Summary
Здесь мы приводим иммунофлюоресценции локализации Динамин для иллюстрации протоколы для обнаружения белков в парафин врезанных мыши эпидидимальных секций и тех, кто увековечен эпидидимальных клеточной линии (mECap18). Мы также описывают протоколы для изоляции секреторной белков от эпидидимальных жидкости и кондиционером ячейки СМИ.
Abstract
Млекопитающих придатка генерирует один из самых сложных жидкостей внутрипросветная любой эндокринной железы с целью поддержки после яичка созревания и хранения сперматозоидов. Такая сложность возникает из-за совместная деятельность секреторных и освоения накладки эпителиальных клеток. Здесь мы описываем методы для анализа эпидидимальных белкового синтеза и секреции, сосредоточив внимание на модели белков семейства Динамин (ДНМ) mechanoenzymes; большие GTPases, которые имеют потенциал, чтобы регулировать двунаправленным мембраны оборота событий. Для изучения экспрессии белков в эпидидимальных ткани мы описываем надежной методологии Этикетировочный иммунофлуоресценции белков-мишеней в парафин врезанных секций и последующего обнаружения пространственного распределения этих белков через иммунофлуоресценции. Мы также обсудим оптимизированный методологии для изоляции и характеристика exosome как пузырьки, известный как epididymosomes, который выделяется в эпидидимальных люмен участвовать в межклеточные связи с созревания сперматозоидов. Как дополнительный подход мы также описывают иммунофлюоресценции обнаружение целевых белков в увековечен SV40 мыши caput эпидидимальных эпителия (mECap18) клеток линии. Кроме того мы обсуждаем утилита mECap18 клеточной линии как модель подходит в пробирке с для изучения регулирование эпидидимальных секреторную активность. Для этой цели мы описываем культивирования требования для поддержания линии клеток mECap18 и использование селективного фармакологических ингибирование схем, которые способны влиять на их профиль белка секреторных. Они легко оценить через уборки кондиционером питательной среды, концентрация секретируемые белки через трихлоруксусной кислоты/ацетон осадков и их последующего анализа через SDS-PAGE и immunoblotting. Мы утверждаем, что эти комбинированные методы подходят для анализа альтернативных эпидидимальных белковых мишеней в качестве прелюдии к определению их функциональной роли в созревания сперматозоидов и/или хранения.
Introduction
Сперматозоиды всех видов млекопитающих приобретать потенциал для отображения вперед прямолинейное и оплодотворить яйцеклетку во время их продолжительного спуска через придатка, узкоспециализированные региона мужской экстра яичка канальные системы, которая может 7-14 дней для навигации (в зависимости от вида)1. Из-за экстремальных конденсации отцовской хроматина и пролития часть цитоплазмы, которая сопровождает чувствующего сперматозоидов в яичках их последующее функционального созревания управляется исключительно их взаимодействия с эпидидимальных микроокружения. Это окружение в свою очередь, создается секреторную и освоения активность Сома эпидидимальных накладки и отображает исключительный уровень сегмента сегмент вариант1. Таким образом наиболее активных сегментов с точки зрения белкового синтеза и секреции являются те, которые расположены в проксимальной части придатка (а именно, caput и корпус)2. Эта деятельность отражает профиль функциональной сперматозоидов, с началом первой ячейки для отображения клейма функциональной компетенции (т.е., прямолинейное и возможность привязки к солюбилизирован кислоты zona гликопротеинов) следующие их проход через caput придатка3. Эти функциональные атрибуты продолжают развивать до достижения оптимального уровня как сперме достигнуть дистальной эпидидимальных сегмента (конского), где они хранятся в состоянии покоя в готовности для эякуляции. Формирование и поддержание этого водохранилища хранения спермы также тесно связаны с подкладкой эпителия, что в конского доминирует сильный освоения деятельности4,5. Хотя анатомические различия были сообщил6,7,8, такие регионализованное разделение труда, как представляется, характеристика придатка, которая является общей среди большинства млекопитающих учился на сегодняшний день, включая наш собственный9,10. Действительно с точки зрения клинической, известно, что эпидидимальных дисфункция делает важный вклад этиологии мужского фактора бесплодия11, таким образом подчеркнув важность понимания регулирования этой специализированной ткани.
Поэтому весьма прискорбно, что наше понимание эпидидимальных физиологии и механизмов, которые регулируют последовательных этапов созревания сперматозоидов и хранение в пределах этой ткани, по-прежнему быть полностью урегулирован. Среди факторов ограничивающих прогресс в исследованиях эпидидимальных являются общей сложности этой ткани и знаний о механизмах, которые оказывают регулирующего контроля над его Люминал микроокружения. Анатомически мы знаем, что помимо различия caput, корпус и конского сегментов, придатка могут подразделяться на несколько зон (Рисунок 1A), каждый разделены перегородками12 и характеризуется дискретных профили гена/белка выражение13,14,,1516,17,18. Действительно на основе подробного транскрипционный анализ профиля экспрессии генов сегментарный в придатка, как 6 и 9 различных эпидидимальных зон были зарегистрированы в моделях мыши и крысы, соответственно19,20. Такие сложности предположительно отражает состав эпидидимальных сома, псевдомногослойный эпителия, состоящий из многочисленных различных типов клеток; Каждый различные их изобилие, распределения и секреторную/освоения деятельности вдоль тракта. Таким образом основные клетки являются, на сегодняшний день наиболее распространенным эпидидимальных ячейки типа составляют свыше 80% всех эпителиальных клеток. Соответственно основные клетки несут ответственность за основную часть эпидидимальных белка биосинтеза и секреции5. Напротив Светлоклеточная население, которое выстраивают в ряд как вторым наиболее распространенным типом ячейки в пределах эпидидимальных сома, занимаются прежде всего избирательного поглощения Люминал компонентов и подкисление этой микроокружения5. Добавляя еще один уровень сложности, андрогены и других факторов lumicrine яичек происхождения оказывают Дифференциальный контроль над каждым из этих типов эпидидимальных ячеек в зависимости от их размещения вдоль тракта.
Несмотря на ограничения, введенные на такие сложности продолжают быть существенных успехов в решении механистический основу эпидидимальных функции. Ключ для этих исследований был применение стратегий передовых масс-спектрометрии для установления широких масштабах инвентаризации эпидидимальных протеома в тандеме с детальным анализом отдельных белков, отобранных из числа этих первоначальных обследований. Примером такого подхода является нашей недавней характеристика DNM семьи mechanoenzymes в мыши модель21. Наш первоначальный интерес в ДНМ был вызван его двойного действия в муфте экзо - и endocytotic процессов. Опираясь на эти замечания, мы смогли продемонстрировать, что три канонические изоформ DNM (DNM1 - DNM3) сильно выражена в мыши придатка и надлежащим образом позиционируется для выполнения нормативных функций секрецию белка и поглощения21 . Кроме того мы смогли четко дифференцировать каждый DNM изоформы на основе их клеточном и субклеточном локализации, таким образом, о том, что они обладают взаимодополняющими, в отличие от избыточной, деятельность в рамках эпидидимальных эпителия21.
Здесь мы описываем экспериментальной методологии для изучения DNM выражения в мыши придатка с надеждой на то, что эта информация будет найти более широкое применение в характеристике альтернативных эпидидимальных белков и тем самым способствовать нашей понимание функции этого важного элемента мужского репродуктивного тракта. В частности мы описывают развитие надежной методологии иммунофлюоресценции маркировки белков-мишеней в парафин врезанных эпидидимальных секций и последующего обнаружения пространственного распределения этих белков через иммунофлуоресценции микроскопия. Мы далее документ нашего недавно оптимизированный протоколы22 для изоляции и характеристика epididymosomes; малые exosome как пузырьки, которые представляют собой ключевые элементы эпидидимальных секреторной профиля и появляются провести важную роль в продвижении сперматозоидов созревания23. Как дополнительный подход мы также описывают иммунофлюоресценции обнаружение целевых белков в увековечен мыши caput эпидидимальных эпителия (mECap18) клеток линии и использования этого ресурса в качестве модели с для изучения регуляции эпидидимальных секреторную активность в пробирке.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Все экспериментальные процедуры, связанные с коллекцией тканей животных были утверждены университета Ньюкасла животных уход и Комитета по этике.
1. иммунофлюоресценции окрашивания от парафин врезанных эпидидимальных секций (рисунки 1 и 2)
- Сразу же после эвтаназии взрослых мышей через CO2 ингаляции (швейцарский мышей, более 8 недель), тщательно анализировать придатка (используя хирургические ножницы и щипчики) бесплатно вышележащих соединительной ткани и жира и погрузиться в Bouin с фиксатором решение (> 10 раз объем/ткани вес) для фиксации на ночь.
- Стирать ткани с 70% этанол с 2 × изменения ежедневно в течение 2 дней и затем обезвоживает через градуированные этанола (70%, 95% и 100%), в рамках подготовки к инфильтрации и встраивания в парафин блок.
- Раздел парафиновых блоков толщиной 4-6 мкм и горе на слайды в рамках подготовки к пятнать иммунофлюоресценции.
- В Зонта dewax эпидидимальных парафиновых срезах, добавив достаточное количество ксилол слайд банку, чтобы полностью погрузиться в разделе ткани (3 × 5 мин каждый раз).
- Увлажняет разделов ткани путем погружения в градуированных этанола решения разводят в очищенной H2O (100% этанола 5 мин, 100% этанола 5 мин, 90% этанола 1 мин, 80% этанола 1 мин., 70% этанол 1 мин и 50% этиловом спирте 1 мин).
- Мыть разделы в банку слайд один раз за 5 мин с достаточной фосфатный буфер (PBS) полностью погрузить весь ткани секции (следуйте этим инструкциям для всех последующих моек).
- Декант соответствующие антигена поиска решения (т.е., 10 цитрат натрия ммоль/Л, 50 ммоль/Л трис рН 10.5 или альтернативных антигена извлечения дополняя, в зависимости от антигена для обнаружения) в стойку слайд и микроволновая печь до кипения. Погружать слайды в это решение и подлежит разделов ткани условий извлечения тепла индуцированной антигена оптимизирован для отдельных антител (см. таблицу 1).
Предупреждение: Убедитесь, что слайды полностью погружены в антиген поиска решения во время процесса извлечения антигена. - Удалите контейнер слайд из микроволновой печи и остыть до комнатной температуры.
- Промойте слайды с PBS и использовать жидкость репеллент слайд маркер для отслеживания вокруг секции ткани.
- Слайды в увлажненные контейнер (созданные смоченной ткани на базе контейнера) и применить блокировки раствор (3% BSA/PBS, ранее фильтруется через фильтр 0,45 мкм) за 1 ч при 37 ° C.
- Промойте слайды с PBS.
- Проинкубируйте разделы с соответствующим основное антитело, разбавляют до экспериментально оптимизированной концентрации в отфильтрованных 1% BSA/PBS на 4 ° C на ночь (1: 60 для анти DNM1, DNM2 и DNM3 антител; 1: 100 для антитела анти ATP6V1B1, см таблица материалов подробности антитела).
Примечание: Различать конкретные от неспецифических антитела binding, надо включать строгие отрицательной (т.е., вторичное антитело только, первичные антитела preabsorbed против вакцинации пептида) и позитивные элементы24. - Согревать слайды, поместив при комнатной температуре за 30 мин.
- Вымойте слайды 3 × с PBS на тряску платформе (60 об/мин) за 10 мин.
- Проинкубируйте разделы с соответствующие вторичные антитела, разводят в 1% BSA/PBS (фильтруется через фильтр 0,45 мкм) при 37 ° C в течение 1 ч (разбавления 1: 400 для всех вторичных антител, смотрите Таблицу материалы антитела).
ВНИМАНИЕ: Держите контейнер слайд в темноте от этот шаг далее. Для двойной маркировки, выбрать совместимый комбинацию вторичных антител (т.е., вторичные антитела должны были подняты в разных видов). - Вымойте слайды 3 × с PBS на тряску платформе (60 об/мин) за 10 мин.
- Counterstain разделы с пропидий йодидом (PI, 7.48 мкмоль/Л) или 4΄, 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI, 4.37 мкмоль/Л) для 2 мин при комнатной температуре на этикетке клеточного ядра.
- Вымойте слайды дважды с PBS на тряску платформе (60 об/мин) 5 мин.
- Смонтировать разделы с 10% в растворе глицерина 30% в 0,2 моль/Л трис (рН 8,5) подготовлен Mowiol 4-88 и 2,5% 1, 4 - diazabicyclo-(2.2.2)-октановое число.
- Печать coverslip лаком для ногтей и хранить слайды на 4 ° C для будущего наблюдения.
ВНИМАНИЕ: Рекомендуется выполнять изображений слайдов как можно только после подготовки во избежание чрезмерной потери флуоресценции.
2 изоляция Epididymosomes из придатка яичка Caput мыши (рис. 3)
- Сразу же после эвтаназии взрослых мышей через CO2 ингаляции (швейцарский мышей более 8 недель) perfuse их сосудистую с PBS (предварительно разогретую до 37 ° C) для сведения к минимуму загрязнение крови эпидидимальных ткани.
Предупреждение: плазмы крови содержит разнообразные популяции exosomes, которые являются аналогичного размера epididymosomes25. Эффективность очистки крови от эпидидимальных ткани могут быть доступны через инспекции первоначального этапа, высоко васкуляризированной эпидидимальных сегмент расположен проксимальный сегмент caput (т.е., зона 1 на рисунке 1A) - Тщательно анализировать придатка свободной от вышележащих жира и соединительной ткани и полоскания с модифицированных Biggers, Уиттен и Уиттингем среднего (BWW; рН 7,4, осмоляльность 300 ммоль/кг воды26,27) уменьшить любые возможности для поверхности заражение крови.
- Блот эпидидимальных ткани, чтобы удалить излишки средств массовой информации, вскрыть caput придатка яичка (т.е., зон в 2-5 Рисунок 1A) и передать свежие Петри (35 × 10 мм) BWW среда. Убедитесь, что количество средних является достаточным для окончательного восстановления.
Примечание: Для 6 caput epididymides, рекомендуется использовать 1.1 мл средства для восстановления ~ 900 мкл, который затем равномерно разделить и применяется на вершине 2 заранее подготовленных градиентов (см. шаг 2.9). - Сделайте несколько небольших разрезов в caput ткани с лезвием бритвы. Не фарш ткани и таким образом избежать загрязнения образца с чрезмерным цитозольной содержимое. Инкубируйте пластину, содержащий ткань с мягким перемешиванием при 37 ° C за 30 мин до выпуска Люминал содержимое.
- Фильтровать результирующий подвеска через 70 мкм мембраны для удаления сотовой мусора.
- Сбора фильтрата и подвергать это шаги последовательных центрифугированием при 4 ° C с увеличением скорости для того, чтобы ликвидировать сотовой мусора (т.е., 500 × g, 2000 × g, 4000 × g, 8000 × g, 5 мин каждый; 17000 g × 20 мин и наконец 17000 × g дополнительные 10 минут или до тех пор, пока не гранул образуется после центрифугирования).
Предупреждение: Важно оценить цвет гранул после первоначального шага центрифугирования g 500 × чтобы убедиться, что загрязнение минимально крови присутствует. Отменить любые образцы, в которых этот Пелле отображает розовой окраской. - Подготовьте разрывными iodixanol градиентов (в составе 40%, 20%, 10%, 5% слои) путем разбавления плотность градиента среднего (в составе 60% (w/v) водный iodixanol) с раствором сахарозы 0,25 моль/Л и 10 ммоль/Л трис (рН 7,5).
- Подготовьте градиента в ультрацентрифуга трубки (11 × 35 мм), с каждой фракции 450 мкл (рис. 3). Осмотрите градиента после применения каждой фракции обеспечить, что интерфейсы успешно образуются между каждым слоем до загрузки образца эпидидимальных жидкости. Подготовка каждого градиента свежий день использования, однако, эпидидимальных Люминал жидкости образцы могут быть сохранены на 4 ° C для до 2 ч перед погрузкой.
- Тщательно 450 мкл эпидидимальных Люминал жидкости подвеска (соответствующий собранного материала от caput 3 epididymides) на вершине одного градиента.
- Ультрацентрифуги градиенты на 160 000 × g при 4 ° C для 18 h.
Предупреждение: Поскольку этот центрифугирования проводится на очень высокой скорости, все ультрацентрифуга трубы должен быть паре и точно сбалансированы. Проверьте трубы для обеспечения, что они свободны от каких-либо видимых повреждений, которые могут нарушить их целостность. - Аккуратно удалите 12 равных долях (состоящих из 185 мкл) начиная с верхнего слоя и прогрессирует в нижней части градиента. Бильярд эквивалентные дроби, оправился от каждого градиента, если применимо (до двух градиентов).
Примечание: Мышь, epididymosomes наиболее сильно обогащенный в дроби 9-1122, смотрите Рисунок 4 и обсуждения. - После восстановления и объединения фракций 9 – 11 развести в 2 мл PBS и ультрацентрифугирования образцы на 100 000 × g при 4 ° C 3 h (13 × 56 мм труба) гранул epididymosomes.
Предупреждение: Поскольку Пелле epididymosome может быть трудно увидеть, убедитесь, что ориентация трубы отмечается как они помещаются в ротор и Марк трубки для указания выжидательного положения epididymosome гранул. Убедитесь, что каждая трубка содержит достаточный объем (т.е., более 50% общего объема) исключает риск коллапса трубки. - Тщательно аспирационная и удалить супернатант не беспокоя epididymosome гранул.
- Оцените epididymosome чистоты (рис. 4).
- Ресуспензируйте гранулы epididymosome в нужную среду согласно течению заявки(заявок). Например средней BWW обычно используется для экспериментов с участием совместного инкубации с сперматозоидов, или же соответствующие литического буфера в подготовке резолюции эпидидимальных протеома через SDS-PAGE.
3. иммунофлюоресценции окрашивания клеток mECap18
- Подготовка стерильные coverslips (которые будут проводиться в капюшоне культуры клеток)
- Замочите coverslips (12 × 12 мм) в этанол 70% за 10 мин и продезинфицируйте сушки при высокой температуре выше лампой этанола.
- Прохладный coverslip для 10 s перед передачей 12 хорошо пластины.
- Применить раствор стерильный поли L-Лизин для покрытия coverslip и соглашаться на 10 мин при комнатной температуре.
- Отменить решение поли L-лизин и промыть coverslip с стерильных H2O или соответствующих средних.
- Подготовка mECap18 клетки
- Проход аликвоты 2 × 105 mECap18 клеток в каждой скважине 12 хорошо пластины, содержащие coverslips.
- Культура клетки с mECap18 клеток средних (DMEM дополнен с 1% L-глютамином, пируват натрия 1%, 1% пенициллина/стрептомицина и 5α-androstan-17β-ol-3-oneC-IIIN 50 мкмоль/Л) содержащий плода теленка 10% сыворотки (ФБС) в инкубаторе 37 ° C под атмосферу 5% CO2 на ночь.
- После того, как клетки придерживаться coverslip, отказаться от среднего и промойте клетки дважды с PBS.
- Добавьте достаточное количество параформальдегида 4% (PFA) разводят в PBS погружают весь coverslip и исправить клетки при комнатной температуре в течение 15 мин.
- Отменить решение PFA и промыть coverslips дважды в PBS.
- Иммунофлюоресценции пятнать
- Разрушения mECap18 клетки путем погружения в 0,1% тритон X-100 в PBS на 10 мин.
- Промывайте coverslips с PBS.
- Блок mECap18 клетки с 3% BSA и приступить к immunolabeling клеток, используя эквивалентных протоколов описанными на разделах эпидидимальных ткани.
4. изоляция белков с кондиционером клетки культуры среднего
- Коллекция кондиционером клеток питательной среды
- Проход аликвоты 4 × 105 mECap18 клеток в каждой скважине 6 также пластины с mECap18 средой клеток с 10% FBS за 24 ч.
- Вымыть клетки mECap18 три раза с mECap18 клеток средних (подготовлен без FBS) для удаления остаточного FBS и любые связанные с ним белковых загрязнений.
- Добавить 1,5 мл mECap18 клеток средних (подготовлен без FBS) в каждой скважине и инкубировать с mECap18 ячейками для 12 h в инкубаторе 37° C под 5% CO2.
Примечание: mECap18 клеток на этом шаге может быть оценена для различных целевых антигены согласно экспериментальный дизайн. - После инкубации 12 h собирайте клеток средних и центрифуги на 2000 × g за 10 минут, чтобы удалить все сотовой мусора.
Примечание: Длительность инкубации имеет возможность быть изменены в соответствии с экспериментальной дизайн/конечной оценки и с учетом ячейки толерантности к прикладной место. Рекомендуется адаптировать сроки инкубации, основанный на конкретных экспериментальных схем для достижения оптимальных результатов. - Оцените жизнеспособность клеток mECap18 через применения стандартных Трипановый синий исключения пробирного28. Выбросите весь материал, в котором жизнеспособность клеток сократилось ниже 90% до устранения предвзятости, представленный белки, освобождены от мертвых или умирающих клеток.
- Изолировать белки от клеток средних следующим или сохранить средне-80 ° c.
- Белка изоляции (проводиться в Зонта)
- Добавьте 20% объем охлажденного 100% трихлоруксусной кислоты 80% объема кондиционером клеток средних осадок белков, выпустили из клетки культивировали mECap18. Инкубируйте на 4 ° C на ночь при постоянном перемешивании.
- После инкубации, Пелле центрифугированием осажденного белка (17 000 × g, 4 ° C на 10 мин).
Примечание: Из-за ограниченного количества белка, ожидается, что выделяется в среду, вполне возможно, что гранулы не быть легко визуализируется после центрифугирования. Поэтому важно правильно сориентироваться трубку до центрифугирования и заботиться, чтобы не нарушить беременных Пелле расположение во время удаления супернатант. - Отменить супернатант и помыть лепешка дважды с охлажденной ацетона до повторного центрифугирования (17 000 × g, 4 ° C на 10 мин).
- Осторожно снимите и выбросьте супернатант до воздушной сушки любых остаточных ацетона в пределах зонта.
- Ресуспензируйте Пелле белка в буфере соответствующие добыча в рамках подготовки анализа конечной точки для определения полной белка секреторных профили и/или отдельных целевых белков (например., SDS-PAGE, immunoblotting).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Рисунок 1 и Рисунок 2 представителя результаты иммунофлюоресценции локализации DNM в мыши caput придатка. Каждый из трех изоформ DNM расследование профили отображения отдельных локализации. Таким образом DNM1 характеризуется относительно скромных рассеянного маркировки эпидидимальных клеток на протяжении первоначального этапа и caput придатка, (рисунок 2A). Напротив, DNM2 изоформы впервые обнаружена вблизи сопротивляясь базальную и апикального границы ячеек в первоначальной части, перед быть приложена надъядерный домен в клетках в сегменте прилегающих течению caput (т.е., зоны 2-5) (рис. 1B, C). Примечательно однако, интенсивность DNM2 маркировки постепенно уменьшилось между зонами 2-5 caput придатка, результат, который по существу отражает секреторную активность этих эпидидимальных сегментов21 (рис. 1B, C). Соответственно надъядерный маркировки DNM2 был впоследствии показан представителям соответствуют распределения Гольджи в caput основные клетки21. Изолированы от этого же региона эпидидимальных сперматозоидов показали интенсивный методу маркировки для DNM2 (рис. 1 d). Как предостережение однако, эквивалентные DNM2 маркировки не обнаружено регулярно Люминал сперматозоидов в наших разделах ткани. Это явление является одним мы столкнулись на несколько случаев при применении широкий спектр антител против антигенов различных эпидидимальных сперматозоидов/и предположительно возникает из-за проблем, связанных с презентации антигена и/или маскировки в парафин врезанных тканей разделы. В любом случае такие различия подчеркивают важность проведения параллельных immunofluorescent маркировки изолированных сперматозоидов наряду с что эпидидимальных самой ткани. В отличие от DNM1 и DNM2, DNM3 изоформы главным образом был обнаружен в апикальной области небольшое количество эпителиальных клеток caput (рис. 2B, зеленые стрелки), которые были показаны, чтобы соответствовать Светлоклеточная подгрупп населения, совместно маркировки с признанным Светлоклеточная маркером, ATP6V1B1 (Рисунок 2Б, красные стрелки). Аналогичным образом представитель маркеры, которые доказали подходит для дифференциации различных эпидидимальных эпителиальных клеток типы кратко излагаются в таблице 229,,3031 , 32 , 33 , 34.
Помимо описания методов для локализации внутриклеточных белков, проживающих в эпителии эпидидимальных здесь, мы также сообщить нашей недавно оптимизированный протоколы по изучению секреторной белков, инкапсулируются в epididymosomes, малые внеклеточного пузырьки, которые представляют собой важный компонент Люминал окружение, отвечает за поддержку для созревания и хранения спермы22. Комбинированные, шаг 2 и на рисунке 3 подробно шаг за шагом методологии, используемые для изоляции высокообогащенного популяций epididymosomes от мыши caput эпидидимальных ткани. Примечательно однако, эти методы являются легко применимы для изоляции альтернативных населения epididymosomes, возникая от более дистальных эпидидимальных сегментов. Благодаря возможности загрязнения этих образцов мы также описал строгие характеристика протоколы, которые мы обычно используем для подготовки каждого epididymosome. К ним относятся оценки размера и неоднородности населения epididymosome, с помощью микроскопии высокого разрешения и методы динамического рассеяния света. В тандеме, мы также используем immunoblotting стратегии для оценки обогащения признанных внеклеточного везикул маркеров и соответствующее отсутствие белков, которые характерны для потенциальных загрязнителей (т.е., анти гемоглобина (ГБД) как маркер, заражение крови и анти липоксигеназа 15-lipoxygenase (ALOX15) и антитела анти IZUMO1 как маркеры цитоплазматические капли и загрязнения спермы, соответственно)22. Хотя мы нашли что загрязнители являются редкими, если они возникают, мы немедленно отказаться от подготовки epididymosome.
Локализация non перекроя изоформ DNM в caput придатка побудило дальнейшее расследование их потенциальной роли в регулировании эпидидимальных микроокружения. Для этой цели увековечен mECap18 линия клетки была использована как в vitro модель для изучения секреторную активность эпидидимальных клеток. Предыдущие характеристика этой клеточной линии показал, что он укрывает популяцию смешанных клеток, который пятно положительное либо основной или очистить ячейки маркеров. Кроме того также оказались подходит для отчетности физиологических профили экспрессии эпидидимальных генов и белков различных в vitro схемы лечения35mECap18 клетки. Перед использованием ДНМ локализации оценивалась в клетки культивировали mECap18 путем урегулирования эти на лечение coverslips поли L-лизин (Рисунок 5A) и подвергая их обнаружения иммунофлюоресценции. В соответствии с моделей распределения, записанная в разделах caput эпидидимальных ткани, DNM1 был обнаружен всей цитоплазме клеток mECap18, в то время как DNM2 было сконцентрировано в пределах домена надъядерный этих клеток и DNM3 характеризовалась дискретных очагов мембраны, пятнать в номер небольшой подгруппы населения (т.е., 11%) mECap18 клеток, которые были ATP6V1B1 положительным (Рисунок 5B). Эти данные подтверждают утилита mECap18 клеточной линии как ценный ресурс для изучения роли DNM в регулирующих секреторную/освоения эпидидимальных клеточной активности.
Соответственно шаг 4 описывает методологию для анализа mECap18 секреторной активности клеток; методы, которые широко поддаются для оценки воздействия целого ряда различных экспериментальных условиях. В нашем исследовании мы применяли селективный фармакологических вмешательств для подавления активности DNM1 и DNM2 до визуализации и количественной оценки профиля белков, освобождены от mECap18 клеток в кондиционированном средних21. Важной особенностью этого анализа, однако, было обеспечить что mECap18 клетки были тщательно промывают и культивировали в отсутствие FBS добавок. Хотя такой шаг имеет важное значение для предотвращения загрязнения с кондиционером среду с FBS производных белков, она тем не менее несет сопутствующим риском негативно сказывается рост клеток mECap18 и/или жизнеспособности. В борьбе за эту возможность, мы отметили, что линия клетки mECap18 мириться FBS бесплатно культуры и введение DNM ингибиторов для продолжительности наших инкубации окна (т.е., 12 ч). Действительно на этот раз курс, жизнеспособность клеток оставалась выше 90% всех экспериментальных реплицирует. Поэтому этот подход может служить полезным доказательства в концепция стратегии для идентификации функции специфических белков эпидидимальных до совершения инвестиций в генной манипуляции стратегии.
| Тепла индуцированной epitope поиска решения | цитрат натрия 10 ммоль/Л | 50 ммоль/Л трис (рН 10.5) |
| Время | 3 мин | 3 мин |
| 6 мин | 6 мин | |
| 9 мин | 9 мин | |
| 12 мин | 12 мин |
Таблица 1 : Общие условия для оптимизации извлечения тепла индуцированной антигена для использования с парафин врезанных эпидидимальных секций. Процесс фиксации может быть проблематичным, как различных эпитопов часто требуют использования методов различных фиксации, тем самым требуя, что методология оптимизирован для каждого антигена.
| Тип эпителиальных клеток | Распределение | Маркер | Ссылки (PMID) |
| Основная ячейка | Весь придатка яичка | AQP9 | 11027599, 17360690 |
| Светлоклеточная | Душу населения, корпус и конского | V-ATPases, CIC-5 | 19448084, 12475763 |
| Базальная клетка | Весь придатка яичка | CLDN1 | 11159859, 21441423 |
| Узкая ячейка | Начальный этап | V-ATPases, CIC-5 | 19448084, 12475763 |
Таблица 2 : Представитель маркеры для обнаружения типов различных первичных эпидидимальных эпителиальных клеток.
Рисунок 1: пространственное выражение в проксимальных мыши придатка DNM 2. (A) схематическая модель придатка яичка, изображающие секционирование на мыши придатка на 10 зон физически разделены перегородками как сообщает Тернер и коллегами20. В этой модели зона 1 соответствует первоначальной части, зоны 2-5 соответствуют caput придатка, зон 6-7 соответствуют корпус придатка и зон 8-10 представляют конского придатка. (B-C) Иммунофлюоресценции локализации DNM2 выявлены зоны конкретного распределения шаблонов (обозначается белая стрелка и стрелки). Граница между зоной 1 и 2 демаркация пунктирной линией или обозначается желтой стрелки. (D) DNM2 выражается также в пери акросомной области сперматозоидов, изолированных от caput придатка. Однако нет такого окрашивания в Люминал сперматозоидов в соответствующих разделах эпидидимальных регулярно обнаружен. EP, эпителиальные клетки; l, люмен; NEG, вторичное антитело только элемента управления. Эксперименты были реплицированы на материале из трех животных и представитель иммунофлюоресценции изображения представлены. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 2: обнаружение иммунофлюоресценции DNM 1 и DNM 3 в мыши caput придатка. (A) локализации DNM136 был рассмотрен в мыши caput придатка. (B) совместно локализации DNM336 и Светлоклеточная маркер, ATP6V1B137 в мыши caput придатка. Этот анализ подтвердил, что оба DNM3 (зеленые стрелки) и ATP6V1B1 (красные стрелки) проживают Светлоклеточная подгрупп населения, но отображать минимальные субклеточном перекрытия. EP, эпителиальные клетки; int, интерстиция; l, люмен; SP, спермы; NEG, вторичное антитело только элемента управления. Клеточных ядер были counterstained с DAPI (синий). Эксперименты были реплицированы на материале из трех животных и представитель иммунофлюоресценции изображения представлены. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 3: схема изоляции протоколов, используемых для обогащения мыши caput epididymosomes. После вскрытия caput эпидидимальных ткани погружается в капли BWW среды и резаная выпустить Люминал содержимое. Люминал жидкость затем фильтруется через мембрану 70 мкм и результирующая подвеска центрифугируется на повышение скорости для пеллет любой остаточный ячейки мусор. Очищенное подвеска затем загружается поверх разрывными плотность градиента (решение iodixanol) и подвергнут ночи ultracentrifugation. Раздел Epididymosomes на фракции 9-11, которые объединяются, промывают через разрежения в PBS и вернулся в ультрацентрифуга Пелле epididymosomes. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 4: Оценка чистоты epididymosome. Двенадцать равных долях были восстановлены после ultracentrifugation градиента и Алиготе каждого подготовлен для (A) белка и РНК количественной оценки, (B) размер неоднородность оценки с помощью динамического рассеяния света и (C). immunoblot анализ распределения epididymosome маркер. Дополнительные характеристики шаги включали (D) двойной маркировка epididymosomes, сосредоточены на альдегид/сульфат латексные шарики, оценки Микроскопия электрона передачи (E) и (F) immunoblot оценки сперматозоидов (Спермы) и эритроцитов (РБК) загрязнение с помощью анти липоксигеназа 15-липоксигеназы (ALOX15, загрязнение цитоплазматические капли/спермы) или анти гемоглобина (ГБД, РБК загрязнение). Иммуноблотов были также исследовали с известными epididymosome грузом (26S протеасом non АТФазы регулирования Субблок 7, PSMD7; теплового шока белка 90kDa член бета 1, HSP90B1; и бета-тубулина, TUBB). Эти данные были первоначально опубликованы в научных докладах (PMID: 27549865) и воспроизводятся здесь с разрешения издателя, Springer характер. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 5: иммунофлюоресценции обнаружения изоформ DNM в mECap18 клетках показывают распределение моделей этого соглашения с теми, кто обнаружил в caput эпидидимальных ткани. (A) схема coverslip подготовки для стерильных mECap18 клеточной культуры. (B) представитель иммунофлюоресценции образы DNM окрашивания моделей выявленных клеточных распределения (стрелки и врезные (двойной маркировки маркер Светлоклеточная ATP6V1B1 и DNM3)), которые отражали те обнаружены в разделах эпидидимальных ткани. Клеточных ядер были counterstained с пропидий йодидом (PI; красный) или DAPI (синий). Эксперименты были реплицированы на материале из трех животных и представитель иммунофлюоресценции изображения представлены. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Эти исследования включено использование Буэна в фиксированной эпидидимальных ткани, которые подвергались встраивание парафин и стандартные протоколы секущей. Буэна фиксирующие решение состоит из смеси формальдегида, Пикриновая кислота и уксусная кислота, с каждым компонентом, имеющие конкретные и взаимодополняющие функции. Таким образом формальдегид реагирует с первичных аминов в форме белка перекрестные ссылки, пикриновой кислоты медленно проникает в ткань, образуя соли и следовательно коагуляции основных белков, и наоборот, уксусная кислота быстро проникает в ткань и вызывает коагуляции Нуклеиновые кислоты. Эти комбинированные свойства породили Буэна как фиксатор выбора для сохранения морфологических деталь и его использование широко сообщалось в эпидидимальных литературе. Однако Буэна решение — не без его ограничения, которые включают склонность для фиксирующие индуцированной флуоресценции и формальдегида индуцированной cross-linking который может маскировать целевой антигены.
Потенциал для фона флуоресценции требует использования строгие негативные элементы управления, которые в наших исследованиях включают бездействие основного антитела, отсутствие вторичных антител и, где доступны реагентов, использование первичных антител preabsorbed против иммунизируя пептид, из которого они были созданы. Подробности применения такого контроля являются примером нашего предыдущего исследования Динамин DNM выражения в мыши придатка21. В идеале такие результаты также должны быть проверены с помощью ткани, получены от животных нокаут, однако, этот материал не всегда легко доступны. В стремлении противостоять вторичные проблемы сшитого или химически модифицированных целевой антигены, это часто необходимо для выполнения той или иной форме поиска антигена для того, чтобы разоблачать epitopes изменены путем фиксации и таким образом восстановить свой потенциал для антитела привязка. Методология, используемая для извлечения зависит от многих переменных, включая целевые антигена, антитела, тип ткани и метод фиксации. Однако наиболее широко распространенных методов есть приложение либо извлечения тепла опосредованной или Протеолитические индуцированных антигена. Бывший функции, как наш благоприятствования подход ввиду более высокой успеха для восстановления иммунореактивности, с деталями тепловой схемы и поиска решений, мы часто используем, описаны в таблице 1. Мы предостерегли, однако, что это отнюдь не исчерпывающий перечень, и в конечном итоге оптимизации поиска антигена для каждой комбинации целевой/антитела протеина требует предварительные исследования с использованием матрицы времени, температуры и рН комбинаций. Дополнительные соображения включают в себя потенциал для извлечения тепла вызывают повреждение тканей и/или вызвать артефакта маркировки. Таким образом помимо применения негативных элементов, документально выше, мы также регулярно включать позитивные элементы, показывая антител, таких как анти Golgin-97, которые признают различных клеточных органелл.
В стремлении установить ли белки, например лиц, принадлежащих к семейству DNM выполнить излишним, в отличие от взаимодополняющих функций в эпидидимальных ткани, мы нашли его особенно информативным для выполнения двойной маркировки экспериментов в таких показано на рисунке 2B. Эта стратегия включает в себя последовательное маркировки разделов ткани с пары первичных антител (поднятые в разных видов) следуют соответствующие вторичные антитела конъюгированные с различными флуорофоров. Однако накладывающееся функция, которая иногда возникает в стремлении выполнить эти двойной маркировки исследования является несовместимость протоколы извлечения антигена, необходимые для оптимального маркировки с каждого основного антитела. Это ограничение обнаружен в случае совместной маркировки DNM 2 и Golgin-97 в мыши caput придатка, ведущих нас использовать подряд серийный секции (в отличие от же разделе)21. Тем не менее любой из этих подходов являются чрезвычайно полезными в контексте приписывание выражение протеина в конкретной ячейке тип среди представленных в псевдомногослойный эпидидимальных эпителия. С этой целью в виду мы включили список представительных ячейки типа маркеров и их моделей сообщил распределения по длине эпидидимальных трубочку (Таблица 2). Когда один хочет, чтобы выйти за рамки типа клеток и начать исследовать субцеллюлярные распределение целевых белков, использование двойной маркировки с признанным органеллы маркеров, например Golgin-97, имеет явные преимущества. Кроме того применение разрешением электронной микроскопии в тандеме с immunogold этикетировочных остается методом выбора для подробного ультраструктурных локализации и проверки окрашивания моделей достигается с помощью иммунофлюоресценции21 .
Среди ограничения, обусловленные исследование epididymosomes их небольшого размера и сложности получения достаточных количествах для анализа подробные конечной точки, особенно в широко используемых лабораторных видов, таких как мышь. Однако, опираясь на новаторские исследования Салливан и коллеги38,,3940, мы были способны оптимизировать надежной методологии для epididymosome изоляции от мыши модели (см. шаг 2). Мы подчеркиваем, однако, необходимость введения строгого контроля для оценки и физические характеристики обогащенный epididymosome населения41 из-за потенциального загрязнения от сперматозоидов, цитоплазматические капли или кровь exosomes ( Смотрите Рисунок 4). Для этой цели, мы регулярно использовать комбинацию: (i) высокое разрешение электронной микроскопии для визуализации размер и неоднородность epididymosome подготовки, (ii) расчет среднего частиц размером и неоднородность (iii) концентрации epididymosomes на 4 мкм альдегид/сульфат латексные шарики и люминесцентные маркировки признаны поверхностных маркеров exosome, в том числе CD9 и FLOT1, и (iv) immunoblotting изолированных epididymosomes с набором антител рекомендованы для экспериментальных Проверка exosomes (например., анти CD9, анти FLOT1), а также негативных элементов управления, соответствующих антигены, которые должны быть ограничены сперматозоидов (анти IZUMO1), цитоплазматические капли спермы (анти ALOX15) или крови (анти ГБД)22. Если эти стандарты будут выполнены, то epididymosome препараты изолированные легко поддаются для использования в нисходящие приложения, включая совместное инкубации с сперматозоидов и/или грузов профилирования анализирует4222,, оба из которых являются мощными подходы для углубления нашего понимания роли epididymosomes в регулировании эпидидимальных сперматозоидов созревания1.
В этом исследовании мы описывают применение увековечен SV40 мыши caput линии эпидидимальных эпителия (mECap18) клеток, который мы использовали для изучения участия DNM в регулировании эпидидимальных секреторную активность21 , а также влияние экологических токсикантов на эпидидимальных физиологии43. Важной особенностью mECap18 клеточной линии является, что он отображает фенотипические стабильности между проходы и функции представителя населения обоих главных и ясно клетки по21,35,44. По сравнению с первичной эпидидимальных клеточных культур, линии клеток mECap18 также отображает терпимость с культивирования в сыворотке крови плода теленка, бесплатная среда, которая простирается на продолжительность и характер экспериментальных мероприятий эти клетки могут быть подвержены, также находясь разрешительный восстановления выше обилие секретируемые белки с кондиционером носителя. Ограничением mECap18 клеточной линии, однако, является, что он был увековечен и таким образом может по-разному реагируют на стресс и стимулы, связанные с иммунной по сравнению с начальной ячейки культур или эти клетки представляют в vivo. С этого ограничения в виду рекомендуется сравнить результаты, полученные с помощью mECap18 клетки в vivo ответы, когда это возможно. В целом протоколы, которые мы опишем подчеркнуть полезность этой линии клетки как инструмент начать изучать функциональность белков-мишеней в caput придатка. Действительно в сочетании с использованием коммерческих белковых ингибиторов и/или геном-инструменты для редактирования (например, ТРИФОСФАТЫ-Cas9), линия клетки mECap18 имеет значительный потенциал, чтобы помочь решить механистический основу эпидидимальных функции.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Авторы не имеют ничего сообщать.
Acknowledgments
Авторы хотели бы признать национального здравоохранения и медицинских исследований Совета Австралии проект Грант APP1103176 за поддержку этой работы.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Dynamin 1 antibody | Abcam | ab108458 | Host species: Rabbit, Isotype: IgG, Class: polyclonal |
| Dynamin 2 antibody | Santa Cruz | sc-6400 | Host species: Goat, Isotype: IgG, Class: polyclonal |
| Dynamin 3 antibody | Proteintech | 14737-1-AP | Host species: Rabbit, Isotype: IgG, Class: polyclonal |
| ATP6V1B1 antibody | Santa Cruz | sc-21206 | Host species: Goat, Isotype: IgG, Class: polyclonal |
| CD9 antibody | BD Pharmingen | 553758 | Host species: Rat, Isotype: IgG, Class: monoclonal |
| Flotillin-1 antibody | Sigma | F1180 | Host species: Rabbit, Isotype: IgG, Class: polyclonal |
| ALOX15 antibody | Abcam | ab80221 | Host species: Rabbit, Isotype: IgG, Class: polyclonal |
| TUBB antibody | Santa Cruz | sc-5274 | Host species: Mouse, Isotype: IgG, Class: monoclonal |
| PSMD7 antibody | Abcam | ab11436 | Host species: Rabbit, Isotype: IgG, Class: polyclonal |
| Anti Rabbit Alexa Fluor 488 | Thermo | A11008 | Host species: Goat, Isotype: IgG, Class: polyclonal |
| Anti Goat Alexa Fluor 488 | Thermo | A11055 | Host species: Donkey, Isotype: IgG, Class: polyclonal |
| Anti Goat Alexa Fluor 594 | Thermo | A11058 | Host species: Donkey, Isotype: IgG, Class: polyclonal |
| Anti Rat Alexa Fluor 594 | Thermo | A11007 | Host species: Goat, Isotype: IgG, Class: polyclonal |
| Anti Rabbit HRP | Millipore | DC03L | Host species: Goat, Isotype: IgG, Class: polyclonal |
| Anti Rat HRP | Millipore | DC01L | Host species: Goat, Isotype: IgG, Class: polyclonal |
| Anti Mouse HRP | Santa Cruz | sc-2005 | Host species: Goat, Isotype: IgG, Class: polyclonal |
| 4', 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) | Sigma | D9564 | |
| propidium iodide (PI) | Sigma | P4170 | |
| Mowiol 4-88 | Calbiochem | 475904 | |
| Bovine serum albumin (BSA) | Sigma | A7906 | |
| fetal bovine serum (FBS) | Bovogen | SFBS-F | |
| DMEM | Thermo | 11960-044 | |
| L-glutamine | Thermo | 25030-081 | |
| penicillin/streptomycin | Thermo | 15140-122 | |
| 5α-androstan-17β-ol-3-oneC-IIIN | Sigma | A8380 | |
| sodium pyruvate | Thermo | 11360-070 | |
| Trypsin-ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) | Sigma | T4049 | |
| Paraformaldehyde (PFA) | EMS | 15710 | |
| Xylene | VWR Chemicals | 1330-20-7 | |
| Ethanol | VWR Chemicals | 64-17-5 | |
| Phosphate buffered saline (PBS) | Sigma | P4417 | |
| Sodium citrate | Sigma | S1804 | |
| Tris | Astral | 0497-5KG | |
| Glycerol | Sigma | G5516 | |
| 1, 4-diazabicyclo-(2.2.2)-octane | Sigma | D2522 | |
| Poly-L-gysine | Sigma | P4832 | |
| Triton X-100 | Sigma | 78787 | |
| Trypan blue | Sigma | T6146 | |
| Trichloroacetic acid | Sigma | T9159 | |
| Acetone | Ajax Finechem | A6-2.5 L GL | |
| Sucrose | Sigma | S0389 | |
| Poly (vinyl alcohol) | Sigma | P8136 | |
| D-Glucose | Ajax Finechem | 783-500G | |
| OptiPrep Density Gradient Medium | Sigma | D1556 | |
| Fluorescence microscopy | Zeiss | Zeiss Axio Imager A1 | |
| Ultracentrifuge | BECKMAN COULTER | Optima Max-XP | |
| Microcentrifuges | Eppendorf | 5424R | |
| Incubator | Heracell | 150 | |
| Large Orbital Shaker | Ratek | OM7 | |
| Microwave | LG | MS3840SR /00 | |
| Lab pH Meter | MeterLab | PHM220 | |
| Liquid-repellent slide marker | Daido Sangyo | Mini | |
| Coverslip | Thermo | 586 | |
| 6 well plate | CELLSTAR | 657160 | |
| 12 well plate | CELLSTAR | 665180 | |
| Slide | Mikro-Glass | SF41296PLMK | |
| 0.45 µm filter | Millox-HV | SLHV033RS | |
| Kimwipes Dustfree Paper | KIMTECH | 34155 | |
| Ultracentrifuge tube (2.2 ml, 11 × 35 mm) | BECKMAN COULTER | 347356 | |
| Ultracentrifuge tube (3.2 ml, 13 × 56 mm) | BECKMAN COULTER | 362305 | |
| Cell strainer 70 µm Nylon | FALCON | 352350 | |
| Petri dish 35 × 10 mm with cams | SARSTED | 82.1135.500 | |
| Slide jar | TRAJAN | #23 319 00 |
References
- Zhou, W., De Iuliis, G. N., Dun, M. D., Nixon, B. Characteristics of the Epididymal Luminal Environment Responsible for Sperm Maturation and Storage. Frontiers in Endocrinology. 9, 59 (2018).
- Dacheux, J. L., Gatti, J. L., Dacheux, F. Contribution of epididymal secretory proteins for spermatozoa maturation. Microscopy research and technique. 61 (1), 7-17 (2003).
- Aitken, R. J., et al. Proteomic changes in mammalian spermatozoa during epididymal maturation. Asian journal of andrology. 9 (4), 554-564 (2007).
- Hermo, L., Dworkin, J., Oko, R. Role of epithelial clear cells of the rat epididymis in the disposal of the contents of cytoplasmic droplets detached from spermatozoa. The American journal of anatomy. 183 (2), 107-124 (1988).
- Robaire, B., Hinton, B., Orgebin-Crist, M. The epididymis. 3, Knobil and Neill's Physiology of Reproduction. (2006).
- Nixon, B., et al. Formation and dissociation of sperm bundles in monotremes. Biology of Reproduction. 95 (4), (2016).
- Cleland, K. The structure and fuction of the Epididymis. 1. The histology of the Rat Epididymis. Australian Journal of Zoology. 5 (3), 223-246 (1957).
- Belleannée, C., et al. Identification of luminal and secreted proteins in bull epididymis. Journal of proteomics. 74 (1), 59-78 (2011).
- Turner, T. T. De Graaf's thread: the human epididymis. Journal of andrology. 29 (3), 237-250 (2008).
- Holland, M. K., Nixon, B. The specificity of epididymal secretory proteins. Journal of reproduction and fertility. 53, 197-210 (1998).
- Cooper, T. G., Hing-Heiyeung, C., Nashan, D., Nieschlag, E. Epididymal markers in human infertility. Journal of andrology. 9 (2), 91-101 (1988).
- Turner, T. T., Johnston, D. S., Jelinsky, S. A., Tomsig, J. L., Finger, J. N. Segment boundaries of the adult rat epididymis limit interstitial signaling by potential paracrine factors and segments lose differential gene expression after efferent duct ligation. Asian journal of andrology. 9 (4), 565-573 (2007).
- Garrett, S. H., Garrett, J. E., Douglass, J. In situ histochemical analysis of region-specific gene expression in the adult rat epididymis. Molecular reproduction and development. 30 (1), 1-17 (1991).
- Lareyre, J. J., et al. A 5-kilobase pair promoter fragment of the murine epididymal retinoic acid-binding protein gene drives the tissue-specific, cell-specific, and androgen-regulated expression of a foreign gene in the epididymis of transgenic mice. Journal of Biological Chemistry. 274 (12), 8282-8290 (1999).
- Cornwall, G. A., Orgebin-Crist, M. C., Hann, S. R. The CRES gene: a unique testis-regulated gene related to the cystatin family is highly restricted in its expression to the proximal region of the mouse epididymis. Molecular Endocrinology. 6 (10), 1653-1664 (1992).
- Nixon, B., Jones, R. C., Hansen, L. A., Holland, M. K. Rabbit epididymal secretory proteins. I. Characterization and hormonal regulation. Biology of Reproduction. 67 (1), 133-139 (2002).
- Nixon, B., Jones, R. C., Clarke, H. G., Holland, M. K. Rabbit epididymal secretory proteins. II. Immunolocalization and sperm association of REP38. Biology of Reproduction. 67 (1), 140-146 (2002).
- Nixon, B., Hardy, C. M., Jones, R. C., Andrews, J. B., Holland, M. K. Rabbit epididymal secretory proteins. III. Molecular cloning and characterization of the complementary DNA for REP38. Biology of Reproduction. 67 (1), 147-153 (2002).
- Jelinsky, S. A., et al. The rat epididymal transcriptome: comparison of segmental gene expression in the rat and mouse epididymides. Biology of Reproduction. 76 (4), 561-570 (2007).
- Johnston, D. S., et al. The Mouse Epididymal Transcriptome: Transcriptional Profiling of Segmental Gene Expression in the Epididymis 1. Biology of Reproduction. 73 (3), 404-413 (2005).
- Zhou, W., et al. Developmental expression of the dynamin family of mechanoenzymes in the mouse epididymis. Biology of Reproduction. 96 (1), 159-173 (2017).
- Reilly, J. N., et al. Characterisation of mouse epididymosomes reveals a complex profile of microRNAs and a potential mechanism for modification of the sperm epigenome. Scientific reports. 6, (2016).
- Sullivan, R. Epididymosomes: a heterogeneous population of microvesicles with multiple functions in sperm maturation and storage. Asian journal of andrology. 17 (5), 726-729 (2015).
- Reid, A. T., et al. Glycogen synthase kinase 3 regulates acrosomal exocytosis in mouse spermatozoa via dynamin phosphorylation. The FASEB Journal. 29 (7), 2872-2882 (2015).
- Danesh, A., et al. Exosomes from red blood cell units bind to monocytes and induce proinflammatory cytokines, boosting T-cell responses in vitro. Blood. 123 (5), 687-696 (2014).
- Anderson, A. L., et al. Assessment of microRNA expression in mouse epididymal epithelial cells and spermatozoa by next generation sequencing. Genomics data. 6, 208-211 (2015).
- Biggers, J., Whitten, W., Whittingham, D. The culture of mouse embryos in vitro. Methods in mammalian embryology. Daniels, J. , San Francisco: Freeman. 86-116 (1971).
- Strober, W. Trypan blue exclusion test of cell viability. Current protocols in immunology. , A3. B. 1-A3. B. 3 (2001).
- Elkjær, M. -L., et al. Immunolocalization of AQP9 in liver, epididymis, testis, spleen, and brain. Biochemical and biophysical research communications. 276 (3), 1118-1128 (2000).
- Gregory, M., Dufresne, J., Hermo, L., Cyr, D. G. Claudin-1 is not restricted to tight junctions in the rat epididymis. Endocrinology. 142 (2), 854-863 (2001).
- Isnard-Bagnis, C., et al. Detection of ClC-3 and ClC-5 in epididymal epithelium: immunofluorescence and RT-PCR after LCM. American Journal of Physiology-Cell Physiology. 284 (1), C220-C232 (2003).
- Rojek, A. M., et al. Defective glycerol metabolism in aquaporin 9 (AQP9) knockout mice. Proceedings of the National Academy of Sciences. 104 (9), 3609-3614 (2007).
- Shum, W. W., Da Silva, N., Brown, D., Breton, S. Regulation of luminal acidification in the male reproductive tract via cell-cell crosstalk. Journal of Experimental Biology. 212 (11), 1753-1761 (2009).
- Shum, W. W., Ruan, Y. C., Silva, N., Breton, S. Establishment of cell-cell cross talk in the epididymis: Control of luminal acidification. Journal of andrology. 32 (6), 576-586 (2011).
- Sipilä, P., Shariatmadari, R., Huhtaniemi, I. T., Poutanen, M. Immortalization of epididymal epithelium in transgenic mice expressing simian virus 40 T antigen: characterization of cell lines and regulation of the polyoma enhancer activator 3. Endocrinology. 145 (1), 437-446 (2004).
- Feugang, J. M., et al. Profiling of relaxin and its receptor proteins in boar reproductive tissues and spermatozoa. Reproductive Biology and Endocrinology. 13 (1), 46 (2015).
- Gullberg, M., et al. Cytokine detection by antibody-based proximity ligation. Proceedings of the National Academy of Sciences. 101 (22), 8420-8424 (2004).
- Frenette, G., Girouard, J., Sullivan, R. Comparison between epididymosomes collected in the intraluminal compartment of the bovine caput and cauda epididymidis. Biology of Reproduction. 75 (6), 885-890 (2006).
- Fornes, M., Barbieri, A., Sosa, M., Bertini, F. First observations on enzymatic activity and protein content of vesicles separated from rat epididymal fluid. Andrologia. 23 (5), 347-351 (1991).
- Eickhoff, R., et al. Influence of macrophage migration inhibitory factor (MIF) on the zinc content and redox state of protein-bound sulphydryl groups in rat sperm: indications for a new role of MIF in sperm maturation. Molecular human reproduction. 10 (8), 605-611 (2004).
- Lötvall, J., et al. Minimal experimental requirements for definition of extracellular vesicles and their functions: a position statement from the International Society for Extracellular Vesicles. Journal of Extracellular Vesicles. 3, 26913 (2014).
- Hutcheon, K., et al. Analysis of the small non-protein-coding RNA profile of mouse spermatozoa reveals specific enrichment of piRNAs within mature spermatozoa. RNA biology. 14 (12), 1776-1790 (2017).
- Bennett, P. Genetic basis of the spread of antibiotic resistance genes. Annali dell'Istituto superiore di sanita. 23 (4), (1987).
- Nixon, B., et al. Next generation sequencing analysis reveals segmental patterns of microRNA expression in mouse epididymal epithelial cells. PloS one. 10 (8), e0135605 (2015).
