDTA | |
| 200 mM の NaCl | |
| 10 mM マルトース | |
| 交換バッファー pH 7.5 | 50 mM トリス |
| 10% グリセロール | |
| 脱塩、バッファー pH 7.5 | 50 mM トリス |
| 10 %t ブタノール |
表 3.蛋白質の浄化のためのバッファーの準備のための成分です。
図 1: 切断 dioxygenases リングによる触媒反応の比較。波線を表示 intradiol 胸の谷間 (赤) が 2 つのヒドロキシル グループと extradiol 胸の谷間 (青) 区切りの間の結合を分解酵素反応中に切断される対応する炭素-炭素結合炭素-炭素結合に隣接して、ヒドロキシル グループ。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 2: DesB と LigAB によって触媒反応、2 つの関連タイプ II プロトカテク酸-ジオキシゲナーゼ (PCAD) スーパーファミリーに属する extradiol dioxygenases.この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 3: 精製・濃縮のステップの結果を示す DesB の SDS ページのゲル。車線は次のようにラベルが付いています: S = 蛋白質の標準、FT1 と FT2 収集フローを通じて分数、W1 と W2 を = = 収集洗浄分数、E1 ・ E4 = 収集した溶出画分。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 4: 酸素電極の校正の生成曲線します。(A) 校正前に周囲温度と圧力は、空気平衡向け酸素濃度を決定するプログラムに入力されます。(B) 酸素飽和ソリューションは平衡に達するし、プロンプトを生成します。酸素信号の減少によって示されるように、すべての酸素を利用する (C) ナトリウム ジチオン ソリューションが追加されます。(D) 校正は、信号がゼロの酸素濃度で安定時に取得されます。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 5: 時間の経過とともに活動の一般的な損失を示す代表的な運動曲線。(A)-56.61 の O2の率と新鮮な DesB を使用して 100 μ m 没食子酸の反応 μ M/分 (B) O2利用率は-29.56 と、データ コレクションの 2 時間後 DesB を使用して 100 μ m 没食子酸の反応 μ M/分してくださいここをクリックして表示するのには、この図の拡大版.
図 6: 没食子酸、ミハイル マントン方程式に合わせると DesB 活動のプロット(ブラック) と基質阻害 (赤; のハルデン方程式にフィット方程式 7.3 b).2 つのフィットから派生した速度論的パラメーターは次のとおりです: ミカエリス-メンテン型 - k猫= 17 秒-1 Km ± 316 = 26 μ M ± 123ハルデン - k猫= 570 ± 110 秒-1 Km = 100 μ M ± 320 Ksi = 600 μ M ± 1600。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 7: 4 nitrocatechol DesB 没食子酸 (1 mM) の分解抑制のプロットします。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 8: DesB による没食子酸の調整 (pdb ID = 3wr3).多くの dioxygenases に見られるように二ファッションのアクティブ サイト鉄原子にリガンドの座標します。没食子酸、4-nitrocatechol (4NC) の構造の類似性に基づいて、4NC による DesB の阻害が予想されていた。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
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Discussion
アクティブな精製された DesB タンパク質を得ることに重要なステップは、形成と酵素の減らされた鉄 (ii) アクティブ サイトの維持を含みます。よう、誘導、浄化、集中、パフォーマンスを修正し、脱塩の手順は活性酵素を正常に取得に欠かせない。1 mM 鉄アンモニウムの硫酸塩の存在下でタンパク質の発現を誘導する鉄 (ii) は DesB の活性部位に正しく組み込まれてことを保証します。このメソッドは、アミドヒドロラーゼ金属酵素は、しばしば適切な折りたたみを許可する成長媒体に金属添加と金属サイト6,41,42 を結合の満室稼働を必要とするとのそれらのような研究に触発され ,43。
嫌気性の精製とグローブ ボックス内の濃度は、おそらくこのプロトコルの最も重要な技術的に困難なステップです。グローブ ボックスの脱酸素雰囲気を維持するために不可欠です。これは低、手袋、グローブ ボックスに接続されているの穴がないことを確認しているときに、ボックスにアタッチされている窒素タンクを定期的に変更、マニュアルで定める、グローブ ボックスの脱酸素触媒を維持する必要があり、グローブ ボックス内の新鮮な乾燥剤のトレイを維持します。周囲の O2にさらされて色が変わる酸素に敏感なストリップは、O2をテストするボックスに置かれるかもしれない-自由な雰囲気。さらに、完全にすべてのバッファーと精製・濃縮の過程で使用されるソリューションをドガに必要です。バッファー内の最小限の O2を確保するため、細心の空気窒素バブリングとサイクルを掃除機間の切り替え時に脱バッファーの露出を制限します。
バッファーに存在する酸素があるかどうかを判断する良いテストは洗浄分数の 1 つの小さい部分を取る、グローブ ボックス内の列を実行するとき (約 0.1 0.5 mL)、鉄 ammoni 社の小さな部分に微量遠心チューブに配置um 硫酸と DTT (濃度ステップに必要な量より少ない)。管の内容をよく混合し、色の変化を観察することが重要ですし。ソリューションが黒く、酸素がある黄色、またはオレンジ色、暗い蛋白質画分に存在可能性がある場合は、完全な精製・濃縮プロセスの後減少触媒活動をします。ソリューションが軽い場合ラベンダーまたは非常に明るい黄色の色最小限 O2存在する可能性がありますが、酵素はまだ高い活性を持つことがありますが。濃い黄色オレンジ色変更する酸素が存在する原因は鉄の硫酸アンモニウムの鉄の酸化による fe (iii) に錆44を形成です。この問題を解決するには、は、ドガのバッファーし原油をグローブ ボックスにそれらを置く前に 1-2 余分な分タンパク質溶液をバブルに窒素を許可することをお勧めします。また、グローブ ボックスの雰囲気が本当に O2であることを確認することが重要です-O2を使用して無料-敏感なストリップ。
速度論的解析の前に酵素を脱塩最後の重要なステップは、無酸素雰囲気を必要とし、浄化された蛋白質は室温で変性しやすい氷の上行われる必要があります。脱塩のタンパク質が抜けて列を決定するは、最も再現性のある結果を与える最も濃縮された分画として成功カイネティックアッセイに不可欠です。新しい樹脂で列を詰め直した、タンパク質の新しいバッチを精製するたびに、脱塩のタンパク質は溶離される分数を決定する必要があります。カイネティックアッセイ中に活動が少なく、精製・濃縮のステップを技術的に習得されている場合、脱塩の手順で問題があります。この手順をトラブルシューティングするときは、50 ミリメートル Tris/10% t ブタノール バッファーが徹底的に脱、新鮮なセファデックス樹脂で列を再梱包およびグローブ袋には穴がないことを確認することが重要です。
DesB が正常に精製し、脱塩した後、酵素の触媒作用に関するデータを取得する酸素電極を用いたカイネティックアッセイを慎重に行う必要があります。速度論的測定は通常再現可能な触媒活性と集中の蛋白質を使用します。データ ポイントは再現していない基板または阻害剤濃度データ ポイントの実行を繰り返すとき、問題は蛋白質が変性や長時間使用した後酸化したことがあります。データ収集の継続を許可する新鮮な脱塩タンパク質を生成できます。ブラッドフォードの試金を使用して、データ コレクションの完了後正確な蛋白質の集中を定めることができるので、酵素のすべてのバイアルを保持することが重要です。酵素は、まず活動と不正確な速度測定を下げることにつながる可能性がありますそれを実行するので、時間をかけて活動を失うので、カイネティクス測定後この手順を実行するとします。タンパク質濃度は、回転数を決定するために必要な反応速度に観察された触媒料金を変換する使用されます。データを再現するとき、長時間使用した後、電極を覆う膜の劣化は照らし合わせ動態結果につながる酵素活性の損失について懸念に加えてと、課題をまた引き起こすかもしれません。膜劣化は通常の増加 (250 ~ 350 nmol/ >350 nmol/ml mL) から最初の信号または酵素剤添加前に安定したバック グラウンド率を達成できないことで示されます (> ± 5 nmol/mL/分)。いずれかが発生した場合は、電極を分解、付属のクリーニングの粉を使用した電極を任意の酸化物をきれい、電極を再構築、再調整することをお勧めします。
嫌気性の浄化法は金属の中心金属タンパク質フォールド後交換することはできませんをしっかりとバインドを持っているそれらのために特に、酸化することができますは、酵素にとって非常に重要です。酵素は、基板調整後のみ酸素を調整することによって自分自身を保護するために進化してきた、彼らは携帯電話環境に実行している -体外環境中の酸素の量を飽和が金属の急速な酸化につながることができます。鉄 (ii) の使用頻度の低い fe (iii) フォーム31への変換。この酸化/不活化は、その触媒活性状態の酵素がないは偏った結果につながります。酸素に敏感な電極を用いたカイネティック アッセイは、酵素基質として酸素に依存するに適用できます。基板または製品の吸収の強度変化を用いた動力学パラメーターを取得するではなく、このメソッドは、ソリューションで飽和状態の酸素消費量を可視化できます。このメソッドは、LigAB、鉄 (ii) を調整し、その基板を切断する活性部位に同様に依存しているプロトカテク酸-ジオキシゲナーゼ スーパーファミリーの別 extradiol ジオキシゲナーゼで以前使用されています。
この原稿は、 Sphingobium株の SYK 6 から酵素 DesB に関する追加情報を提供します。酵素の機能と DesB10,19,39の構造定義作業、次は決定されました本、DesB k猫の没食子酸の二原子酸素添加の有能な触媒17.8 ± 1.0 の-1と Km k猫/Km 3.98 x 10 の結果 45 ± 13 μ M の5 M/s。このレートは、LigAB を含む他のジオキシゲナーゼ酵素のために定められるそれらに匹敵する (51 s-1とk猫のk猫/KM 106 M-1の-1 x 4.26) とkの猫を持っている他の dioxygenases/105-108 M-1の-136,45,46に至るKm値,47,48,49,50。
DesB アクティブ サイトが [残基、鉄の (ii) を結合するモノマーに起因は残基中、残基番号で示されます基板の調整に貢献する両方のモノマーの残基と、二量体の界面に表示されています。他のモノマーからの残数と素数 (すなわちGlu377ʹ) で表示されます]6。DesB と 4NC の結合の相互作用を示す構造の情報がない場合は、構造類似および没食子酸と 4NC の違いは、DesB が 4NC で抑制する方法への洞察力を提供できます。没食子酸が鉄 (ii) 中心に調整されている、C3 および C4 の水酸基と Glu377ʹ で調整されている C5 水酸基 C3、C4、および C5 で 3 つの水酸基置換基 (図 8)。C1 でカルボン酸基は DesB 活性部位の Tyr 391ʹ、Tyr 412ʹ、木-13、および Thr 267 でコーディネートします。4NC は、DesB のささやかな阻害剤をあると証明したが鉄 (ii) 中心と 1 つの C1 ニトロ基、カルボン酸に等量 (ながらも調整のため 2 つの酸素残留 391, 412, 13, と 267 で)、はるかですが調整できる 2 つの水酸基電子-没食子酸のカルボン酸より撤退。それは非常に強力な阻害剤ではなかったことが意外じゃない阻害剤割増超過基質に存在していたときに 4NC の没食子酸の DesB 分解の 36.6% 阻害のみ表示されますので (と、K私2.3 ± 0.3 mM)。C5 の水酸基と C1 の置換基が促進酵素リガンド複合体の重要な役割を果たすことが示唆されました。残基 Glu377ʹ、Tyr-391ʹ、Tyr 412ʹ すべてのこれらの相互作用に関与している、ので DesB アクティブ サイト連絡先を隣接するモノマーが化合物と活性部位の構造の配置の重要なことが示唆されました。
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Disclosures
著者ない競合する金銭的な利益やその他の利害の関係があります。
Acknowledgments
テクニカル サポートのウェスリアン大学の博士カミーユ ・ ケラーに感謝したいと思います。嫌気性蛋白質精製方法および O2 の使用に関する彼らのアドバイス教授リンゼイ + Eltis、ジェナ ・ k ・ Capyk ブリティッシュ ・ コロンビアの大学から、テキサス大学オースティン校からキリスト教ホイットマンのおかげで特別な-電極。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Isopropyl β-D-1-thiogalactopyranodise | Gold Bio Technologies | I2481C50 | |
| Coomassie Brilliant Blue R-250 | Bio-Rad | 161-0400 | |
| Ammonium persulfate | Bio-Rad | 161-0700 | |
| 30% Acrylamide | Bio-Rad | 161-0158 | |
| N,N'tetramethyl-ethylenediamine | Bio-Rad | 161-0801 | |
| Amylose Resin High Flow | New England Biolabs | E8022S | |
| BL21 (DE3) competent Escherichia coli cells | New England Biolabs | C2527I | |
| L-cysteine | Sigma Aldrich | C7352 | |
| gallic acid | Sigma Aldrich | G7384 | |
| 4-nitrocatechol | Sigma Aldrich | N15553 | |
| Ferrous ammonium sulfate | Mallinckrodt | 5064 | |
| Sodium dithionite | Alfa Aesar | 33381-22 | |
| wheaton serum bottles | Fisher Scientific | 06-406G | |
| 25 mm Acrodisc PF Syringe Filter with Supor Membrane | Pall Corportation | 4187 | |
| 400 mL Amicon Stirred Cell Concentrator | EMD Millipore | UFSC40001 | |
| 76 mm Millipore Ultracel 10 kDa cutoff reconsituted cellulose membrane filter | EMD Millipore | PLGC07610 | |
| DL-dithiothreitol | Gold Bio Technologies | DTT50 | |
| Sephadex G-25 coarse desalting gal column | GE Healthcare | 17-0033-01 | |
| 2 mL Crimp-Top Vials | Fisher Scientific | 03-391-38 | |
| Oxygraph Plus Electrode Control Unit | Hansatech Instruments | OXYG1 Plus | |
| Oxygen Eletrode Chamber | Hansatech Instruments | DW1 | |
| Electrode Disc | Hansatech Instruments | S1 | |
| PTFE (0.0125 mmX25mm) 30m reel | Hansatech Instruments | S4 | |
| Electrode cleaning Kit | Hansatech Instruments | S16 | |
| Spacer paper | Zig Zag | available at any gas station | |
| He-series Dri-Lab glove box | Vacuum/Atmospheres Company | ||
| HE-493 Dri-Train | Vacuum/Atmospheres Company | ||
| Double-Ended Micro-Tapered Stainless Steel Spatula | Fisher Scientific | 21-401-10 | |
| DWK Life Sciences Kimble Kontes Flex Column Economy Column | Fisher Scientific | k420400-1530 | |
| 10 μL, Model 701 N SYR, Cemented NDL 26s ga, 2 in, point stlye 2 syringe | Hamilton | 80300 | |
| DWK Life Sciences Kimble Kontes Flex Column Economy Column | Fisher Scientific | K420401-1505 | |
| Emulsiflex-C5 high-pressure homogenizer | Avestin | ||
| B-PER Complete Bacterial Protein Extraction Reagent | Thermo Fisher Scientific | 89821 | |
| Lysozyme from chicken egg white | Sigma Aldrich | 12650-88-3 | |
| Sodium dodecyl sulfate | Thermo Fisher Scientific | 151-21-3 | |
| ampicillin | Sigma Aldrich | 7177-48-2 | |
| Tryptone | Fisher Scientific | BP-1421-500 | |
| Yeast extract | Fisher Scientific | BP1422-2 | |
| Sodium Chloride | Fisher Scientific | S271-10 | |
| Potassium Chloride | Fisher Scientific | P217-3 | |
| Magnesium Chloride | Fisher Scientific | M33-500 | |
| Dextrose | Fisher Scientific | D16-3 | |
| Sodium Hydroxide | Fisher Scientific | S318-1 | |
| Tris hydrochloride | Fisher Scientific | BP153-500 | |
| Maltose | Fisher Scientific | BP684-500 | |
| Glycine | Fisher Scientific | G46-500 |
References
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