Summary
Här presenterar vi ett protokoll för anaerob protein rening, anaerob proteinkoncentration och efterföljande kinetiska karakterisering använder ett syre elektrod system. Metoden illustreras med hjälp av enzymet DesB, en dioxygenas enzym som är mer stabil och aktiv när renat och lagras i en syrefri miljö.
Abstract
Syre-känsliga proteiner, inklusive de enzymer som utnyttjar syre som substrat, kan har nedsatt stabilitet när renat med traditionella aerob reningsmetoder. Detta manuskript illustrerar de tekniska detaljerna som är involverade i reningsprocessen anaerob, inklusive utarbetandet av buffertar och reagenser, metoder för kolonnkromatografi i ett handskfacket och avsaltning av proteinet innan kinetik. Beskrev också är metoder för att förbereda och använda en syre-elektrod för kinetiska karakterisering av ett syre-utnyttja enzym. Dessa metoder är illustrerade med hjälp av enzymet dioxygenas DesB, en gallate dioxygenas från bakterien Sphingobium sp. stam SYK-6.
Introduction
Enzymer som använder järn eller andra metaller för att aktivera syre är ofta känsliga för inaktivering under reningsprocessen på grund av deras avlägsna från reducerande miljö i en cell. Därför dessa proteiner måste användas som cellen lysates, underkastas extern reduktionsmedel eller renas anaerobt för att säkerställa att de har optimal enzymaktivitet1,2,3,4. För de enzymer som är är syre-känsliga (speciellt järn-innehållande enzymer), utför alla rening och karakterisering steg bibehållen anaeroba förhållanden nödvändigt att fullständigt karakterisera dem. Detta har lett forskare att utveckla hela laboratorium uppställningar inom ramarna för anaerob kammare för studier alltifrån proteinuttryck genom kristallografi5,6,7,8 .
Häri, rapporterar vi metoder för anaerob rening och kinetiska karakterisering av enzymet DesB använder ett syre elektrod system. DesB är en gallate dioxygenas från bakterien Sphingobium sp. stam SYK-6 som är relaterade till LigAB, en protocatecuate dioxygenas från samma organism. Båda enzymer hör till typ II protocatechuate dioxygenas (PCAD) överfamiljen som inte har studerats datum9, troligen delvis på grund av enzymer av denna superfamiljen att vara mottagliga för inaktivering när renat med standard aerob protein reningsmetoder. Eftersom några av enzymerna som PCAD Visa substrat promiskuitet medan andra är substrat-specifika2,10, vidare är karakterisering av denna Överfamilj nödvändigt att identifiera specificitet bestämningsfaktorer. Såsom har påpekats i flera enzym superfamilies11,12,13,14,15, kan små molekyler ändra aktiviteten via direkta kompetitiv hämning eller bindningen av molekyler till separata Alloster fickor som orsakar en ökning eller minskning av enzymaktivitet16. Medan kinetik ensam inte kan skilja bindande platsen för en modulator, avgöra omfattningen av en aktivitet förändringen är viktigt för att förstå effekterna. Som sådan, metoder för kinetiska karakterisering infödda DesB verksamhet och dess verksamhet i närvaro av 4-nitrocatechol (4NC), en förening som vanligen används för att karakterisera och hämmar dioxygenas enzymer2,17, 18, visas.
DesB är kunna bryta ner Epigallocatechingallat, en lignin-derived aromatisk förening, via en extradiol dioxygenas (EDO) reaktion i vilken ring öppnandet catalyzeds använder syre som en av substrat10,19. Detta enzymatisk reaktion inträffar inom ramen för fördelningen av lignin, en aromatisk heteropolymer Funna i cellväggen av växter. Lignin kan vara depolymerized, vilket ger en mängd aromatiska föreningar som kan ytterligare delas upp i centrala metaboliter3,20,21,22,23,24 ,25,26,27,28,29,30,31,32,33 . Extradiol dioxygenases (EDO) katalyserar en ring öppning reaktion på dihydroxylated aromatiska föreningar, där klyvning sker i anslutning till en metall-samordnad diol; Däremot klyva intradiol dioxygenases liknande aromatiska föreningar mellan de två hydroxylgrupperna (figur 1). EDOs, som många andra metalloenzymes, har en tvåvärda metall center för samordnande Fe(II) består av en två-histidin, one-bildas triad9,34,35. Dessa metalloenzymes blir oxiderade, antingen genom autoxidation eller mekanism-baserade inaktivering, medan enzymet återges inaktiva2,36,37,38.
I de experimentella procedurer som beskrivs i detta manuskript, använder vi DesB, medlem av PCAD superfamiljen från det bakterie Sphingobium sp. SYK-6, katalysera tillsats av syre över C4-C5 förbindelsen av Epigallocatechingallat (figur 2A). Regiochemistry av denna klyvning är analogt med LigAB, som är en protocatechuate-4,5-dioxygenas (figur 2B). Hittills, inkluderar utredningar av detta gallate dioxygenas inga rapporter av föreningar som hämmar DesB10,19,39. Med användning av aerob reningsmetoder utställda DesB variabeln aktiviteten, medan med användning av anaerob metoder kunde vi konsekvent få protein med reproducerbara aktivitet. De kinetiska studier beskrivs här visar metoder för anaerob rening av DesB, kinetic karakterisering av reaktionen av DesB med Epigallocatechingallat, och hämning av DesB av 4-nitrocatechol (4NC).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. allmänna material och metoder
- Förbered alla nödvändiga som beskrivs i tabell 1. Autoklavera vid 120 ° c under 15 min. steril filtrera SOC lösningen, efter tillsats av MgCl2 och glukos, genom passering genom ett 0,2 µm filter. Justera pH-värdet i den Millers Lysogeny buljong (LB media) lösning före autoklavering. Komplettera den LB-Amp media lösningen efter autoklavering med sterila lösningar av 0,2 mM L-cystein, sedan 0,1 mM järnhaltigt ammoniumsulfat att förbättra proteinuttryck och löslighet.
- Förbereda Laemmli buffert och rinnande buffert för polyakrylamid gelelektrofores (sidan) som beskrivs i tabell 2. Justera pH-värdet av lösningar (med 1 M HCl och Tris base för buffert förberedelse) före spädning av komponenter till sin slutliga volymer.
- Förbereda buffertar för protein rening enligt beskrivningen i tabell 3. Justera pH-värdet av lösningar (med 1 M HCl och Tris base för buffert förberedelse) före spädning av komponenter till sin slutliga volymer.
- Överföra de beredda buffertarna till en flaska som kan vara förseglade med en gummipropp med ett hål och innehåller ett glasrör.
- Använda en slang för att ansluta glasröret i proppen till ett vakuum källa. Låt lösningen degas under undertryck under ca 30 minuter under omrörning på medellång hastighet.
- Bryta det vakuum tätning först, sedan stänga av dammsugaren. Nästa, pierce genom gummiproppen med två 20G nålar (en som är lång nog att nå botten av flaskan och en kortare nål som kan användas som en gas fly vent). Bubbla i ett stadigt flöde av kväve under omrörning på medelhög hastighet i 30 min.
- Ta bort nålarna och upprepa den avgasning och bubblande i kväve för sammanlagt tre cykler. När du är klar, ordentligt täta flaskan med en solid gummipropp. Ytterligare säkra proppen med paraffin film och koppartråd (20G), och placera dem i glovebox.
Obs: Alla material placeras i glovebox och utsätts för 3 cykler av rensning ett väntrum, följt av dammsugning ut syre och påfyllningar det med kväve. Buffertar används för rening och koncentration kan vara maximerad och lagras i handskfacket på obestämd tid.
- Bereda natrium jonstrålar lösning genom att lösa upp ungefär en spatel (0,31 ”x 2”, den mindre änden av en dubbeländad mikro-avsmalnande rostfritt stål spatel) full av natrium jonstrålar i ca 1 mL avgasade vatten i ett 1,5 mL mikrocentrifug rör . Förslut röret med paraffin film innan borttagning från handskfacket.
Obs: Förvara fast natrium jonstrålar i handskfacket att förhindra oxidation.
2. beredning av den Amylose kolumnen för Protein rening
- Göra en slurry från högt flöde amylose harts (15 mL) kombinerat med 5 kolumn volymer (75 mL) av amylose kolumn buffert. Överför harts slammet till två 50 mL serum flaskor och förslut flaskan med en gummi septum. Punktera en 20G, 305 mm nål genom septa och bubbla kväve i slam i cirka 1 minut att avlägsna syre från upphävandet. Över den harts och proteinhaltiga lösningen till handskfacket.
- I handskfacket, häll kådan i en 2 x 30 cm Borsilikat kolumn försedd med en enkel Avstängningskranen, vilket gör att kådan att bosätta sig och skapa en nivå säng. Rinna av kolumn bufferten och jämvikta kolonnen med 3 kolumn volymer (~ 30 mL totalt) av avgasade amylose kolumn buffert med trycksatt kväve gas för att driva bufferten genom kådan på cirka 1 droppe/s eller 5 mL/min, tills vätskan är precis ovanför den harts säng.
Obs: Efter proteinet elueras (se steg 3.5 nedan), den amylose kolumn hartsen regenereras genom tvättning med 1 kolumn volym (10 mL) vatten, och sedan 1 kolumn volym av 1% sodium dodecyl sulfate (SDS) och slutligen 3 kolumn volymer (30 mL) vatten. Detta steg kan utföras utanför handskfacket. Kolumnen kådan lagras vid 4 ° C i 20% etanol och kan regenereras upp till 5 gånger.
3. proteinuttryck och anaerob rening av DesB
Obs: Genen DesB kommersiellt synthesized, efter att ha placerats i pET-15b, pET-32a och pMAL-c5x vektorer med NdeI och BamHI begränsningen kloning platser.
- Komplett protein uttryck analyserna enligt tillverkarens riktlinjer för att fastställa de rätta förutsättningarna för storskalig uttryck (beskrivs i korthet nedan).
- Omvandla de DesB-innehållande plasmidsna till kommersiellt göras, kemiskt behöriga E. coli BL21 (DE3) celler, enligt tillverkarens instruktioner. I korthet Tina cellerna på is i 10 min, Lägg till ca 10-50 ng av plasmid DNA till cell blandningen, värme chock cellerna vid 42 ° C i 10 s, och inkubera dem på is för en ytterligare 5 min. Lägg till SOC media att erhålla en slutlig volym av 1 mL och låta den celler att skaka (~ 200 rpm) vid 37 ° C i 60 min. Till ett LB-Amp, lägga till och sprida 100 µL av den cell lösningen och inkubera över natten vid 37 ° C.
- Välj en kolonibildande enhet från plattan efter natten inkubation och använda denna koloni för att Inokulera 10 mL LB-Amp media. Odla cellerna över natten, med skakningar (~ 200 rpm) vid 37 ° C.
- 10 ml av media, tillsätt 100 µL av den natten tillväxt-lösningen och skaka det nya mediet som beskrivs i steg 3.1.2 vid 37 ° C. När den optiska densiteten vid 600 nm (OD600) är mellan 0,4-0,8, lägga isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside (IPTG) att få en slutlig lösning koncentration av 1 mM.
- Omedelbart ta bort en 1 mL alikvot av lösningen och överföra det till ett 1,5 mL mikrocentrifug rör med märkta tid = 0 timmar. Snurra röret vid 15 000 x g i 10 min till pellet cellerna. Efter spinning, avlägsna supernatanten och lagra cellerna vid 4 ° C.
- Ta bort ytterligare alikvoter (1 mL) vid tidsintervall efter tillsats av IPTG (vanligtvis på 5, 10, 12, 18 och 24 h). Som beskrivs i steg 3.1.4, Centrifugera varje tub, Dekantera supernatanten och lagra cellerna vid 4 ° C.
- När alla alikvoter erhålls, Omsuspendera cellerna från varje tidpunkt i 30 µL av bakteriell protein utvinning lösning, odla dem i rumstemperatur 10-15 minuter och centrifugera rören vid 15.000 × g i 5 min att skilja på lösliga och olösliga proteiner.
- Överför lösligt protein lösningen till ett nytt mikrocentrifug rör och resuspendera återstående olösliga pellets med 30 µL av bakteriell protein extraktionslösning.
- Kombinera den 30 µL av varje lösning (både lösliga och olösliga lösningar för varje tidpunkt) med en lika stor volym av Laemmli buffert och sedan visualisera på en SDS-PAGE gel40. Välj villkor motsvarande de köer som innehåller banden rätt storlek i lösliga fraktionen för storskaliga proteinuttryck och rening.
Obs: Eftersom minimal lösligt protein var ursprungligen genereras med hjälp av villkoren ovan, olika kosttillskott lades till att testa för effekter på lösligt protein uttrycket, med 0,2 mM L-cystein och 0,1 mM järnhaltigt ammoniumsulfat visar förbättrad protein uttryck. Enligt detta protein uttryck skärmen var ett lämpligt uttryck vektor för lösliga produktion av DesB pMAL-c5x vektor.
- Efter omvandling i Escherichia coli BL21 (DE3), gör ett lager av DesB/pMal-c5x genom att kombinera 900 µL av bakterieodling (odlade övernattning med skakningar vid 200 rpm och 37 ° C) med 100 µL av 80% glycerol. Lagra beståndet vid-80 ° C i en kryogen slang.
Obs: Gör en ny fryst lager ungefär var 6-8 månader. - Använd en pipettspetsen att skrapa celler från fryst lager och starta en bakterieodling, växer över natten i 5 mL LB-Amp media vid 37 ° C under skakning. Inokulera 1,5 liter för LB-Amp media i en 2 L kolv vid 37 ° C och 200 rpm, med hjälp av övernattning odlade bakterie kultur.
Obs: På grund av den observerade känsligheten av proteinet till syre konstaterades att minskad headspace i kolven och måttlig skakar hastigheter förbättrad protein avkastningen för storskaliga uttryck. - Inducera proteinuttryck när den optiska densiteten vid 600 nm (OD600) är mellan 0,4-0,8 med 1 mM IPTG och kompletteras med 0,2 mM L-cystein och 0,1 mM järnhaltigt ammoniumsulfat. Sänka inkubation temperaturen till 30 ° C och skaka på 200 rpm. Snurra ner cellerna via centrifugering efter 24 h efter induktion vid 4 700 x g i 10 min och kassera det förbrukade mediet.
- Återsuspendera cellpelleten i 20 mL amylose kolumn buffert per varje 1,5 L tillväxt, följt av tillägg av 1 mg lysozym. Rör i 20 minuter på isen.
Obs: Mer buffert kan läggas om lösningen är för trögflytande, lösningar som är alltför trögflytande som protein kan störa följande homogeniserande steg. - Lysera den återsuspenderade cell lösningen via högt tryck homogenisering med 3-5 passerar på cirka 15 000 psi. Överföra proteinet till en 50 mL centrifugrör och spola headspace med kväve för 1 min. Sedan Centrifugera cellen lysate vid 20 000 x g för 40 min att ta bort olösligt skräp.
Obs: Framgångsrika homogenisering orsakar proteinet att bilda miceller som flyter genom röret och i samlingen kolven och lösningen visas som en genomskinlig grå-brun färg. Hålla det homogeniserade proteinet på is under hela processen. - Efter centrifugering, överföring supernatanten till en 50 mL tub (mer än en kan vara nödvändigt), cap röret med en gummi septum och med en 20-gauge nål, långsamt bubbla kvävgas genom lösningen i 2 min att förflytta syre. Wrap septum med paraffin film ytterligare säkra den med koppartråd och föra supernatanten i handskfacket tillsammans med kolumnen material.
- Jämvikta kolonnen (se steg 2,3) och ladda proteinet supernatant på kolumnen. Samla genomströmmande i 5 mL fraktioner under måttligt trycksatt kväve (1 droppe/sekund eller cirka 5 mL/min). Nästa, Tvätta kolonnen med hjälp av en annan kolumn 3 volymer av amylose kolumn buffert och manuellt samla 3 mL fraktioner i glas provrör under måttligt trycksatt kväve (ca 5 mL/min). Eluera proteinet med 5 kolumn volymer (~ 50 mL) av eluering buffert och manuellt samla 3 mL fraktioner under måttlig kväve tryck (cirka 5 mL/min).
Obs: Fraktioner kan alternativt samlas in med hjälp av gravitation filtrering. Cirka 12 eluering fraktioner bör samlas in. - Samla 30 µL portioner av fraktioner och ta bort dem från handskfacket för att visualisering av proteinhaltiga fraktioner via SDS-PAGE analys.
Obs: De insamlade fraktionerna kvar i handskfacket för varaktigheten av detta test. Renat DesB eluerar vanligtvis från kolumnen i fraktioner 3 till 5.
4. anaerob Protein koncentration/Buffer Exchange
- Montera Platskoncentratorn trycksatt, rörs cell med en 76 mm rekonstituerad cellulosa membranfilter (10 kDa cutoff). Lägga till en tillräcklig mängd av 20% etanol i anrikningsverket att hålla membranet våt som monterade koncentratorn övergår i handskfacket.
Anmärkning: Se till att det finns inga tårar i membranet och att o-ringen inte är skrynkligt. - Efter att föra Platskoncentratorn rörs cell i handskfacket, tvätta etanol lösningen av membranet med vatten. Mössa och trycksätta rörs cellen att rengöra slangar och membran av eventuellt överflödigt vatten.
- Lägg till alla de fraktioner som innehåller protein som bestäms av SDS-PAGE (figur 3) till anrikningsverket. Lägg till tillräcklig exchange buffert för att ge 150 mL totalt protein lösningsvolym.
- Trycksätta rörs cell kammaren använder en extern N2 linje och koncentrera sig proteinet till 50 mL med måttlig omrörning fart.
Obs: Att uppnå en koncentration av 50 mL tar cirka 20 min. - Tillägg 100 mL exchange buffert med 0,1 mM Ditiotreitol (DTT) och 0,1 mM järnhaltigt ammoniumsulfat, lägga till lösningen rörs cellen och koncentrera sig proteinet till en total volym om 50 mL med en måttlig omrörning fart.
- Efter lösningen når en volym 50 ml, lägga i kompletterade exchange bufferten gång, men koncentrera lösningen till en total volym på 10 mL med måttlig omrörning fart.
- Filtrera den koncentrerat protein med ett 0,45 µm porstorlek storlek spruta filter och alikvot till enskilda 0,2 mL polymeras-kedjereaktion (pcr) rör (som vardera innehåller ca 150 µL av den protein-lösningen). Ta bort de utjämnade alikvoter från handskfacket och omedelbart flash frysa dem med flytande kväve. Lagra alikvoter vid-80 ° C.
5. avsaltning DesB
- Spola handske påsen med kvävgas för ungefär 1,5 timme före användning.
- Tina en 150 µL alikvot av renat DesB protein inne i handsken påsen, på is.
- Medan proteinet blidväder, förbereda en liten gravitation, avsaltning kolumn som innehåller 3 mL Sephadex G-25 grova avsaltning gel i en 9 mL Borsilikat kolumn. Tvätta kolonnen med 2 kolumn volymer (~ 6 mL) av avgasas avsalta buffert.
Obs: Ersätt avsaltning gelen när det finns en förändring i gel färg från vit till gul (efter cirka 7 använder). - Lägg de tinade DesB på kolonnen via en allvar-kontrollerad process. Kassera genomflöde. Eluera proteinet med cirka 5 mL avsaltning buffert.
Obs: Trycket från bensintanken kontinuerligt fylla handske påsen påverkar den hastighet vid vilken lösningarna droppa från kolumnen. - För inledande fastställandet av protein eluering från kolumnen, samla in 12 injektionsflaskor/elutions (innehållande 3 droppar per injektionsflaska). Förseglade med en gummi septum, ta bort dem från handske väska och test för förekomst av protein antingen direkt (genom SDS-PAGE gel analys) eller indirekt (genom undersökning av aktiviteten av respektive fraktion).
Obs: Vanligtvis fraktioner testas individuellt för aktivitet, som beskrivs i steg 7,1, med den största aktiviteten motsvarar andelen med den största koncentrationen av aktivt protein. DesB eluerar vanligtvis börjar i den 7: e släpp, varefter den följande 9 droppar desalted protein samlas. Protein alikvoter lagras på is under kinetik mätningarna (steg 7.1-7.4).
6. förberedelse syre elektroden
- Polera silver anod ringen och platina katod med elektroden renare och en fuktad tops tills det finns inga synliga tecken på svart oxid insättningar.
- Med sax, klippa cirka en 1,5-tums fyrkant spacer papper (eller cigarett rullande papper, vilket fungerar lika samt). Sedan skär 1) små trianglar på varje ansikte square och 2) slitsar i hörnen till stöd inslagning av elektroden.
- Tillsätt 5 droppar en 50% KCl lösning på silver anoden groove och ansluta dem så de bildar en kontinuerlig ring lösning. Tillsätt 2 droppar av 50% KCl lösningen till toppen av platina elektroden. Noggrant placera spacer papperet ovanpå platina elektroden och jämna ut spacer papperet så det finns inga luftbubblor.
Obs: Försiktig för att undvika att slita spacer papperet. - Skär en bit i S4 30m PTFE (polytetrafluoreten) membran som är ungefär 2 inches lång och placera det ovanpå spacer papperet. Skär av kanterna på membranet så de är i linje med den yttre ringen på elektroden.
- Med hjälp av O-ring applikatorn, skjuta den lilla o-ringen över elektroden att säkra mellanlägget papper och membran på elektroden. Placera större o-ringen på cirkulära spåret på elektroden, se till att det finns inget membran undertill. Skjut den övre kammaren av elektroden på basen och skruva fast två tillsammans.
Obs: Två skruvas på ordentligt om ingen luft bubblor stick till sidorna av kammaren. - Placera den monterade elektroden på sin bas och anslut elektroden till övervakningssystemet. Starta kontrollprogrammet elektrod och kalibrera elektroden genom att utföra protokollet vätskefasen kalibrering (figur 4A). Variabeln temperatur bör temperaturen i rummet där experimentet utförs, och variabeln omgivningstryck är beroende av regionen och aktuella väderförhållanden.
Obs: Omgivningstryck kan erhållas från en väderleksrapport för regionen. - Tillsätt 1 mL 25 mM Tris buffert till elektroden kammaren, infoga kolven, påbörja kalibrering av en syre mättad lösning och justera omrörare hastigheten till 100. Efter elektroden stabiliserar, kalibrering-börvärdet för syret mättad lösning bestäms (figur 4B).
- Utan att ta bort kolven, Använd en 1,2 x 40 mm nål och 1 mL spruta för att injicera cirka 1 mL natrium Ditionit lösning i kammaren, är noga med att undvika att lägga till eventuella luftbubblor (figur 4 c). Använd en gummipropp för att täta elektrod kammaren omedelbart efter natrium Ditionit.
- Gör kalibreringen att fortsätta tills allt syre utnyttjas och programmet är avslutat och spara kalibreringen (figur 4 d). Aspirera lösningen från kammaren och skölj kolven och kammare med avjoniserat vatten 5 - 6 gånger att säkerställa fullständig borttagning av den natrium Ditionit. När sköljning, Använd ett plaströr som är utrustad med en pipettspetsen ansluten till en sidoarm Termoskanna. Undvika att skada membranet.
7. kinetiska analyser med hjälp av syre elektroden
- Identifiera de desalted alikvoter som innehåller aktivt protein seriellt provning 1 µL av enzymet lösning för aktivitet i en lösning av 25 mM Tris buffert med pH 7.5, innehållande 100 µM gallate. Använda aliquot(s) med den största observerade aktiviteten för återstående experiment. (Se steg 5.5.1)
- Fastställa vilken den enzymatiska reaktionen genom att mäta O2 konsumtion använder en O2-känsliga Clark-typ elektrod med dator integration via elektrod-styrenheten.
- För varje kinetik data punkt mätning av DesB, tillsätt 1 mL 25 mM Tris buffert (pH 7,5) till elektroden kammaren. Lägga till en beräknad volym av en 25 mM stamlösning av gallate Tris buffert att uppnå den önska slutliga substrat koncentrationen (0,05-25 mM).
Obs: Förbereda färska stamlösningar av gallate och hämmande föreningar med vatten dagligen och justera pH till 7,5 med tillsats av 0,1 mM NaOH, om det behövs. - Efter 10 s av omrörning för att tillåta blandning av lösningen, försegla kammaren med kolven långsamt och skruva upp ner. En ren vävnad kan användas för att suga upp överflödig vätska som är förskjuten från kammaren. Kan elektroden temperera där det kan ge en stabil mätning av syrekoncentrationen i lösningen i minst 1 minut innan du fortsätter till tillägg av enzym (bakgrund O2 materialåtgången ± 0,5 µM/min).
- Använd en gas snäva 10 µL spruta och Lägg till ca 1 µL av enzym (ca 3-7 µM enzym) elektrod kammaren genom kolven.
Obs: Mängden enzym kan ökas eller minskas svar på den observerade aktiviteten av den specifika alikvoten för reaktion priser vara tillräcklig. - Beräkna den reaktion hastighet baserat på sluttningen av de första 30 s linjära data efter enzym och rätt för bakgrund O2 konsumtion med 30 s för data omedelbart före enzym tillskott. Katalys är lika med andelen O2 konsumtion (figur 5A).
- Efter insamling av rate data för ett visst substrat koncentrationen, Töm elektrod kammaren genom aspiration med hjälp av en plastslang ansluten till en sidoarm Termoskanna och skölja upprepade gånger med vatten för 4-6 cykler. Ställa in lösningen i elektroden som beskrivs i steg 7.2.1 använda nya substrat koncentration.
- Varierar substrat koncentrationer i en oordnad sätt och replikeras i hela loppet av experimentet till konto för minskningar av enzymaktivitet med tiden (figur 5B).
Obs: När replikat av en viss koncentration körs och visar mer än en 30% minskning av priset jämfört med en tidigare kör, ingen ytterligare analyser bör utföras med det partiet av enzym. Vanligtvis efter 30-40 körningar visar enzymet en 30% minskning i aktivitet. - Fastställa de kinetiska parametrarna, kkatt (katalytisk konstanten för omvandlingen av substrat till produkten) och Km (Michaelis konstanten, operativt definierad som substrat koncentrationen vid vilken den ursprungliga satsen är hälften av den högsta hastigheten), genom en minsta kvadratmetoden montering av data från varje substrat koncentrationerna i Michaelis−Menten ekvationen (figur 6) med GraphPad Prism.
- För varje kinetik data punkt mätning av DesB, tillsätt 1 mL 25 mM Tris buffert (pH 7,5) till elektroden kammaren. Lägga till en beräknad volym av en 25 mM stamlösning av gallate Tris buffert att uppnå den önska slutliga substrat koncentrationen (0,05-25 mM).
- Lägga till 4-nitrocatechol (4NC) för att testa dess inverkan på dioxigenation kinetik och bestämma den hämning konstanten (Kjag) med DesB. För varje reaktion villkor, lagerför lösningar av Tris (50 mM), Epigallocatechingallat (25 mM) och 4NC (25 mM) kombineras och spädas med vatten för att ge en 2 mL lösning av 25 mM Tris buffert (pH 7,5) med 1 mM gallate och varierande koncentrationer av 4NC. Volymen av 4NC varierades för att uppnå den önska slutliga hämmare koncentrationen (0,05-20 mM).
- Efter 10 sekunder av omrörning att tillåta blandning av lösningen, Placera kolven i kammaren långsamt och skruva upp ner. En ren vävnad kan användas för att suga upp överflödig vätska som är förskjuten från kammaren. Kan elektroden att temperera och producera en stabil mätning av syrehalten i lösningen i minst 1 minut innan du fortsätter till tillägg av enzym (bakgrund O2 materialåtgången ± 0,5 µM/min).
- Som beskrivits tidigare, lägga till proteinet (steg 7.2.3), bestämma reaktionen klassar (steg 7.2.4) och återställa elektroden för nästa villkoret.
- Som en del av denna serie experiment, bestämma reaktionen klassar i frånvaro av hämmaren flera gånger. Bestämma hämning av standardisering av syreförbrukningen i närvaro av olika hämmare koncentrationer med 1 mM substrat och avsaknad av hämmare (v/vo).
- Passa hämning av gallate dioxigenation ekvationen 7.3A och sedan data som hämning ska ekvationen 7.3B använder en grafritande program (figur 7).
- Bestämma exakt enzym koncentration för varje experiment genom att utföra en Bradford analysen efter slutförandet av alla kinetiska körningar.
Obs: Alla priser har korrigerats för enzym koncentration. Detta steg behöver inte göras i handskfacket eller handske väska.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Visas är SDS-PAGE gel analysen av enskilda fraktioner från rening av DesB-maltos bindande protein (MBP) fusion Konstrukt (figur 3). Gelen avslöjar att proteinet är ren (MW = 91.22 kDa), med undantag för förekomsten av DesB (MW = 49.22 kDa) och MBP protein domän (42 kDa) klyvs från varandra. Fraktioner E2 och E3 valdes för koncentration (steg 4.2).
Reproducerbara resultat från DesB kinetiska analyser beror på rätt montering, kalibrering och experimentell teknik. Det är nödvändigt att ange rätt temperatur och tryck, som dessa variabler bestämma procentandelen av O2 förväntas upplösas i lösningar under analysen (figur 4A). Den första signalen bör vara mellan 1800 och 2000 nmol/mL och bör producera en stabil takt nära noll, vilket indikerar att syremättnad av lösningen minimalt förändras (figur 4B). När den natrium jonstrålar läggs och kammaren är förseglad, O2 konsumtion bör snabbt och stadigt öka tills det finns minimal O2 (< 60 nmol/mL) kvar i lösningen. En stadig negativ lutning anger att 1) monterade elektroden har ingen luftläckage och 2) elektroden svarar adekvat på förändringar i O2 koncentration (figur 4 c och D). Om den O2 kvar i lösning inte är tillräckligt låg, blir kalibrering förskjutningsvärdet felaktiga. Kalibrering måste upprepas med elektroden rätt sammanställd och färska natrium Ditionit måste användas.
När elektroden är korrekt kalibrerad, kan kinetiska analyser utföras. Den första mätningen fastställs aktiviteten av enzymet nymalen desalted använder 100 µM gallate i 25 mM Tris buffert och 1 uL av enzym. Innan tillsats av enzymet, är de Tris buffert och gallate rörde i kammaren med kolven i position. Detta bör ge en ungefärlig första signalen mellan 250 och 350 nmol/mL, och signalen bör stabiliseras (±5 nmol/mL/min) innan enzymet läggs. En stabil signal indikerar att det finns inga variabler (t.ex. slits membran, överblivna natrium Ditionit, smutsiga elektrod) som kan orsaka inkonsekventa mätningar. När enzymet läggs, signalen bör snabbt och minska stadigt, vilket indikerar att reaktionen av DesB är förfarande, eftersom O2 förbrukas i reaktionen med gallate. Lutningen på den ursprungliga satsen innan enzym tillskott och katalytisk priset bestämdes genom att använda verktygen rate och justera fönstret till 30 sekunder (bild 5A). Efter ca 1-1,5 timmars användning, enzymaktiviteten minskar med ca 30-50%, varvid det bör inte längre användas (figur 5B).
När alla kinetiska mätningar har vidtagits, kan data ritas med ett modellering program (figur 6). Aktiviteten av DesB med gallate erhålls genom att mäta graden av O2 konsumtion i varierande gallate koncentrationer. Den bakgrund hastigheten innan enzym tillskott subtraheras från den katalytiska kursen att erhålla korrigerade priset. Bakgrunden korrigerade priset delas av enzym koncentration och monteras på ekvationen 7.3A (se steg 7.3.3). En tillräcklig passform är beroende av de ursprungliga parametrarna för KM och Ksi, (inledande parametrar:KM = 320 μM, Ksi = 1600 μM). Resultatet visar en hyperbolisk kurva som når en maximal platå och sedan sluttar nedåt något [gallate] ökar. Detta är en typisk kurva för ett enzym som uppvisar substrat hämning vid hög substrat koncentrationer.
Graden av hämning av DesB med 4-nitrocatechol bestämdes genom att observera minskade materialåtgången syre av DesB med 1 mM gallate i närvaro av varierande koncentrationer av 4-nitrocatechol (figur 7). 4-NC koncentrationen var plottas mot aktiviteten normaliserade (andelen i närvaro av hämmaren var dividerat med hämningslös frekvens) och passar till ekvationen 7.3B (se steg 7.3.3). Resultaten visar att 4-NC hämmar konsumtion av syre, vilket hämmar DesB reaktionen.
| Typ av media | Komponenter |
| Super Optimal buljong med Catabolite förtryck (SOC media) | 2% (w/v) trypton |
| 0,5% (w/v) jästextrakt | |
| 10 mM NaCl | |
| 2,5 mM KCl | |
| 10 mM MgCl2 (Tillagd efter sterilisering) | |
| 20 mM glukos (Tillagd efter sterilisering) | |
| Millers Lysogeny buljong med Ampicillin (LB-Amp media) | 0,5% (w/v) jästextrakt |
| 1% (w/v) trypton | |
| 1% (w/v) NaCl | |
| 0,1 mg/mL Ampicillin (Tillagd efter sterilisering) |
Tabell 1. Ingredienser för beredning av super optimal buljong med catabolite förtryck (SOC media) och Millers lysogeny buljong med ampicillin (LB-Amp media).
| Fungerande lösning | Komponenten slutliga koncentrationer |
| Laemelli buffert, pH 6,8 | 100 mM tris (hydroxymetyl) aminometan (Tris) |
| 200 mM Ditiotreitol (DTT), | |
| 4% sodium dodecyl sulfate (SDS) | |
| 0,05% bromofenolblått | |
| 20% glycerol | |
| Kör buffert pH 8,3 | 25 mM Tris |
| 192 mM glycin | |
| 0,1% SDS |
Tabell 2. Ingredienser för beredning av Laemelli och kör buffertar för SDS-PAGE analys.
| Fungerande lösning | Komponenten slutliga koncentrationer |
| Amylose kolumn buffert, pH 7,4 | 20 mM tris (hydroxymetyl) aminometan (Tris) |
| 1 mM etylendiamintetraättiksyrans dinatriumsalt (EDTA) | |
| 200 mM NaCl | |
| Eluering buffert pH 7,4 | 20 mM Tris |
| 1 mM EDTA | |
| 200 mM NaCl | |
| 10 mM maltos | |
| Exchange buffert, pH 7,5 | 50 mM Tris |
| 10% glycerol | |
| Avsalta buffert, pH 7,5 | 50 mM Tris |
| 10% t-butanol |
Tabell 3. Ingredienser för beredning av buffertar för protein rening.
Figur 1: jämförelse av de reaktioner som katalyseras av ring klyva dioxygenases. De vågiga linjerna visar den motsvarande kol-kol-bond som är tätt under dioxygenas reaktionen, där intradiol klyvning (röd) bryter banden mellan de två hydroxylgrupper och extradiol klyvning (blå) bryter en kol-kol-bond intill den hydroxylgrupper. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2: de reaktioner som katalyseras av DesB och LigAB, två relaterade extradiol dioxygenases som hör till typ II protocatechuate dioxygenas (PCAD) överfamiljen. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 3: SDS-PAGE gel av DesB visar rening och koncentration steg resultat. Lanes är märkta enligt följande: S = protein standard, FT1 och FT2 = insamlade genomflöde fraktioner, W1 och W2 = insamlade tvätta fraktioner, E1-E4 = den insamlade eluera fraktioner. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 4: generationen av kalibrering kurvor för syre elektroden. (A) är före kalibrering, omgivningstemperatur och omgivningstryck trädde i programmet för att avgöra syrehalter för luft-jämviktas lösningar. (B) syre mättad lösning når jämvikt och genererar en prompt. (C) natrium jonstrålar lösning tillsätts för att utnyttja allt syre, som indikeras av minskningen i syre signal. (D) kalibrering erhålls när signalen stabiliserar vid noll syrekoncentration av. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 5: representativa kinetiska kurvor som illustrerar en typisk förlust av aktivitet över tiden. (A) reaktionen av 100 µm gallate med färska DesB, med en O2 utnyttjandegrad av-56.61 µM/min. (B) reaktionen av 100 µm gallate använder DesB efter 2 h för datainsamling, med en O2 utnyttjandegrad av-29.56 µM/min. Klicka här för att visa en större version av denna siffra.
Figur 6: tomt på DesB aktivitet med Epigallocatechingallat, passar till Michaelis-Menton ekvationen (svart), och passar till Haldane ekvationen för substrat hämning (röd; Ekvation 7.3B). Kinetiska parametrar som härrör från de två passar är följande: Michaelis-Menten - kcat = 316 +/-17 SEK-1, Km = 123 +/-26 μM. Haldane - kcat = 570 +/-110 SEK-1, Km = 320 +/-100 μM, Ksi = 1600 +/-600 μM. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 7: tomt 4-nitrocatechol hämning av DesB dioxigenation av Epigallocatechingallat (1 mM). Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 8: samordning av gallate av DesB (pdb ID = 3wr3). Som sett i många dioxygenases, koordinater liganden till en aktiv plats järn(II) atom i en bidentate mode. Baserat på strukturella likheter mellan gallate och 4-nitrocatechol (4NC), förutspåddes hämningen av DesB 4NC. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
De kritiska steg i att få aktiva, renat DesB protein innebär formning och bibehålla den reducera Fe(II) aktiva platsen i enzymet. Som sådan, korrigera prestanda av induktion, rening, koncentration och avsaltning steg är avgörande för framgångsrikt att få aktivt enzym. Inducerande proteinuttryck i närvaro av 1 mM järnhaltigt ammoniumsulfat säkerställer att Fe(II) korrekt införlivas i den aktiva platsen av DesB. Denna metod är inspirerad av studier som de med amidohydrolase metalloenzymes, som ofta kräver tillägg av metall till tillväxt medier att tillåta korrekt vikning och full beläggning av metall bindande webbplats6,41,42 ,43.
Anaerob rening och koncentration i handskfacket är kanske de mest kritiska och tekniskt svårt stegen i detta protokoll. Det är viktigt att upprätthålla en syrefri atmosfär i handskfacket. Detta kräver att upprätthålla syrebrist katalysator i glovebox som föreskrivs av handboken, med jämna mellanrum förändras kväve tankarna som är kopplade till rutan när de är låga, att säkerställa att det finns inga hål i handskarna bifogas glovebox, och att hålla en bricka med färska torkmedel i glovebox. Syre-känsliga remsor som ändrar färg när de utsätts till omgivande O2 kan placeras i rutan för att testa om en O2-fri atmosfär. Dessutom är det nödvändigt att fullständigt degas alla buffrar och lösningar som kommer att användas under rening och koncentration. För att säkerställa minimal O2 i buffertar, ta stor omsorg att begränsa exponeringen av de avgasade buffertarna till luft när du växlar mellan kväve bubblande och dammsugning cykler.
När du kör kolumnen i handskfacket, ett bra test för att avgöra om det finns syre i buffertar är att ta en liten del av en av de tvätta fraktionerna (cirka 0,1-0,5 mL) och placera den i en mikrocentrifug rör med en liten del av järnhaltiga ammoniak UM sulfat och DTT (mindre än beloppet som är nödvändigt för koncentration steg). Det är då viktigt att blanda innehållet i tuben väl och observera den färgförändring. Om den lösning vänder svarten, mörkt gul eller orange, det finns syre förekommer i protein fraktioner, och det kommer sannolikt vara minskad katalytisk aktivitet efter komplett rening och koncentration processen. Om lösningen är en ljus lavendel eller mycket ljusgul färg, det kan vara minimal O2 närvarande, men det är troligt att enzymet fortfarande har hög aktivitet. Mörk gula till orange färgförändring när syre är närvarande orsakas sannolikt av oxidation av järn i den järnhaltigt ammoniumsulfat att Fe(III), bildar rost44. Åtgärda problemet, rekommenderas det att degas buffertar och låta kväve bubbla genom rå protein lösningen för 1-2 extra minuter innan du placerar dem i handskfacket. Dessutom är det viktigt att se till att stämningen i handskfacket är verkligen O2-gratis med hjälp av O2-känsliga remsor.
Det sista viktiga steget, avsaltning enzymet före kinetic karakterisering, kräver en syrefri atmosfär och måste göras på is, eftersom det renat proteinet är utsatt för denaturering vid rumstemperatur. Avgöra när proteinet desalted lossnar kolumnen är avgörande för framgångsrik kinetiska analyser, som mest koncentrerade fraktioner ge mest reproducerbara resultat. Det bråk där proteinet desalted elueras skall bestämmas varje gång en ny sats av protein renas och när kolumnen är omförpackas med ny harts. Om aktiviteten är låg under kinetiska analyser och rening och koncentration stegen har varit tekniskt behärskar, kan problemet ligga i avsaltning steg. När du felsöker det här steget, är det viktigt att kontrollera att 50 mM Tris/10% t-butanol bufferten är grundligt avgasade, packa kolumnen med färska Sephadex harts och säkerställa att det finns inga hål i handske påsen.
Efter DesB har framgångsrikt renas och avsaltat, måste kinetiska analyser med hjälp av syre elektroden utföras noga för att få fram uppgifter om katalytisk aktivitet av enzymet. Kinetic mätningar är vanligtvis reproducerbara när ett katalytiskt aktiva och koncentrerat protein används. Om datapunkterna inte är reproducerbar när upprepa en körning för en substrat eller -hämmare koncentration datapunkt, kan problemet vara att proteinet har denaturerat eller oxideras efter långvarig användning. Nymalen desalted protein kan skapas för att tillåta fortsatt insamling av uppgifter. Det är viktigt att behålla alla injektionsflaskor av enzymet, så den exakta proteinkoncentration kan bestämmas efter avslutad datainsamling med en Bradford-analys. Detta steg utförs efter de kinetics mätningarna eftersom enzymet förlorar aktivitet över tid, så utför det första kan leda till lägre aktivitet och felaktig kinetik mätningar. Proteinkoncentration används sedan konvertera observerade katalytisk priser till de reaktion priser som behövs för att bestämma antalet omsättning. Förutom oro för förlusten av enzymaktivitet som leder till oreproducerbara kinetik resultat, nedbrytning av membranet som täcker elektroden efter långvarig användning kan också orsaka utmaningar att återge data. Membranet nedbrytning indikeras normalt av en ökning av den ursprungliga signalen (från 250-350 nmol/mL >350 nmol/mL) eller en oförmåga att uppnå en stabil bakgrund innan enzym tillskott (> ±5 nmol/mL/min). Om antingen observeras, rekommenderas det att demontera elektroden, rengör alla oxider av elektroden med hjälp av det medföljande rengörings pulvret, återmontera elektroden och kalibrera om.
Metoden för anaerob rening är mycket viktigt för enzymer med en metall center som kan oxideras, särskilt för dem som har tätt bundna metaller som inte kan bytas efter protein veck. Även om enzymer har utvecklats för att skydda sig genom att samordna syre endast efter substrat samordning, de har gjort så i en cellulära miljön - de mättar mängder syre i en in vitro- miljö kan leda till snabb oxidering av metaller och omvandling av Fe(II) till den inaktiva Fe(III) bildar31. Denna oxidation och inaktivering kan leda till skeva resultat där enzymet inte är i dess catalytically aktiv stat. De kinetiska analyser med hjälp av en syre-känslig elektrod kan tillämpas på enzymer som är beroende av syre som substrat. Snarare än att erhålla kinetik parametrar med hjälp av förändringen i intensitet av substrat eller produktens absorption, tillåter denna metod för visualisering av syreförbrukning mättad lösning. Denna metod har använts tidigare med LigAB, en annan extradiol dioxygenas i protocatechuate dioxygenas överfamiljen som på samma sätt förlitar sig på en Fe(II) i dess aktiva platsen att samordna och klyva sitt substrat.
Detta manuskript ger också ytterligare information om enzymet DesB från Sphingobium sp. stam SYK-6. Efter det arbete som definierade den enzymatiska funktion och uppbyggnad av DesB10,19,39, det bestämdes häri att DesB är behöriga katalysator för dioxigenation av Epigallocatechingallat, med kkatt 17.8 ± 1,0 s-1 och Km 45 ± 13 µm, vilket resulterar i kkattkm 3,98 x 105 M/s. Dessa priser är jämförbara med dem som fastställts för andra dioxygenas enzymer, inklusive LigAB (kkatt av 51 s-1 och kcat/KM av 4,26 x 106 M-1s-1 ) och andra dioxygenases som har kcat/Km värden sträcker sig från 105-108 M-1s-136,45,46 , 47 , 48 , 49 , 50.
Den DesB aktiva platsen tidigare visat sig vara på gränssnittet dimer, med rester från båda monomerer som bidrar till samordning av substrat [rester som härrör från monomeren som binder Fe(II) indikeras av deras rester nummer, medan restprodukter från andra monomeren indikeras av antalet rester och en prime (dvs Glu377ʹ)]6. I avsaknad av strukturell information visar de bindande interaktionerna mellan 4NC och DesB, kan strukturella likheter och skillnader mellan gallate och 4NC ge insikt i hur DesB kan hämmas av 4NC. Gallate har tre hydroxyl substituenter på C3, C4 och C5, med dess C3 och C4 hydroxyl samordnas till Fe(II) center och den C5 hydroxyl samordnas av Glu377ʹ (figur 8). Karboxylsyra gruppen på C1 koordineras av Tyr-391ʹ, Tyr-412ʹ, Thr-13 och Thr-267 i den DesB aktiva platsen. 4NC, som visade sig vara en måttlig hämmare av DesB, har två hydroxylgrupper tillgängliga att samordna stadens Fe(II) och en C1 nitro grupp som är isosteric till en bildas (samtidigt ha två syreatomerna för samordning av rester 391, 412, 13 och 267), men är mycket mer elektron-återkalla än karboxylsyra på gallate. Eftersom 4NC visas endast 36,6% hämning av den DesB dioxigenation av gallate när hämmaren var närvarande i 5 gånger överskott över substrat, det är förvånande att inte den är en mycket potent hämmare (med en Kjag 2.3 ± 0,3 mM). Detta tyder som C5 hydroxyl och C1 substituent spela en betydande roll i att främja enzym-ligand komplexet. Eftersom rester Glu377ʹ, Tyr-391ʹ och Tyr-412ʹ är alla inblandade i dessa interaktioner, tyder detta på att DesB aktiva platsen kontakter med intilliggande monomerer är viktiga för placering av en förening och strukturera den aktiva platsen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna har ingen konkurrerande ekonomiska intressen eller andra intressekonflikter.
Acknowledgments
Vi vill tacka Dr Camille Keller Wesleyan University för teknisk support. Speciellt tack till Professor Lindsay D. Eltis och Jenna K. Capyk från University of British Columbia, samt Christian Whitman från University of Texas i Austin, för deras råd angående anaerob protein reningsmetoder och användning av en O2 -känslig elektrod.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Isopropyl β-D-1-thiogalactopyranodise | Gold Bio Technologies | I2481C50 | |
| Coomassie Brilliant Blue R-250 | Bio-Rad | 161-0400 | |
| Ammonium persulfate | Bio-Rad | 161-0700 | |
| 30% Acrylamide | Bio-Rad | 161-0158 | |
| N,N'tetramethyl-ethylenediamine | Bio-Rad | 161-0801 | |
| Amylose Resin High Flow | New England Biolabs | E8022S | |
| BL21 (DE3) competent Escherichia coli cells | New England Biolabs | C2527I | |
| L-cysteine | Sigma Aldrich | C7352 | |
| gallic acid | Sigma Aldrich | G7384 | |
| 4-nitrocatechol | Sigma Aldrich | N15553 | |
| Ferrous ammonium sulfate | Mallinckrodt | 5064 | |
| Sodium dithionite | Alfa Aesar | 33381-22 | |
| wheaton serum bottles | Fisher Scientific | 06-406G | |
| 25 mm Acrodisc PF Syringe Filter with Supor Membrane | Pall Corportation | 4187 | |
| 400 mL Amicon Stirred Cell Concentrator | EMD Millipore | UFSC40001 | |
| 76 mm Millipore Ultracel 10 kDa cutoff reconsituted cellulose membrane filter | EMD Millipore | PLGC07610 | |
| DL-dithiothreitol | Gold Bio Technologies | DTT50 | |
| Sephadex G-25 coarse desalting gal column | GE Healthcare | 17-0033-01 | |
| 2 mL Crimp-Top Vials | Fisher Scientific | 03-391-38 | |
| Oxygraph Plus Electrode Control Unit | Hansatech Instruments | OXYG1 Plus | |
| Oxygen Eletrode Chamber | Hansatech Instruments | DW1 | |
| Electrode Disc | Hansatech Instruments | S1 | |
| PTFE (0.0125 mmX25mm) 30m reel | Hansatech Instruments | S4 | |
| Electrode cleaning Kit | Hansatech Instruments | S16 | |
| Spacer paper | Zig Zag | available at any gas station | |
| He-series Dri-Lab glove box | Vacuum/Atmospheres Company | ||
| HE-493 Dri-Train | Vacuum/Atmospheres Company | ||
| Double-Ended Micro-Tapered Stainless Steel Spatula | Fisher Scientific | 21-401-10 | |
| DWK Life Sciences Kimble Kontes Flex Column Economy Column | Fisher Scientific | k420400-1530 | |
| 10 μL, Model 701 N SYR, Cemented NDL 26s ga, 2 in, point stlye 2 syringe | Hamilton | 80300 | |
| DWK Life Sciences Kimble Kontes Flex Column Economy Column | Fisher Scientific | K420401-1505 | |
| Emulsiflex-C5 high-pressure homogenizer | Avestin | ||
| B-PER Complete Bacterial Protein Extraction Reagent | Thermo Fisher Scientific | 89821 | |
| Lysozyme from chicken egg white | Sigma Aldrich | 12650-88-3 | |
| Sodium dodecyl sulfate | Thermo Fisher Scientific | 151-21-3 | |
| ampicillin | Sigma Aldrich | 7177-48-2 | |
| Tryptone | Fisher Scientific | BP-1421-500 | |
| Yeast extract | Fisher Scientific | BP1422-2 | |
| Sodium Chloride | Fisher Scientific | S271-10 | |
| Potassium Chloride | Fisher Scientific | P217-3 | |
| Magnesium Chloride | Fisher Scientific | M33-500 | |
| Dextrose | Fisher Scientific | D16-3 | |
| Sodium Hydroxide | Fisher Scientific | S318-1 | |
| Tris hydrochloride | Fisher Scientific | BP153-500 | |
| Maltose | Fisher Scientific | BP684-500 | |
| Glycine | Fisher Scientific | G46-500 |
References
- Awaya, J. D., Walton, C., Borthakur, D. The pydA-pydB fusion gene produces an active dioxygenase-hydrolase that degrades 3-hydroxy-4-pyridone, an intermediate of mimosine metabolism. Applied Microbiology and Biotechnology. 75 (3), 583-588 (2007).
- Barry, K. P., Taylor, E. A. Characterizing the Promiscuity of LigAB, a Lignin Catabolite Degrading Extradiol Dioxygenase from Sphingomonas paucimobilis SYK-6. Biochemistry. 52 (38), 6724-6736 (2013).
- Colabroy, K. L., Smith, I. R., Vlahos, A. H. S., Markham, A. J., Jakubik, M. E. Defining a kinetic mechanism for l-DOPA 2,3 dioxygenase, a single-domain type I extradiol dioxygenase from Streptomyces lincolnensis. Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Proteins and Proteomics. 1844 (3), 607-614 (2014).
- Imsand, E. M., Njeri, C. W., Ellis, H. R. Addition of an external electron donor to in vitro assays of cysteine dioxygenase precludes the need for exogenous iron. Archives of Biochemistry and Biophysics. 521 (1), 10-17 (2012).
- Tsai, C. -L., Tainer, J. A. Methods in Enzymology. David, S. S. 599, Academic Press. 157-196 (2018).
- Kuchenreuther, J. M., et al. High-Yield Expression of Heterologous [FeFe] Hydrogenases in Escherichia coli. Public Library of Science ONE. 5 (11), e15491 (2010).
- Dupuy, J., et al. Crystallization and preliminary X-ray diffraction data for the aconitase form of human iron-regulatory protein 1. Acta Crystallographica Section F. 61 (5), 482-485 (2005).
- Fan, L., et al. XPD Helicase Structures and Activities: Insights into the Cancer and Aging Phenotypes from XPD Mutations. Cell. 133 (5), 789-800 (2008).
- Vaillancourt, F. H., Bolin, J. T., Eltis, L. D. The ins and outs of ring-cleaving dioxygenases. Critical Reviews in Biochemistry and Molecular Biology. 41, 241-267 (2006).
- Sugimoto, K., et al. Molecular Mechanism of Strict Substrate Specificity of an Extradiol Dioxygenase, DesB, Derived from Sphingobium sp. SYK-6. Public Library of Science ONE. 9 (3), e92249 (2014).
- Lewis-Ballester, A., et al. Structural insights into substrate and inhibitor binding sites in human indoleamine 2,3-dioxygenase 1. Nature Communications. 8, (2017).
- Lipscomb, J. D., Hoffman, B. M. Allosteric control of O-2 reactivity in Rieske oxygenases. Structure. 13 (5), 684-685 (2005).
- Mccray, J. A., Brady, F. O. Allosteric Control of Transient Kinetics of Carbon Monoxide-L-Tryptoohan-2,3-Dioxygenase Complex-Formation. Federation Proceedings. 32 (3), 469 (1973).
- Pearson, J. T., Siu, S., Meininger, D. P., Wienkers, L. C., Rock, D. A. In Vitro Modulation of Cytochrome P450 Reductase Supported Indoleamine 2,3-Dioxygenase Activity by Allosteric Effectors Cytochrome b(5) and Methylene Blue. Biochemistry. 49 (12), 2647-2656 (2010).
- Walsh, H. A., Daya, S. Inhibition of hepatic tryptophan-2,3-dioxygenase: Superior potency of melatonin over serotonin. Journal of Pineal Research. 23 (1), 20-23 (1997).
- Barry, K. P., et al. Exploring allosteric activation of LigAB from Sphingobium sp strain SYK-6 through kinetics, mutagenesis and computational studies. Archives of Biochemistry and Biophysics. 567, 35-45 (2015).
- Reynolds, M. F., et al. 4-Nitrocatechol as a probe of a Mn(II)-dependent extradiol-cleaving catechol dioxygenase (MndD): comparison with relevant Fe(II) and Mn(II) model complexes. Journal of Biological Inorganic Chemistry. 8 (3), 263-272 (2003).
- Tyson, C. A. 4-Nitrocatechol as a colorimetric probe for non-heme iron dioxygenases. Journal of Biological Chemistry. 250 (5), 1765-1770 (1975).
- Kasai, D., Masai, E., Miyauchi, K., Katayama, Y., Fukuda, M. Characterization of the gallate dioxygenase gene: Three distinct ring cleavage dioxygenases are involved in syringate degradation by Sphingomonas paucimobilis SYK-6. Journal of Bacteriology. 187 (15), 5067-5074 (2005).
- Billings, A. F., et al. Genome sequence and description of the anaerobic lignin-degrading bacterium Tolumonas lignolytica sp. nov. Standards in Genomic Sciences. 10 (1), 106 (2015).
- Brown, M. E., Chang, M. C. Y. Exploring bacterial lignin degradation. Current Opinion in Chemical Biology. 19, 1-7 (2014).
- Bugg, T. D. H., Ahmad, M., Hardiman, E. M., Rahmanpour, R. Pathways for degradation of lignin in bacteria and fungi. Natural Product Reports. 28 (12), 1883-1896 (2011).
- Clarkson, S. M., et al. Construction and Optimization of a Heterologous Pathway for Protocatechuate Catabolism in Escherichia coli Enables Bioconversion of Model Aromatic Compounds. Applied and Environmental Microbiology. 83 (18), (2017).
- de Gonzalo, G., Colpa, D. I., Habib, M. H. M., Fraaije, M. W. Bacterial enzymes involved in lignin degradation. Journal of Biotechnology. 236, 110-119 (2016).
- Falade, A. O., Eyisi, O. A. L., Mabinya, L. V., Nwodo, U. U., Okoh, A. I. Peroxidase production and ligninolytic potentials of fresh water bacteria Raoultella ornithinolytica and Ensifer adhaerens. Biotechnology Reports. 16, 12-17 (2017).
- Gall, D. L., Ralph, J., Donohue, T. J., Noguera, D. R. A Group of Sequence-Related Sphingomonad Enzymes Catalyzes Cleavage of β-Aryl Ether Linkages in Lignin β-Guaiacyl and β-Syringyl Ether Dimers. Environmental Science & Technology. 48 (20), 12454-12463 (2014).
- Li, J., Yuan, H., Yang, J. Bacteria and lignin degradation. Frontiers of Biology in China. 4 (1), 29-38 (2009).
- Masai, E., Katayama, Y., Nishikawa, S., Fukuda, M. Characterization of Sphingomonas paucimobilis SYK-6 genes involved in degradation of lignin-related compounds. Journal of Industrial Microbiology & Biotechnology. 23, 364-373 (1999).
- Morales, L. T., González-García, L. N., Orozco, M. C., Restrepo, S., Vives, M. J. The genomic study of an environmental isolate of Scedosporium apiospermum shows its metabolic potential to degrade hydrocarbons. Standards in Genomic Sciences. 12 (1), 71 (2017).
- Shettigar, M., et al. Isolation of the (+)-Pinoresinol-Mineralizing Pseudomonas sp. Strain SG-MS2 and Elucidation of Its Catabolic Pathway. Applied and Environmental Microbiology. 84 (4), (2018).
- Shi, Y., et al. Characterization and genomic analysis of kraft lignin biodegradation by the beta-proteobacterium Cupriavidus basilensis B-8. Biotechnology for Biofuels. 6 (1), 1 (2013).
- Varman, A. M., et al. Decoding how a soil bacterium extracts building blocks and metabolic energy from ligninolysis provides road map for lignin valorization. Proceedings of the National Academy of Sciences. 113 (40), E5802-E5811 (2016).
- Wu, W., et al. Lignin Valorization: Two Hybrid Biochemical Routes for the Conversion of Polymeric Lignin into Value-added Chemicals. Scientific Reports. 7 (1), 8420 (2017).
- Koehntop, K. D., Emerson, J. P., Que, L. The 2-His-1-carboxylate facial triad: a versatile platform for dioxygen activation by mononuclear non-heme iron(II) enzymes. Journal of Biological Inorganic Chemistry. 10 (2), 87-93 (2005).
- Lipscomb, J. D. Mechanism of extradiol aromatic ring-cleaving dioxygenases. Current Opinion in Structural Biology. 18 (6), 644-649 (2008).
- Machonkin, T. E., Doerner, A. E. Substrate specificity of Sphingobium chlorophenolicum 2,6-dichlorohydroquinone 1,2-dioxygenase. Biochemistry. 50, 8899-8913 (2011).
- Suzuki, T., Kawamichi, H., Imai, K. Amino Acid Sequence, Spectral, Oxygen-Binding, and Autoxidation Properties of Indoleamine Dioxygenase-Like Myoglobin from the Gastropod Mollusc Turbo cornutus. Journal of Protein Chemistry. 17 (8), 817-826 (1998).
- Vaillancourt, F. H., Labbe, G., Drouin, N. M., Fortin, P. D., Eltis, L. D. The Mechanism-based Inactivation of 2,3-Dihydroxybiphenyl 1,2-Dioxygenase by Catecholic Substrates. Journal of Biological Chemistry. 277 (3), 2019-2027 (2002).
- Sugimoto, K., et al. Crystallization and preliminary crystallographic analysis of gallate dioxygenase DesB from Sphingobium sp. SYK-6. Acta Crystallographica Section F. 65 (11), 1171-1174 (2009).
- Gallagher, S. R. SDS‐Polyacrylamide Gel Electrophoresis (SDS-PAGE). Current Protocols in Essential Laboratory Techniques. 6 (1), 7.3.1-7.3.28 (2012).
- Xiang, D. F., et al. Function Discovery and Structural Characterization of a Methylphosphonate Esterase. Biochemistry. 54 (18), 2919-2930 (2015).
- Vladimirova, A., et al. Substrate Distortion and the Catalytic Reaction Mechanism of 5-Carboxyvanillate Decarboxylase. Journal of the American Chemical Society. 138 (3), 826-836 (2016).
- Korczynska, M., et al. Functional Annotation and Structural Characterization of a Novel Lactonase Hydrolyzing d-Xylono-1,4-lactone-5-phosphate and l-Arabino-1,4-lactone-5-phosphate. Biochemistry. 53 (28), 4727-4738 (2014).
- Netto, L. E. S., Stadtman, E. R. The Iron-Catalyzed Oxidation of Dithiothreitol Is a Biphasic Process: Hydrogen Peroxide Is Involved in the Initiation of a Free Radical Chain of Reactions. Archives of Biochemistry and Biophysics. 333 (1), 233-242 (1996).
- Arciero, D. M., Orville, A. M., Lipscomb, J. D. Protocatechuate 4,5-Dioxygenase from Pseudomonas testosteroni. Methods in Enzymology. 188, 89-95 (1990).
- Harpel, M. R., Lipscomb, J. D. Gentisate 1,2-dioxygenase from pseudomonas. Purification, characterization, and comparison of the enzymes from Pseudomonas testosteroni and Pseudomonas acidovorans. Journal of Biological Chemistry. 265 (11), 6301-6311 (1990).
- Ishida, T., Tanaka, H., Horiike, K. Quantitative structure-activity relationship for the cleavage of C3/C4-substituted catechols by a prototypal extradiol catechol dioxygenase with broad substrate specificity. Journal of Biochemistry. 135 (6), 721-730 (2004).
- Vaillancourt, F. H., Han, S., Fortin, P. D., Bolin, J. T., Eltis, L. D. Molecular Basis for the Stabilization and Inhibition of 2,3-Dihydroxybiphenyl 1,2-Dioxygenase by t-Butanol. Journal of Biological Chemistry. 273 (52), 34887-34895 (1998).
- Veldhuizen, E. J. A., et al. Steady-state kinetics and inhibition of anaerobically purified human homogentisate 1,2-dioxygenase. Biochemical Journal. 386, 305-314 (2005).
- Wolgel, S. A., et al. Purification and Characterization of Protocatechuate 2,3-Dioxygenase from Bacillus macerans: a New Extradiol Catecholic Dioxygenase. Journal of Bacteriology. 175 (14), 4414-4426 (1993).
